UNE FONCTION MAJEURE DES PROTEINES : LA CATALYSE ENZYMATIQUE I. INTRODUCTION II. PROPRIETES GENERALES DES ENZYMES III. COFACTEURS 1°) INORGANIQUES (IONS) 2°) ORGANIQUES (COENZYMES) A) « LIBRES » B) GROUPEMENTS PROSTHETIQUES IV. SITE ACTIF 1°) PROPRIETES GENERALES 2°) INHIBITION PAR EXCES DE SUBSTRAT V. CINETIQUE ENZYMATIQUE MICHAELIENNE 1°) V FONCTION DE S, EQUATION DE MICHAELIS-MENTEN 2°) V FONCTION DE E 3°) REPRESENTATION de LINEWEAVER et BURK 1 + 3HN-CH-CO-NH-CH-COO R1 +H 3N + R2 acide chlorhydrique 6 N 110°C H2O 16-96 heures vide ou atmosphère d’azote COO C H R1 COO +H N C 3 R2 Nécessité de fournir une H énergie importante 2 INSULINE spécifique des protéines synthétisées dans le RE Pré-proinsuline COO- RE séquence signal + 3H N précurseur de la proinsuline (préproinsuline) séquence signal Proinsuline (produit de sécrétion immature) 15’ clivage protéolytique vésicules de sécrétion lisses (endopeptidases) proinsuline peptide C 21 aa 60’ insuline 30 aa Insuline (produit de sécrétion mature) Insuline : hormone peptidique, 2 chaînes (A : 21 aa ; B : 30 aa), PM = 5700, agit par l’intermédiaire d’un récepteur 3 Les réactions sont catalysées : l’énergie nécessaire pour les déclencher est beaucoup plus faible qu’en l’absence de catalyseur. 4 catalyseur : une ou un enzyme Enzym, en- , zumé « levain » : dans le ferment (XIXe) protéines (ribozymes) agissent à très faible concentration sont inchangés à la fin de la réaction n’affectent pas l’équilibre d’une réaction réversible mais augmentent la vitesse à laquelle l’équilibre est atteint, i.e. augmentent la vitesse de réaction 5 Un catalyseur (un enzyme) agit exclusivement sur la vitesse et non sur l’équilibre d’une réaction. A B Un catalyseur (K) [un enzyme] diminue l’énergie d’activation d’une réaction en permettant la formation d’un ou de plusieurs intermédiaires dont l’énergie d’activation est plus basse. 6 Les enzymes sont plus efficaces que les catalyseurs non organiques limaille de fer plusieurs tonnes 2 H2O2 1 mg de fer catalase 2 H2O + O2 La partie protéique de la catalase, l’hème et les structures associées augmentent considérablement le pouvoir catalytique du fer 7 é A. R. Cofacteurs : inorganiques (ions) organiques (coenzymes) 8 A. R. Cofacteurs : ions inorganiques, molécules organiques (coenzymes) La synthèse naturelle des coenzymes ne peut être faite que par des cellules vivantes. Lorsque cette synthèse n’est pas inscrite dans le patrimoine génétique d’une espèce, alors tout ou partie de la molécule du coenzyme doit être apporté à cette espèce par son alimentation : cet aliment 9 indispensable s’appelle une vitamine. Enzyme Type Cofacteurs Subtilisine (protéase) Hydrolase aucun Glucose isomérase Isomérase Co2+, Mg2+ ion ß-galactosidase Hydrolase Na+, K+ ion Acide lactique déshydrogénase Oxydoréductase NAD+ coenzyme « libre » Glucose oxydase Oxydoréductase FAD coenzyme : « groupement prosthétique » ion Fe Peroxydase Oxydoréductase Nom Hème (Fe2+) groupement 10 prosthétique catalyseur : une ou un enzyme agit à très faible concentration est inchangé à la fin de la réaction n’affecte pas l’équilibre d’une réaction réversible augmente la vitesse à laquelle l’équilibre est atteint, i.e. augmente la vitesse de réaction présente une grande spécificité son activité est régulable 11 Les enzymes ont une grande spécificité : ils catalysent une réaction chimique donnée à partir d’un substrat défini. A. R.12 13 A. R. 14 A. R. 15 A. R. Les enzymes sont spécifiques du/des substrat(s) et du type de réaction La spécificité d’une réaction enzymatique est liée à l’adéquation entre la structure du/des substrat(s) et la structure de l ’enzyme Chymotrypsine en présence d’un peptide substrat Dihydrofolate réductase en présence de ses deux substrats On appelle site actif de l’enzyme, la partie de la protéine capable de reconnaître et de transformer le/les substrats. 16 G.T. Changement conformationnel et flexibilité L’hexokinase catalyse la réaction : glucose + ATP Æ glucose-6-P C’est une étape clé du métabolisme des glucides La fixation de glucose entraîne une modification conformationnelle indispensable à la mise en oeuvre de la catalyse Conformation ouverte Glucose non fixé sur son site Pas de catalyse Conformation fermée Glucose fixé sur son site Catalyse Le passage de la conformation ouverte à la conformation fermée implique des déplacements de plusieurs Angströms 17 G.T. Inhibition par excès de substrat (ESS) 18 k 1 et k –1 sont les constantes de vitesse d’association et de dissociation du complexe ES k E + S k k 1 ES -1 cat E + P k cat est la constante catalytique, c’est-à-dire la constante de vitesse de la réaction enzymatique où E = Enzyme, S = substrat, ES = complexe enzyme-substrat, P = produit 19 k 1 et k –1 sont les constantes de vitesse d’association et de dissociation du complexe ES k E + S k k 1 ES -1 cat E + P k cat est la constante catalytique, c’est-à-dire la constante de vitesse de la réaction enzymatique y = a.x / b + x où a et b sont des constantes v = a.[S] / b + [S] v = Vmax .[S] / KM + [S] Vo = Vmax [S] KM + [S] équation de Michaelis-Menten KM : constante de 20 Michaelis Influence de la concentration en substrat : l’équation de Michaelis-Menten Courbe correspondant à l’équation de MichaelisMenten : V0 = Vmax [S] KM + [S] Cette courbe indique : * que la réaction enzymatique suit une hyperbole. * que la réaction enzymatique est saturable. * qu’il existe une valeur particulière Vmax/2 qui permet de mesurer KM. KM est une constante fondamentale pour les enzymes. Selon le mécanisme précis de la réaction, KM est une fonction complexe des constantes k 1, k –1 et k cat. Dans la plupart des cas, KM est un index de l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Plus KM est petit, plus l’affinité est grande et inversement. Les valeurs courantes 21 de KM s’échelonnent entre 10-1 et 10-7 M. G.T. Influence de la concentration en enzyme La mesure de l’activité enzymatique en présence de concentrations croissantes d’enzyme, et dans certaines conditions, montre que V et Vmax varient linéairement avec [E]. S E P 22 23 A. R. La transformation de l’équation de Michaelis-Menten proposée par Lineweaver et Burk consiste à prendre les inverses de ses 2 membres. En effectuant quelques opérations mathématiques simples, l’équation devient celle d’une fonction linéaire de type y = a.x + b. 1 V0 = KM Vmax [S] + 24 1 Vmax l’activité des enzymes est régulable la majorité des réactions sont catalysées par des enzymes les réactions sont régulées 25 contrôle de l’activité enzymatique L’activité des enzymes peut être contrôlée par de nombreux processus : 1. L’activité des enzymes dépend de leur concentration et de leur localisation dans la cellule, ou dans l’espace extracellulaire ; i.e. fonction de la synthèse et de la dégradation des enzymes, de leur trafic intracellulaire et/ou de leur sécrétion. 2. L’activité des enzymes dépend de leur environnement : pH, température, cofacteurs (ions, coenzymes), concentration de substrat (cinétique + inhibition par excès de substrat). 3. L’activité des enzymes peut être contrôlée de manière réversible par modification covalente. 4. L’activité des enzymes peut être contrôlée de manière irréversible par protéolyse ménagée. 5. L’activité des enzymes peut être contrôlée par des agents modulateurs (inhibiteurs, activateurs) agissant par divers mécanismes. 6. Plusieurs modes de contrôle peuvent être associés. 26 UNE FONCTION MAJEURE DES PROTEINES : LA CATALYSE ENZYMATIQUE VI. CONTROLE DE L’ACTIVITE DES ENZYMES 1°) GENERALITES 2°) ROLE DU pH 3°) ROLE DE LA TEMPERATURE 4°) MODIFICATIONS COVALENTES A) REVERSIBLES : PHOSPHORYLATION/DEPHOSPHORYLATION B) IRREVERSIBLES : PROTEOLYSE MENAGEE 5°) ROLE DES AGENTS MODULATEURS VII. LES AGENTS MODULATEURS DE L’ACTIVITE DES ENZYMES 1°) INHIBITEURS A) IRREVERSIBLES - EXEMPLE : ASPIRINE B) REVERSIBLES 27 Influence du pH Les enzymes sont des protéines. Elles sont sensibles aux variations du pH du milieu. De fait, quand le pH change, l’état d’ionisation des groupements chargés, aussi bien dans le site actif de l’enzyme (en fonction du pKa propre à chaque résidu chargé participant à la constitution du site actif), que dans le substrat, varie. L’activité enzymatique dépend du pH et cette dépendance est spécifique à chaque enzyme. acétylcholinestérase vitesse initiale, V0 pepsine chymotrypsine 28 Influence de la température Les effets de la température sur l’activité d’une enzyme sont complexes, et peuvent être considérés comme le résultat de l’action de 2 forces agissant simultanément mais dans des sens opposés. 1. Quand la température augmente, la vitesse de réaction augmente. 2. Quand la température augmente, il se produit une inactivation (« dénaturation ») progressive de la protéine enzymatique, de telle sorte qu’il existe une température optimale apparente. 29 Influence de la température La température à laquelle la dénaturation devient un facteur important varie d’une enzyme à l’autre. Généralement, la dénaturation est négligeable en dessous de 30°C et commence à être appréciable au-delà de 40°C. Quelques enzymes gardent une activité importante à des températures bien supérieures à 40°C, par exemple les enzymes des bactéries thermophiles. Cette propriété a des applications pratiques importantes. 30 contrôle de l’activité enzymatique par modification covalente réversible Parmi les modifications covalentes possibles, la phosphorylation est l’une des plus fréquentes. Elle permet temporairement soit l’activation soit l’inhibition de l’enzyme, le plus souvent en réponse à un signal extracellulaire. La phosphorylation se produit le plus souvent sur un résidu sérine ou thréonine. Un type particulier de phosphorylation concerne les résidus tyrosine. signal extracellulaire A signal extracellulaire B Elle met en jeu des kinases (addition de phosphate) ou des phosphatases (suppression de phosphate) 31 G.T. contrôle de l’activité enzymatique par protéolyse ménagée La protéolyse ménagée est un mode d’activation courant des enzymes en particulier les enzymes digestives et les enzymes de la cascade de la coagulation du sang. On appelle zymogène le précurseur inactif d’une enzyme activée par protéolyse. Il existe plusieurs modalités d’activation par protéolyse. Exemple de la chymotrypsine Chymotrypsininogène (inactif) Trypsine Chymotrypsine A B C Chymotrypsine π (active) Chymotrypsine α (active) 32 G.T. Inhibiteurs Il existe deux grandes classes d’inhibiteurs : les inhibiteurs irréversibles et les inhibiteurs réversibles. inhibiteurs irréversibles Exemple : aspirine Cyclooxygénases (COX) AINS : antiinflammatoires non-stéroïdiens 33 34 - effets divers sur la fonction cardiovasculaire - l’aspirine à faible dose est un traitement préventif secondaire efficace de l’infarctus du myocarde et de l’ischémie cérébrale -capacité limitée des plaquettes (anuclées) à régénérer des protéines : cible particulière de l’aspirine -administration chronique de faibles doses d’aspirine : réduction de la production de leur principal produit, le thromboxane, un puissant 35 vasoconstricteur UNE FONCTION MAJEURE DES PROTEINES : LA CATALYSE ENZYMATIQUE VII. LES AGENTS MODULATEURS DE L’ACTIVITE DES ENZYMES 1°) INHIBITEURS A) IRREVERSIBLES - EXEMPLE : ASPIRINE B) REVERSIBLES a) COMPETITIFS b) INCOMPETITIFS c) NON COMPETITIFS d) EXEMPLES α) SULFAMIDES ß) SILDENAFIL 2°) ACTIVATEURS VIII. LES ENZYMES ALLOSTERIQUES 1°) PROPRIETES GENERALES 2°) RETROCONTROLE, EFFET HOMOTROPE, EFFET HETEROTROPE 3°) CINETIQUE A) SYSTEME K B) SYSTEME V IX. CLASSIFICATION DES ENZYMES 36 inhibiteurs Il existe deux grandes classes d’inhibiteurs : les inhibiteurs irréversibles et les inhibiteurs réversibles. Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action : inhibition compétitive, incompétitive, et non compétitive. Inhibiteur compétitif S Ic ES EI E+S ES E+P + Ic KI EI G.T. 37 Inhibiteur compétitif [I] 38 G.T. Il existe deux grandes classes d’inhibiteurs : les inhibiteurs irréversibles et les inhibiteurs réversibles. Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action : inhibition compétitive, incompétitive, et non compétitive. Inhibiteur incompétitif S ES Iic ESI E+S ES E+P + Iic K ’I ESI 39 G.T. Inhibiteur incompétitif [I] 40 G.T. Il existe deux grandes classes d’inhibiteurs : les inhibiteurs irréversibles et les inhibiteurs réversibles. Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action : inhibition compétitive, incompétitive, et non compétitive. Inhibiteur non compétitif S ES Inc EI ESI E+S ES + + Inc Inc KI EI+ S ESI E+P K ’I G.T. 41 Inhibiteur non compétitif [I] 42 G.T. 43 44 45 enzymes allostériques Les enzymes allostériques sont des protéines allostériques (cf. hémoglobine) et en partagent les caractéristiques. Les enzymes allostériques font intervenir une liaison réversible, non covalente, d’une molécule régulatrice appelée modulateur allostérique. Le terme allostérique vient du grec allos, autre, et stereos, forme. Les enzymes allostériques prennent une autre forme (une autre conformation) à la suite de la liaison du modulateur. Ce sont des protéines complexes possédant généralement plusieurs sous-unités. Il existe au moins un site de fixation pour le substrat (site actif, catalytique) et au moins un site de fixation (spécifique) pour un modulateur (site régulateur). Dans certains cas, le site régulateur et le site actif sont sur des sous-unités différentes. 46 enzymes allostériques Dans certains systèmes multi-enzymatiques, l’enzyme régulateur est inhibé de façon spécifique par le produit terminal de la voie métabolique, chaque fois qu’il se trouve en excès par rapport aux besoins. Ce type de régulation est appelée rétrocontrôle (inhibition par « feed-back »). Les modulateurs des enzymes allostériques peuvent être des inhibiteurs ou au contraire des activateurs. Le substrat lui-même est souvent un activateur. Quand le substrat et le modulateur sont les mêmes, on parle d’effet homotrope. Quand le modulateur est une molécule différente du substrat, l’effet est dit hétérotrope. Très souvent les enzymes allostériques se placent à une étape clé d’une chaîne métabolique. Dans cet exemple théorique, A le substrat de E1 enzyme clé, allostérique, est un modulateur positif (= activateur allostérique, il active l’enzyme) et G, le produit final est un modulateur négatif (= inhibiteur allostérique, il inhibe l’enzyme). A X E1 B E2 C E3 D E4 E E5 F E6 G 47 tissus 1,0 poumons Saturation (Y) v v max 0,5 v max/2 P50 = 26 0,0 0 20 40 60 80 100 K1/2 [S] Pression partielle en oxygène, pO2 (en torr) Ces courbes traduisent des interactions coopératives entre plusieurs sous-unités 48 49 ENZYME ALLOSTERIQUE DU SYSTEME K T R "inactive" "active" v v max Effet coopératif homotrope positif v max/2 K 1 /2 [S] S+A S v Les enzymes allostériques permettent une réponse rapide et fine aux variations des conditions intracellulaires en présence d’effecteurs Vmax = constante K1/2 varie v max v max/2 Effet hétérotrope S+I 50 K 1 /2 [S] J.J.B. ENZYME ALLOSTERIQUE DU SYSTEME V Le substrat ne modifie pas sa propre fixation : hyperbole Activateur et inhibiteur modifient la vitesse sans modifier K1/2 v max v max/2 K1/2 [S] 51 v v [A] [I] Dans les 2 systèmes (K et V), on met en évidence l’effet coopératif des effecteurs (activateur : A ; inhibiteur : I) en faisant varier leur concentration à concentration de substrat constante. L’activateur favorise sa propre fixation sur la forme R, tandis que l’inhibiteur favorise sa propre fixation sur la forme T. C’est une façon de mettre en évidence le caractère allostérique des enzymes du système V. 52 Classe Action 1 Oxydo-réductases Transfert d’électrons 2 Transférases Transfert de groupes chimiques 3 Hydrolases Réaction d’hydrolyse : transfert de groupes fonctionnels à l’eau 4 Lyases Addition de groupes sur double liaison ou formation de double liaison par soustraction de groupe 5 Isomérases Transfert de groupes à l’intérieur d ’une molécule pour former un isomère 6 Ligases Formation de liaison C-C, C-S, C-O ou C-N par réaction de condensation. Nécessite la fourniture d’énergie (ATP). 53 G.T. Nomenclature Nom : nom du substrat + ase Ex.: saccharase (← saccharose) ou… nom du substrat et de la transformation réalisée Ex. : lactate déshydrogénase ( lactate pyruvate) Numéro matricule (EC) à 4 chiffres : Ex.: chymotrypsine = EC 3.4.4.5 3 (hydrolase) - 4 (hydrolyse de peptide) - 4 (protéase à sérine) - 5 (chymotrypsine) X - X - X - X Réaction chimique classe Sous classe Caractéristique de l’enzyme 54 G.T.