enzyme

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UNE FONCTION MAJEURE DES PROTEINES : LA CATALYSE ENZYMATIQUE
I.
INTRODUCTION
II.
PROPRIETES GENERALES DES ENZYMES
III.
COFACTEURS
1°) INORGANIQUES (IONS)
2°) ORGANIQUES (COENZYMES)
A) « LIBRES »
B) GROUPEMENTS PROSTHETIQUES
IV.
SITE ACTIF
1°) PROPRIETES GENERALES
2°) INHIBITION PAR EXCES DE SUBSTRAT
V.
CINETIQUE ENZYMATIQUE MICHAELIENNE
1°) V FONCTION DE S, EQUATION DE MICHAELIS-MENTEN
2°) V FONCTION DE E
3°) REPRESENTATION de LINEWEAVER et BURK
1
+
3HN-CH-CO-NH-CH-COO
R1
+H
3N
+
R2 acide chlorhydrique 6 N
110°C
H2O
16-96 heures
vide
ou
atmosphère
d’azote
COO
C
H
R1 COO
+H N
C
3
R2
Nécessité de
fournir une
H énergie
importante
2
INSULINE
spécifique des protéines synthétisées dans le RE
Pré-proinsuline
COO-
RE
séquence signal
+
3H N
précurseur de la proinsuline (préproinsuline)
séquence
signal
Proinsuline
(produit de sécrétion
immature)
15’
clivage
protéolytique
vésicules de sécrétion
lisses (endopeptidases)
proinsuline
peptide C
21 aa
60’
insuline
30 aa
Insuline
(produit de sécrétion
mature)
Insuline : hormone peptidique, 2 chaînes (A : 21 aa ; B : 30 aa), PM = 5700, agit
par l’intermédiaire d’un récepteur
3
Les réactions sont catalysées :
l’énergie nécessaire pour les
déclencher est beaucoup plus
faible qu’en l’absence de
catalyseur.
4
catalyseur : une ou un enzyme
Enzym, en- , zumé « levain » : dans le ferment (XIXe)
protéines
(ribozymes)
agissent à très faible concentration
sont inchangés à la fin de la réaction
n’affectent pas l’équilibre d’une réaction réversible
mais augmentent la vitesse à laquelle l’équilibre
est atteint, i.e. augmentent la vitesse de réaction
5
Un catalyseur (un enzyme) agit exclusivement sur la
vitesse et non sur l’équilibre d’une réaction.
A
B
Un catalyseur (K)
[un enzyme]
diminue l’énergie
d’activation d’une
réaction en
permettant la
formation d’un ou
de plusieurs
intermédiaires
dont l’énergie
d’activation est
plus basse.
6
Les enzymes sont plus efficaces que les
catalyseurs non organiques
limaille de fer
plusieurs tonnes
2 H2O2
1 mg de fer
catalase
2 H2O + O2
La partie protéique
de la catalase,
l’hème et les
structures associées
augmentent
considérablement le
pouvoir catalytique
du fer
7
é
A. R.
Cofacteurs :
inorganiques (ions)
organiques (coenzymes)
8
A. R.
Cofacteurs : ions inorganiques, molécules organiques
(coenzymes)
La synthèse naturelle des coenzymes ne peut être
faite que par des cellules vivantes. Lorsque cette
synthèse n’est pas inscrite dans le patrimoine
génétique d’une espèce, alors tout ou partie de la
molécule du coenzyme doit être apporté à cette
espèce par son alimentation : cet aliment
9
indispensable s’appelle une vitamine.
Enzyme
Type
Cofacteurs
Subtilisine
(protéase)
Hydrolase
aucun
Glucose isomérase
Isomérase
Co2+, Mg2+ ion
ß-galactosidase
Hydrolase
Na+, K+
ion
Acide lactique
déshydrogénase
Oxydoréductase
NAD+
coenzyme
« libre »
Glucose oxydase
Oxydoréductase
FAD
coenzyme :
« groupement
prosthétique »
ion
Fe
Peroxydase
Oxydoréductase
Nom
Hème (Fe2+) groupement
10
prosthétique
catalyseur : une ou un enzyme
agit à très faible concentration
est inchangé à la fin de la réaction
n’affecte pas l’équilibre d’une réaction réversible
augmente la vitesse à laquelle l’équilibre est
atteint, i.e. augmente la vitesse de réaction
présente une grande spécificité
son activité est régulable
11
Les enzymes ont une grande
spécificité : ils catalysent une
réaction chimique donnée à partir
d’un substrat défini.
A. R.12
13
A. R.
14
A. R.
15
A. R.
Les enzymes sont spécifiques du/des substrat(s) et du type de réaction
La spécificité d’une réaction enzymatique est liée à l’adéquation entre la structure
du/des substrat(s) et la structure de l ’enzyme
Chymotrypsine en présence
d’un peptide substrat
Dihydrofolate réductase en
présence de ses deux substrats
On appelle site actif de l’enzyme, la partie de la protéine capable de reconnaître
et de transformer le/les substrats.
16
G.T.
Changement conformationnel et flexibilité
L’hexokinase catalyse la réaction : glucose + ATP Æ glucose-6-P
C’est une étape clé du métabolisme des glucides
La fixation de glucose entraîne une modification conformationnelle
indispensable à la mise en oeuvre de la catalyse
Conformation ouverte
Glucose non fixé sur son
site
Pas de catalyse
Conformation fermée
Glucose fixé sur son site
Catalyse
Le passage de la
conformation ouverte à la
conformation fermée
implique des déplacements
de plusieurs Angströms
17
G.T.
Inhibition par excès de substrat (ESS)
18
k 1 et k –1 sont les
constantes de vitesse
d’association et de
dissociation du complexe ES
k
E
+
S
k
k
1
ES
-1
cat
E
+
P
k cat est la constante catalytique,
c’est-à-dire la constante de
vitesse de la réaction
enzymatique
où E = Enzyme, S = substrat,
ES = complexe enzyme-substrat, P = produit
19
k 1 et k –1 sont les
constantes de vitesse
d’association et de
dissociation du complexe ES
k
E
+
S
k
k
1
ES
-1
cat
E
+
P
k cat est la constante catalytique,
c’est-à-dire la constante de
vitesse de la réaction
enzymatique
y = a.x / b + x
où a et b sont des
constantes
v = a.[S] / b + [S]
v = Vmax .[S] / KM + [S]
Vo = Vmax
[S]
KM + [S]
équation de Michaelis-Menten
KM : constante de
20
Michaelis
Influence de la concentration en substrat : l’équation de Michaelis-Menten
Courbe correspondant à l’équation de MichaelisMenten :
V0 = Vmax
[S]
KM + [S]
Cette courbe indique :
* que la réaction enzymatique suit une
hyperbole.
* que la réaction enzymatique est saturable.
* qu’il existe une valeur particulière Vmax/2
qui permet de mesurer KM.
KM est une constante fondamentale pour les enzymes. Selon le mécanisme précis
de la réaction, KM est une fonction complexe des constantes k 1, k –1 et k cat.
Dans la plupart des cas, KM est un index de l’affinité de l’enzyme pour son
substrat.
Plus KM est petit, plus l’affinité est grande et inversement. Les valeurs courantes
21
de KM s’échelonnent entre 10-1 et 10-7 M.
G.T.
Influence de la concentration en enzyme
La mesure de l’activité enzymatique en présence de concentrations croissantes
d’enzyme, et dans certaines conditions, montre que V et Vmax varient
linéairement avec [E].
S
E
P
22
23
A. R.
La transformation de l’équation de Michaelis-Menten proposée par Lineweaver et Burk consiste à
prendre les inverses de ses 2 membres. En effectuant quelques opérations mathématiques
simples, l’équation devient celle d’une fonction linéaire de type y = a.x + b.
1
V0
=
KM
Vmax [S]
+
24
1
Vmax
l’activité des enzymes est régulable
la majorité des réactions sont
catalysées par des enzymes
les réactions sont régulées
25
contrôle de l’activité enzymatique
L’activité des enzymes peut être contrôlée par de nombreux processus :
1. L’activité des enzymes dépend de leur concentration et de leur
localisation dans la cellule, ou dans l’espace extracellulaire ; i.e. fonction de
la synthèse et de la dégradation des enzymes, de leur trafic intracellulaire
et/ou de leur sécrétion.
2. L’activité des enzymes dépend de leur environnement : pH, température,
cofacteurs (ions, coenzymes), concentration de substrat (cinétique +
inhibition par excès de substrat).
3. L’activité des enzymes peut être contrôlée de manière réversible par
modification covalente.
4. L’activité des enzymes peut être contrôlée de manière irréversible par
protéolyse ménagée.
5. L’activité des enzymes peut être contrôlée par des agents modulateurs
(inhibiteurs, activateurs) agissant par divers mécanismes.
6. Plusieurs modes de contrôle peuvent être associés.
26
UNE FONCTION MAJEURE DES PROTEINES : LA CATALYSE ENZYMATIQUE
VI.
CONTROLE DE L’ACTIVITE DES ENZYMES
1°) GENERALITES
2°) ROLE DU pH
3°) ROLE DE LA TEMPERATURE
4°) MODIFICATIONS COVALENTES
A) REVERSIBLES :
PHOSPHORYLATION/DEPHOSPHORYLATION
B) IRREVERSIBLES : PROTEOLYSE MENAGEE
5°) ROLE DES AGENTS MODULATEURS
VII.
LES AGENTS MODULATEURS DE L’ACTIVITE DES ENZYMES
1°) INHIBITEURS
A) IRREVERSIBLES - EXEMPLE : ASPIRINE
B) REVERSIBLES
27
Influence du pH
Les enzymes sont des protéines. Elles sont sensibles aux variations du pH du
milieu. De fait, quand le pH change, l’état d’ionisation des groupements chargés,
aussi bien dans le site actif de l’enzyme (en fonction du pKa propre à chaque
résidu chargé participant à la constitution du site actif), que dans le substrat,
varie. L’activité enzymatique dépend du pH et cette dépendance est spécifique à
chaque enzyme.
acétylcholinestérase
vitesse initiale, V0
pepsine
chymotrypsine
28
Influence de la température
Les effets de la température sur l’activité d’une enzyme sont complexes, et peuvent être considérés
comme le résultat de l’action de 2 forces agissant simultanément mais dans des sens opposés.
1.
Quand la température augmente, la vitesse de réaction augmente.
2.
Quand la température augmente, il se produit une inactivation (« dénaturation ») progressive
de la protéine enzymatique, de telle sorte qu’il existe une température optimale apparente.
29
Influence de la température
La température à laquelle la dénaturation devient un facteur important varie d’une enzyme à l’autre.
Généralement, la dénaturation est négligeable en dessous de 30°C et commence à être appréciable
au-delà de 40°C. Quelques enzymes gardent une activité importante à des températures bien
supérieures à 40°C, par exemple les enzymes des bactéries thermophiles. Cette propriété a des
applications pratiques importantes.
30
contrôle de l’activité enzymatique par modification covalente réversible
Parmi les modifications covalentes possibles, la phosphorylation est l’une des plus fréquentes.
Elle permet temporairement soit l’activation soit l’inhibition de l’enzyme, le plus souvent en
réponse à un signal extracellulaire.
La phosphorylation se produit le plus souvent
sur un résidu sérine ou thréonine. Un type
particulier de phosphorylation concerne les
résidus tyrosine.
signal
extracellulaire
A
signal
extracellulaire
B
Elle met en jeu des kinases (addition de
phosphate) ou des phosphatases (suppression
de phosphate)
31
G.T.
contrôle de l’activité enzymatique par protéolyse ménagée
La protéolyse ménagée est un mode d’activation courant des
enzymes en particulier les enzymes digestives et les enzymes
de la cascade de la coagulation du sang.
On appelle zymogène le précurseur inactif d’une enzyme activée
par protéolyse.
Il existe plusieurs modalités d’activation par protéolyse.
Exemple de la chymotrypsine
Chymotrypsininogène
(inactif)
Trypsine
Chymotrypsine
A
B
C
Chymotrypsine π
(active)
Chymotrypsine α
(active)
32
G.T.
Inhibiteurs
Il existe deux grandes classes d’inhibiteurs : les inhibiteurs irréversibles et
les inhibiteurs réversibles.
inhibiteurs
irréversibles
Exemple :
aspirine
Cyclooxygénases
(COX)
AINS : antiinflammatoires
non-stéroïdiens
33
34
- effets divers sur la fonction cardiovasculaire
- l’aspirine à faible dose est un traitement préventif secondaire efficace de
l’infarctus du myocarde et de l’ischémie cérébrale
-capacité limitée des plaquettes (anuclées) à régénérer des protéines :
cible particulière de l’aspirine
-administration chronique de faibles doses d’aspirine : réduction de la
production de leur principal produit, le thromboxane, un puissant
35
vasoconstricteur
UNE FONCTION MAJEURE DES PROTEINES : LA CATALYSE ENZYMATIQUE
VII.
LES AGENTS MODULATEURS DE L’ACTIVITE DES ENZYMES
1°) INHIBITEURS
A) IRREVERSIBLES - EXEMPLE : ASPIRINE
B) REVERSIBLES
a) COMPETITIFS
b) INCOMPETITIFS
c) NON COMPETITIFS
d) EXEMPLES
α) SULFAMIDES
ß) SILDENAFIL
2°) ACTIVATEURS
VIII. LES ENZYMES ALLOSTERIQUES
1°) PROPRIETES GENERALES
2°) RETROCONTROLE, EFFET HOMOTROPE, EFFET HETEROTROPE
3°) CINETIQUE
A) SYSTEME K
B) SYSTEME V
IX. CLASSIFICATION DES ENZYMES
36
inhibiteurs
Il existe deux grandes classes d’inhibiteurs : les inhibiteurs irréversibles et les inhibiteurs
réversibles.
Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent
par leur mécanisme d’action : inhibition compétitive, incompétitive, et non
compétitive.
Inhibiteur compétitif
S
Ic
ES
EI
E+S
ES
E+P
+
Ic
KI
EI
G.T.
37
Inhibiteur compétitif
[I]
38
G.T.
Il existe deux grandes classes d’inhibiteurs : les inhibiteurs irréversibles et les inhibiteurs
réversibles.
Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent
par leur mécanisme d’action : inhibition compétitive, incompétitive, et non
compétitive.
Inhibiteur incompétitif
S
ES
Iic
ESI
E+S
ES
E+P
+
Iic
K
’I
ESI
39
G.T.
Inhibiteur incompétitif
[I]
40
G.T.
Il existe deux grandes classes d’inhibiteurs : les inhibiteurs irréversibles et les inhibiteurs
réversibles.
Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent
par leur mécanisme d’action : inhibition compétitive, incompétitive, et non
compétitive.
Inhibiteur non compétitif
S
ES
Inc
EI
ESI
E+S
ES
+
+
Inc
Inc
KI
EI+ S
ESI
E+P
K
’I
G.T.
41
Inhibiteur non compétitif
[I]
42
G.T.
43
44
45
enzymes allostériques
Les enzymes allostériques sont des protéines allostériques
(cf. hémoglobine) et en partagent les caractéristiques.
Les enzymes allostériques font intervenir une liaison
réversible, non covalente, d’une molécule régulatrice
appelée modulateur allostérique.
Le terme allostérique vient du grec allos, autre, et
stereos, forme. Les enzymes allostériques prennent une
autre forme (une autre conformation) à la suite de la
liaison du modulateur.
Ce sont des protéines complexes possédant généralement
plusieurs sous-unités. Il existe au moins un site de
fixation pour le substrat (site actif, catalytique) et au
moins un site de fixation (spécifique) pour un modulateur
(site régulateur). Dans certains cas, le site régulateur et
le site actif sont sur des sous-unités différentes.
46
enzymes allostériques
Dans certains systèmes multi-enzymatiques, l’enzyme régulateur est inhibé de
façon spécifique par le produit terminal de la voie métabolique, chaque fois qu’il
se trouve en excès par rapport aux besoins. Ce type de régulation est appelée
rétrocontrôle (inhibition par « feed-back »).
Les modulateurs des enzymes allostériques peuvent être des inhibiteurs ou au
contraire des activateurs. Le substrat lui-même est souvent un activateur.
Quand le substrat et le modulateur sont les mêmes, on parle d’effet
homotrope. Quand le modulateur est une molécule différente du substrat,
l’effet est dit hétérotrope.
Très souvent les enzymes allostériques se placent à une étape clé d’une chaîne
métabolique. Dans cet exemple théorique, A le substrat de E1 enzyme clé,
allostérique, est un modulateur positif (= activateur allostérique, il active
l’enzyme) et G, le produit final est un modulateur négatif (= inhibiteur
allostérique, il inhibe l’enzyme).
A
X
E1
B
E2
C
E3
D
E4
E
E5
F
E6
G
47
tissus
1,0
poumons
Saturation (Y)
v
v max
0,5
v max/2
P50 =
26
0,0
0
20
40
60
80
100
K1/2
[S]
Pression partielle en oxygène, pO2 (en torr)
Ces courbes traduisent des interactions
coopératives entre plusieurs sous-unités
48
49
ENZYME ALLOSTERIQUE DU SYSTEME K
T
R
"inactive"
"active"
v
v max
Effet coopératif homotrope positif
v max/2
K 1 /2
[S]
S+A
S
v
Les enzymes allostériques permettent
une réponse rapide et fine aux variations
des conditions intracellulaires
en présence d’effecteurs
Vmax = constante
K1/2 varie
v max
v max/2
Effet hétérotrope
S+I
50
K 1 /2
[S]
J.J.B.
ENZYME ALLOSTERIQUE DU SYSTEME V
Le substrat ne modifie pas sa propre fixation : hyperbole
Activateur et inhibiteur modifient la vitesse sans modifier K1/2
v max
v max/2
K1/2
[S]
51
v
v
[A]
[I]
Dans les 2 systèmes (K et V), on met en évidence l’effet coopératif des
effecteurs (activateur : A ; inhibiteur : I) en faisant varier leur
concentration à concentration de substrat constante.
L’activateur favorise sa propre fixation sur la forme R, tandis que
l’inhibiteur favorise sa propre fixation sur la forme T.
C’est une façon de mettre en évidence le caractère allostérique des
enzymes du système V.
52
Classe
Action
1
Oxydo-réductases
Transfert d’électrons
2
Transférases
Transfert de groupes chimiques
3
Hydrolases
Réaction d’hydrolyse : transfert de groupes fonctionnels à l’eau
4
Lyases
Addition de groupes sur double liaison ou
formation de double liaison par soustraction de groupe
5
Isomérases
Transfert de groupes à l’intérieur d ’une molécule
pour former un isomère
6
Ligases
Formation de liaison C-C, C-S, C-O ou C-N par réaction de
condensation. Nécessite la fourniture d’énergie (ATP).
53
G.T.
Nomenclature
Nom : nom du substrat + ase
Ex.: saccharase (← saccharose)
ou… nom du substrat et de la transformation réalisée
Ex. : lactate déshydrogénase ( lactate
pyruvate)
Numéro matricule (EC) à 4 chiffres :
Ex.: chymotrypsine = EC 3.4.4.5
3 (hydrolase) - 4 (hydrolyse de peptide) - 4 (protéase à sérine) - 5
(chymotrypsine)
X - X - X - X
Réaction
chimique
classe
Sous
classe
Caractéristique
de l’enzyme
54
G.T.
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