DEMARCHE DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

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TD-ED DCEM 1 Bactériologie B. Berçot, C. Branger
Propriété de la Faculté de Médecine Université Paris 7-Denis Diderot
Démarche du diagnostic bactériologique
II. COMMENT FAIT-ON LE DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION BACTERIENNE ?
Le diagnostic bactériologique est un ensemble de moyens permettant de confirmer
telle ou telle étiologie infectieuse d'origine bactérienne.
Ces moyens diagnostiques sont variés et caractérisent soit le diagnostic direct soit
celui indirect :
DIAGNOSTIC DIRECT : mise en évidence de la bactérie elle-même, donc finalement
de sa culture ou isolement qui permettra l'identification ultérieure ainsi que de
préciser sa sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme).
Ceci n’est pas toujours possible soit :
-
L’agent a disparu avant ou peu après l’apparition des symptômes (ex :
Rhumatisme articulaire aigu , brucellose) ou a la suite d’un traitement antibiotique
trop hâtif.
-
La bactérie de culture impossible, ex : agent de la syphilis (tréponème)
-
La bactérie est de culture très lente ou nécessite des milieux de culture
spéciaux. Isolement fait par des laboratoires spécialisés (ex : agent de
pneumopathie atypiques : chlamydiae, mycoplasmes).
On a donc recourt à d'autres moyens de diagnostic direct : recherche d’Ag bactérien
ou mise en évidence de séquences d'ADN spécifiques de bactéries.
DIAGNOSTIC INDIRECT : mise en évidence de la réponse de l'organisme à
l'infection par la présence d'anticorps spécifiques, le plus souvent sériques ou plus
rarement par une réponse d’hypersensibilité, dite allergique.
RETENIR : Le diagnostic direct est le seul diagnostic de certitude, car
il permet la mise en évidence de la bactérie elle-même, donc finalement sa culture
ou isolement qui permettra l'identification ultérieure mais aussi de préciser sa
sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme).
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DEMARCHE DIAGNOSTIQUE BACTERIOLOGIQUE DIRECT
(cf.poly)
• Site
• Mode
• Transport
PRELEVEMENT
EXAMEN BACTERIOLOGIQUE
• Aspect macroscopique
JO
• Examen microscopique
- cytologie → appréciation de la
présence de polynucléaires
- coloration → mise en évidence de la
présence de bactéries
• Diagnostic moléculaire direct : PCR, sonde
• Mise en culture : → choix des milieux de culture spécifiques
→ incubation * température
* atmosphère
* durée
• Résultats des cultures
- si culture positive
J1
→ identification
→ antibiogramme
- si culture négative → prolongation de l'incubation
• Résultats de l'identification et de l'antibiogramme
J2
• Typage selon indication :
sérotype, technique moléculaire
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1/ LE PRELEVEMENT : 1ERE ETAPE DU DIAGNOSTIC
Les résultats des examens bactériologiques dépendent pour une grande part
des conditions de prélèvements et de transport.
• VARIE SELON LE SIEGE DE L’INFECTION ET LE GERME QUE L’ON COMPTE ISOLER
Méningite
Diarrhée
PL (LCR)
+
hémoculture
(sang)
Coproculture
(selles)
Infection urinaire
ECBU
Pneumonie
expectoration ou
prélèvement
bronchique +
hémocultures
• DOIT ETRE EFFECTUE AVEC DU MATERIEL STERILE A USAGE UNIQUE (RECIPIENT
STERILE OU ECOUVILLON) EN RESPECTANT LES REGLES D’ASEPSIE
ELEMENTAIRES :
Toute contamination du produit peut entraîner des causes d’erreur dans
l’interprétation du résultat.
Contamination par les flores :
Penser que la peau, les muqueuses, les cavités naturelles oropharyngées,
digestives, vaginales sont le siège d’une flore commensale (cf. poly et cours sur
flore commensale) qui vont contaminer le prélèvement. (ex de la gélose ensemencée
avec gorge)
ex : urines
Contaminations par l’environnement :
Penser que dans l’environnement il y a des bactéries et spores (eau, terre,
poussière)
ex : gélose ouverte en début de cours
•
DOIT ETRE EFFECTUE AU MOMENT OPPORTUN :
-
•
Précocement
Avant toute antibiothérapie.
DOIT ETRE TRANSPORTE RAPIDEMENT ⇒ ENSEMENCEMENT RAPIDE
Certains germes ne résistent pas ou se multiplient
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2/ L’EXAMEN BACTERIOLOGIQUE A J0
Infection bactérienne
la présence de bactéries
de signes biologiques liés à l'inflammation : leucocytes
polynucléaires
2.1. ETUDE MACROSCOPIQUE DU PRELEVEMENT :
Trouble : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire
Hématurique : urine, LCR, liquide ou autre coloration anormale pleural
ou articulaire
o Odeur : on notera celle caractéristique lors d'infections à germes
anaérobies stricts dans un liquide pleural
o Consistance : Exemple d'une selle diarrhéique
o
o
2.2 ETUDE MICROSCOPIQUE DU PRELEVEMENT
aucune anomalie macroscopique visible
nécessité de rechercher des bactéries et des éléments
cellulaires de type polynucléaire au microscope optique
ETAT FRAIS :
1. compte des cellules en Malassez
(microscope optique X40)
2. visualisation de la mobilité des bactéries
(microscope optique X40)
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COLORATION DE GRAM : microscope optique à immersion (X100)
Coloration basée sur la perméabilité de la paroi des bactéries à l’alcool.
- 1er temps : cristal violet + lugol
⇒ complexe colorant soluble dans l’alcool qui colore en violet le cytoplasme
de toutes les bactéries.
- 2e temps : décoloration par l’alcool
⇒ l’alcool traverse la paroi des bactéries dites à Gram négatif et dissout le
complexe colorant (bactéries décolorées).
⇒ bactéries à Gram positif : la paroi ne se laisse pas traverser par l’alcool
(bactéries restent colorées en violet): bactéries dites à Gram positif.
- 3e temps : contre coloration par de la fushine (rose) : les bactéries
décolorées apparaissent rose ⇒ on les dit à Gram négatif .
Retenir : La coloration de Gram ne permet pas une identification
mais une orientation (17-19)
Renseigne sur
Ex :
la présence (ou absence) de bactéries
leur forme (cocci ou bacille, cocobacille, fusiforme)
leur groupement (amas, chaînettes, diplocoques)
leur gram (+ ou -) voir tableau à la fin du poly ⇒
très utile car oriente l’antibiothérapie.
Pus : ⇒ orientation vers un Staphylocoque.
Leucocytes
Coccis à Gram positif
en amas
Hématies
Ex : Méningite : ⇒ orientation vers un méningocoque : atb approprié.
Diplocoques à Gram
négatif
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AUTRES COLORATIONS (certaines bactéries ne se colorent pas avec la
coloration de Gram)
Ziehl-Neelsen pour les mycobactéries : coloration des bacilles acidoalcoolo-résistants
2.3/ AUTRES METHODES UTILISEES : en développement+++
Recherche du pathogène dans le prélèvement (on détecte une de ses
caractéristiques)
* Méthodes immunologiques
Ex : Détection de l’antigène soluble pneumococcique dans le LCR
rapide 30min (méthode immunochromatographique sur membrane)
écouvillon
spécifique
négatif
Echantillon de
Contrôle
LCR
15 min
membrane revêtue d’Ac de
lapin spécifique de l’Ag
soluble de S. pneumoniae
positif
* Méthodes moléculaires
PCR : décrite en 1983 par Kary Mullis
L’amplification génique multiplie de manière exponentielle un ADN cible
ADN (pg) 10-12
1 copie
non détectable
ADN (µg) 10-6
1 milliard de copies
détectable
2(cycles)
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La PCR (réaction de polymération en chaine)
- multiplie spécifiquement l’ADN cible
- le nombre de copies croît de manière exponentielle avec le nombre de
réplications effectuées (30 à 35 cycles)
Applications :
bactéries non cultivables
bactéries de culture lente et difficile
détection rapide en urgence d’un pathogène
amélioration de délai diagnostic (mycobactéries)
Inconvénient : encore cher en bactériologie et pas développé pour l’ensemble des
applications.
2.4/ LA MISE EN CULTURE DU PRELEVEMENT :
Retenir : La culture est l’examen principal, reste la référence en bactériologie,
nécessite au minimum 24h, couramment quelques jours parfois 3 mois.
Le prélèvement est ensemencé sur différents milieux choisis en fonction du
pathogène recherché :
Simples
Enrichis
bactéries exigeantes
ex : méningocoque
Sélectifs
bactérie à isoler au
sein d’une flore
commensale
Isolement des bactéries : ⇒ milieux solides étalement et isolement en stries (voir
poly) pour étaler les bactéries et les isoler les unes des autres. les bactéries se
multiplient et donne une colonie visible à l’œil nu au bout de 18 à 24h ou plus.
1
2
3
⇒ Etuve à 37°C
⇒ Atmosphère : aérobie, anaérobie, CO2
4
Colonies
isolées
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2.5/ SYNTHESE POUR LE CLINICIEN :
Retenir : signes inflammation+détection bactérie+tests diagnostic rapide permettent
une orientation clinique
Mise en place d’une antibiothérapie probabiliste
3/ L’EXAMEN BACTERIOLOGIQUE A J1
J1 (à J5)
Lecture des milieux de culture
L’isolement sur milieu solide permet d’obtenir des colonies séparées.
3 .1 IDENTIFICATION D’UN PATHOGENE :
L’interprétation d’une culture positive se fait en fonction du site de prélèvement et du
contexte clinique.
Responsabilité du bactériologiste
distinguer un pathogène au sein d’un flore
incriminer une bactérie dite commensale comme responsable de
l’infection (terrain particulier)
Quantification du pathogène
ex : urines
3.2 IDENTIFICATION DE LA BACTERIE RESPONSABLE DE L’INFECTION
Orientation diagnostic :
- Coloration de Gram sur une ou des colonies (confirme ex direct) : forme,
groupement coloration + ou - présence d’une capsule ou non, de spore.
- Aspect des colonies en culture :
grosses petites, muqueuses, sèches,
hémolyse sur gélose au sang, pigmentation
odeur particulière
caractères culturaux (pousse en atmosphère anaérobie, sous
CO2) sur milieu enrichi uniquement.
- Tests biochimiques simples sur les colonies :
Les bactéries possèdent un équipement enzymatique que l’on utilise pour les
identifier
Ex : certaines bactéries possèdent une catalase d’autre non : enzyme qui
décompose l’H2O2 en H2O et oxygène libre (une goutte de H2O2 + une colonie =
apparition de bulles). Ex p 17
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- Mise en évidence de constituants antigéniques :
avec des sérums spécifiques dirigés contre la paroi
Ex : méningocoque (type C, virulent)
But de cette première analyse ⇒ résultat au clinicien, permet d’orienter l’étiologie de
l’infection et le traitement.
Galerie d’identification :
Evolution avec les années mais reste la référence
Pourrait être progressivement remplacé
par des identifications génomiques
Contient des tests plus lents (résultat en 4h à 24h) basés sur l’étude de la
fermentation de sucres et des caractères enzymatiques.
Une colonie
Inoculation
des
cupules
incubation
10
3.3 REALISATION D’UN ANTIBIOGRAMME
But : Tester la bactérie vis a vis d’un panel d’antibiotiques pour déterminer les
sensibilités aux antibiotiques à partir d’une colonie, résultat en 4h à 24h.
Méthode manuelle la plus utilisée :
méthode de diffusion en gélose
inoculum 106 bactéries /ml
gélose standardisée (Mueller Hinton)
disque de papier (antibiotique)
Avantages :
Simple, compatible avec routine, test de nombreux antibiotiques
sur une seule boite de gélose
Une colonie suspension
10 ml H2O bactérienne
1
2
inoculer gélose
3
4
Incubation
étuve
Dépôt des disques
imprégnés
d’antibiotiques
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4/ L’examen bactériologique à J2
Retenir : Résultats de l’identification et de l’antibiogramme en un minimum de 48 h
Intérêt de l’utilisation de tests rapides d’identification et l’utilisation
d’antibiothérapie probabiliste dans les infections graves à pronostic vital
4.1 Lecture des galeries d’identification
Notification des réactions positives et négatives
Code d’identification
Banques de données
Nom de la bactérie
NB : Il suffit d’intégrer cette démarche pour identifier la plupart des pathogènes.
Même logique pour l’identification à partir à d’autres critères (ADN)
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4.2 Lecture de l’antibiogramme
Après une incubation à 37°C, le diamètre d ’inhibition de l’antibiotique entourant les
disques permet de calculer la CMI de l ’antibiotique pour la souche examinée en
rapportant ce diamètre à une courbe de concordance.
Culture au
contact du
disque
Diamètre
d’inhibition
(absence de
culture autour du
disque)
diamètre (en mm)
--- pénicilline G
30
Diamètre observé
20
10
0
0.25
c
CMI
calculée
16
C
Courbe de concordance
CMI(en mg/l)
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L’intérêt de l’antibiogramme est de permettre de comparer la CMI d’un antibiotique
donné à celle de 2 concentrations critiques c et C proposées par le comité d’expert
du Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie.
Ces 2 concentrations permettent de catégoriser la souche à étudier en S, R ou I en
confrontant la CMI d’un antibiotique donné à celle de c et C.
4.3/ Retour des résultats aux cliniciens
Liaison clinique : essentielle
Renseignements cliniques : indispensables pour orienter les recherches
bactériologiques. Car dans le laboratoire, il n’existe pas une méthode seule qui
permette d’isoler tous les germes (voir généralités du cours).
Retour des résultats au clinicien ⇒ réorientation diagnostic et thérapeutique
A 48h : Rediscutions de l’antibiothérapie probabiliste
Références
http://www.microbes-edu.com
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DEMARCHE DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE INDIRECT
But : Détection d’anticorps spécifiques d’une pathologie donnée
Diagnostic d’infection bactérienne pourra se faire par l’ascension des Ac dirigés
contre la bactérie. Classiquement la production d'IgM caractérise une infection
primaire (ne persistent pas).
Indications : le diagnostic d’infection due à une bactérie de croissance difficile ou
impossible (Syphilis, rickettsiose, leptospirose, maladie de lyme…)
Tester 2 sérums à 15 jours d’intervalle.
Interprétation peut être délicate en raison de :
- Infection antérieure cicatrices sérologiques
- Vaccination
- Réaction croisée avec antigènes voisins d’une autre bactérie : fausse
positivité
Sérodiagnostic est tardif ne peut se substituer au diagnostic direct : méthode
complémentaire