Diagnostic bactériologique : démarche et méthodes

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TD-ED DCEM 1 Bactériologie B. Berçot, C. Branger
Propriété de la Faculté de Médecine Université Paris 7-Denis Diderot
Démarche du diagnostic bactériologique
II. COMMENT FAIT-ON LE DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION BACTERIENNE ?
Le diagnostic bactériologique est un ensemble de moyens permettant de confirmer
telle ou telle étiologie infectieuse d'origine bactérienne.
Ces moyens diagnostiques sont variés et caractérisent soit le diagnostic direct soit
celui indirect :
DIAGNOSTIC DIRECT : mise en évidence de la bactérie elle-même, donc finalement
de sa culture ou isolement qui permettra l'identification ultérieure ainsi que de
préciser sa sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme).
Ceci n’est pas toujours possible soit :
- L’agent a disparu avant ou peu après l’apparition des symptômes (ex :
Rhumatisme articulaire aigu , brucellose) ou a la suite d’un traitement antibiotique
trop hâtif.
- La bactérie de culture impossible, ex : agent de la syphilis (tréponème)
- La bactérie est de culture très lente ou nécessite des milieux de culture
spéciaux. Isolement fait par des laboratoires spécialisés (ex : agent de
pneumopathie atypiques : chlamydiae, mycoplasmes).
On a donc recourt à d'autres moyens de diagnostic direct : recherche d’Ag bactérien
ou mise en évidence de séquences d'ADN spécifiques de bactéries.
DIAGNOSTIC INDIRECT : mise en évidence de la réponse de l'organisme à
l'infection par la présence d'anticorps spécifiques, le plus souvent sériques ou plus
rarement par une réponse d’hypersensibilité, dite allergique.
RETENIR : Le diagnostic direct est le seul diagnostic de certitude, car
il permet la mise en évidence de la bactérie elle-même, donc finalement sa culture
ou isolement qui permettra l'identification ultérieure mais aussi de préciser sa
sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme).

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DEMARCHE DIAGNOSTIQUE BACTERIOLOGIQUE DIRECT
(cf.poly)
PRELEVEMENT • Site
• Mode
• Transport
EXAMEN BACTERIOLOGIQUE
• Aspect macroscopique
JO • Examen microscopique - cytologie → appréciation de la
présence de polynucléaires
- coloration → mise en évidence de la
présence de bactéries
• Diagnostic moléculaire direct : PCR, sonde
• Mise en culture : → choix des milieux de culture spécifiques
→ incubation * température
* atmosphère
* durée
• Résultats des cultures
- si culture positive → identification
J1 → antibiogramme
- si culture négative → prolongation de l'incubation
• Résultats de l'identification et de l'antibiogramme
J2 • Typage selon indication : sérotype, technique moléculaire

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1/ LE PRELEVEMENT : 1ERE ETAPE DU DIAGNOSTIC
Les résultats des examens bactériologiques dépendent pour une grande part
des conditions de prélèvements et de transport.
• VARIE SELON LE SIEGE DE L’INFECTION ET LE GERME QUE L’ON COMPTE ISOLER
Méningite Diarrhée Infection urinaire Pneumonie
PL (LCR)
+
hémoculture
(
san
g)
Coproculture
(selles) ECBU
expectoration ou
prélèvement
bronchique +
hémocultures
• DOIT ETRE EFFECTUE AVEC DU MATERIEL STERILE A USAGE UNIQUE (RECIPIENT
STERILE OU ECOUVILLON) EN RESPECTANT LES REGLES D’ASEPSIE
ELEMENTAIRES :
Toute contamination du produit peut entraîner des causes d’erreur dans
l’interprétation du résultat.
 Contamination par les flores :
Penser que la peau, les muqueuses, les cavités naturelles oropharyngées,
digestives, vaginales sont le siège d’une flore commensale (cf. poly et cours sur
flore commensale) qui vont contaminer le prélèvement. (ex de la gélose ensemencée
avec gorge)
ex : urines
 Contaminations par l’environnement :
Penser que dans l’environnement il y a des bactéries et spores (eau, terre,
poussière)
ex : gélose ouverte en début de cours
• DOIT ETRE EFFECTUE AU MOMENT OPPORTUN :
- Précocement
- Avant toute antibiothérapie.
• DOIT ETRE TRANSPORTE RAPIDEMENT ⇒ ENSEMENCEMENT RAPIDE
Certains germes ne résistent pas ou se multiplient

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2/ L’EXAMEN BACTERIOLOGIQUE A J0
Infection bactérienne  la présence de bactéries
 de signes biologiques liés à l'inflammation : leucocytes
polynucléaires
2.1. ETUDE MACROSCOPIQUE DU PRELEVEMENT :
o Trouble : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire
o Hématurique : urine, LCR, liquide ou autre coloration anormale pleural
ou articulaire
o Odeur : on notera celle caractéristique lors d'infections à germes
anaérobies stricts dans un liquide pleural
o Consistance : Exemple d'une selle diarrhéique
2.2 ETUDE MICROSCOPIQUE DU PRELEVEMENT
aucune anomalie macroscopique visible
 nécessité de rechercher des bactéries et des éléments
cellulaires de type polynucléaire au microscope optique
 ETAT FRAIS : 1. compte des cellules en Malassez
(microscope optique X40)
2. visualisation de la mobilité des bactéries
(microscope optique X40)

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 COLORATION DE GRAM : microscope optique à immersion (X100)
Coloration basée sur la perméabilité de la paroi des bactéries à l’alcool.
- 1er temps : cristal violet + lugol
⇒ complexe colorant soluble dans l’alcool qui colore en violet le cytoplasme
de toutes les bactéries.
- 2e temps : décoloration par l’alcool
⇒ l’alcool traverse la paroi des bactéries dites à Gram négatif et dissout le
complexe colorant (bactéries décolorées).
⇒ bactéries à Gram positif : la paroi ne se laisse pas traverser par l’alcool
(bactéries restent colorées en violet): bactéries dites à Gram positif.
- 3e temps : contre coloration par de la fushine (rose) : les bactéries
décolorées apparaissent rose ⇒ on les dit à Gram négatif .
Retenir : La coloration de Gram ne permet pas une identification
mais une orientation (17-19)
Renseigne sur la présence (ou absence) de bactéries
leur forme (cocci ou bacille, cocobacille, fusiforme)
leur groupement (amas, chaînettes, diplocoques)
leur gram (+ ou -) voir tableau à la fin du poly ⇒
très utile car oriente l’antibiothérapie.
Ex : Pus : ⇒ orientation vers un Staphylocoque.
Leucocytes
Hématies
Ex : Méningite : ⇒ orientation vers un méningocoque : atb approprié.
Coccis à Gram positif
en amas
Diplocoques à Gram
négatif