Laboratoire #3 - Collège Lionel

101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies Hiver 2015
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Bactériologie
L4. IDENTIFICATION BACTÉRIENNE
1. OBJECTIFS
 Identifier une bactérie inconnue à l’aide de tests
microscopiques, bactériologiques et enzymatiques.
 Déterminer sa sensibilité à divers antibiotiques par un antibiogramme.
2. INTRODUCTION
2.1. Diversité des bactéries.
Il existe des milliers d’espèces bactériennes et probablement encore plus qui ne sont pas connues. Ce
labo porte sur l’identification d’espèces fréquemment rencontrées en santé.
 On les trouve dans la flore normale humaine ou dans notre environnement immédiat.
 Elles peuvent causer des infections alimentaires ou nosocomiales (en cours de traitement médical).
2.2. Diversité des tests.
De nombreux tests et milieux de culture servent à leur identification. Cependant,
 L’interprétation d’un test n’est pas toujours très nette et repose en partie sur l’expérience.
 Les résultats ne sont pas toujours constants à 100%; une identification peut nécessiter de nombreux
tests différents (>20) afin de compenser pour certains résultats parfois contradictoires.
 L’identification repose sur un choix judicieux des tests, selon l’infection et les symptômes observés.
2.3. Types de tests.
Dans ce labo, nous utiliserons des techniques classiques répandues en microbiologie :
 Tests microscopiques. La coloration de Gram permet de différencier les parois des bactéries «Gram
+» et «Gram -» et permet d’orienter correctement le choix des autres tests.
 Tests bactériologiques et biochimiques. Ces tests varient
1o Selon leur composition
o Milieu sélectif : favorise ou inhibe la croissance de certaines bactéries.
o Milieu différentiel : distingue les bactéries qui y croissent (ex : par coloration spécifique).
2o Selon les conditions d’incubation : température variable, aérobie ou anaérobie (sans O2).
 Tests enzymatiques. Mise en évidence d’enzymes spécifiques aux bactéries recherchées.
2.4. Antibiogramme.
L’antibiogramme est un test de croissance sur gélose servant à vérifier l’efficacité d’un antibiotique.
Sécurité au laboratoire
Sarrau
Port du sarrau obligatoire.
Contamination
Bactéries : éviter de se contaminer ou de contaminer des objets ou le labo.
En cas de doute, nettoyer soigneusement.
Asepsie
Nettoyer le plan de travail et les mains avant et après le labo.
Brûleur
Surveiller les becs de gaz. Ajuster le brûleur avec soin. Attacher les cheveux.
Rappel
Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au labo.

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3. MANIPULATIONS. Consignes en démo suivant les Fiches techniques de bactériologie. [1]
3.1. Familiarisation avec les tests enzymatiques catalase et oxydase
Chaque équipe effectue les 2 tests avec chacune des bactéries fournies, de manière à observer des
résultats + et -. Noter les observations à la section des résultats.
Tests enzymatiques
Bactéries
Oxydase
Pseudomonas fluorescens
Escherichia coli
Catalase
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
3.2. Identification d’une bactérie inconnue et antibiogramme.
Chaque équipe reçoit une culture pure d’une bactérie inconnue et tente de l’identifier en suivant la
démarche proposée à l’Annexe 1. [2]
NB. Tous les tests sont effectués en équipe sauf la coloration de Gram qui est effectuée individuellement et
approuvée par le professeur avant de poursuivre l’identification.
1. Bien noter le numéro de la bactérie inconnue.
2. Effectuer une coloration de Gram (2 lames par élève, au cas où) et observer à immersion (G: 1000X).
Noter le Gram, la morphologie et les types d’arrangements observés. Faire valider par le professeur.
3. À l’aide d’une anse bactériologique stérile, ensemencer par la technique des 4 stries
 Une gélose au sang; identifier, sceller au papier Parafilm et incuber à 37oC pendant 24 hres.
 Une 1ère gélose nutritive; identifier et incuber à 37oC pendant 24 hres en anaérobie (sans Parafilm).
4. À l’aide d’un écouvillon stérile, ensemencer une 2e gélose nutritive pour réaliser un antibiogramme.
5. Selon les résultats obtenus avec la coloration de Gram, effectuer les tests d’identification suggérés à
l’Annexe 1. Faire valider vos choix par le professeur ou la technicienne.
4. MÉDIAGRAPHIE
1. Collège Lionel-Groulx, Hiver 2014. Fiches techniques de bactériologie. Microbiologie et biotechnologies
(101-NE2-LG).
2. Ikram M., (1994), Bacteriology for veterinary technicians, Amer. Vet. Pub., 150 p.

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5. RÉSULTATS NOMS : _________________________ _________________________
5.1. Tests enzymatiques sur bactéries connues.
Tests enzymatiques
Bactéries
Oxydase
Pseudomonas fluorescens
Escherichia coli
Observation : Mauve ou incolore
Interprétation : +/ -
Catalase
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Observation : Avec ou sans bulles
Interprétation : +/ -
5.2. Bactérie inconnue.
No de l’inconnue : _____
Coloration de gram
Morphologie
Arrangements
Couleur
Interprétation (+/ -)
Test enzymatique :
Observation
Interprétation (+/ -)
Gélose sélective et différentielle:
Croissance (+/-)
Observation
Interprétation (+/-)
Gélose au sang
Apparence/colonies
Hémolyse
Gélose anaérobie
Croissance (+/-)
Interprétation
CONCLUSION :
5.3. Antibiogramme.
Antibiotique
Zone d’inhibition
(mm)
Sensibilité
(résistante, limite, sensible)

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ANAÉROBIE
spécimen
nutritive
sang
grands bacilles +
coques +
arrangement petits bacilles + bacilles --
GRAM
CATALASE
+ -
S. faecalis
man+man-
Staphylococcus
aureus Staphylococcus
epidermidis
MANNITOL-SEL
BSA
hém γhém αhém β
S. pneumoniae S. agalactiae
+ -
Listeria sp.
Corynebacterium sp. Erysipelothrix sp. Actinomyces sp.
CATALASE
BACILLUS
croiss+
man -
lécit +
B. cereus
OXYDASE
+ -
Staphylococcus sp Streptococcussp
Bacillus sp
Pseudomonas sp.
ex: P. fluorescens
Enterobacteriaceae
Ex: Escherichia coli
Ex: Proteus vulgaris
TSI
Hémolyse α,β,γ
Morphologie
Des colonies
Chartres d’interpretation
Annexe 1. DÉMARCHE D’IDENTIFICATION
BACTÉRIENNE
P. Masse, modifié de Ikram M. 1994
4 stries
nutritive
ANTIBIOGRAMME
croiss±
man +
lécit -
B. subtilis
strepstaph
Hiver 2014
Tapis/écouvillon
MANNITOL-SEL
ET/OU
man-man+
4 stries
MacConkey
Lac-Lac+
Pseudomonas
Proteus E. coli
ET/OU