Corrigé ET1_2010
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BIO241 Examen terminal 1ère session (25 mai 2010) Documents et calculatrices non autorisés ATTENTION : Les parties A, B et C doivent être traitées sur des copies séparées Notation sur 100 points PARTIE A Cours de Mme C. Breton (44 points) Question 1 : les MPT 12 pts Les mécanismes de régulation de la fonction des protéines impliquent souvent des modifications post-traductionnelles (MPTs). 1/ Quelles sont les 2 grandes catégories de MPTs ? - 2 pts addition covalente de groupements plus ou moins gros clivage de la chaîne polypeptidique 2/ Dans le cas d’une modification par phosphorylation : 8,5 pts a. Quels sont les résidus d’acides aminés concernés par cette modification Ser, Thr, Tyr b. Donner la formule semi-développée d’un résidu d’acide aminé (un exemple au choix) avant et après modification 1 pt pour la sérine non modifiée 2 pts pour la serine modifiée (avec bonne indication de la charge) c. S’agissant d’une modification réversible, donner le nom des enzymes impliquées dans les réactions de phosphorylation et dé-phosphorylation Protéines kinases et phosphatases d. Quelle est l’incidence de cette modification sur la structure de la protéine Introduction d’une charge négative entrainant une modification de l’environnement protéique. Au niveau des enzymes, cela se traduit le plus souvent par un effet d’activation/inactivation de la protéine (On /Off). 3/ Donner trois autres exemples de MPTs 1,5 pts Réactions d’acylation : ex N-acétylation, N-myristoylation, Spalmitoylation, ubiquitination, Réactions d’alkylation : ex méthylation Autres exemples : glycosylation, maturation protéolytique, hydroxylation, biotinylation Question 2 : Hémoglobine 6 pts Les mobilités électrophorétiques à pH 8,6 d’une série de molécules d’hémoglobine normale et mutantes sont données ci-dessous : électrode - l a l b i k l l Hb c normale h l d électrode + m Faire correspondre les positions a, b, c et d avec les molécules Hb mutantes indiquées ci-dessous : Hbh : glycine remplacée par aspartate en position β69 Hbi : glutamate remplacé par lysine en position β6 Hbk : asparagine remplacée par lysine en position α68 Hbm : lysine remplacée par glutamate en position β95 Justifier votre réponse Réponse : a=Hbi b=Hbk c=Hbh d=Hbm Raisonnement : il fallait évaluer quelle était l’influence de la mutation sur la charge nette de la protéine par rapport à l’Hb normale Hbh : -1 Hbi : +2 Hbk : +1 Hbm : -2 Question 3 : Glycolyse 20 pts 1. Certaines réactions de la glycolyse se produisent dans des conditions d’irréversibilité thermodynamique. Indiquer lesquelles. Ecrire en détail les réactions (noms et formules semi-développées des réactants et noms des enzymes) (6 pts) 1. Glucose + ATP Glucose-6-P + ADP hexokinase (HK) 3. Fructose-6-P + ATP Fructose-1,6-bis-P + ADP Phosphofructokinase (PFK) 10. Phosphoenolpyruvate + ADP Pyruvate (Pyr) + ATP Pyruvate kinase (PK) 2. Chez l’homme, en condition anaérobie, le pyruvate subit une transformation. (7 pts) a. Donner le nom de cette transformation. Ecrire en détail la ou les réaction(s) (noms et formules semi-développées des réactants et noms des enzymes) Fermentation lactique Pyruvate + NADH,H+ lactate + NAD+ Lactate deshydrogenase (LDH) b. Dans quel(s) type(s) cellulaire(s) ou tissu(s) cette réaction a-t-elle lieu ? muscle squelettique (en activité) et GR c. Quel est l’intérêt principal de cette réaction ? régénérer le NAD+ 3. Dans le contexte de la glycolyse, quel est le point commun entre ATP, Fru2,6-bisP et citrate ? (3 pts) Ce sont des molécules qui vont moduler la vitesse de glycolyse. Ce sont plus précisément des inhibiteurs (ATP et citrate) ou des activateurs (F2,6-bisP) allostériques de la PFK 4. Lors d’un petit déjeuner, il est ingéré 17g de saccharose. Calculer le nombre de moles ATP formées (en conditions aérobies) en supposant que les monosaccharides libérés à partir du saccharose (glucose et fructose) empruntent immédiatement la voie de la glycolyse. Vous utiliserez les valeurs hautes de P/O. MM saccharose : 340 g.mol-1 (4 pts) Une mole de saccharose libère une mole de glucose et une mole de fructose. Chacun de ces sucres permet de former 38 ATP, soit 76 moles ATP au total/ mole de saccharose. 17/342= 0,05 moles de saccharose 0.05x76 = 3,8 moles ATP Question 4 : Glycogène 3 pts 1/ Donner la structure du glycogène et son rôle dans l’organisme. Polymère de résidus glucose liés en 1,4. Branchement en 1,6. Forme stockage du glucose rapidement mobilisable 2/ Indiquer les lieux de stockage du glycogène dans l’organisme. Foie et muscles 3/ Quelles sont les deux enzymes clé du métabolisme du glycogène (synthèse et dégradation) ? Glycogène synthase et Glycogène phosphorylase Question 5 : ATP synthase 3 pts L’ATP synthase est un complexe protéique enzymatique qui permet de produire de l’ATP à partir d’ADP et de Pi. Indiquer sa localisation cellulaire et quelle est la source directe d’énergie utilisée pour cette synthèse ? Localisation : membrane interne mitochondriale L’énergie provient d’un gradient de protons qui s’établit au niveau de la membrane interne de la mitochondrie. Il s’agit d’un couplage entre un transport spontané de protons (entre espace intermembranaire et la matrice) et une réaction chimique non spontanée. ************************ PARTIE B Bioénergétique et Enzymologie : cours de Mme F. Cornillon Les hydrogénases sont des enzymes qui catalysent la réaction réversible d'oxydation de l'hydrogène moléculaire selon la réaction suivante : E°'= -0,42V Une hydrogénase a été purifiée à partir d'une bactérie sulfato-réductrice. Une analyse par ultracentrifugation analytique indique que la protéine native a un poids moléculaire de 50 kDa. L'analyse par gel d'électrophorèse en présence de SDS donne le résultat suivant présenté sur la figure 1 : électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (dodécyl sulfate de sodium) A : Marqueurs de poids moléculaires suivants : 10 KDa, 20 KDa, 30 KDa, 50 KDa et 60 Kda. B : Echantillon purifiée Figure 1 : d'hydrogénase Question 1 : 6 pts 1/ Rappeler le principe de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. L'application d'un champs électrique permet de faire migrer les molécules chargées. Le gel se comporte comme un tamis moléculaire : il retarde les grosses molécules et laisse passer entre ses mailles les plus petites. Le SDS, sodium dodecyl sulfate, est un détergent anionique : il dénature les protéines (rupture des liaisons faibles uniquement) en les tapissant de charges négatives. Ainsi, en présence de SDS, l'électrophorèse permet de séparer les protéines uniquement selon leur masse molaire. En effet, les protéines sont dénaturées et chargées uniformément négativement par le SDS : elles migrent toutes vers l'anode. 2/ Que pouvez-vous conclure de l'expérience précédente ? L'hydrogénase est formée de deux sous unités de 40 et 10kDa respectivement, reliées par des liaisons faibles. Question 2 : 9 pts Les électrons produits lors de la réaction d'oxydation de l'hydrogène moléculaire sont transférés par l'hydrogénase à un accepteur d'électrons. Afin de pouvoir suivre la réaction de consommation de l'hydrogène par l'hydrogénase, nous utilisons un composé coloré : le méthyl viologène (MV2+). La réaction de réduction du méthyl viologène est la suivante : E°'=-0,45V Le méthyl viologène réduit (MV+) absorbe la lumière à 600 nm, ce qui lui confère sa couleur violette, alors que la forme oxydée (MV2+) est incolore. 1/ Ecrire l'équation bilan de réduction du méthyl viologène par l'hydrogène moléculaire catalysée par l'hydrogénase. H2 + 2 MV2+ 2H+ + 2MV+ 2/ Calculer le potentiel d'oxydoréduction dans les conditions standard apparentes de la réaction bilan de réduction du méthyl viologène par l'hydrogène moléculaire. ΔE°' = E°'MV2+/MV+ - E°'H+/H2 = -0,45 -(-0,42) = -0,03V 3/ Cette réaction de réduction du méthyl viologène par l'hydrogène moléculaire est-elle spontanée dans les conditions standard apparentes ? Justifier. ΔG°' = - n F ΔE°' = -2x96500x(-0,03) >0 donc réaction non spontanée dans les conditions standard apparentes 4/ Pourrez-vous faire l'étude cinétique de cette réaction, pour mesurer l'activité de l'hydrogénase, indifféremment dans le sens 1 ou 2 ? Justifier. Dans les conditions standard, l'étude ne peut se faire que dans le sens 2 (quand ΔG°'<0), par contre en changeant les concentrations des réactifs ΔG' peut devenir négative ou rester positive et permettre l'étude dans le sens 1 ou dans le sens 2. Question 3 : 21 pts 1/ La valeur de l'absorbance, mesurée à 600 nm, dans une cuve de 1 cm de trajet optique et contenant 3 mL d'une solution à 100 μM de méthyl viologène réduit (MV+) est de 1. Déterminer le coefficient d'extinction molaire du méthyl viologène réduit. A600nm = ε600nm x l x [MV+] d'où ε600nm = 1/10-4 = 104 M-1.cm-1 La solution d'hydrogénase purifiée utilisée est à 2,5 mg.mL-1. Dans une cuve de 1 cm de trajet optique, 2 mL d'une solution de Tris-HCl pH 8 100 mM, méthyl viologène oxydé 1 mM, est saturé en hydrogène gazeux dissout par barbotage. Au temps t = 0 s, 1 μL de la solution d'hydrogénase purifiée, diluée 200 fois, est ajouté. Le résultat expérimental obtenu est donné dans la figure 2. Figure 2 2/ Donner un titre à la courbe expérimentale obtenue. Commenter la courbe. Détermination de la vitesse initiale de la réaction catalysée par l'hydrogénase en présence de 1mM de méthyl viologène oxydé et à saturation en H2 pour 1 μL de la solution d'hydrogénase purifiée, diluée 200 fois, à pH 8 et à température ambiante. A MV+ à 600nm = f(t) Cette courbe hyperbolique permet dans sa partie initiale de déterminer la V0, tangente à la courbe à t=0. La partie plateau caractérise la fin de la réaction : l'équilibre est atteint. 3/ Donner la définition de la vitesse initiale de la réaction de consommation de l'hydrogène moléculaire catalysée par l'hydrogénase. V0= d[H2]/dt 4/ Calculer la vitesse initiale de la réaction de consommation de l'hydrogène moléculaire catalysée par l'hydrogénase exprimée en mol.L-1.s-1. V0= d[H2]/dt= ½ (d[MV+]/dt) = ΔA/(2xΔtx = ½ x 1/10x 1/104 = 0,5 10-5 M-1.s-1 ε600nm x l )= ½ x ΔA/Δt x 1/ ε600nm x l 5/ Dans quelles conditions se place-t-on pour déterminer l’activité d’une solution enzymatique ? Qu'en est-il ici pour déterminer l'activité enzymatique de la solution d'hydrogénase ? Conditions optimales de mesure : pH opt, t° opt, conditions saturantes en substrat ici H2 saturante, pHopt = 8, pas d'indication sur t° 6/ Donner la définition de l’activité enzymatique et la calculer pour 1 mL de solution d'hydrogénase purifiée (exprimée en katal). L'activité enzymatique est le nombre de moles de substrat consommées par unités de temps dans les conditions optimales pour un volume d'enzyme donné. Elle est exprimée en mol.s-1 ou katals. AE (1 μL de la solution d'hydrogénase purifiée, diluée 200 fois, à pH 8 et à température ambiante) = ΔnH2/Δt = (d[H2]/dt) x V réactionnel = V0 x V réactionnel = 0,5 10-5 x 2 10-3 = 10-8 kat AE (1 mL de la solution d'hydrogénase purifiée, non diluée, à pH 8 et à température ambiante) = AE (1 μL de la solution d'hydrogénase purifiée, diluée 200 fois, à pH 8 et à température ambiante) x 200x 1000 = 10-8 x 200 x 1000 = 2 10-3 kat 7/ Donner la définition de l’activité spécifique et déterminer celle de la solution enzymatique. L'activité spécifique est l'activité enzymatique par mg de protéines contenues dans le volume enzymatique utilisé. Elle est exprimée en kat.mg-1. AS = AE (1 mL de solution enzymatique non diluée) / [prot] en mg.mL-1 = 2 10-3 / 2,5 = 8 10-4 kat.mg-1 8/ Donner la définition de la constante kcat. Que permet-elle d'étudier ? La constante catalytique ou turn over de l'enzyme donne le nombre de molécules de substrat consommées par unité de temps par molécule d'enzyme, à saturation. Elle est exprimée en s-1. Elle permet d'étudier les performances du site catalytique de l'enzyme. 9/ Déterminer la valeur de la constante kcat de l'hydrogénase. Vm = Kcat x [Et] V0 = Vm = 0,5.10-5 M.s-1 puisque nous sommes en conditions de saturation en H2. [Et] = 2,5 g.L-1 /200 pour la solution utilisée pour mesurer Vm donc avec une masse molaire de 50kDa, [Et] = 2,5 / (200 x 50.103) d'où Kcat = (0,5.10-5 x 200 x 50.103) / 2,5 = 20 s-1 PARTIE C Métabolisme bactérien : cours de Mr Y. Markowicz (20 pts) Le lac Searle (USA) est un lac saturé en sels, une saumure alcaline particulièrement riche en arsenic. L’arsenic est présent dans différents états : arséniate (As[V], pentavalent), arsénite (As[III], trivalent). arséniate arsénite Des sédiments prélevés dans le lac ont été incubés en absence d’oxygène, après ajout éventuel de lactate (○), de sulfure (■) ou d’hydrogène () ; les contrôles consistent en des sédiments incubés sans additif (No additions) et des sédiments dont la flore a été tuée par la chaleur (killed control). La figure A quantifie l’arséniate, la figure B l’arsénite : chaque donnée correspond à la moyenne de trois expériences. Time (days) 1) Si l’on compare (qualitativement) l’évolution des concentrations en arséniate et arsénite au cours du temps, en présence d’hydrogène, quelles conclusions peut-on tirer ? Pouvez-vous nommer le type trophique impliqué (justifier votre réponse en quelques mots) ? L’arséniate est réduit en arsénite grâce aux électrons de l’hydrogène. (1,5 points) L’hydrogène sert de source d’électrons : il s’agit de lithotrophie. (1 point) 2) Mêmes questions en présence de lactate ? Ici, les électrons qui permettent la réduction de l’arséniate en arsénite proviennent de l’oxydation du lactate. (1,5 points) La source d’électron étant organique, il s’agit ici d’organotrophie. (1 point) 3) Quelles conclusions pouvez-vous tirer de la comparaison des expériences réalisées sans additif (après chauffage vs. sans chauffage) ? En chauffant, on tue la flore (constituée en très grande partie de microorganismes) ; on constate que la concentration en arséniate reste stable. (1 point) L’expérience réalisée avec les sédiments chauffés montre donc que la présence de micro-organismes est nécessaire à la réduction de l’arséniate en arsénite. (1 point) 4) Quelles conclusions pouvez-vous tirer de la comparaison des expériences réalisées sans additif (ni chauffage) et avec un additif (quel qu’il soit) ? Une réduction de l’arséniate en arsénite est observée y compris en l’absence d’additif : ceci suggère que les sédiments contiennent des donneurs d’électrons qui sont utilisés par certains des micro-organismes présents dans la flore des sédiments. (2 points) Le rendement de la réduction de l’arséniate est cependant meilleur si l’on ajoute l’un des additifs mentionnés, comme en atteste la pente des courbes. (1 point) 5) En quoi les expériences réalisées en présence de sulfure peuvent-elles être considérées comme surprenantes ? Alors que la concentration en arséniate diminue rapidement, on n’observe pas d’augmentation concomitante de la concentration en arsénite !?! (2 points) Une expérience semblable a été réalisée en présence d’oxygène (aucun additif dans le milieu). La figure suivante montre l’évolution des concentrations en arséniate (triangle avec la pointe en haut) et en arsénite (triangle avec la pointe en bas), avec des sédiments traités (symboles pleins) ou non (symboles vides) par la chaleur. Time (days) 6) Quelles conclusions pouvez-vous tirer des résultats de l’expérience réalisée en aérobie ? Ici, c’est l’arsénite qui est oxydé en arséniate. (1 point) Les électrons issus de l’arsénite sont injectés sur l’oxygène à la sortie de la chaîne respiratoire. (1,5 points) 7) L’échelle de temps étant la même dans les deux types d’expérience, pouvez-vous dire pourquoi les phénomènes observés en aérobie sont beaucoup plus rapides ? La respiration sur oxygène est plus énergétique que les respirations anaérobies. (1 point) Donc, les cellules qui respirent sur oxygène croissent plus vite. Or, plus il y a de cellules impliquées, plus les phénomènes observés sont rapides… (2 points) 8) Si les mêmes micro-organismes étaient impliqués dans les phénomènes observés en aérobie et en anaérobie, que pourriez-vous dire de leur comportement vis-à-vis de l’oxygène ? Il s’agirait de capables de respirer l’oxygène mais aussi l’arséniate (en l’absence d’oxygène). (1,5 points) Dans un tel cas, on parle de bactéries anaérobies facultatives. (1 point)
