Etude génétique du cycle cellulaire et de sa régulation Introduction
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Etude génétique du cycle cellulaire et de sa régulation Introduction. Comment a-t-on pu établir le cycle cellulaire de cette espèce ? Chez tous les organismes : il y a des étapes faciles a observées comme la division cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, la mitose est également facilement observable. Les populations cellulaires sont asynchrones : toutes les cellules ne se divisent pas en même temps : techniques spéciales pour les synchroniser. Estimation de la durée de la phase S. On fait un marquage de l’ADN néo-synthétisé avec un marqueur appelé BrdU. Puis on fixe immédiatement les cellules et on rajoute des Ac anti-BdrU. Ainsi, on ne marque que les cellules qui sont à un moment précis de leur cycle et qui fixe donc ce BrdU. Pour les cellules de mammifères, la phase S représente environ 1/3 du cycle. Mais ou se situe exactement cette phase S dans un cycle ? Estimation de la phase G2. On rajoute du BrdU pendant différents temps, jusqu’à que l’on ne voit plus de marquage. Cela marque la durée entre la fin de la phase S et le début de la mitose. Analyse du cycle cellulaire par iodure de propidium (IP). [Il s’agit d’un agent intercalant : la quantité fixée est directement liée à la quantité d’ADN.] Le nocodazole est un poison du fuseau mitotique : les chromosomes ne peuvent pas migrer aux pôles. Les hépatocytes ont un contenu en ADN de type G1. Ils ne se divisent plus en temps normal. Mais la morphologie des hépatocytes en G1 quiescent sont différents de ceux en G1 cyclant. : on a alors appelé ce stage G0. 1948 : premières cultures de cellules de mammifères. Quelques années plus tard, on est capable de faire fusionner des cellules de mammifères ce qui donne des hétérocaryons. Les cellules qui arrivent à survivre à la fusion et à la culture arrivent à un stade d’hybrides somatiques (4n ADN). Que se passe t’il si les cellules fusionnent ne sont pas au même stade cellulaire ? G1 avec G2 : G1 fait ses G1, S, G2 pendant que G2 attend puis les deux cellules rentrent en mitose. G1 avec S : G1 écourte son S et rattrape l’autre puis les deux cellules rentrent en mitose. Il existe donc des protéines régulatrices. On garde toujours le même ordre des phases. En G1 et S, il doit y avoir des inhibiteurs de rentrée en mitose pour le noyau de G2. En S, il doit y avoir des activateurs de rentrée en S pour les cellules G1 et des inhibiteurs de rentrée en S pour le noyau de G2. Phénomènes hautement régulés. Une fusion d’une cellule en mitose avec n’importe qu’elle cellule aux stades G1, S, G2 provoque une condensation des chromosomes (en G1 : chromosomes à une chromatide) (en G2, ca se passe bien) (en S : pas viable). Il existe un activateur de rentrée en M très puissant qui permet dans ce cas uniquement d’inverser l’ordre des phases : c’est le MPF (mitosis promotting factor). On peut faire condenser des chromosomes humains avec un noyau mitotique de souris, drosophile…etc.et réciproquement. Le MPF est très conservé. Caractéristiques de S.cerevisae et S.pombe. Génome haploïde : 17,5Mbases. Cycle cellulaire chez S.cerevisae. La cellule qui commence a présenté un bourgeon comme sa phase S. C’est un moyen physique de reconnaitre les cellules qui rentrent dans ce stade. (Erreur sur le schéma du polycopier). Il s’agit d’un organisme haplo-diplo-biontique. -haploïde : utile pour avoir des mutants récessifs -diploïde : utile pour avoir des mutants dominants. Les cellules de type A sécrètent un peptide A qui est capable de bloquer les cellules α au stade Start, ainsi que les cellules de type α sécrètent un peptide α qui est capable de bloquer les cellules A au stade Start. Les cellules sont donc au même stade avant de fusionner. Mutants de cycles conditionnels (cdc) Prix Nobel 2001. On va passer par des mutants thermosensibles (le phénotype de thermosensibilité n’est pas forcement la létalité). C’est la protéine qui sera thermosensible. La protéine sauvage résistera jusqu’à x degrés alors que la mutante y sera instable. On utilise en général 3 températures chez la levure : -11°C : la levure se divise de façon normale (si <, alors on n’observe que peu de divisions) -36°C -23°C WT Mutants TS Mutants CS 11°C + + - 23°C + ? ? 36°C + + Sélections de mutants létaux thermosensibles (TS) indépendants. =>plusieurs mutants sont créés. On met en culture pour obtenir une large palette de mutants différents. On ne veut surtout pas que deux mutants provenant de la même cellule mère soit créés. On commence à faire une culture à température non permissive pour éviter des mutants déjà présents pour la protéine recherchée. Les mutants, qui n’ont pas le temps de se diviser, ne tombe que dans un seul tube donné lors de l’élution. (On se dépêche de faire des aligots pour éviter que le mutant ne se divise). On met ensuite en culture sur un milieu riche pour éviter les parasitages des mutations qui auraient été induites partout ailleurs (ex : mutants des voies métaboliques…) Analyse génétique : procédure générale. Combien de gènes sont touchés dans ces mutants ? On étale les cellules sur un milieu Ura- Leu- parce que les diploïdes n’aient pas besoin d’Ura et Leu pour vivre (Ura et Leu sont dominants). Cependant, nos levures sont de même sexe, donc il va falloir créer soit des levures A ou des levures α. On va faire passer la méiose aux levures pour les faire sporuler. Pour récupérer les bonnes spores, et éviter les problèmes de probabilité de récupérer les bons mutants, on va faire pousser les levures sur différents milieux sous différentes conditions. On récupère alors cdc x, Ura3, Leu2, α/A. Il nous reste à savoir si la souche et A ou α ? =>on fait des croisements arbitrairement avec des souches de références dont le sexe est connu. On fait pousser sur un milieu sans Ura ni Leu pour que seules les cellules diploïdes poussent. Si ca pousse, on verra l’apparition de colonies a l’intersection des stries sur la boite de Pétri. cdc x Si muté dans le même gène : 𝑐𝑑𝑐 𝑦 cdc x Si muté dans un gène différent : 𝑐𝑑𝑐 𝑋 cdc y 𝑐𝑑𝑐 𝑌 Résultats finaux : un panel de 32 gènes ont été identifiés. Analyse fine des phénotypes. On repère les cellules individuelles qui ont été étalées sur la boite et on regarde la forme de ces cellules. On met en culture en température non permissive. Ils voient dans les deux types de mutants des cellules avec leurs bourgeons mais dans d’autres cas il y a deux cellules avec leurs bourgeons. Certaines cellules se sont arrêtées en G2/M du premier cycle (1cellule avec un gros bourgeon) D’autres sont rentrées dans un cycle et se sont arrêtées dans le cycle suivant en G2/M. Cela permet de définir le point d’exécution. Pour cdc7 : toutes les cellules sans bourgeons se sont arrêtées dans le 1 er cycle et toutes les cellules ayant un bourgeon se sont arrêtées dans le 2e cycle. La protéine n’est importante que dans un moment précis du cycle. Si on porte à température non permissives les cellules qui ont besoin de la protéine, alors il y aura un blocage. Apres G1/S, la protéine n’est plus nécessaire. Pour cdc8, son point d’exécution est en fin de S. On peut donc avoir les deux mutants qui ont des phénotypes finaux similaires mais avec des points d’exécutions différents. Les cdc7 et cdc8 ont un faux phénotype terminal de type G1/S : il y a un bourgeon avec entre les deux le noyau mais celui-ci n’a pas été répliqué. La cellule reste à 1n ADN après analyse par la technique de FACS. Puis, dans une autre expérience, on le laisse à température permissive jusqu’à ce qu’elles passent S, et ensuite a température non permissive. Les cdc8 arrêtent leurs phases S directement, alors que les cdc7 continuent comme a température permissive. Cdc7 est une protéine d’initiation alors que cdc8 est une protéine d’élongation. Le cycle de l’ADN est finalement indépendant de la morphogénèse. Sur le polycopier : ++ signifie que la cellule est capable de faire plusieurs fois l’étape. Ex : cdc24 mutant : abouti a une cellule polynuclée qui va mourir. Dans une 2e série d’expériences, on ne part pas de 400 souches mais de 5000. On ne découvre alors que 3 groupes de complémentations en plus. Raison : -certaines protéines ne se prêtent pas aux mutations. -plusieurs gènes codent pour la même protéine ce qui empêche de voir les mutants. (Des mutants sortent à plus basse fréquences que d’autres.) Le couplage peut être mécanique (le produit d’une étape permet le passage à une autre étape) ou moléculaire (des protéines régulatrice sont mises en jeu.) On peut inhiber la ribonucléotides réductase par une molécule : l’hydroxyurée (HU). Par manque de substrat, les polymérases vont ralentir et la phase S sera effacée (ou retardée). Après traitement des cellules par l’HU, on observe de grosses cellules (car leurs cycles est allongé : phase S quasiment doublée). Est-ce qu’il existe des mutations qui abolissent ce couplage synthèse/mitose ? Oui ! Cdc2-3wee chez S.pombe, cdc28 chez S.cerevisae. C’est un mutant gain de fonction avec une protéine très active. Presque pas de G2 avant pour rentrer en mitose plus vite a cause de cette kinase très active. Avec le HU, les cellules rentrent en mitose avant la fin de la phase S. Le noyau est coupé par le septum : létal. Cette mutation découple la phase S de la phase M. C’est bien une régulation moléculaire qui fait ce couplage. La protéine cdc2 est directement impliquée dans cette régulation. Exemple : dominante cdc17 cdc2+ --------------X-----------------cdc17+ cdc2-3w Phénotype TS non TS /non létal Point d’initiation : S Petites cellules. Phénotype final G2/M Cdc17 ------Cdc17+ Après méiose : spores : cdc17 cdc2+ cdc17+ cdc2-3w cdc2+ -------cdc2-3w Mutation cdc17 cdc2-3w cdc17+ cdc2+ cdc17 cdc2+ cdc17+ cdc2-3w cdc17 cdc2-3w cdc17+ cdc2+ Température permissive [wt] [wee] [wee] [wt] Température non permissive [létal] [wee] [cut] [wt] Il existe des détections des anomalies (le mutant swi7-H4 laisse penser que la polymérase joue un rôle dans cette détection). On fait des mutations sur le gène cdc2 pour avoir une Ala15 à la place d’une Tyr15. L’Ala15 n’est pas phosphorylable, donc pas active. Analyse des intermédiaires de la signalisation. Mutants hypersensibles à HU. On essaie de trouver des mutants pertes de fonction. Les mutations sont récessives dans ce cas. Après culture…, on a trouvé 20 mutants cut, repartis en 8 groupes de complémentation. Mutants hypersensibles aux radiations. En principe, les mutants Rad sont des mutants de réparation donc il a fallu prouver que qu’il s’agissait bien de mutants de checkpoint. Utilisation de mutants cdc1-rad1 (ce double mutant peut survivre quelques instants à 36°C) Le mutant rad1 est un mutant qui ne se donne pas le temps de réparer son ADN mais ils savent très bien réparer en temps normal. Il s’agit donc de mutant de checkpoint. La plupart des mutants HUS sont Rad et réciproquement. Les mutants sont donc les même (mut »s sur le même gène) mais qui ont été récupérés avec des phénotypes différents. 6 groupes de complémentation commun entre rad et HUS, et seulement 2 divergent. Ordre d’intervention des différentes protéines. Pour déterminer cet ordre, on surexprimera une protéine situé en aval de la chaine pour voir si on ne peut pas supprimer le phénotype des protéines en amonts. Comme Rad3 et Rad26 co-immunoprécipite, cela signifie que ces deux protéines doivent former un complexe, et se situe vers la fin de la chaine de signalisation. Des compléments d’études ont été réalisés : études par cristallographie. On remarque un parallèle strict de structure entre le complexe clamp-loader et le complexe 9-1-1 qui est lui recruté sur un ADN simple brin. La molécule RPA est une molécule qui se fixe sur de l’ADN simple brin pour le protéger. Le complexe Rad26 et Rad3 viennent également interagir avec le complexe 9-1-1. Mise en évidence de Chk1 : suppression de Rad3Δ Forme phosphorylée de Cdc2 : forme inactive. Est-ce que Rad3 phosphoryle directement cdc2 pour l’empêcher de rentrer en M tant que l’ADN n’est pas réparé ? Ou existe-t-il des intermédiaires ? (Wee1 qui inactive Cdc2 : donc Rad3 peut-il phosphoryler Wee1 pour l’activer afin qu’il inactive a son tour Cdc2 ?) Apres analyses biochimique, on s’aperçoit que Rad3 ne phosphoryle aucune de ses protéines ! Conclusion : manque t’il une étape avec une protéine qui n’apparait pas dans les groupes de complémentation ? Rad3 doit phosphoryler une autre protéine X. Pour identifier la protéine X, on va la surexprimer. Problème : on ne connait pas cette protéine. Donc on fait une banque génomique de S.pombe sauvage dans un vecteur qui peut être maintenu à copies multiples dans la cellule. On utilise des vecteurs navettes : vecteurs amplifiés chez la Bactérie puis mis dans des levures. Les levures qui survient sur les milieux de sélection vont être analysées (les plasmides qu’elles contiennent sont ou Rad3+, ou ont un suppresseur Chk1) On fait alors de la génétique reverse : on a le gène, et à partir de ce gène on va créer le mutant déficient en Chk1. On isole le fragment d’ADN dans le vecteur qui code pour Chk1. On fabrique un gène Chk1 qui contient le marqueur Leu2. On clone ceci dans un vecteur d’expression bactérien : gène Chk1 ::Leu2+ A partir de ce plasmide, on ressort l’insert. On transfecte des levures avec, les levures étant de génotype Chk1+ Leu2Δ. PS : il y a de fortes tendances chez la levure à faire des recombinaisons avec le chromosome, en chassant le gène résident. De cette manière, on remplace le gène sauvage par le gène interrompu par Leu2+. On récupère les cellules qui poussent sur milieu sans Leucine, puis on irradie. Les cellules Chk1- sont hypersensibles aux UV avec un phénotype « cut », mais ne sont pas sensible à HU. Que se passe-t-il chez les mutants surexprimant Chk1 ? On fait une construction sous contrôle de Nmt1, promoteur fort répressible par la thiamine. Obtention de souches létales avec un phénotype du genre G2/M : attendu car comme la protéine est surexprimée, elle empêchera de rentrer en mitose même si il n’y a pas de lésions. Quel est l’état de phosphorylation de Cdc1, CDc2 et Cdc25 ? -pCdc2 : phosphorylée sur la Tyr15 : inactive. -pCdc25 : phosphorylée inactive. -pWee1 : hyperphosphorylée : activatrice. Mais problème : les mutants Chk1 ne sont pas sensibles à l’HU alors que les mutants Rad3 sont sensibles à HU et aux radiations. Mise en évidence de Cds1 : suppression de Swi7-H4 (TS) On réalise les mêmes expériences que précédemment. On retrouve également des survivants : certains codant pour Pol-α, d’autres pour Cds1 (Sér-Thr-Kinase). On casse également le gène Cds1 par une cassette de Leu2. Il y a apparition de deux voies parallèles, l’une sensible aux UV avec Chk1, l’autre sensible à HU avec Cds1. Rad3 n’a pas d’affinité directe à Chk1 et Cds1. Il faut que ces protéines soient en présence de protéines adaptatrice : Mrc1 pour Cds1 et Crb2 pour Chk1. Cela explique cette double voie car Mrc1 et Crb2 sont des protéines cycliques qui ne sont exprimées qu’a certains moments du cycle cellulaire. -Mrc1 : exprimée plutôt en phase S -Crb2 : exprimée plutôt en phase G2. Il existe un seuil de RPA, qui, lorsqu’il sera franchi à cause d’un découplage partiel de l’hélicase avec les polymérases, va activer les checkpoints. Lors d’une cassure double brin, très rapidement arrivent des exonucléase qui libèrent du simple brin et permettent le recrutement de RPA : checkpoint activé. Le point de non-retour se situe à la limite Métaphase-Anaphase. Branche intra-S du checkpoint. Chez S.cerevisae, e mutant Rad53 = mutant Cds1 chez S.pombe. En cas de stress, l’origine tardive ne se déclenche pas. L’absence de Cds1 empêche l’extinction des origines tardives en cas de stress. Mises en évidences des rôles des protéines 14-3-3σ Ces protéines ont d’abord été trouvées chez les mammifères. Cdc25 est directement phosphorylé par Chk1. Autour de la Ser216, on trouve des motifs de la protéine 14-3-3σ qui co-précipite avec Cdc25. Même si il y a une mutation de la Serine, l’activité phosphorylase est présente. Donc la forme phosphorylée est inactive (?). La régulation de cycle chez les levures : le passage du START chez Saccaromyces cerevisae. Clonage de Cdc28, mutant START chez Saccaromyces cerevisae. (= Cdc2 chez Saccaromyces pombe). Voir techniques des banques génomiques du TD3) Le mutant Cdc254 est bloqués au START. Est-ce que cette suppression était due au plasmide ? Cf. TD3. A-t-on cloné le gène Cdc28 ou un suppresseur de Cdc284. On force la recombinaison homologue du plasmide dans le chromosome. Le marqueur Leu2 va se retrouver aussi dans le chromosome. On passe alors non plus dans un vecteur de type navette mais dans un vecteur de type non-réplicatif. On introduit une coupure dans le gène dans le vecteur ce qui force la combinaison. On ajoute le plasmide dans le chromosome. Avant, la cellule était Leu2Δ, mais désormais présente le gène Leu2 qui était dans le plasmide. On va pouvoir trouver ce gène Leu2 et voir si il est localisé dans Cdc28 ou ailleurs. On peut aussi voir ou ca s’est intégrer car on supprime le phénomène de multicopie est donc on efface la thermo résistance. Rappel : obtention de mutants nuls. On a ici un appariement linéaire avec perte du gène fonctionnel. Procédure générale d'analyse. Séquençage du gène cloné => séquence de la protéine correspondante => Comparaisons avec d'autres séquences connues. Clonage du gène dans un vecteur bactérien si possible étiqueté. On insère une petite séquence juste avant le coton stop, et qui sera très immunogène (il ne faut pas qu'il modifie trop la structure de la protéine). C'est le système de marquage. Analyse de suppresseurs multicopies spécifiques de l’allèle Cdc28-4 On remarque que les deux plasmides sécrètent des protéines fortes ressemblant aux cyclines : Cln1 et Cln2. Diapositive. Quel est le phénotype pour un mutant Cln1 et Cln2 ? On fabrique ses mutants. On casse les gènes par des marqueurs de sélection que l’on va remplacée dans le chromosome de la levure. On part de diploïdes au cas où remplacement chez un haploïde soit létal. Se diploïde est délété pour trois marqueurs : Ura3 Δ/Δ, Leu2 Δ/Δ, Trp1 Δ/Δ. On remplace donc le gène sauvage Cln1 par Cln1::Trp1 et Cln2 par Cln2::Leu2 On regarde la méiose et on regarde les spores. On récupère uniquement les cellules qui sont mutantes pour Cln1, Cln2, et pour le double mutant. Si les cellules présentent ces gènes Leu et Trp, cela veut dire qu'elles ont aussi Cln1- et Cln2-. Si on fait ses mutants GDF (gain de fonctions). Quand Cln1 ou Cln2 est surproduit, les cellules sont de petites tailles. Les mutations PDF et GDF n'ont pas des phénotypes très marqués. Il existe une troisième cycline qui a été identifiée de manière indépendante de ces manipulations. Démarche : Mutagénèse de cellules haploïdes (car on veut des mutants récessifs) : synchronisation des cellules au point START => séparation des cellules sur gradient de saccharose et récupération des cellules de petites tailles. Ils ont trouvé un mutant Whi avec une taille de 50 % du type sauvage. WHI/whi : petites tailles avec une mutation dominante. On s'aperçoit que le gène codant contient plusieurs phases de lecture. On coupe la région chromosomique par des enzymes de restrictions, puis on clone dans un vecteur réplicatif en utilisant un marqueur Ura3. On transfecte alors les cellules sauvages. On surproduit les gènes. Un de ces gènes confère une petite taille à la cellule : mêmes phénotypes que whi. La surproduction de la protéine sauvage a le même phénotype que le mutant dominant. On séquence alors le gène : 1740 bases pour 580 acides aminés. La séquence ressemble à celle des cyclines 1 et cyclines 2. La partie C-terminale de la protéine est très importante dans la dégradation de la protéine ce qui explique la protéine mutée tronquée s'accumule et donne un mutant gain de fonctions. Construction d'un prix triple mutant Cln1, Cl2, Cln3. Le phénotype est létal. On veut maintenant connaître les phénotypes finaux, leurs points d’exécutions. On fait des triples mutants conditionnels. On part du double mutant Trp Leu (Cln1Cln2) haploïde que l'on transfecte par le plasmide ayant le gène Cln1 sous contrôle du promoteur Gal1. Cln1 ne sera exprimé qu'en présence de galactose. On travaille maintenant sur le milieu avec du galactose et on remplace Cln3 par Cln3 ::Ura3. Puis ensuite sur glucose : les cellules non plus de bourgeons et ont une seule molécule d'ADN. En contact avec une cellule de sexe complémentaire, elles peuvent fusionner. Le blocage et le point exécution sont au point START. Il doit y avoir d'autres cyclines pour le reste du cycle cellulaire. On va rechercher les autres types de cyclines. Mises en évidences des cyclines B. Il existe des mutants Cdc28 atypiques qui ne sont pas bloqués au START met à l'entrée de mitose. C'est le mutant Cdc28-1N. On retransfecte avec des levures Leu2Δ. Par les mêmes manipulations que précédemment on trouve des suppresseurs de Cdc28-1N et on s'assure qu'il ne s'agit pas de mutants Cdc28-4. On distingue quatre groupes de plasmides qui suppriment Cdc28-1N mais pas Cdc28-4. Analyse des mutants nuls. On a encore l'impression d'une redondance. Fluctuations des différentes cyclines au cours du cycle. Les cyclines 3 et 4 sont capables de se substituer aux 5 et 6 lorsque ces dernières ne sont pas là. Il faut une forte concentration de 3 et 4 pour entrer en phase S. Les CLN sont présentes mais sont incapables de faire passer le START. Les CycB5-6 sont nécessaires pour passer en phase S. si on a un mutant B5 B6, il faut atteindre les B3 B4 pour entrer en phase S. Analyse des redondances des cyclines B. => la morphogénèse dépend des cyclines N. La rentrée en phase S dépend des cyclines B. À 36 degrés : après transfert sur galactose, on fait exprimer Cln5 : les cellules redémarrent mais ne pourraient pas rentrer en mitose. Cln 5 est suffisante pour assurer la rentrée et le maintien de la phase S et ne permet pas de rentrer en mitose. À 23 ° : sur glucose, Clb2 est exprimé mais pas Clb5 : pas de rentrer en phase S. mais émergence du bourgeon. Clb2 est incapable de faire rentrer en phase S. on montre que si on fait exprimer Clb2 à un autre moment du cycle (phase de mitose par exemple), on est incapable de faire rentrer en phase S. Pour faire rentrer à morphogène, il faut soit Cln1 ou 2 ou3. Pour faire rentrer en START : il faut soit Clb5 ou 6. Pour faire rentrer en phase S : il faut soit Clb3 ou 4. Finalement seulement trois d'entre elles sont essentielles pour le cycle : il existe une énorme redondance. Chez Saccaromyces pombe. Cdc13 a été identifié comme un mutant thermosensible. (Qui s'arrête en phase G2/M) : indispensable pour entrer en phase de mitose. Cig1 : rôle équivalent du START Cig2 : active à la rentrée en S. Sauf que l'on peut faire enlever Cig1 et Cig2 et il ne se passe rien du tout. Une seule kinase (cdc2) et une seule cycline semblent être suffisantes. Quand on prend des cellules ΔCig1 et ΔCig2 : la cinétique d'activité kinase est différente. La courbe représente le complexe Cdc2Cdc13 alors que dans le grave supérieur, il y avait les complexes Cdc2Cdc13, Cdc2cig1, et cdc2cig2. Il existe une activité seuil pour entrer en phase S et aussi en phase M. il s'agit d'un problème quantitatif avec des notions d'activités. Il existe des substrats à basse et à haute affinité. Les substrats en G1/S sont à haute affinité. Les substrats en M sont à faible affinité. Qu'est-ce qui empêche de rentrer en phase S lorsque l'on a une forte activité kinase ? Le fonctionnement de la machinerie de la phase S empêche l'entrée en phase M tant que S n'est pas fini : c'est le rôle du checkpoint avec le contrôle inactif decdc25 et le maintien actif de Wee1. (Cdc25 est un activateur de CDC2 alors queWee1 est un inactivateur de cdc2) Sélection de mutants Cdc chez les mammifères. Il est plus compliqué de sélectionner des mutants chez les cellules de mammifères parce que ce sont des cellules diploïdes. Les mutants sortent à plus basses fréquences. On a des cellules en culture que l'on mute. Ont faite une phase d'expression à température permissive (34 degrés). On monte alors à une température non permissive pendant le temps d'une génération. On laisse ainsi le temps aux cellules d'arriver alors à leurs points de blocage. Puis on fournit du BrdU pendant une génération. Les cellules bloquées ne seront donc pas capables d'incorporer le BrdU : elles sont mutantes. Pour les cellules non mutantes, on met encore des ultraviolets. Ce système tend à tuer les cellules non mutantes. On redescend alors à une température permissive : on aura enrichi en cellules mutantes. Et on recommence : température non permissive, deuxième incorporation de BrdU, température permissive... On aura alors suffisamment enrichi en mutants pour pouvoir observer environ une centaine de colonies. Obtention de mutants par utilisation des séquences clonées. Gain de fonction : la surexpression est facile (construction dans un plasmide [ne peut se faire que pendant 48 heures environ]). Perte de fonction : - micro injection d'anticorps anti-protéines d'intérêts. - Expression d’ARN antisens (pas très efficace) - expression de silencer (RNAi) : cette technique fonctionne assez bien, mais ne permet pas de faire des mutants létaux. Transfection par des plasmides codants pour des protéines mutantes : un mutant dominant négatif est un mutant négatif qui s'avère être dominant. La protéine va interférer avec les protéines naturelles. Clonage de hCdc2/cdk1 et Cdk2. Est ce que les protéines humaines peuvent compléter les protéines de levures ? On construit des banques d’ADNc sous le contrôle d'un promoteur Gal1 dans un vecteur navette ayant Ura3. On transfecte alors ses plasmides chez des mutants thermosensibles Saccaromyces cerevisae. Puis on met en culture sur une température non permissive sur galactose (le gène humain est exprimé). Pour savoir si c'est bien le plasmide qui supprime la mutation, on fait ses gré j'ai le plasmide (on ferme le promoteur et on observe si la complémentation est due au plasmide). 10E6 colonies ont été sélectionnées : 40 qui ne pousser que sur du galactose. Puis on fait un séquençage : on a identifié deux types de suppresseurs : - hCdc2 (ou Cdk1) : 63 % d'identité en acide aminé avec Cdc2 - hCdk2 Est ce que ces protéines ou le même rôle chez les cellules humaines que celui qu'elles ont chez les levures ? Cas de Cdk1. Chez le mutant FT210 : les cellules sont bloquées en G2 à 39 degrés. En regard de l'activité kinase. Quand le dosage effets à 39 degrés, il n'y a plus activité kinase chez le mutant : mutants de p34 cdc2 est thermosensible. Ils ont fait exprimer chez ce mutant la protéine humaine et il y a une complémentation de ce mutant. Puis on injecte des anticorps anti p34 cdc2 dans des cellules normales : les cellules deviennent létales. Cdc 1 joue le même rôle alors que Cdc28. Cas de Cdk2. Aucuns mutants n'ont été trouvés. Ils synchronisaient les cellules au START puis il prélève à des températures variées, fabrication d'extrait et co-immunoprécipitation. Ensuite, on fait une analyse de l'activité kinase. Cdk2 est présente tout au long du cycle cellulaire mais actif seulement en fin de G1, pendant S, et son activité diminue au fur et à mesure de la phase S. Chez les mammifères, il y a plusieurs Cdk. L'une ou l'autre peut complémenter Cdc2 ou Cdc28 chez Saccaromyces pombe. Clonage des cyclines humaines. On crée un triple mutant Cln1, 2, 3Δ avec présence d'un plasmide pourtant le gène CLN3 sous contrôle du promoteur Gal1. Les cellules ne sont donc viables qu'en présence de galactose. Ils transfectent avec les banques d'ADN complémentaire. La culture se fait sur un milieu sans uracile, plus glucose. On obtient une multitude de cellules qui survivent. Puis on vérifie que c'est bien le plasmide responsable de la survie, et on effectue un séquençage des plasmides. Ainsi on a caractérisé un grand nombre de cyclines : elle complémentent toutes les cyclines N de Saccaromyces cerevisae. CDK et les cyclines chez les mammifères. Schéma bilan. Cdk1 = Cdc2 Les cyclines D sont présentes en permanence au cours du cycle cellulaire. En phase G0, il n'y a pas de cyclines D : elles sont spécifiques de la sortie de la phase G0. Les cyclines D sont surexprimées dans certains cancers. Phosphorylé par les cyclines D et Cdk2 Cdk6, E2F est relâché et entraîne la rentrée en phase S. E2F : à tendance à pousser dans le cycle cellulaire, facteur pro-cancéreux. Rb : suppresseur de tumeur. Point de contrôle chez les mammifères. Technique des oligonucléotides dégénérés. SP SC Homme : --Mêmes motifs---aa1 aa2 aa3 aa1 aa2 aa3 --Motifs divergents-- ---Mêmes motifs--… … … aax aay aaz … … … aax aay aaz aa1 AAC … aa2 CCG CCA aa3 … … aax aay aaz On fait synthétiser tous les oligonucléotides possibles du fait de la redondance du code génétique. Puis on traire les ARN et on fait une PCR en mettant comme amorce l’ensemble des oligonucléotides : un d’entre eux sera complémentaire entre la levure et le modèle humain. (RT-PCR en fait) On obtiendra alors une sonde parfaitement complémentaire au gène humain. On s’en servira pour cibler une banque d’ADN humain.
