Mise en evidence du role inducteur de Fencephale

J. Embryol. exp. Morph. Vol. 19, l,pp. 88-93, February 1968
With 1 plate
Printed in Great Britain
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Mise en evidence du role
inducteur de Fencephale dans Fosteogenese
du crane embryonnaire du poulet
Par JEAN SCHOWING 1
Laboratoire d'Embryologie experimentale du College de France
et du C.N.R.S. {Directeur: Professeur Etienne Wolff)
Nos experiences d'excision des differents territoires encephaliques (Schowing,
1959, 1961, 1967) mettent en evidence Pimportance du role des structures
nerveuses dans la differentiation du squelette cranien. Le mecanisme de cette
action inductrice, ainsi que la nature de l'inducteur, est mal connu.
Nous avons tente de confirmer le role inducteur de l'encephale par des
experiences in vitro. Strudel (1959, 1962) a obtenu du cartilage a partir de
somites d'embryons de poulet cultives sur le milieu standard de Wolff & Haffen
(1952) contenant un extrait de tube nerveux, tandis que Benoit (1960), greffant
un fragment de tube nerveux a la place de la placode otique, a observe l'apparition d'un cartilage surnumeraire dans le mesenchyme de l'oreille. II semble done
qu'il existe un facteur inducteur de la chondrogenese dans le tube nerveux. De
meme, existe-t-il un facteur de l'osteogenese dans l'encephale embryonnaire?
Ce facteur inducteur est-il specifique, comme son homologue chondrogene?
Pour repondre a ces questions, nous avons pratique des experiences de greffes
chorio-allantoidiennes ou le mesenchyme cephalique est mis en presence de tissu
nerveux encephalique, ainsi que des operations microchirurgicales consistant
a remplacer certains territoires nerveux par d'autres.
Mais, au prealable, il nous a paru necessaire de localiser une ebauche osseuse
susceptible de disparaitre en l'absence d'encephale, nous avons recherche
l'origine du frontal.
RECHERCHE D'UNE EBAUCHE SUSCEPTIBLE DE DISPARAITRE
EN L'ABSENCE D'ENCEPHALE, L'OS FRONTAL
Materiel et technique
Nous utilisons des oeufs de poule de la race Leghorn blanche, que nous incubons pendant 48 h. Les embryons ont alors de 10 a 20 paires de somites.
Pour rechercher l'origine de l'os frontal dans le mesenchyme cephalique d'un
1
Adresse de Vauteur'. Laboratoire d'Embryologie experimentale, College de France, 49 bis,
avenue de la Belle Gabrielle, 94-Nogent-sur-Marne, France.
6-2
84
J. SCHOWING
jeune embryon, nous nous sommes adresse a la technique des greffes chorioallantoidiennes telle qu'elle a ete inauguree par Murphy (1912) et modifi.ee par
Wolff & Lutz (1939).
(a) Technique de marquage
Nous avons utilise cette technique dans les experiences de greffes chorioallantoidiennes. Elle consiste a introduire dans le mesenchyme cephalique un
petit amas de grains de charbon prealablement agglutines par de Falbumine.
Si le coagulum d'albumine est suffisamment dur, les grains de charbon ne se
dissocient pas dans le mesenchyme, mais s'integrent a lui sans perturber son
evolution. Ainsi une marque mise en place dans le mesenchyme a un stade
precoce permet de suivre la destinee du territoire ou elle se trouve, et facilite
l'explantation ulterieure de ce territoire.
(b) Techniques de coloration
Les coupes histologiques, d'une epaisseur de 7 a 10 ju,, sont colorees dans une
solution aqueuse d'alizarine sulfonee qui fait apparaitre les formations osseuses
en rouge vif. Nous completons cette coloration par un passage des coupes dans
une solution de bleu alcian pour la coloration de fond et la mise en evidence des
cartilages.
Recherche de Vorigine de Vos frontal
Dans la partie externe du mesenchyme cephalique, nous voyons apparaitre
une condensation, approximativement au milieu de la bordure oculaire. Cette
condensation, qui se developpe dans les jours suivants, se transforme en os
frontal a partir du 9eme ou lOeme jour de l'incubation.
L'utilisation des marques de carbone nous a permis de localiser le point
d'origine de l'amas cellulaire qui evoluera plus tard en os frontal. Pour qu'une
marque se retrouve a son voisinage, il faut qu'elle soit placee dorsalement a
l'ebauche oculaire, et legerement en avant de l'axe reliant les deux vesicules
optiques (Fig. 1). Si, apres 4 jours, nous prelevons l'ebauche presomptive du
frontal accompagnee de la marque de carbone avoisinante, et si nous les greffons
dans la chorio-allantoiide d'un embryon-hote de 6 a 8 jours, nous obtenons apres
10 jours de culture la formation d'un os dermique pres duquel nous retrouvons
les grains de charbon (Planche 1, fig. A).
II est done possible, grace a cette technique de marquage, de reperer l'origine
de l'os frontal chez un embryon tres jeune et de suivre son evolution jusqu'a un
stade suffisamment avance pour pouvoir observer sa differenciation.
Recherche du stade de determination de Vos frontal
L'os frontal est-il determine au bout de 48 h d'incubation, e'est-a-dire au
moment ou nous introduisons notre marque de carbone ? Pour le savoir, nous
prelevons des mesenchymes cephaliques prealablement marques a differents
Role inducteur de Vencephale
85
stades qui sont 48 h, 60 h, 3 jours, 3,5 jours et 4 jours. Ces explants sont greffes
sur la chorio-allantoide d'embryons-hotes de 6 a 8 jours et cultives dans cette
position pendant 10 jours.
Les greffons les plus jeunes evoluent peu ou n'evoluent pas. Tout au plus y
voyons-nous apparaitre quelques formations cartilagineuses, generalement
petites et arrondies.
F
Fig. 1. Schema montrant la position de l'ebauche presomptive de
l'os frontal (F) chez l'embryon de quinze somites.
Tableau 1
Age des
greffons
Nombre de
greffons
Differentiation
osseuse
Nombre de cas
indifferencies
Ossification
(%)
48 h
60 h
3j
+ de 3j
12
18
16
14
0
4
14
14
12
14
2
0
0%
22,2%
87,5 %
100%
Les greffons de 60 h se developpent davantage. Les cartilages qu'ils renferment
sont plus importants, mais en general il est difficile de dire a quel territoire ils
appartiennent. Parfois, nous observons Fapparition de formations osseuses
capables d'evoluer rapidement, ceci dans quatre cas sur dix-huit etudies.
Dans les greffons de 3 jours, nous observons presque toujours la formation
d'un os. Quatorze echantillons sur seize sont porteurs d'un point d'ossification.
Les greffons les plus ages, soit de 3,5 jours, soit de 4 jours, se differencient
toujours en os, ainsi que nous l'avons deja vu sur la Planche 1, figure A.
Ces resultats sont groupes dans le tableau 1:
A la lumiere de ces resultats, nous pouvons conclure que l'os frontal n'est pas
determine chez l'embryon de poulet tres jeune. C'est seulement a partir de 60 h
d'incubation que le mesenchyme cephalique isole devient capable de s'auto-
86
J. SCHOWING
differencier en os. Ce pouvoir d'autodifferenciation s'acquiert entre 2,5 et
3 jours, stade a partir duquel tout greffon renfermant le territoire presomptif de
l'os frontal evolue en une formation osseuse typique.
GREFFES CHORIO-ALLANTOIDIENNES DE MESENCHYME CEPHALIQUE
SEUL OU ASSOCIE A L'ENCEPHALE EMBRYONNAIRE
Les experiences precedentes nous montrent qu'un mesenchyme cephalique
renfermant l'ebauche frontale et ayant moins de 60 h ne peut evoluer en greffe
chorio-allantoidienne. Evoluera-t-il s'il se trouve associe au territoire encephalique qui lui est adjacent ?
Nous prelevons sur la tete d'embryons de poulet de 15 a 20 somites l'ensemble
constitue par les deux mesenchymes cephaliques droit et gauche et le territoire
encephalique correspondant (Fig. 2 a).
(1) Nous separons l'un des mesenchymes et nous le greffons soit seul, soit
associe a d'autres mesenchymes identiques afin de realiser un effet de masse. II
est, en effet, difficile d'obtenir en culture la differentiation d'un explant dont la
taille est inferieure a une certaine limite. L'association de plusieurs petits explants
est un palliatif a cet inconvenient et permet d'obtenir un ensemble suffisamment
volumineux pour se differencier normalement.
(2) Nous greffons d'autre part l'autre mesenchyme cephalique accompagne
du territoire nerveux (Fig. 2 b). Dans tous les cas, un fragment d'oeil est conserve pour servir de repere au moment de sa pigmentation.
Mesenchymes cephaliques cultives seuls
Nos observations ont porte sur dix-neuf greffons. Parmi ceux-ci, quinze sont
peu ou pas differencies. Nous y relevons la presence de quelques nodules cartilagineux semblables a ceux que nous avons deja rencontres. Les yeux ne sont
generalement pas developpes, ils sont reduits a un amas pigmente (Planche 1,
fig. B). Les quatres autres greffons comportent quelques formations osseuses
peripheriques, associees a un epaississement de l'epiderme dont l'aspect keratiPLANCHE 1
Fig. A. Os frontal (F) obtenu apres 10 jours de culture en greffe chorio-allantoidienne.
Remarquer a son voisinage les grains de charbon provenant de la marque initiate.
Fig. B. Mesenchyme cephalique isole apres 10 jours de culture en greffe chorio-allantoidienne.
Remarquer l'amas pigmente correspondant a l'ceil (ce) qui n'a pas evolue.
Fig. C. Mesenchyme cephalique apres 10 jours de culture en presence de tissu encephalique.
Le tissu encephalique (en) est entoure par un mesenchyme meninge lache (m).
Fig. D. Detail de la figure C, montrant l'os dermique developpe a la peripherie de l'ectomeninge. La substance osseuse (os) est entouree d'un perioste net (/?).
Fig. E. Embryon de poulet de 14 jours dont l'encephale a ete remplace par un fragment de
tube medullaire. Remarquer le defaut de fermeture du tube medullaire.
Fig. F. Embryon de poulet de 14 jours ayant subi l'inversion de l'encephale. Noter le developpement du bee superieur dans la region occipitale.
/. Embryol. exp. Morp/i., Vol. 19, Part 1
J. SCHOWING
PLANCHE 1
facing p. 86
Role inducteur de Vencephale
n
Fig. 2. Greffe chorio-allantoidienne de mesenchyme cephalique seul ou associe a
l'encephale embryonnaire. (a) Ensemble des deux mesenchymes cephaliques et du
territoire encephalique correspondant au moment du prelevement. (b) Separation
des mesenchymes: 1, mesenchyme cephalique seul; 2, mesenchyme cephalique
accompagne du territoire nerveux.
Fig. 3. Schema representant la substitution d'un fragment de tube medullaire a
l'encephale embryonnaire.
Fig. 4. Schema de l'inversion de l'encephale embryonnaire. Le rhombencephale prend
la place du prosencephale.
Fig. 5. Schema de l'intervention consistant a remplacer l'encephale posterieur par
l'encephale anterieur du meme embryon. (a) Le mesencephale et le rhombencephale
sont excises, (b) ils sont remplaces par le prosencephale.
87
88
J. SCHOWING
nise evoque le bee. Ces pieces osseuses font done partie de la face et proviennent
certainement de la differentiation des bourgeons maxillaires.
On ne voit en aucun cas apparaitre une formation osseuse assimilable a un
element de la boite cranienne.
Mesenchymes cephaliques cultives en presence de tissu nerveux
Vingt et une experiences nous ont fourni, apres 10 jours de culture, vingt et un
greffons dont dix-sept renferment un tissu encephalique bien evolue, et entoure
d'un mesenchyme meninge lache (Planche 1, fig. C). L'ectomeninge, plus dense
et bien vascularisee, montre sur sa face externe une lame osseuse typique,
correspondante a un ebauche de frontal. Cette ebauche est limitee par un perioste
tres net (Planche 1, fig. D). Le reste du mesenchyme est homogene et renferme
des formations cartilagineuses variables en taille et en position.
Les quatre autres cas montrent des traces de necrose, dues certainement au fait
que la circulation s'est installee tardivement dans le greffon. L'on n'y observe
aucune differentiation osseuse, seuls quelques cartilages sont visibles.
La comparaison des resultats figures dans le tableau 2 nous montre qu'ils
sont tres significatifs.
Nous voyons que des mesenchymes cephaliques jeunes, isoles et cultives en
greffe chorio-allantoidienne ne differencient aucun os assimilable a un frontal.
Tableau 2
Nombre Apparition Os de type
Inde cas d'os frontal facial differencies Probability
Mes. ceph. seul
Mes. ceph. + tissu nerv.
19
21
0
17
4
—
15
4
\
J
u uu:>
'
RECHERCHE DE LA SPECIFICITE DE L'lNDUCTEUR OSTEOGENE
Technique
Nous revenons ici a notre technique microchirurgicale d'excision.
Dans une premiere serie d'experiences, nous substituons a l'encephale embryonnaire un fragment de tube nerveux preleve entre la lOeme et la 20eme
paire de somites d'un embryon donneur (Fig. 3).
Pour remplacer un territoire encephalique par un autre, nous excisons
l'encephale entier et le remettons en place apres lui avoir fait subir une inversion
de 180° (Fig. 4). Le prosencephale occupe ainsi la place du rhombencephale, qui
se trouve lui-meme entre les yeux. Le mesencephale, qui joue le role de pivot
dans la rotation, est sensiblement a sa place normale. Cette serie experimentale
est completee par des excisions de l'encephale entier, suivies de la substitution
du prosencephale au rhombencephale du meme embryon.
Nous commencons par exciser le mesencephale et le rhombencephale (Fig. 5 a),
puis nous excisons le prosencephale, qui est mis sans inversion prealable a la
Role indueteur de Vencephale
89
place du rhombencephale (Fig. 5 b). Elle est accompagnee de temoins chez
lesqueJs J'encephale est egalement excise, mais replace normaJement apres
quelques minutes.
Dans tous Jes cas, Jes yeux sont epargnes.
Substitution (Pun fragment de tube nerveux a Vencephale embryonnaire
Douze embryons ont survecu a cette intervention. IJ sont caracterises par
J'absence de Ja face, excisee avec J'encephale. Les yeux sont plus ou moins
developpes suivant les cas. Us sont separes par le fragment de tube nerveux qui
s'est bien deveioppe et porte Je pJus souvent des traces de spina bifida (PJanche 1,
fig. E).
Chez de teJs embryons, iJ n'y a pas de voute cranienne. Seuls les constituants
posterieurs du crane, e'est-a-dire les supraoccipitaux, subsistent, de meme que
les squamosaux, qui s'articulent avec les carres.
Sq
Fig. 6. Schema du crane d'un embryon de pouJet de 14 jours ayant subi l'inversion
de I'encephale. Bee sup, bee superieur; Exo, exoccipital; F, frontal,/, arcjugal;jP,
parietal; Pa, palatin; Ps, parasphenoi'de; Q, carre; Sq, squamosal.
Les modifications du plancher cranien sont consecutives a J'absence de la
face. Les palatins sont recroqueviiles, le rostre du parasphenoide a disparu.
Tout se passe comme si Ton avait purement et simpiement excise 1'encephale
entier (Schowing, 1961a, fig. 13).
Le remplacement de 1'encephale embryonnaire par un fragment de tube
nerveux ne favorise done pas le developpement des os craniens, il semble que
seul J'encephaJe soit capabJe de determiner leur apparition.
Inversion de Vencephale
Vingt-quatre heures apres 1'intervention, nous constatons que la cicatrisation
s'est operee a tous les niveaux. Les territoires encephaliques excises sont ressoudes a ceux qui sont restes en place, I'ectoderme recouvre 1'ensemble et la
circulation sanguine est normalement retablie.
90
J. SCHOWING
Les dix temoins observes apres 14 jours d'incubation ne montrent aucune
malformation cranienne. Leur aspect est identique a celui des embryons normaux, les elements squelettiques n'ont subi aucun dommage.
Chez les dix embryons qui ont survecu a Tin version de l'encephale, le bourgeon
frontal accompagne generalement le prosencephale et se developpe pour former
un bee superieur d'aspect tres tourmente dans la region occipitale de la tete
(Planche 1, fig. F). Les yeux sont separes par le rhombencephale, l'ensemble est
recouvert par un epiderme normal. Le bee inferieur est bien developpe.
Huit d'entre eux ont un crane tres modifie par suite de la position anormale
de l'encephale. La plaque basilaire est alteree, les palatins et les arcs jugaux sont
recroquevilles par l'absence de face, le rostre du parasphenoide a disparu. La
face surplombe le complexe occipital qui subit peu de changement. Le rudiment
de bee superieur est forme de pieces osseuses premaxillaires et nasales (Fig. 6).
La voute cranienne est tres reduite. Elle se compose des squamosaux qui sont
legerement reduits dans leur partie dorsale. Les parietaux existent, ils sont
reduits et recouvrent le prosencephale. Leur position est normale. Les frontaux
sont egalement reduits a deux ecailles qui flanquent le mesencephale. Ils ne se
developpent jamais de maniere a recouvrir le rhombencephale.
Substitution du prosencephale au rhombencephale du mime embryon
Les sept echantillons etudies nous ramenent dans le domaine des synophtalmes typiques. Leur aspect est celui des monstres obtenus par excision du
prosencephale et du mesencephale, et decrits en 1965.
Leur squelette cranien est egalement typique des formes connues. II ne subsiste
de la voute cranienne que les squamosaux qui sont legerement reduits comme
dans le cas precedent. Les frontaux et les parietaux ont totalement disparu.
Le complexe occipital n'est pas touche par cette intervention.
Le plancher cranien presente les malformations caracteristiques de l'absence
de face, de plus, la plaque basilaire est reduite.
CONCLUSION
Le role de l'encephale dans l'organisation cranienne est confirme par nos
experiences de greffes chorio-allantoiidiennes. Un mesenchyme cephalique jeune,
done indifferencie, et cultive isolement n'evolue pas, meme s'il renferme un
territoire osseux presomptif. Par contre, le meme mesenchyme associe au territoire encephalique correspondant evolue, et Ton observe apres plusieurs jours
de culture l'apparition d'un os dermique a l'exterieur des membranes meningees.
Ces experiences contribuent a souligner l'importance de celles-ci, en particulier
de l'ectomeninge, derivee du mesenchyme perineural qui prend lui-meme son
origine dans le mesentoderme cephalique (van Gelderen, 1924, 1925, 1926;
Kappers, 1929, 1932). II est probable que la meninge molle a une autre origine,
mesectodermique selon Harvey & Burr (1924). Ce fait est a rapprocher des
Role inducteur de Vencephale
91
observations de Seno & Nieuwkoop (1958) et Chibon (1966) qui mettent en
valeur le role des cretes neurales dans la formation des meninges chez les
Amphibiens. S'il en est de meme chez l'embryon de poulet, cette difference
d'origine peut expliquer la difference de reaction a l'induction encephalique.
En accord avec Benoit (1960), nous pensons que le mesenchyme meninge est
incapable de reagir a l'induction de l'encephale, seule la partie externe du mesenchyme perineural est competente vis-a-vis de l'inducteur. Celui-ci agit a courte
distance, comme son homologue chondrogene.
Le remplacement de l'encephale embryonnaire par un fragment de tube
nerveux entraine l'absence de voute cranienne et des malformations squelettiques
identiques a celles que Ton rencontre apres avoir excise l'encephale entier. Ceci
permet de penser que l'inducteur osteogene est specifique. Nous constatons ici
une difference entre l'inducteur osteogene et l'inducteur chondrogene. En effet, la
(a)
(b)
Fig. 7. Schema representant les influences des territoires encephaliques sur les os de
voute cranienne: (a) lorsque l'encephale est en place normale, (6) lorsque l'encephale
a subi une inversion de 180°. Apres inversion, le frontal (F) est sous la seule influence
du mesencephale (M). Le rhombencephale (Rh) n'a aucune influence sur lui. Le
parietal (P) subit la seule influence du mesencephale (M), le prosencephale (Pr) n'a
aucune action sur lui.
capacite d'induire le cartilage otique ou vertebral chez les embryons d'oiseau
et de mammifere semble partagee entre les inducteurs normaux et quelques
organes embryonnaires (Grobstein & Holtzer, 1955; Strudel, 1955; Lash,
Holtzer & Holtzer, 1957; Benoit, 1960). Par contre, l'encephale embryonnaire
semble le seul a pouvoir induire les os dermiques du crane, le tissu nerveux axial
ne peut le suppleer.
Les experiences d'inversion de l'encephale ou de substitution du prosencephale
au rhombencephale rendent le probleme encore plus complexe, car il ressort
des resultats qu'elles apportent qu'il y a non pas un inducteur encephalique des
os craniens, mais plusieurs inducteurs localisee au niveau des vesicules encepha-
92
J. SCHOWING
liques primordiales. II semble en effet que le rhombencephale ne puisse induire
la formation des frontaux. Ceux-ci ne se developpent qu'au voisinage immediat
du mesencephale. De meme, les parietaux ne se differencient que si le mesencephale se trouve a proximite. Sa suppression entraine la disparition des parietaux, le prosencephale n'ayant pas le pouvoir d'induire leur formation. L'hypothese que nous avons representee par la Fig. 8 (Schowing, 19676) peut alors etre
completee par la Fig. 7.
Ces experiences montrent que si l'encephale induit la formation des os craniens
a distance, cette distance est tres courte. II n'y a done pas un inducteur encephalique osteogene, mais plusieurs inducteurs, chacun agit specifiquement sur une
ou plusieurs ebauches osseuses determinees.
A la lumiere de ces resultats, nous pouvons resumer en un schema general
les differents phenomenes d'induction (Fig. 8).
Frontal
Squamosal
Parietal
Occipital
ParasphenoYde
Chorde
BasisphdnoVde
Fig. 8. Schema general representant les differentes actions inductrices de
l'encephale et de la chorde sur les os de la boite cranienne.
RESUME
1. Partant de la technique des greffes chorio-allantoidiennes, nous avons
cultive des mesenchymes cephaliques isoles ages de moins de 60 h d'incubation.
En aucun cas nous ne voyons apparaitre de formation osseuse cranienne.
2. Les memes mesenchymes cephaliques cultives en presence de tissu encephalique evoluent dans la majorite des cas en os craniens typiques. Ceux-ci se
differencient a une distance correspondant a Fespace meninge.
3. Des experiences microchirurgicales consistent a substituer un fragment
de tube nerveux a l'encephale embryonnaire de poulets ages de 48 h. Ces embryons sont depourvus de voute cranienne, leur aspect evoque celui des
embryons prives de l'encephale entier.
Role inducteur de Vencephale
93
4. Si Ton fait subir a l'encephale une inversion de 180°, la voute cranienne est
reduite, les frontaux et les parietaux existent sous la forme d'ecailles osseuses
au voisinage du mesencephale.
5. Le remplacement du rhombencephale par le prosencephale du meme
embryon entraine la formation de monstres synophtalmes depourvus de voute
cranienne.
6. L'ensemble de ces experiences montre que l'encephale est l'inducteur des
os du crane. II exerce son influence inductrice a distance. D'autre part, l'induction
encephalique est specifique, le tissu axial ne peut le suppleer. Chaque territoire
encephalique exerce une induction particuliere sur les ebauches osseuses qui lui
sont voisines, a l'exclusion des autres. II n'y a done pas un inducteur encephalique osteogene, mais plusieurs inducteurs, chacun agit specifiquement sur une
ou plusieurs ebauches osseuses determinees.
SUMMARY
Evidence for the inductive role of the brain in the osteogenesis
of the chick skull
1. Cephalic mesoderm from chick embryos of less than 60 h incubation never
gave rise to cranial bone when grafted on to the chorio-allantoic membrane.
2. The same tissue gave rise in most cases to typical cranial bones when
associated with brain tissue. These bones form at a distance from the brain
which corresponds to the meningeal space.
3. Substituting spinal cord for brain in 48 h embryos led to the absence of the
cranial roof and the embryos resembled those lacking the whole brain.
4. On rotating the brain through 180° the cranial roof becomes reduced,
frontals and parietals being small bony scales near the mesencephalon.
5. Replacing the rhombencephalon by the prosencephalon of the same
embryo causes the formation of synophthalmic monsters lacking a cranial roof.
6. These results show that the brain is the inducer of the cranium. It acts at
a distance, and is specific, each region of the brain acting on neighbouring bone
anlagen. There is therefore, not a single osteogenic inductor, but several, each
acting on one or more bone anlagen.
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VAN GELDEREN,
{Manuscrit regu le 1 aout 1967)