17/11/2014 BEOLETTO Florian L2 CR : Victor CHABBERT
publicité
GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire 17/11/2014 BEOLETTO Florian L2 CR : Victor CHABBERT Génétique médicale C. BEROUD, remplacé par J. BOUDJARANE et T.BUSA 16 pages Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire (haplotypes ; interprétation de données mutationnelles ; notion de bioinformatique ; mucoviscidose) Plan A. Démarche diagnostic dans les maladies génétiques B. Diagnostic moléculaire des maladies génétiques : cas du diagnostic indirect I. Définitions II. Principe III. Marqueurs microsatellites IV. Exemples V. Notion d'informativité VI. Notion de recombinaisons VII. Haplotype Ce cours tombait souvent à l'examen du temps où ce n'était pas des QCM, mais comme cette année ça sera des QCM, le professeur ne sait pas si c'est techniquement possible que ce cours fasse l'objet de questions. Il faut savoir construire un haplotype au cas où. A. Démarche diagnostic dans les maladies génétiques L'interrogatoire et l'examen clinique associés à des examens complémentaires, qui ne sont pas forcément génétique (biochimie, imagerie...), permettent d'aboutir à un diagnostic clinique. Le but de l'analyse génétique va être de confirmer ou non ce diagnostic clinique. 1/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire B. Diagnostic moléculaire des maladies génétiques : cas du diagnostic indirect On peut faire des analyses de : • cytogénétique (caryotype standard, FISH...) ; • génétique moléculaire ; ◦ soit par diagnostic direct : séquençage du gène et recherche de l'anomalie génétique primaire ; ce qui est de plus en plus fait à l'heure actuelle ; ◦ soit par diagnostic indirect : en essayant de connaître le locus de l'anomalie et d'analyser son mode de ségrégation dans une famille par des haplotypes. Cette méthode a été utilisée pendant de nombreuses années quand on connaissait les gènes (on savait à peu près ou ils étaient), mais on ne savait pas aller chercher directement la mutation dans le gène. L'objectif du diagnostic moléculaire est d'établir un diagnostic précis par l'identification de l'anomalie génétique. Cela a un intérêt de certitude diagnostic pour permettre une prise en charge adaptée (les recommandations de certaines mutations ne sont pas les mêmes en terme de suivi) et un conseil génétique adéquat (risque d'être porteur, risque de récurrence...) Il y a deux approches : • diagnostic direct qui consiste en la recherche de l'anomalie génétique primaire permettant l'identification de mutations constitutionnelles délétères ; • diagnostic indirect qui à l'aide de marqueurs informatifs (haplotype) va permettre d'étudier la coségrégation d'un phénotype avec un allèle particulier dans une famille. Dans le diagnostic direct, on a donc un individu auquel on fait des analyses ; alors que dans le diagnostic indirect il faut disposer d'une famille suffisamment grande pour avoir des sujets sains et des sujets malades afin de savoir quel est l'haplotype qui ségrège avec la maladie. Dans ce cours, on ne s'intéresse qu'au diagnostic indirect. Actuellement, on utilise le diagnostic indirect dans certaines situations particulières (très restreintes) : • diagnostic prénatal de certaines maladies (recherche de la mutation causale) • et plutôt en complément de l'étude directe • diagnostic pré-implantatoire : analyse d'une seule cellule afin de savoir si le fœtus a hérité ou pas du marqueur pathologique / haplotype morbide (faire du séquencage sur une cellule n'est pas possible en raison de la trop faible quantité d'ADN : analyse directe impossible dans ce cas). La technique est aussi utilisée pour : • vérification de l'identité d'un échantillon : par exemple, quand on réalise un diagnostic prénatal, cette technique permet de confirmer que le prélèvement réalisé (de trophoblaste ou de liquide amniotique) est bien celui du fœtus et non celui de la mère par contamination (car le prélèvement peut être sanglant) ; • empreintes génétiques ; • autres applications. L'utilisation de marqueurs pour analyser la coségrégation marqueur/maladie nécessite de : • connaître la localisation du gène morbide : si on ne connaît pas le locus du gène, on ne peut aller trouver les marqueurs de polymorphisme qui vont l'entourer ; • connaître des marqueurs polymorphes localisés à proximité ou dans le gène ; • étudier la coségrégation familiale phénotype/marqueur : il faut que les marqueurs ségrègent toujours avec la maladie. 2/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Tout cela permet donc de réaliser un suivi indirect de la transmission d'une mutation dans une famille. Ainsi, pour chaque famille, l'étude va être différente. Principales contraintes : • nécessite de connaître le gène impliqué (ou le locus) pour choisir les marqueurs à utiliser (le problème se pose s'il y a hétérogénéité génétique) • nécessite une certitude du diagnostic clinique chez les sujets • nécessite une étude familiale • nécessite une famille suffisamment grande pour qu'elle soit « informative » : parfois non concluant. • risque d'erreur ou d'impossibilité de conclure en cas de recombinaison (ségrégation du marqueur d'un côté et la mutation de l'autre alors qu'il sont liés chez tous les autres individus). Par exemple, dans le cas du diagnostic prénatal par méthode indirecte, le résultat n'est sur qu'à 99%, le 1% correspondant au risque de recombinaison. I. Définitions Locus : emplacement sur un chromosome (d'un gène, d'une séquence...). Allèle : une ou plusieurs versions alternatives d'un même gène, d'une même séquence d'ADN. S'applique aux mutations, aux polymorphismes, aux marqueurs génétiques... Ex : pour un gène : allèle sauvage et allèles mutés ; pour un marqueur : différentes tailles (allèle de 8 répétitions, allèle de 1 répétitions, etc.). Hétérozygote : un individu est hétérozygote pour un locus lorsqu'il possède deux allèles différents à ce locus. Homozygote : un individu est homozygote pour un locus lorsqu'il possède deux allèles identiques à ce locus. Hémizygote : un individu est hémizygote pour un locus lorsqu'il possède un seul allèle à ce locus (cas du chromosome X chez l'homme). 3/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Génotype : ensemble des allèles à un ou plusieurs locus chez un individu. Haplotype : l'arrangement linéaire ordonné des allèles sur un chromosome. A, B, C : locus de polymorphisme. Lorsque l'on a des résultats bruts, on ne sait pas si on a A2 B2 C2 ou A2 B1 C2 ou A3 B1 C2, etc. On sait juste que l'individu a ces deux marqueurs mais on ne sait pas lequel est situé sur un allèle et lequel est situé sur l'autre. Le but de reconstruire ces haplotypes est de savoir dans quels alignements ils sont. Les allèles proches sont transmis ensemble (« en bloc ») sauf s'il y a une recombinaison méiotique entre 2 locus. II. Principe Les outils utilisés sont des marqueurs génétiques « anonymes ». Ce sont des variations polymorphes de la séquence d'ADN, répartis uniformément sur le génome et de localisation connue, n'ayant pas d'effet direct sur le phénotype. Il faut sélectionner des marqueurs à proximité du ou dans le gène/locus morbide impliqué (les marqueurs peuvent donc être intragéniques ou extragéniques). Les marqueurs n'ont pas d'effet pathologique. Ils sont utilisés pour suivre indirectement la transmission d'une mutation (connue ou non) dans une famille. Il existe différents types de marqueurs : • Microsatellites (ou Short Tandem Repeats : STR) : polymorphismes de répétitions, répartis uniformément dans le génome, tous les 25 à 100 kb. Ce sont ceux qui sont le plus utilisés car souvent on est mutltiallélique et non homozygote pour ces régions là. Ils sont multialléliques. • Single Nucleotide Polymorphism (SNP) : polymorphisme au niveau d'un nucléotide ◦ très abondants (1 SNP/1 kb) : > 1,5 millions de SNPs connus ◦ répartis uniformément dans le génome ◦ bi-alléliques • Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (RFLP) : polymorphismes de restriction. Il s'agit de marqueurs de polymorphismes qui réagissent avec des enzymes de restriction. • Autres : délétion, insertions... 4/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Il faut retenir que la plupart du temps ce sont les microsatellites qui sont utilisés. III. Les marqueurs microsatellites Le choix dans la région d'intérêt dépend du diagnostic clinique et des connaissances. On sélection les marqueurs de polymorphisme (marqueurs informatifs dans la famille) puis on procède à une amplification des régions par PCR de ces marqueurs ce qui permet d'obtenir des quantités suffisantes des séquences d'intérêt pour permettre leur détection (1 cellule contient environ 7 pg d'ADN). L'analyse des produits amplifiés permet ainsi la détection des allèles (taille des produits amplifiés) et la détermination du génotype. Ce sont des séquences d'ADN répétées en tandem d'un motif de 2 à 10 pb et dont la taille totale est inférieure à 100 pb. Ils sont très polymorphes et répartis uniformément sur l'ensemble du génome, principalement dans les séquences intergéniques et intragéniques (rarement dans les séquences codantes) et constituent d'excellents marqueurs génétiques. On sépare les allèles en fonction de leur taille. On détermine le statut de chaque individu pour le marqueur étudié : • 1 bande (ou 1 pic) si c'est un homozygote ; • 2 bandes (ou 2 pics) si c'est un hétérozygote. Pourquoi la technique de séquençage n'est-elle pas utilisée ? Car c'est beaucoup plus compliqué et ça coûte beaucoup trop cher. Dans quelles situations est-elle intéressante ? (aucune réponse du professeur) La séparation des allèles est réalisée en fonction de leur taille (non expliqué mais selon le ronéo de l'an passé : c'est une électrophorèse, l'ADN migre vers le + car il est chargé négativement). 5/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Diagnostic moléculaire indirect : récapitulatif Il s'agit d'une étude au niveau de la liaison marqueurs-maladie avec utilisation de marqueurs polymorphes intragéniques ou extragéniques pour analyser la coségrégation d'un phénotype avec un allèle particulier dans une famille. Il repose sur des méthodes de PCR de marqueurs situés dans le / près du locus morbide (si possible) afin de minimiser les risques d'erreurs dus à des événements de recombinaison. Les marqueurs microsatellites sont vraiment des marqueurs de premier choix. IV. Exemple : étude familiale, maladie autosomique dominante. L'homme a un haplotype à 105 / 113 et son épouse, à 105 / 115. Pour pouvoir interpréter il ne faut pas que trop de personnes aient le même haplotype (problème d'informativité ). La pathologie semble être dominante. Un enfant est 113 / 115 : il est donc forcément 113 de son père et 115 de sa mère. L'autre enfant est 105 / 115 : comme il est nécessairement 115 de sa mère, on en déduit qu'il est 105 de son père. 6/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire L'haplotype morbide semble être 113. Chez le père, l’allèle 113 du marqueur est sur le même chromosome que la mutation impliquée dans la maladie. Lorsque le père transmet le chromosome avec la mutation, il transmet aussi l'allèle 113. Cela permet de suivre indirectement la transmission de la mutation sans mise en évidence directe de celle-ci. V. Notion d'informativité Il s'agit d'une maladie autosomique récessive. Cas n° 1 : Quels allèles du marqueur sont liés au locus morbide ? L'allèle « 3 » paternel et l'allèle « 5 » maternel sont liés au locus morbide. Si on hérite et de 3 et de 5, on est malade ; si on hérite ou de 3 ou de 5, on est hétérozygote. Il y a coségrégation de ces allèles du marqueur avec les allèles mutés du gène. Il est ici possible de conclure : la famille est dite « informative ». Quel est le statut du fœtus si son génotype est : • 1/2 ? → sain ; • 2/5 ? → sain mais porteur hétérozygote ; • 1/3 ? → sain mais porteur hétérozygote ; • 3/5 ? → atteint. Attention, ceci est vrai sauf s'il y a eu une recombinaison entre le marqueur et le locus morbide. En pratique, nous n'utilisons jamais un seul marqueur. 7/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Chaque famille aura des marqueurs différents puisque les polymorphismes sont uniques pour chaque individu. Cas n°2 : Quels allèles du marqueur sont liés au locus morbide ? Ici les données ne permettent pas de distinguer quels allèles du marqueur sont liés aux allèles mutés du gène en cause. Le marqueur n'est pas informatif. Il n'est pas possible de conclure : la famille est dite « non informative ». Il faut poursuivre l'étude par l'analyse d'autres marqueurs. L'utilisation d'un grand nombre de marqueurs à un intérêt si la famille est non informative et réduit la possibilité de recombinaisons. VI. Notion de recombinaisons Pendant la méiose, les crossing-over provoquent l'échange de matériel génétique entre chromosomes homologues d'une même paire : il y a brassage génétique, échange de segments d'ADN avec l'autre chromosome de la paire et donc réarrangement du matériel génétique. La recombinaison entre 2 loci dépend de la distance entre eux : 1 % (1 cM) = 1 Mb 8/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire S'il y a crossing-over, l'allèle (marqueur) « rouge » (gris foncé) n'est plus lié à l'allèle muté : il a donc un risque d'erreur de conclusion, que le marqueur soit intra ou extragénique ! Il y a toutefois moins de recombinaisons pour les marqueurs intragéniques : à utiliser de préférence ! Ce risque dépend de la distance entre le marqueur et le gène impliqué dans la maladie. Cas d'une maladie autosomique récessive liée à l'X avec une recombinaison méiotique. La mère a un frère qui est atteint et qui a 1, mais elle a un fils atteint mais qui a un 4. Mais que c'est-il passé O_O ??? Il y a eu une recombinaison non homologue lors de la méiose maternelle et du coup le gène n'était plus associé à l'haplotype 1 mais au polymorphisme 4. 9/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Si le fœtus est de genre masculin, quel est son statut : atteint, sain ? Comment va-t-on faire pour faire le diagnostic ? Va-t-on dire que c'est le 1 ou que c'est le 4 qui marque le gène morbide ? On va essayer de trouver d'autres marqueurs car on ne peut pas assurer que ça soit 1 ou 4 qui marque le gène morbide. Le risque de recombinaison est de 1%. Toutefois, la mère a encore un risque de recombinaison ; et puis comme il y a déjà eu une recombinaison, cela veut dire que le marqueur et l'haplotype sont trop éloigné. Il faut trouver d'autres marqueurs. Diagnostic moléculaire indirect : récapitulatif En pratique, on utilise simultanément plusieurs marqueurs de loci proches (on fait plusieurs marqueurs au sein d'un même locus global) ce qui permet de réduire les problèmes de non-informativité et de recombinaisons. Au lieu de déterminer les allèles d'un marqueur lié à l'allèle muté (…du gène impliqué dans la famille étudiée), nous allons déterminer les allèles de plusieurs marqueurs liés à l'allèle muté (haplotype lié à l'allèle muté). VI. Haplotypes L'haplotype est une combinaison d'allèles « verticalement » disposées sur un même chromosome. Comment déterminer les haplotypes à partir des données brutes ? a. La démarche Les indispensables : • connaître l'ordre des marqueurs sur le chromosome • connaître les génotypes des individus • disposer de l'arbre généalogique 10/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire b. Les étapes 1. 2. 3. 4. 5. 6. disposer les chromosomes ordonner les marqueurs (A, B, C) placer les homozygotes (3/3, 1/1...) identifier les individus de la famille ordonner les chromosomes commencer par le haut Ce qu'il faut garder en tête : • • • • Les chiffres dans le tableau (qui correspondent aux marqueurs) ne sont pas dans l'ordre : il s'agit des résultats bruts (on ne sait pas encore quel allèle vient du père et quel allèle vient de la mère). Le but de reconstruire ces haplotypes est de savoir dans quels alignements ils sont (cf p.4). Les symboles ♂ et ♀ correspondent aux haplotypes hérités respectivement du père et de la mère (voir ci-dessous). Il faut toujours construire l'haplotype des enfants pour remonter ensuite à celui des parents puis redescendre à la fratrie. On va retrouver quelles sont les allèles d'un individu en se servant de ses enfants ou de ses parents. Les allèles proches sont transmis ensemble (« en bloc ») sauf s'il y a une recombinaison méiotique entre 2 locus (cf p.4). Comment lire l'arbre et le tableau : • • • • Chaque génération est désignée par un chiffre romain (I, II, III...) Chaque individu est désigné par un chiffre arabe (1, 2, 3...) Chaque individu d'une génération est donc désigné par 2 chiffres (I-1, II-2, III-5...) Chaque individu possède les 3 marqueurs (A, B, C) 11/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Explications : le but est de savoir quel marqueur vient de quel parent (de quoi l'individu a hérité de qui). • On considère l'individu II-2 (puisqu'on part des enfants). Pour le marqueur A : il est 1/3. I-1 (son père) est 3/3 et I-2 (sa mère) est 1/2. II-2 a donc hérité du 3 de son père et du 1 de sa mère. Pour le marqueur B : il est 2/3. I-1 est 2/4 et I-2 est 1/3. II-2 a donc hérité du 2 de son père et du 3 de sa mère. Pour le marqueur B : il est 3/5. I-1 est 1/3 et I-2 est 4/5. II-2 a donc hérité du 3 de son père et du 5 de sa mère. L'haplotype hérité du père (♂) est 3, 2, 3. Et l'haplotype hérité de la mère (♀) est 1, 3, 5. Comme la transmission se réalise en bloc, on peut maintenant écrire sur le chromosome de l'individu I-1 l'haplotype 3, 2, 3 et sur le chromosome de l'individu I-2 l'haplotype 1, 3, 5. Il reste à déterminer l'autre haplotype de chaque parent. Pour cela, on revient à la fratrie. • On considère l'individu II-3. Pour le marqueur A : il est 2/3. I-1 est 3/3 et I-2 est 1/2. Il a donc hérité du 3 de son père et du 2 de sa mère. Pour le marqueur B : il est 1/2. I-1 est 2/4 et I-2 est 1/3. Il a donc hérité du 2 de son père et du 1 de sa mère. Pour le marqueur C : il est 3/4. I-1 est 1/3 et I-2 est 4/5. Il a donc hérité du 3 de son père et du 4 de sa mère. 12/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire L'haplotype hérité du père est 3, 2, 3 (encore une fois, ce qui illustre bien le fait qu'il y a transmission de l'haplotype « en bloc »). Et l'haplotype hérité de la mère est 2, 1, 4. On a donc découvert ici le 2ème haplotype de la mère que l'on s'empresse d'écrire sur le chromosome de l'individu I-2. Le deuxième haplotype du père I-1 sera découvert grâce à l'individu II-5. Et ainsi de suite ! On peut remarquer que pour les individus III-1 et III-2 les haplotypes respectifs sont 4, 1, 2 (hérité de la mère) et 3, 2, 5 (hérité du père) mais ne sont pas présents chez leurs parents. Les haplotypes 4, 1, 4 de la mère et 3, 2, 3 du père n'ont pas été transmis « en bloc ». Il s'agit donc de recombinaisons. Les recombinaisons permettent de regarder si l'anomalie est plus proche du locus A et B que de C par exemple (voir exemple qui suit). c. Exercice : l'haplotype Résultat : 13/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Sur l'ENT, la diapo est en couleur : à chaque haplotype correspond une couleur ce qui met d'autant mieux en évidence le fait que la transmission se réalise « en bloc ». Quel est l'haplotype qui ségrège avec la maladie ? Il s'agit de l'haplotype 1, 1, 2. On remarque que pour l'individu III-5 il y a eu une recombinaison / crossing-over (l'haplotype 1, 1, 2 de sa mère n'a pas été transmis « en bloc » puisque cet individu est 1, 1, 4). Toutefois, il est quant même malade. Ainsi, plus que 1, 1, 2 qui est associé à la pathologie, c'est 1, 1 (que se soit le 2 ou le 4, ils sont suffisamment éloignés pour quand ça s'échange ça ne change pas le statut). d. Applications Dans certaines situations particulières : • Diagnostic prénatal de certaines maladies (utilisé de plus en plus rarement), et autant que possible en complément de l'étude directe : cas de certaines formes familiales de la myopathie de Duchenne (récessive liée à l'X) où on étudie une vingtaine de marqueurs intragéniques ; • Diagnostic pré-implantatoire (DPI) : lorsque le DPI concerne une maladie causée par un gène qui est le siège de nombreuses mutations différentes d'une famille à l'autre, et qu'il est simple (car déjà mit au point) d'utiliser un panel de marqueurs de ce gène. Cette méthode permet de vérifier l'identité d'un échantillon concernant : • le diagnostic prénatal ; • la médecine légale (réalisation d'empreintes génétiques, de recherche de parenté...). Elle permet une approche diagnostic à visée étiologique si on dispose de familles potentiellement informatives : • pour exclure certains loci dans des maladies avec hétérogénéité génétique ; • pour chercher (par puces SNP) des zones d'homozygotie. Enfin, en recherche cette approche a été historiquement très utilisée pour identifier des loci morbides puis des gènes par analyses de liaison. e. Exercice : la recherche de paternité Recherche de paternité : cas n°1 Est-ce que l'un des pères potentiels peut être exclu ? Est-ce que l'un des pères peut être retenu ? On n'est plus sur un locus avec plein de polymorphismes mais sur un multi-locus. On peut être soit A, soit B, soit C. Par exemple, pour le locus 1 (LDLR) l'enfant est A, pour le locus 2 (GYPA) l'enfant est B, pour le locus 3 (HBGG) il est AB, de même pour le 4 (D7S8), et pour le 5 (GC) il est BC. 14/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Pour le 1er locus, l'enfant est A, c'est-à-dire qu'il est homozygote à A. Sa mère est AB ; elle lui a donc forcément donné le A. Son père potentiel a du lui aussi lui transmettre un A, puisque l'enfant est homozygote. Ainsi, le locus 1 ne permet pas d'identifier le père puisque les pères potentiels 1 et 2 sont tous deux A. Pour le 2ème locus, l'enfant est B (homozygote pour B). La mère est B. L'enfant a nécessairement reçu un B de son père (car il est homozygote pour B). Ainsi, le père potentiel 2 ne peut pas être le véritable père. Pour le 3ème locus, l'enfant est AB (hétérozygote). Sa mère est AC. Il a donc reçu le A de sa mère. Son père lui a transmis un B. Ce locus ne nous permet pas de connaître quel est le véritable père puisque les pères potentiels sont tous deux porteurs de B. Pour le 4ème locus, l'enfant est AB (hétérozygote). Sa mère est A. Il a donc reçu le A de sa mère. Le père lui a donc forcément transmis un B. Les deux pères potentiels ont du B, ce n'est donc pas concluant pour ce locus. Pour le 5ème locus, l'enfant est BC (hétérozygote). Sa mère est AB. Elle lui a donc transmit le B. Et le père lui a nécessairement transmis le C. Une fois encore, ce locus ne permet pas de conclure. Le père 2 est discordant sur un locus (le deuxième) à la différence du père 1. Le père 1 est donc peut-être le père de cet enfant. Recherche de paternité : cas n°2 Est-ce que l'un des pères potentiels peut être exclu ? Est-ce que l'un des pères peut être retenu ? 15/16 GENETIQUE MEDICALE – Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire Grâce au locus 1, on remarque que le père potentiel 1 ne peut pas être le véritable père puisque l'enfant étant AB et sa mère, B, le père lui a forcément transmis un A. Or le père potentiel 1 ne possède pas ce A contrairement au père potentiel 2. La suite concorde pour le père potentiel 2. Il peut donc s'agir du véritable père. Et parce qu'un ronéo sans dédicace c'est triste... : Merci à Marie-Lucie pour ses explications ;) ! Merci à Noémie pour des photos qui n'ont finalement pas servi (désolé ^^!)... Et merci à Kenza d'être sortie de son lit pour me soutenir moralement:) ! Merci également à Victor pour sa disponibilité. Et bien sur, une pensée pour tous ceux qui ont tristement découvert ce jour là dans l'amphi qu'ils étaient le (la) fils (fille) du facteur... 16/16
