30/11/2015 LE BOHEC Blandine L2 CR : Orianne DODIER
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GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes 30/11/2015 LE BOHEC Blandine L2 CR : Orianne DODIER Génétique médicale C. BEROUD 14 pages Étude de ségrégation, ED de génétique moléculaire (haplotypes ; interprétation de données mutationnelles ; notion de bioinformatique ; mucoviscidose) Diagnostic indirect et haplotypes. Plan A. A. Démarche diagnostique dans les maladies génétiques B. C. B. Diagnostic moléculaire des maladies génétiques : cas du diagnostic indirect I. Définitions II. Principe III. Marqueurs microsatellites IV. Exemples V. Notion d'informativité VI. Notion de recombinaisons VII. Haplotype : a. Principe b. Les différentes étapes c. Exercices VIII. Applications IX. Exercices A. Démarche diagnostique dans les maladies génétiques L'interrogatoire et l'examen clinique associés à des examens complémentaires, qui ne sont pas forcément génétiques (biochimie, imagerie...), permettent d'aboutir à un diagnostic clinique. Le but de l'analyse génétique va être de confirmer ou non ce diagnostic clinique. 1/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes B. Diagnostic moléculaire des maladies génétiques : cas du diagnostic indirect On peut faire des analyses de cytogénétique (caryotype standard, FISH...) ou de génétique moléculaire : • soit par diagnostic direct : séquençage du gène et recherche de l'anomalie génétique primaire ; ce qui est de plus en plus fait à l'heure actuelle ; • soit par diagnostic indirect : analyse de ségrégation des marqueurs en essayant de connaître le locus de l'anomalie et d'analyser son mode de ségrégation dans une famille par des haplotypes. Cette méthode a été utilisée pendant de nombreuses années quand on connaissait les gènes (on savait à peu près ou ils étaient), mais qu'on ne savait pas aller chercher directement la mutation dans le gène. L'objectif du diagnostic moléculaire est d'établir un diagnostic précis par l'identification de l'anomalie génétique. Cela a un intérêt de certitude diagnostique pour permettre une prise en charge adaptée (les recommandations de certaines mutations ne sont pas les mêmes en terme de suivi) et un conseil génétique adéquat (risque d'être porteur, risque de récurrence...). Il y a deux approches : • diagnostic direct qui consiste en la recherche de l'anomalie génétique primaire permettant l'identification de mutations constitutionnelles délétères. • diagnostic indirect qui à l'aide de marqueurs informatifs (haplotypes) va permettre d'étudier la coségrégation d'un phénotype avec un allèle particulier dans une famille. Dans le diagnostic direct, on a donc un individu auquel on fait des analyses, alors que dans le diagnostic indirect il faut disposer d'une famille suffisamment grande pour avoir des sujets sains et des sujets malades afin de savoir quel est l'haplotype qui ségrège avec la maladie. Dans ce cours, on ne s'intéresse qu'au diagnostic indirect. Actuellement, on utilise le diagnostic indirect dans certaines situations particulières (très restreintes) : • diagnostic prénatal de certaines maladies (recherche de la mutation causale) : plutôt en complément de l'étude directe (par exemple, pour un avortement, la responsabilité est très grande donc il faut être sûr du diagnostic). • diagnostic pré-implantatoire : analyse d'une seule cellule afin de savoir si le fœtus a hérité ou pas du marqueur pathologique ou de l'haplotype morbide (faire du séquencage sur une cellule n'est pas possible en raison de la trop faible quantité d'ADN donc l'analyse directe est impossible dans ce cas). La technique est aussi utilisée pour : • la vérification de l'identité d'un échantillon : par exemple, quand on réalise un diagnostic prénatal, cette technique permet de confirmer que le prélèvement réalisé (de trophoblaste ou de liquide amniotique) est bien celui du fœtus et non celui de la mère par contamination (car le prélèvement peut être sanglant) ; • les empreintes génétiques ; • d'autres applications. L'utilisation de marqueurs pour analyser la coségrégation marqueur/maladie nécessite de : • connaître la localisation du gène morbide : si on ne connaît pas le locus du gène, on ne peut aller trouver les marqueurs de polymorphisme qui vont l'entourer ; • connaître des marqueurs polymorphes localisés à proximité ou dans le gène ; • étudier la coségrégation familiale phénotype/marqueur : il faut que les marqueurs ségrègent toujours avec la maladie. 2/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes Tout cela permet donc de réaliser un suivi indirect de la transmission d'une mutation dans une famille. Ainsi, pour chaque famille, l'étude va être différente. Les principales contraintes sont : • la nécessité de connaître le gène impliqué (ou le locus) pour choisir les marqueurs à utiliser (le problème se pose s'il y a hétérogénéité génétique). • la nécessité d'avoir une certitude du diagnostic clinique chez les sujets. • la nécessité d'une étude familiale. • la nécessité d'avoir une famille suffisamment grande pour qu'elle soit « informative », c'est à dire qu'il faut avoir accès aux autres personnes de la famille et que c'est parfois non concluant. • le risque d'erreur ou d'impossibilité de conclure en cas de recombinaison (ségrégation du marqueur d'un côté et la mutation de l'autre alors qu'il sont liés chez tous les autres individus). I. Définitions Locus : emplacement sur un chromosome (d'un gène, d'une séquence...). Allèle : une ou plusieurs versions alternatives d'un même gène, d'une même séquence d'ADN. S'applique aux mutations, aux polymorphismes, aux marqueurs génétiques... Exemples : pour un gène, allèle sauvage et allèles mutés ; pour un marqueur, différentes tailles (allèle de 8 répétitions, allèle de 2 répétitions, etc). Un marqueur est d'autant plus informatif qu'il a de nombreux allèles. Hétérozygote : un individu est hétérozygote pour un locus lorsqu'il possède deux allèles différents à ce locus. Homozygote : un individu est homozygote pour un locus lorsqu'il possède deux allèles identiques à ce locus. Hémizygote : un individu est hémizygote pour un locus lorsqu'il possède un seul allèle à ce locus (cas du chromosome X chez l'homme). Génotype : ensemble des allèles à un ou plusieurs locus chez un individu. Haplotype : arrangement linéaire ordonné des allèles sur un chromosome. 3/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes A, B, C : locus de polymorphisme. Lorsque l'on a des résultats bruts, on ne sait pas si on a A2 B2 C2 ou A2 B1 C2 ou A3 B1 C2, etc. On sait juste que l'individu a ces deux marqueurs mais on ne sait pas lequel est situé sur un allèle et lequel est situé sur l'autre. Le but est de reconstruire ces haplotypes pour savoir dans quels alignements ils sont. Les allèles proches sont transmis ensemble (« en bloc ») sauf s'il y a une recombinaison méiotique entre deux locus. II. Principe Les outils utilisés sont des marqueurs génétiques « anonymes ». Ce sont des variations polymorphes de la séquence d'ADN, répartis uniformément sur le génome et de localisation connue, n'ayant pas d'effet direct sur le phénotype. Il faut sélectionner des marqueurs à proximité du gène/locus ou dans le gène/locus morbide impliqué (les marqueurs peuvent donc être intragéniques ou extragéniques). Quand on a le choix il est préférable de choisir un marqueur intragénique car il y moins de risque de recombinaison. CR : les marqueurs n'ont pas d'effet pathologique. Ils sont utilisés pour suivre directement ou indirectement la transmission d'une mutation (connue ou non) dans une famille). Il existe différents types de marqueurs : • Microsatellites (ou Short Tandem Repeats : STR) : polymorphismes de répétitions, répartis uniformément dans le génome, tous les 25 à 100 kb. Ce sont ceux qui sont le plus utilisés car souvent on est multi-allélique et non homozygote pour ces régions là (marqueurs de choix). • Single Nucleotide Polymorphism (SNP) : polymorphismes au niveau d'un nucléotide, très abondants (1 SNP/1 kb), on en connaît plus de 1,5 millions, ils sont répartis uniformément dans le génome et bialléliques. • Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (RFLP) : polymorphismes de restriction. Il s'agit de marqueurs de polymorphismes qui réagissent avec des enzymes de restriction. C'est aussi un marqueur bi-allélique (s'apparente aux SNP). • Autres : délétions, insertions... Il faut retenir que la plupart du temps ce sont les microsatellites qui sont utilisés. III. Les marqueurs microsatellites Le choix de la région d'intérêt dépend du diagnostic clinique et des connaissances. On sélectionne les marqueurs de polymorphisme (marqueurs informatifs dans la famille) puis on procède à une amplification des régions par PCR de ces marqueurs ce qui permet d'obtenir des quantités suffisantes des séquences d'intérêt pour permettre leur détection (1 cellule contient environ 7 pg d'ADN donc il faut amplifier les régions d'intérêt car sinon elles sont indétectables). L'analyse des produits amplifiés permet ainsi la détection des allèles (selon la taille des produits amplifiés) et la détermination du génotype. 4/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes Les microsatellites sont des séquences d'ADN répétées en tandem, d'un motif de 2 à 10 pb et dont la taille totale est inférieure à 100 pb. Plus le motif est grand, plus le produit amplifié sera grand et moins ce sera pratique. Ils sont très polymorphes et répartis uniformément sur l'ensemble du génome, principalement dans les séquences intergéniques et intragéniques (rarement dans les séquences codantes) et constituent d'excellents marqueurs génétiques. On sépare les allèles en fonction de leur taille. On détermine le statut de chaque individu pour le marqueur étudié : 1 bande (ou 1 pic) si c'est un homozygote, 2 bandes (ou 2 pics) si c'est un hétérozygote. Pourquoi la technique de séquençage n'est-elle pas utilisée ? Car c'est beaucoup plus compliqué à interpréter lorsque l'on a des allèles différents (l'un avec 12 répétitions et l'autre 15 répétitions par exemple), le risque d'erreur est donc accru. Dans quelle situation est-elle intéressante ? Sur le chromosome X chez un homme (car hémizygote donc il n'y a qu'un seul allèle) La séparation des allèles est réalisée en fonction de leur taille (c'est une électrophorèse, l'ADN migre vers le + car il est chargé négativement). Diagnostic moléculaire indirect : récapitulatif Il s'agit d'une étude au niveau de la liaison marqueurs-maladie avec utilisation de marqueurs polymorphes intragéniques ou extragéniques pour analyser la coségrégation d'un phénotype avec un allèle particulier dans une famille.Il repose sur des méthodes de PCR de marqueurs situés dans ou à proximité du locus morbide (si possible) afin de minimiser les risques d'erreurs dus à des événements de recombinaison. Les marqueurs microsatellites sont vraiment des marqueurs de premier choix. 5/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes IV. Exemple : étude familiale, maladie autosomique dominante. L'homme a un haplotype 105/113, la femme a un haplotype 105/115. Il y a donc 3 allèles dans cette famille. Un enfant est 113 / 115 : il est donc forcément 113 de son père et 115 de sa mère. L'autre enfant est 105 / 115 : comme il est nécessairement 115 de sa mère, on en déduit qu'il est 105 de son père. La pathologie semble être dominante. L'haplotype morbide semble être 113 (incertitude à cause de la probabilité de recombinaison) Chez le père, l’allèle 113 du marqueur est sur le même chromosome que la mutation impliquée dans la maladie. Lorsque le père transmet le chromosome avec la mutation, il transmet aussi l'allèle 113. Cela permet de suivre indirectement la transmission de la mutation sans mise en évidence directe de celleci. 6/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes V. Notion d'informativité Il s'agit d'une maladie autosomique récessive. Cas n° 1 : Quels allèles du marqueur sont liés au locus morbide? L'allèle « 3 » paternel et l'allèle « 5 » maternel sont liés au locus morbide. Si on hérite et de 3 et de 5, on est malade ; si on hérite ou de 3 ou de 5, on est hétérozygote (asymptomatique). Il y a coségrégation de ces allèles du marqueur avec les allèles mutés du gène. Il est ici possible de conclure : la famille est dite « informative ». Quel est le statut du fœtus si son génotype est : • 1/2 ? → sain. • 2/5 ? → sain mais porteur hétérozygote (porteur sain). • 1/3 ? → sain mais porteur hétérozygote (porteur sain). • 3/5 ? → atteint. Attention, ceci est vrai sauf s'il y a eu une recombinaison entre le marqueur et le locus morbide. En pratique, nous n'utilisons jamais un seul marqueur. Cas n°2 : Quels allèles du marqueur sont liés au locus morbide ? Ici les données ne permettent pas de distinguer quels allèles du marqueur sont liés aux allèles mutés du gène en cause. Le marqueur n'est pas informatif car il est incapable de dissocier les deux chromosomes du père et ceux de la mère. Il n'est pas possible de conclure : la famille est dite « non informative ». Il faut poursuivre l'étude avec d'autres marqueurs. L'utilisation d'un grand nombre de marqueurs à un intérêt si la famille est non informative et réduit la possibilité de recombinaisons. 7/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes VI. Notion de recombinaison Pendant la méiose, les crossing-over provoquent l'échange de matériel génétique entre chromosomes homologues d'une même paire : il y a brassage génétique, échange de segments d'ADN avec l'autre chromosome de la paire et donc réarrangement du matériel génétique. Le plus souvent ces recombinaisons sont équilibrées. La recombinaison entre 2 locus dépend de la distance entre eux. S'il y a crossing-over, l'allèle (marqueur) ''smiley gris foncé'' n'est plus lié à l'allèle muté : il y a donc un risque d'erreur de conclusion, que le marqueur soit intra ou extragénique ! Il y a toutefois moins de recombinaisons pour les marqueurs intragéniques, ils sont donc à utiliser de préférence. Ce risque dépend de la distance entre le marqueur et le gène impliqué dans la maladie. Cas d'une maladie récessive liée à l'X avec une recombinaison méiotique Au niveau du premier schéma, à la place de l'allèle 4 on s'attendait à avoir un 1. Or, du fait d'une recombinaison, la mutation porte maintenant sur l'allèle 4. 8/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes Si le fœtus (losange) est de genre masculin, quel est son statut : atteint, sain ? Comment va-t-on faire pour faire le diagnostic ? Va-t-on dire que c'est le 1 ou que c'est le 4 qui marque le gène morbide ? L'hypothèse la plus probable est que l'individu soit malade car il est rare d'avoir une recombinaison méiotique pour la deuxième fois. Il y a cependant une infime chance qu'il y ait eu une deuxième recombinaison chez la mère et dans ce cas l'individu sera sain. Diagnostic moléculaire indirect : récapitulatif En pratique, on utilise simultanément plusieurs marqueurs de locus proches (on fait plusieurs marqueurs au sein d'un même locus global) ce qui permet de réduire les problèmes de non-informativité et de recombinaisons. Au lieu de déterminer les allèles d'un marqueur lié à l'allèle muté (du gène impliqué dans la famille étudiée), nous allons déterminer les allèles de plusieurs marqueurs liés à l'allèle muté (haplotype lié à l'allèle muté). VI. Haplotypes Un haplotype est une combinaison d'allèles « verticalement » disposées sur un même chromosome. Comment déterminer les haplotypes à partir des données brutes ? a. La démarche Les indispensables : • connaître l'ordre des marqueurs sur le chromosome. • connaître les génotypes des individus. • disposer de l'arbre généalogique. b. Les étapes 1) Dispose les chromosomes 2) Ordonner les marqueurs 3) Places les homozygotes 4) Identifier les individus de la famille 5) Ordonner les chromosomes 6) Commencer par le haut 9/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes Ce qu'il faut garder en tête : • Les chiffres dans le tableau (qui correspondent aux marqueurs) ne sont pas dans l'ordre : il s'agit des résultats bruts (on ne sait pas encore quel allèle vient du père et quel allèle vient de la mère). Le but de reconstruire ces haplotypes est de savoir dans quels alignements ils sont (cf p.4). • Les symboles ♂ et ♀ correspondent aux haplotypes hérités respectivement du père et de la mère (voir ci-dessous). • Il faut toujours construire l'haplotype des enfants pour remonter ensuite à celui des parents puis redescendre à la fratrie. On va retrouver quelles sont les allèles d'un individu en se servant de ses enfants ou de ses parents. • Les allèles proches sont transmis ensemble (« en bloc ») sauf s'il y a une recombinaison méiotique entre 2 locus (cf p.4). Comment lire l'arbre et le tableau : • • • Chaque génération est désignée par un chiffre romain (I, II, III...) Chaque individu est désigné par un chiffre arabe (1, 2, 3...) Chaque individu d'une génération est donc désigné par 2 chiffres (I-1, II-2, III-5...) • Chaque individu possède les 3 marqueurs (A, B, C) 10/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes Explications : le but est de savoir quel marqueur vient de quel parent. • On considère l'individu II-2 (puisqu'on part des enfants). Pour le marqueur A : il est 1/3. I-1 (son père) est 3/3 et I-2 (sa mère) est 1/2. II-2 a donc hérité du 3 de son père et du 1 de sa mère. Pour le marqueur B : il est 2/3. I-1 est 2/4 et I-2 est 1/3. II-2 a donc hérité du 2 de son père et du 3 de sa mère. Pour le marqueur B : il est 3/5. I-1 est 1/3 et I-2 est 4/5. II-2 a donc hérité du 3 de son père et du 5 de sa mère. L'haplotype hérité du père (♂) est 3, 2, 3. Et l'haplotype hérité de la mère (♀) est 1, 3, 5. Comme la transmission se réalise en bloc, on peut maintenant écrire sur le chromosome de l'individu I-1 l'haplotype 3, 2, 3 et sur le chromosome de l'individu I-2 l'haplotype 1, 3, 5. Il reste à déterminer l'autre haplotype de chaque parent. Pour cela, on revient à la fratrie. • On considère l'individu II-3. Pour le marqueur A : il est 2/3. I-1 est 3/3 et I-2 est 1/2. Il a donc hérité du 3 de son père et du 2 de sa mère. Pour le marqueur B : il est 1/2. I-1 est 2/4 et I-2 est 1/3. Il a donc hérité du 2 de son père et du 1 de sa mère. Pour le marqueur C : il est 3/4. I-1 est 1/3 et I-2 est 4/5. Il a donc hérité du 3 de son père et du 4 de sa mère. L'haplotype hérité du père est 3, 2, 3 (encore une fois, ce qui illustre bien le fait qu'il y a transmission de l'haplotype « en bloc »). Et l'haplotype hérité de la mère est 2, 1, 4. On a donc découvert ici le 2ème haplotype de la mère que l'on s'empresse d'écrire sur le chromosome de l'individu I-2. Le deuxième haplotype du père I-1 sera découvert grâce à l'individu II-5. Et ainsi de suite On peut remarquer que pour les individus III-1 et III-2 les haplotypes respectifs sont 4, 1, 2 (hérité de la mère) et 3, 2, 5 (hérité du père) mais ne sont pas présents chez leurs parents. Les haplotypes 4, 1, 4 de la mère et 3, 2, 3 du père n'ont pas été transmis « en bloc ». Il s'agit donc de recombinaisons. Les recombinaisons permettent de regarder si l'anomalie est plus proche du locus A et B que de C par exemple (voir exemple qui suit). 11/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes c. Exercice : Reconstruire l'haplotype Résultat : Sur l'ENT, la diapo est en couleur : à chaque haplotype correspond une couleur ce qui met d'autant mieux en évidence le fait que la transmission se réalise « en bloc ». Quel est l'haplotype qui ségrège avec la maladie ? Il s'agit de l'haplotype 1, 1, 2. On remarque que pour l'individu III-5 il y a eu une recombinaison / crossing-over (l'haplotype 1, 1, 2 de sa mère n'a pas été transmis « en bloc » puisque cet individu est 1, 1, 4). Toutefois, il est quant même malade. Ainsi, ça n'est plus 1, 1, 2 qui est associé à la pathologie, c'est 1, 1 (que se soit le 2 ou le 4, ils sont suffisamment éloignés pour quand ça s'échange ça ne change pas le statut). 12/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes VIII. Applications (le prof a passé très rapidement ce sous chapitre) Dans certaines situations particulières : • Diagnostic prénatal de certaines maladies, et autant que possible en complément de l'étude directe : cas de certaines formes familiales de la myopathie de Duchenne (récessive liée à l'X) où on étudie une vingtaine de marqueurs intragéniques. • Diagnostic pré-implantatoire (DPI) : lorsque le DPI concerne une maladie causée par un gène qui est le siège de nombreuses mutations différentes d'une famille à l'autre, et qu'il est simple d'utiliser un panel de marqueurs de ce gène. Cette méthode permet de vérifier l'identité d'un échantillon concernant : • le diagnostic prénatal. • la médecine légale (réalisation d'empreintes génétiques, de recherche de parenté...). Elle permet une approche diagnostique à visée étiologique si on dispose de familles potentiellement informatives : • pour exclure certains locus dans des maladies avec hétérogénéité génétique • pour chercher (par puces SNP) des zones d'homozygoties Enfin, en recherche cette approche a été historiquement très utilisée pour identifier des locus morbides puis des gènes par analyses de liaison. IX. Exercices : la recherche de paternité Recherche de paternité : cas n°1 Est-ce que l'un des pères potentiels peut être exclu ? Est-ce que l'un des pères peut être retenu ? On n'est plus sur un locus avec plein de polymorphismes mais sur un multi-locus. On peut être soit A, soit B, soit C. Par exemple, pour le locus 1 (LDLR) l'enfant est A, pour le locus 2 (GYPA) l'enfant est B, pour le locus 3 (HBGG) il est AB, de même pour le 4 (D7S8), et pour le 5 (GC) il est BC. Pour le 1er locus, l'enfant est A, c'est-à-dire qu'il est homozygote à A. Sa mère est AB ; elle lui a donc forcément donné le A. Son père potentiel a du lui aussi lui transmettre un A, puisque l'enfant est homozygote. Ainsi, le locus 1 ne permet pas d'identifier le père puisque les pères potentiels 1 et 2 sont tous deux A. Pour le 2ème locus, l'enfant est B (homozygote pour B). La mère est B. L'enfant a nécessairement reçu un B de son père (car il est homozygote pour B). Ainsi, le père potentiel 2 ne peut pas être le véritable père. 13/14 GENETIQUE MEDICALE – Diagnostic indirect et haplotypes Pour le 3ème locus, l'enfant est AB (hétérozygote). Sa mère est AC. Il a donc reçu le A de sa mère. Son père lui a transmis un B. Ce locus ne nous permet pas de connaître quel est le véritable père puisque les pères potentiels sont tous deux porteurs de B. Pour le 4ème locus, l'enfant est AB (hétérozygote). Sa mère est A. Il a donc reçu le A de sa mère. Le père lui a donc forcément transmis un B. Les deux pères potentiels ont du B, ce n'est donc pas concluant pour ce locus. Pour le 5ème locus, l'enfant est BC (hétérozygote). Sa mère est AB. Elle lui a donc transmit le B. Et le père lui a nécessairement transmis le C. Une fois encore, ce locus ne permet pas de conclure. Le père 2 est discordant sur un locus (le deuxième) à la différence du père 1. Le père 1 est donc peutêtre le père de cet enfant. Recherche de paternité : cas n°2 Est-ce que l'un des pères potentiels peut être exclu ? Est-ce que l'un des pères peut être retenu ? Grâce au locus 1, on remarque que le père potentiel 1 ne peut pas être le véritable père puisque l'enfant étant AB et sa mère, B, le père lui a forcément transmis un A. Or le père potentiel 1 ne possède pas ce A contrairement au père potentiel 2. La suite concorde pour le père potentiel 2. Il peut donc s'agir du véritable père. 14/14
