de la culture cellulaire au modèle animal

M2P EGPR
L'histiocytose Langerhansienne
et le polyomavirus de Merkel :
de la culture cellulaire au modèle animal
Sous l’encadrement du Pr. Laurence Nieto
Ma. Victoria Ayala
Victor Chaumeton
Léonid Velikovsky
2015 - 2016
Remerciement
En tout premier lieu, nous souhaitons vivement remercier notre professeur encadrante, Laurence,
qui a su nous guider, avec toute la pédagogie dont elle est capable, pour la réalisation de ce projet.
Nous saluons aussi sa patience (il en a fallu beaucoup), et son accessibilité. Son recul dans le domaine
de la recherche nous a été indispensable au cours de la mise en place de ce travail (ou jeu ?).
Nous remercions Laurent, pour nous avoir permis de suivre le cursus d’expression génique et de
protéines recombinantes, ainsi que pour sa vision de l’enseignement, à notre sens d’une qualité rare,
et pour les nombreuses discussions qui découlaient de ses interventions.
Nous tenons à remercier Remy pour ses conseils et ses éclaircissements, particulièrement au sujet
des maladies chroniques inflammatoires.
Nous souhaitons également remercier le reste de l’équipe pédagogique, Pascal, Samuel, Eric,
François, Vincent et Sylvie. Ensemble, ils ont participé à notre épanouissement intellectuel et
scientifique.
Enfin, nous remercions vivement la promotion n°16 du M2P EGPR, pour la qualité du travail fourni et
pour la bonne humeur régnant dans notre petite salle.
Abréviations
CCL20: chimiokine CCL20
DC: dendritic cell
Gluc : luciférase Gaussia
GM-CSF : facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages
HL-MS : HL multi-systémique
HL-RO - : HL dans les organes non à risque élevé
HL-RO + : HL dans les organes à risque élevé
HL-SS : HL à système unique
hPBMC : cellules mononucléaires humaines du sang périphérique
IFN- γ : interféron-γ
IL : interleukine-1
IL-17A : interleukine 17A
IL-1R : récepteur de l’interleukine 1
LC : cellules de Langerhans
HL : Histiocytose Langerhansienne
MCC : Merkel Cell Carcinoma
MCMV : cytomégalovirus murin
MCPyV/MCV : Merkel cell polyomavirus
MGCs : cellules géantes multinuclées
MoDC : cellules dendritiques dérivées de monocytes
NCRR: non-coding regulatory region
PAMP: pathogen-associated microbia pattern
Pfu : unités formant des plages
Tg : Transgenic
Th17: lymphocytes T auxiliaires 17
TLR: Toll-like receptor
TNF-α : facteur de nécrose tumorale α
TRAP : phosphatase acide tartrate-résistante
Sommaire
I - Introduction
L'histiocytose langerhansienne
Mutation BRAF
Merkel cell polyomavirus (MCPyV) et HL
Le virus
La réponse immunitaire contre l'infection viral
Epidémiologie
« Cytokine storm »
IL-17A
IL-1
CCL20
II - Analyse d'une publication
Etude de l'IL-17A dans les sérums des sujets avec HL
L’action d’IL-17A
Caractérisation fonctionnelle des DCs stimulées par IL-17A
III - Projet de Recherche
Établissement du modèle murin
Prise de sang dans le sinus orbitaire
Sacrifice de la souris et prélèvement des organes et du sang
Rôle du virus : Infection par MCPyV
Analyse sanguine
Analyse tissulaire
Modèles cellulaires
Différenciation des iPSC en cellules de la lignée myéloïde
Transduction des iPSC par un vecteur lentiviral
VI - Perspectives
V - Bibliographie
Résumé
Figure 1 : Présentation des différents stades de maturation des cellules de l’immunité.
Dans la moelle osseuse, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) vont se différencier en précurseurs
myéloïdes (MP) et lymphoïdes (ML). Les MPs donneront naissance à un précurseur commun des monocytes
et des cellules dendritiques (MDP) qui pourra se différencier en monocytes ou en précurseurs de DCs (CDP).
Ces CDP subiront une dernière étape de différentiation en pré DCs (Pre-c DC) avant d’être libérées dans la
circulation sanguine. Ils termineront leur maturation en infiltrant les différents tissus ciblés.
Le lignage des cellules dendritiques communes est indiqué par une étoile rouge, celui des cellules dendritiques
dérivées de monocytes par une étoile orange.
cDC: classical dendritic cell ; CDP : common dendritic cell precursor ; HSC : hematopoietic stem cell ; LCs :
Langherans cell ; LP : lymphoid precursor ; lpDCs : lamina propria dendritic cells ; M macrophage ; MDP :
monocyte/macrophage and dendritic cell progenitors ; moDCs : monocyte-derived dendritic cells ; MP :
myeloid precursor ; Pre-c DC : preclassical dendritic cell ; Pro-B : B cell progenitor ; Pro-T :T cell progenitor
Introduction
L'histiocytose Langerhansienne
Les maladies orphelines sont caractérisées comme étant des maladies rares dont on ne
dispose pas de traitements efficaces. Parmi elles, l’histiocytose Langheransienne n’échappe pas à la
règle : elle reste une maladie peu caractérisée et mal comprise. De plus, les thérapies actuellement
proposées n’ont pas étaient développées à la base pour soigner l’HL mais plutôt pour des maladies
présentant un spectre symptomatique proche de l’HL, comme une inflammation chronique
(psoariasis, maladie de Crohn’s, sclérose en plaques), la formation de granulome avec la présence de
cellules géantes multinuclées (MGCs) (infection à Mycobacterium tuberculosis) ou une résorption
osseuse (poly arthrite rhumatoïde). L’HL est une maladie rare (1/200000 environ) (Guyot-Goubin et
al, 2008) qui se caractérise par une infiltration tissulaire excessive de cellules dendritiques de type
Langerhans conduisant à la formation de cellules géantes multinuclées et de granulomes (Morimoto
et al, 2014).
Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigènes, localisé au sein des
tissus. Elles jouent un rôle notamment dans l’induction de la réponse immunitaire adaptative et dans
la tolérance du ‘’soi’’. Elles dérivent généralement d’un progéniteur hématopoïétique (Fig 1) présent
dans la moelle osseuse. Au cours de la différentiation, les précurseurs des cellules dendritiques
(cellules progénitrices myéloïdes, progéniteur monocytaire) vont s’orienter vers la lignée dendritique
via la stimulation par différentes cytokines qui sont majoritairement le GM-CSF et le TNF et seront
libérées dans le sang et la lymphe. Le recrutement tissulaire des DCs est la dernière phase de leur
maturation, dans le sens ou après cette étape, les DCs seront capable de présenter un antigène aux
cellules de l’immunité (lymphocyte T notamment). L’infiltration tissulaire est stimulée par la
libération de cytokines et chimiokines chimio-attractives (CCL20 et l’INF-) par les tissus
inflammatoires ou néoplasiques. Il est important de noter que le lignage des DCs est extrêmement
complexe dans le sens où il existe différentes sous populations de cellules dendritiques qui dérivent
parfois de progéniteurs différents. De plus, ces cellules sont également capables de se former à partir
de monocytes par stimulation au TGF-, IL-4 et GM-CSF (Caux et al, 1992).
Dans la pathologie HL, l’infiltration excessive des DCs peut toucher un ou différents organes,
avec une agressivité variable, ce qui permet de diviser la maladie en deux classes : L’HL focale, encore
appelée histiocytose « single system », ou un seul système organique est touché et L’HL multifocale
ou histiocytose « multi system ». Le caractère disséminé de l’HL est établi par la mise en évidence
d’au moins une atteinte hépatique, pulmonaire, hématopoïétique ou splénique et représente la
forme la plus grave de la maladie. L’os, la peau et l’hypophyse sont les organes les plus souvent
3
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Figure 2 : Implication de la voie NF-B dans l’histiocytose Langheransienne
NF-B joue un rôle dans la répression ou l'activation des gènes codants, et est retenue dans le cytoplasme par
la protéine inhibitrice IB. La dégradation d’IB par phosphorylation et ubiquitination permet la translocation
de NF-B jusqu'au noyau et l'activation de la transcription des gènes cibles
1) L’induction de la voie NF-B débute par l’activation d’un récepteur de la famille des TLR (toll like receptor)
par des cytokines pro-inflammatoires (IL-1, TNF-…). 2) Ce TLR va induire la phosphorylation d’I-B, le
répresseur fonctionnel d’NF-B. I-B phosphorylé va ensuite être ubiquitinylé par une ubiquitine ligase et est
envoyé au protéasome. 3) I-B est dégradé dans le protéasome, les ubiquitines sont libérées dans le
cytoplasme. 4) NF-B se retrouve libre dans le cytoplasme (retrouvé actif dans les DCs et MGCs). 5) NF-B
pourra traverser la membrane nucléaire et jouer son rôle d’activateur transcriptionnel, activant la libération
de cytokines pro inflammatoires, de facteurs mitogéniques ou encore de facteurs de résistances à l’apoptose.
P : phosphate ; Ub : ubiquitine ; Il : interleukine ; NF-B : nuclear factor-kappa B ; IB : inhibitor of kappa B ; IL
: interleukine
touchés. De ces atteintes organiques découlent des dérégulations métaboliques et fonctionnelles qui
dépendent du tissu atteint tel qu’une résorption osseuse, l’apparition d’un diabète insipide, le déficit
en facteurs de croissances, la présence de lésions tissulaires cutanées notamment (Bandalian-Very et
al, 2013).
La maladie est caractérisée notamment par la formation de granulome avec la présence de
MGCs. Ces cellules ressemblent aux ostéoclastes, et proviennent de la fusion des DCs (Coury et al,
2008). Elles sont capables de dégrader la matrice extra cellulaire grâce à l’activité de plusieurs
enzymes (TRAP, MMP-9, cathepsine K). La présence anormale de MGCs dans les tissus joue un rôle
dans l’apparition des lésions.
La variabilité des tableaux cliniques retrouvés pose de grandes difficultés dans le dépistage et
les soins promulgués aux patients. Les stratégies thérapeutiques actuelles reposent sur l’utilisation
d’anti-inflammatoires stéroïdiens (corticoïdes) et d’anti tumoraux classiquement utilisé dans le
traitement des lymphomes tel que le méthotrexate ou les vinca-alcaloïdes. Par manque de
caractérisation de la maladie, ces thérapies donnent des résultats plus qu’aléatoires (Gadner et al,
2001 et 2008). Chez les patients atteint de la forme ‘’single system’’, les traitements recommandés
reposent sur une stratégie ‘’wait and see’’ adapté à l’évolution de la maladie. Pour les cas présentant
des lésions cutanées ou osseuses, l’injection locale de corticostéroïde (prednisolone) permet de
maitriser les poussées de la maladie. Lorsque plusieurs os présentent des lésions (on reste dans une
forme « single system »), la mise en place d’une corticothérapie à long terme (6 à 12 mois) et à plus
forte dose, associée à l’utilisation de vinca-alcaloïde (vinblastine) présente de bons résultats, à savoir
une stabilisation de la maladie (Morimoto et al, 2010). Cette même thérapie est utilisée lorsque la
maladie évolue vers une forme ‘’multi système’’, mais reste sans risque majeur pour le patient. En
revanche, si un ou plusieurs organe(s) à risque est/sont touché(s) (10% des malades) à savoir le foie,
la rate, les poumons ou le système hématopoïétique, la thérapie évolue vers l’utilisation de vincaalcaloïde (vincristine) associé à un anti mitotique, la cytarabidine et à une corticothérapie sur le long
terme. Ces patients présentent un risque élevé de développer des séquelles à vie, tel que l’apparition
d’un diabète insipide ou une fragilité osseuse importante. Pour les individus atteints de la forme
multi-systémique de l’HL, ces thérapies présentent un taux de rechute d’environ 30% (Gadner et al,
2013).
Deux voies métaboliques se retrouvent impactées dans l’HL, NF-B (Fig 2) et la voie des
MAPK (Fig 3A). La voie NF-B, activé notamment par l’IL-1 (Murakami et al, 2014) va entrainer la
libération de facteur pro-inflammatoire, mitogénique, de résistance à l’apoptose et d’attraction
expliquant en partie la formation de granulomes et le potentiel migratoire anormal des DCs dans les
A
B
Figure 3 : Impact des mutations retrouvées chez les patients sur la voie des MAPK :
A) Schéma récapitulatif de la voie des MAPK, les mutations retrouvées chez les malades sont indiquées par une
étoile rouge. Après activation d’un récepteur (cytokine, hormone de croissance), la sérine thréonine kinase Ras
va se retrouver activée par la fixation d'un GTP. Ras, de son côté ira activer la protéine Raf, Raf activera les
protéines MAP2K1 (ou MEK1) et MAP2K2 (ou MEK2), qui elle-même active ERK en le phosphorylant. ERK est le
dernier maillon connu de cette cascade, il pourra directement activer des facteurs de transcription, entrainant
la libération de cytokines et l’activation du cycle cellulaire entre autre.
B) Impact d’ERK phosphorylé sur l’agressivité de l’histiocytose Langheransienne. Plus le précurseur présentant
une forte concentration en ERK phosphorylé est précoce, plus la maladie risque d’évoluer vers une forme multisystémique grave.
MAPK: mitogen-activated protein kinases ; ERK : extracellular signal-Regulated Kinases ; MEK : mitogenactivated extracellular signal-regulated protein kinase ; HL : histiocytose Langheransienne.
tissus touchés. Cette voie, dans le cadre de l’HL (Coury et al, 2008) et de la poly arthrite rhumatoïde
(Kotake et al, 1999) est retrouvée active dans les DCs et les MGCs des sujets malades. La voie des
MAPK joue un rôle dans la régulation de la prolifération, la survie, la différentiation et la migration
cellulaire.
Des analogies existent au niveau des symptômes retrouvés entre l’HL et d’autres maladies
chroniques inflammatoires comme la poly arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn’s et l’infection à
Mycobacterium tuberculosis. De plus des études basées sur l’utilisation de modèles animaux (Zhou et
al, 2007 ; Umemura et al, 2007) ont mis en évidence l’impact de l’IL-17A sur la formation de
granulome et la résorption osseuse dans les pathologies cités précédemment. La publication que
nous allons présenter en seconde partie analyse en détail les mécanismes impliquant l’IL-17A dans
l’apparition des symptômes de l’HL et de la fusion des DCs en MGCs.
L’étiologie de la maladie reste actuellement un mystère, même si la découverte récente
d’une mutation de BRAF (V600E BRAF) présente chez des patients atteints pousse l’argumentation en
faveur d’une cause néoplasique (Bandalian-Very et al, 2010).
Mutation BRAF
L’équipe de Badalian-Very a montré que la protéine BRAF présentait la mutation V600E dans 50% des
patients atteint de l’HL (sur une cohorte de 41 patients) conduisant à une expression constitutive
d’ERK phosphorylé. Cette mutation est retrouvée dans certains cas de mélanomes, de cancers
colorectaux et de leucémies myéloïdes (Chan et al, 2009 ; Davies et al, 2002). Cependant, l’impact de
cette mutation sur l’origine et l’évolution de la maladie n’est pas clairement définit (Badalian-Very et
al, 2010). Afin de mieux comprendre le rôle de cette mutation, de nouvelles études ont été réalisées.
Elles ont permis de dire que l’agressivité de la maladie n’est pas corrélée avec la présence directe de
la mutation (Berres et al, 2014 ; Chakraborty et al, 2014). En revanche la présence anormalement
forte d’ERK phosphorylé dans les DCs des sujets malades peut être reliée avec l’agressivité de l’HL
(Fig 3B) (R. Chakraborty et al, 2014). Lorsque les premiers précurseurs des DCs tel que les
progéniteurs myéloïdes ou sanguins, présentent de fortes concentrations en ERK phosphorylé, les
sujets atteints présentent plus souvent une évolution multi systémique grave (Chakraborty et al,
2014). Alors que la présence d’ERK phosphorylé dans des concentrations élevées au niveau des DCs
matures ou dans leurs précurseurs tissulaires (plus tardif que les progéniteurs myéloïdes et
circulants) entraine plus souvent l’atteinte d’un seul système organique. D’autre part, il est décrit la
présence d’autres mutations au niveau de la protéine MAP2K1 (Fig 3A et 3B), pouvant jouer un rôle
dans la surexpression d’ERK phosphorylé dans les cellules touchées (Chakraborty et al, 2014).
A
B
MCPyV
Figure 4 : Présentation du polyomavirus de Merkel : structure et génome
A) Schéma représentant la structure de la capside du virus et l’agencement de l’ADN au sein de la capside. Les
protéines structurales VP1, VP2 et VP3 sont représentées ainsi que l’ADN enroulé autour des histones. A
droite, une vision externe de la capside est présentée.
B) Organisation génétique de l’ADN viral. Les séquences codantes pour les protéines VP1, VP2 et VP3 sont
indiqué respectivement en vert, orange et jaune. Celles codantes pour les antigènes T sont représentées de la
manière suivante : Small T en bleu, Large T en violet et 57kT en bleu clair et le cadre blanc correspond à
l’origine de réplication.
MCPyV : Merkel cell polyomavirus ; VP : viral protein
Merkel cell polyomavirus (MCPyV) et l’histiocytose Langheransienne
Le Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV ou MCV) est un polyomavirus humain découvert en
2008 grâce aux progrès technologiques réalisés dans le domaine du séquençage à haut débit.
L’intérêt porté à ce virus par la communauté scientifique s’est largement accru depuis que son
implication dans l’oncogenèse des carcinomes cutanés épithéliaux et en particulier au Merkel Cell
Carcinoma (MCC) a été démontrée (Feng et al., 2008).
Les cellules de Merkel se situent dans la couche basale de l’épiderme et au niveau du bulbe
des follicules pileux, et sont plus abondants dans les zones de la peau impliquées dans la sensation
du toucher. Elles forment des synapses avec les extrémités terminales des fibres nerveuses sensitives
et servent comme mécanorécepteurs traduisant la sensation tactile (Halata et al.,2003). Les cellules
de Merkel et les cellules de Langerhans (LC) partagent certaines caractéristiques telles que la
localisation et l´association étroite avec des nerfs périphériques. Il existe une interaction
fonctionnelle entre eux. Ainsi, ces cellules pourraient communiquer par des dendrites dans lesquelles
certains neuropeptides ou cytokines peuvent être stockés (Kayo et al.,2002).
Le virus
Le MCPyV est un virus non enveloppé portant un ADN double brin d'environ 5400 paires de
bases (Johne et al., 2011) (Fig 4A). Son génome est similaire aux autres polyomavirus humains : il
comprend une origine de réplication conservée entre tous les virus de cette famille, ainsi que deux
régions codantes non chevauchantes et en orientation inverse. Une de ces régions est codée en
phase précoce et permet l’expression des antigènes T (Small T, Large T (LT) et 57kT) alors que la
deuxième, codée en phase tardive, permet l’expression des protéines de la capside (VP1, VP2, VP3).
Ces régions sont séparées par une région régulatrice non codante (non-coding regulatory region
(NCRR)) qui contient l'origine de réplication virale (Feng et al., 2008) (Shuda et al., 2008) (DeCaprio et
al., 1988) (Schowalter et al.,2013) (Fig 4B).
La réponse immunitaire contre l'infection viral
Les récepteurs TLR ("Toll-like receptor") sont des récepteurs présents à la surface de certains
types cellulaires chez l'homme et les mammifères. Ces récepteurs très conservés par l'évolution
jouent un rôle important dans l'immunité innée, notamment dans les défenses contre les
microorganismes. Ils peuvent reconnaître des motifs moléculaires dénommés PAMP pour "pathogenassociated microbia pattern". Des virus seront détectés par différents TLRs et, lors de la liaison avec
leurs ligands, tous (sauf TLR3) recrutent la protéine adaptatrice MyD88. Cette protéine a la capacité
d’activité (par l’intermédiaire du complexe IRAK/ TRAF6 et de TAK1) la voie NF-B et la voie des
MAPK (Fig 5A) (Li et al., 2012 ; Murakami et al., 2015 ; Takeda et al., 2004).
A
B
Figure 5 : Rôle et influence du polyomavirus de Merkel dans l’histiocytose Langheransienne.
A) Schéma récapitulatif du mécanisme d’activation des TLRs. Les TLR possèdent des séquences très conservées
inter-espèce, et sont capable de reconnaître le polyomavirus des cellules de Merkel. Cette reconnaissance
induit le recrutement de la protéine adaptatrice MyD88 qui, par l’intermédiaire du complexe IRAK/TRAF6 et
de la protéine TAK1, va activer la voie NF-B et la voie des MAPK. L’action conjointe de ces deux voies va
entrainer une libération importante de cytokines pro inflammatoire notamment.
B) Etude épidémiologique sur la présence du polyomavirus de Merkel chez les patients atteint d’HL. La
prévalence de l’infection par le MCPyV est représentée en ordonnée. La cohorte est divisée en cinq groupe
selon l’âge, de gauche à droite au niveau de l’axe des abscisses : de 0 à 5 ans ; de 6 à 15 ans ; de 16 à 25 ans ;
de 26 à 50 ans et plus de 50 ans
MCPyV/MCP : Merkel cell polyomavirus ; TLR : toll-like receptor ; MyD88: myeloid differentiation primary
response gene 88 ; IRAK: interleukin-1 receptor-associated kinase ; TRAF6: TNF receptor associated factor 6 ;
TAK1: TGF-beta activated kinase 1; MKK: mitogen-activated protein kinase kinase; ERK: extracellular signalregulated kinase: JNK: c-Jun N-terminal kinase ; AP-1: activator protein-1 ; NF-B : nuclear factor-kappa B ; HL :
histiocytose Langheransienne
Le MCPyV est détecté par le TLR9 intracellulaire qui détecte les nombreux motifs CpG non-méthylé
de l’ADN double brin viral (Shahzad et al., 2013). Son activation entraine, par l’intermédiaire de la
voie NF-B, la production et la libération de cytokines et de chimiokines pour réprimer l'infection
viral (Ishii et al., 2006 ; Tsujimura et al., 2004). Dans le contexte de la HL, l'infection du MCPyV peut
stimuler la production d’IL-1 des précurseurs des DCs. La production d’IL-1 pourrait être accentuée
par la présence de la mutation BRAF V600E comme nous verrons plus tard (Murakami et al., 2014).
Epidémiologie
Des immunodosages enzymatiques spécifiques de VP1 ont montré que jusqu'à à 80% de la
population adulte ont des anticorps sériques dirigés contre MCPyV (Carter et al., 2009 ; Tolstov et
al.,2009). La séropositivité est quasi inexistante chez les nouveau-nés (Gustafsson et al., 2012) mais
devient largement répandue chez les enfants dans leur première décennie de vie, continuant à
augmenter avec l'âge, ce qui suggère que l'exposition au virus se produit au début l'enfance (Chen et
al., 2011).
Le même profil est retrouvé chez les patients atteint de l’ HL : le sérum des enfants âgés d’un
an ou moins n’étaient pas positifs aux anticorps contre MCPyV. En revanche, la valeur augmente
jusqu’à 43% chez les enfants âgés de 2 à 5 ans et 49% chez des enfants et des jeunes adultes entre 6
et 15 ans. Enfin, 80% dans des patients de plus de 50 ans sont séropositifs pour ce virus (Tolstov et
al.,2009) (Fig 5B).
L'ADN viral a été détecté dans une large variété de localisations anatomiques mais de façon
relativement faible par rapport à la peau, où à la fois l'ADN viral et le virions encapsulés peuvent être
détectés (Feng et al.,2008). Ce virus fait partie de la microflore physiologique, principalement de la
peau, où se trouvent les cellules de Merkel. Cependant, chez des sujets immunodéprimés, on peut
observer la réactivation du virus (Spurgeon et al.,2013).
Le groupe de Murakami a détecté la présence du MCPyV dans les monocytes sanguins des
patients présentant la forme disséminée de la maladie avec une atteinte d’organes à risque élevé
(HL-RO +). Alors que le virus n’est pas détéctable dans les monocytes des patients présentant des
formes moins sévères de la HL, sans atteinte d’organes à risque élevé (HL-RO -). Parmi les patients
HL-RO -, la présence de l’ADN MCPyV n’a été détecté que dans les LC lésionnelles (Murakami et
al.,2013).
Le tropisme cellulaire reste peu décrit, ainsi que les modes de diffusion et les réservoirs du
MCPyV dans le corps humain (Spurgeon et al.,2013). Le virus pourrait persister dans les monocytes
inflammatoires et profiter de leur capacité migratoire pour ce propager dans l’hôte et se maintenir
dans les tissus inféctés (Mertz et al.,2010). Au niveau de la HL, l’équipe de Murakami émettent
Figure 6 : Cellules et cytokines impliquées dans « l’orage de cytokine » chez les patients atteint d’HL
Les quatre types cellulaires majoritairement impliqués dans l’orage de cytokines sont présentées : les
macrophages (rose), les lymphocytes T (violet), les polynucléaires éosinophiles (rouge) et les cellules de
Langerhans des patients malades (orange). Les cytokines et les chimiokines retrouvées au niveau des lésions
des patients sont indiquées. Les effets activateurs et inhibiteurs des cytokines et des chimiokines sur les types
cellulaires concernés sont respectivement représentés en bleu et en rouge.
CCL : chemokine (C-C motif) ligand ; TGF : transforming growth factor ; GM-CSF : granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor ; TNF : tumor necrosis factor ; IL : interleukine ; IFN : interferon ; PGE2 :
prostaglandine E2 ; CD : cluster of differentiation ; LIF : Leukemia inhibitory factor ; LCH : histiocytose
Langheransienne
l’hypothèse que si des monocytes porteurs de la mutation BRAF V600E reconnaissent le MCPyV dans
les vaisseaux sanguins, il pourrait plutôt induire une HL-RO + tandis que s’il est reconnu dans les
tissues périphériques par des précurseurs de LC ou par des LCs matures, portant tous les deux la
mutation, on observera plutôt une HL-RO - (Murakami et al.,2014).
« Cytokine storm »
On observe, dans les lésions des patients atteints de HL une grande variété de cytokines à
des niveaux élevés. Ce phénomène est désigné par l’expression « orage de cytokines » (« cytokine
storm »). Parmi ces cytokines, on trouve l’interféron-γ (IFN- γ), le facteur de nécrose tumorale α
(TNF-α), le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages (GM-CSF) et de
nombreuses interleukines, notamment IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-10 et IL-17A (Egeler et al.,
1999, Laman et al., 2003, Coury et al., 2008). Les différents types cellulaires présents au niveau des
lésions, à savoir les éosinophiles, les macrophages, les lymphocytes T et les cellules dendritiques
anormales (les cellules HL) se partagent la production de ces facteurs. La Fig 6 tirée de la publication
de Laman représente les types cellulaires impliqués et les cytokines produites.
Dans la suite de cette introduction, l’accent sera mis sur l’interleukine-1, la chimiokine CCL20
et sur l’interleukine 17A.
IL-17A
IL-17A est une interleukine pro-inflammatoire. L’équipe de C. Delprat a détecté de l’IL-17A
dans les lésions, ainsi que dans le sérum des patients atteints de l’HL. Ces auteurs ont montré que
l’IL-17A était synthétisée par les cellules dendritiques et était responsable de la fusion de ces cellules,
aboutissant à la formation des cellules géantes multinuclées (MGCs). Ces MGCs seraient à l’origine
des lésions observés chez les malades (Coury et al, 2008). Ces résultats seront présentés en détail
dans la deuxième partie.
IL-1
L’interleukine 1 (IL-1), une autre interleukine pro-inflammatoire, a également été détectée dans les
sites de lésion chez des patients atteints de HL (De Graaf et al., 1996 ; Egeler et al., 1999), ainsi que
dans la salive de ces mêmes patients (Preliasco et al., 2008). Un des rôles connus d’IL-1 est de
participer à la différentiation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T auxiliaires 17 (Th17), et
de maintenir leur état de différentiation (Chung et al., 2009). Les lymphocytes auxiliaires Th17 sont
reconnus comme des producteurs majeurs d’IL-17A (Annunziato et al., 2012) et pourraient être une
des sources d’IL-17A détectée chez les patients. Bien qu’on détecte peu ou pas de Th17 dans les
lésions des patients atteints de l’HL, leur implication dans la maladie ne peut pas être complètement
écartée.
De plus, une boucle autocrine de régulation positive a été décrite pour IL-1. En effet, le
récepteur à l’interleukine 1 (IL-1R) sollicite la voie de signalisation NF-B. Parmi les gènes
positivement régulés par cette voie, se trouve le gène codant l’interleukine-1.
Ainsi, IL-1 est capable d’induire sa propre production. La voie de signalisation intracellulaire
du récepteur IL-1R implique l’adaptateur protéique MyD88 (Muzio et al., 1997). Comme dit
précédemment les TLRs reconnaissent des motifs conservés des pathogènes et activent également la
voie NF-κB en sollicitant MyD88 (O’Neill et al., 2008). Murakami et al. émettent l’hypothèse selon
laquelle MCPyV serait reconnu par les TLRs. Ainsi, la production d’IL-1 serait suractivée par l’action
concomitante de MCPyV et d’IL-1 elle-même sur les récepteurs TLR et IL-1R respectivement
(Murakami et al, 2015).
La mutation BRAF V600E aboutit à la phosphorylation constitutive de la kinase ERK, un des
intermédiaires de la voie de signalisation des MAP kinases. Cependant ERK est rapidement
déphosphorylée par la phosphatase DUSP6. L’adaptateur MyD88, libéré suite l’activation des
récepteurs TLR et IL-1R auxquels il est associé, est capable de se lier à la protéine ERK phosphorylée,
et d’empêcher l’interaction entre ERK phosphorylée et la phosphatase DUSP6 (Coste et al., 2010).
Ainsi ERK reste phosphorylée plus longtemps et provoque la suractivation de la voie des MAP
kinases. Cette voie contrôle l’expression de gènes impliqués dans la prolifération. Ce mécanisme
permettrait d’expliquer le nombre anormalement élevé de cellules dendritiques observé chez les
patients atteints de HL.
CCL20
La chimiokine CCL20 est surexprimée par les cellules dendritiques présentes dans les lésions
des malades (Annels et al., 2003). CCL20 exerce un effet chimioattracteur sur les cellules portant
l’unique récepteur à CCL20, le récepteur CCR6. Les DCs immatures expriment CCR6, et un des rôles
connus de CCL20 est de recruter et de retenir ces cellules immatures sur les sites d’inflammation, au
niveau de la peau notamment (Dieu et al., 1998). Quand les DCs immatures rencontrent et
phagocytent un antigène, la maturation a lieu et se traduit entre autres par un arrêt d’expression de
CCR6 et par l’expression de récepteurs à d’autres chimiokines. Ainsi, les cellules dendritiques
matures peuvent quitter le site d’inflammation et migrer dans les ganglions lymphatiques où elles
présentent l’antigène aux lymphocytes T. Pour des raisons mal élucidées, dans le contexte de HL, la
maturation des cellules dendritiques est incomplète ; elles portent conjointement des marqueurs des
DCs matures et immatures : on parle de phénotype semi-mature (Laman et al., 2003). Notamment,
les DCs des patients présentent constitutivement le récepteur CCR6 (Annels et al., 2003). Par
conséquent, CCL20 joue probablement un rôle dans le recrutement de nouvelles DCs immatures ou
IL-1
Stimule
la différenciation
Th17
MCPyV
B).
C).
IL-1R
TLR
Recrutement
IL-17
CCL20
A).
IL-1
CCL20
Stimule
la
prolifération
Cellule
LCH
Fusion
D).
MGCs
Fig 7 : Dérégulation des voies de signalisation NF-B et MAPK, et implication des interleukines dans
l’histiocytose Langheransienne.
A). L’activation des récepteurs membranaires de la famille Toll-like (TLR) et du récepteur à l’interleukine 1 (IL1R) par le Polyomavirus de Merkel (MCPyV), et par l’interleukine 1 (IL-1) respectivement, libère l’adaptateur
protéique MyD88 dans les cellules dendritiques des patients (cellule HL). D’une part, MyD88 empêche la
déphosphorylation de la kinase ERK, elle-même constitutivement phosphorylée par la protéine Raf mutée, ce
qui provoque une suractivation de la voie des MAP kinases. Cela aboutirait à la prolifération des cellules HL.
D’autre part, MyD88 active la voie NF-B, en induisant ainsi l’expression de la chimiokine CCL20 et de l’IL-1.
Une boucle autocrine de régulation par l’IL-1 de l’expression de l’IL-1 pourrait ainsi se mettre en place.
B). L’interleukine 1 produite par les cellules HL pourrait stimuler la différenciation des lymphocytes T en
lymphocytes T helper 17 (Th17).
Les lymphocytes Th17 sont connus pour sécréter de l’interleukine 17 (IL-17)
C). La chimiokine CCL20, produite par les cellules HL serait capable d’attirer d’autres cellules HL sur les sites de
lésion, ainsi que des lymphocytes Th17 (Recrutement).
D). CCL20 et IL-17, produites par les cellules HL et les Th17, provoquent la fusion des cellules HL en cellules
géantes multinucléées (MGC) qui seraient à l’origine des lésions observées chez les patients.
MCPyV : Merkel cell polyomavirus ; TLR : toll-like receptor ; MyD88: myeloid differentiation primary response
gene 88 ; NF-B : nuclear factor-kappa B ; CCL : chemokine (C-C motif) ligand ; IL : interleukine ; LCH :
histiocytose Langheransienne ; MGC : cellule géante multinucléée ; Th17 : lymphocytes T helper 17 ; ERK :
extracellular signal-Regulated Kinases
semi-matures sur les sites des lésions. Il est à noter que les lymphocytes Th17 portent également le
récepteur CCR6 (Hirota et al., 2007, Annuziatoet al., 2012) et pourraient être recrutés au niveau des
lésions. De plus, la région promotrice du gène codant CCL20 on trouve un site de liaison de NF-κB
(Zhao L. et al., 2014). En conséquence, l’expression de CCL20 pourrait être induite par IL-1,
contribuant à l’activation du cercle vicieux décrit dans la Fig 7.
II- Présentation d’une publication : Langherans cell histiocytosis reveals a new IL-17A
dependent pathway of dendritic cell fusion. F. Coury et al, nature medecine, 2007.
Les études de Coury et al portent sur une cohorte de 13 patients présentant différentes formes
(focale ou disséminé) et phases (active ou inactive) de la maladie.
1) Etude d’IL-17A
Etant donné que l’os est l’organe majoritairement atteint par la HL, leurs recherches ont débuté par
le dosage sanguin du RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), cytokine qui
contrôle la régénération et le remodelage osseux en induisant la formation d’ostéoclaste à partir de
monocytes sanguins. Une concentration élevée du RANKL chez les patients en phase active de la
maladie, synonyme d’une ostéoclastogénèse importante, a ainsi été mise en évidence (Fig 8A,
gauche). La production et la sécrétion de RANKL étant stimulé par trois cytokines : Il-1, le TNF- et
l’IL-17A (Page et al, 2005), les auteurs ont dosé ces 3 protéines et, ontpu montrer que seule la
concentration d’’IL-17A était significativement différente chez les sujets en phase active de la
maladie, comparé aux sujets sains où l’Il-17A n’est pas détectable (Fig 8A, droite). IL-17A étant
caractérisée comme une cytokine spécifique des Lymphocytes T (Yao et al, 1995), les auteurs se
posent la question de la provenance de l’IL-17A. En effet, l’HL est surtout caractérisée par une
infiltration de DCs (Beverley et al, 2005). Ainsi, via un triple marquage immunohistochimique dirigé
contre le marqueur CD-3 (spécifique des lymphocytes T), la langhérine (ou CD 207, spécifique des
cellules de Langerhans) et l’IL-17A sur des coupes tissulaires de peau et d’os, les auteurs ont montré
la présence de DCs positifs au marquage IL-17A (Fig 8B, gauche et centre). Ce type de DCs est absent
sur des coupes de tissus sains marqués de la même manière (Fig 8B, droite). Les auteurs ont aussi
remarqué la présence de cellules géantes multinuclées positive au marquageIL-17A (Fig 8B, centre).
Ces MGCs sont caractérisées grâce à l’expression majoritaire de trois enzymes de dégradation de la
matrice extra cellulaire qui sont la tartrate resistant acidic phosphatase (TRAP), les
métalloprotéinases matricielles 9 et 12 (MMP-9 et 12) (da Costa et al, 2005). Leur présence dans des
lésions de patients HL a précédemment été montrée (Bechan et al, 2006). En désaccord avec ce
Commenté [NL1]: reprendre
Figure 8 : Etude de l’IL-17A dans le sérum, les lésions et le sang chez les patients atteint de l’HL.
A : Dosage des cytokines indiquées dans le sérum de patients sains ou atteints de l’HL par utilisation de Kit
ELISA.
B : Marquage immunohistochimique sur coupe tissulaire au niveau des lésions cutanées (gauche), osseuse
(droite) et sur tissu sain (à droite). Les anticorps primaires sont dirigés contre le marqueur CD3 (révélé en
rouge), la langhérine (en bleu) et l’IL-17A (en vert) révélé par des anticorps secondaires couplés à des
fluorophores. La ligne blanche (en pointillé à gauche et pleine à droite) représente la jonction dermoépidermique. Les DCs IL-17A+ sont visualisées en bleu clair (gauche) et les lymphocytes T IL-17A+ en jaune
(gauche et centre).
C : Dosage de la sécrétion d’IL-17A des lymphocytes T activés ou non in vitro, des monocytes et des Mo-DCs
(dérivés in vitro) chez les patients sains et malades (gauche) par test ELISA. (à droite) Evaluation de la quantité
d’IL-17A intra cytoplasmique de ces quatre types cellulaires par cytométrie de flux après triple marquage
immunohistochimique (CD3, langhérine, HLA-DR) chez les patients sains et malades
HL : histiocytose Langheransienne ; IL : interleukine ; Mo-DCs : cellules dendritiques dérivées de monocytes ;
ELISA : enzym-linked immunosorbent assay ; HLA : human leukocyte antigen
* : p<0.05 ; ** : p<0.01 ; *** : p<0.001. Echelle : 50µm
qui avait été précédemment décrit (l’IL-17A serait une cytokine spécifique des lymphocytes T et
particulièrement des LTH-17 selon l’équipe de Zao et al), les auteurs détectent de très faible quantité
de Lymphocyte T positifs à l’IL-17A au niveau des lésions tissulaires. Ces résultats leurs permettent de
conclure que, chez les patients en phase active de la maladie, l’IL-17A provient essentiellement des
DCs et MGCs.
Les auteurs ont ensuite testé la capacité des Lymphocytes T immatures et activées, des monocytes et
des DCs dérivées de monocytes à secréter l’IL-17A (Fig 8C, droite). Ces cellules sont prélevées chez
des patients en phase active et inactive de la maladie. Les lymphocytes T activées sont obtenus à
partir de Lymphocytes T immatures après stimulation in vitro par des anticorps anti CD3 et CD28. Les
DCs dérivées de monocytes sont générées après culture in vitro en présence de GM-CSF et d’IL-4.
Dans chaque cas, l’expression intra cytoplasmique d’IL-17A est mesurée par cytométrie de flux après
triple marquage immunohistochimique contre CD3, HLA-DR (spécifiques du CMH II) et IL-17A. Par ces
expériences, les chercheurs montrent d’une part que seulement les lymphocytes T activées à la fois
Commenté [NL2]: Pour ne pas alourdir le texte et complexifier
l’histoire, je mettrai ça dans la légende (en expliquant mieux
pourquoi le triple marquage et ne mettrai ici que la conclusion
Pensez à ceux qui vous reliront !!!
chez les patients sains et malades sont positifs au marquage de l’IL-17A. Mais aussi que les Mo-DCs
des patients malades seulement sont positifs au marquage contre l’IL-17A. Ces résultats sont
confirmés en quantifiant la secrétions d’IL-17A par test ELISA (Fig 8C, gauche). Aucunes différences
n’est observable au niveau du profil d’expression et de sécrétion de l’IL-17A des lymphocytes T
activées entre les patients sains et malades. En revanche, seules les Mo-DCs de patients malades
sont capables de sécréter spontanément de l’IL-17A.
L’action de l’IL-17A
Après avoir montré la présence d’IL-17A dans les lésions des patients atteints de l’HL, les
auteurs se sont intéressés à l’action d’IL-17A sur les cellules dendritiques. Les effets d’IL-17A
recombinante ont été étudiés d’une part sur un modèle de cellules dendritiques saines, d’autre part
sur des cellules dendritiques de patients. Pour finir, la fonction d’IL17-A endogène et sa spécificité
ont été investiguées. Les cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDC) constituent un modèle
classique pour l’étude des cellules dendritiques. Pour obtenir les MoDC, les monocytes circulants
provenant du sang de donneurs sains sont isolés et cultivés pendant 6 jours en présence d’IL-4 et de
GM-CSF.
Dans un premier temps les MoDC ont été incubés en présence d'IL-17A recombinante. Après
incubation, les cellules résultantes, analysées par cytométrie en flux, présentaient un phénotype
immature mixte monocyte-macrophage-cellule dendritique d'après les antigènes de surface qu'elles
portaient. Ce phénotype a été précédemment décrit dans les lésions de patients atteints de HL.
De plus, ces cellules résistaient à l'apoptose spontanée. Par conséquent les effets d’une
Commenté [NL3]: Dans la fig c’est le contraire non ?
Elisa puis cyto
A
B
C
Figure 9 : Caractérisation de l’impact de l’IL-17A sur les monocytes et les cellules dendritiques de malades
A) Des monocytes isolés à partir de prélèvement sanguins de donneurs sains sont dérivés en cellules dendritiques
et sont cultivés pendant 12 jours en présence d’IL-17A, avec (droite) ou sans (milieu) IFN-γ. A gauche est présenté
le profil d’une MoDC avant la culture. Les noyaux sont marqués par le colorant Hoechst (bleu). L’activité TRAP
cytoplasmique est détectée (rose : activité normale, violet : forte activité). Les MGCs sont indiquées par une étoile
blanche.
B) Des DCs de patient atteint de LH sont prélevées et cultivées pendant 12 jours en présence (droite) ou non
(centre) d’IFN-γ. A gauche est présent une DCs de patient avant la culture. Le même marquage nucléaire et le
même test d’activité de la TRAP sont réalisés.
C) Comptage des MGCs (gauche) et du nombre moyen de noyaux par MGC (droite) après 12 jours de culture de
MoDCs provenant de donneurs sains (DCs saines) ou de patients atteints de LCH (LCH DCs), en présence de
cytokines indiquées. Le traitement par M-CSF + RANKL, inducteurs connus de la fusion des DCs, est utilisé en
contrôle positif.
MoDC : cellule dendritique dérivée de monocyte ; DCs : cellules dendritiques ; MGCs : cellules géantes
multinucléées ; LCH DCs : cellules dendritiques de patient ; TRAP : tartrate resistant acide phophatase ; IFN :
interféron ; RANKL : receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand ; M-CSF : macrophage colony-stimulating
factor ; IL : interleukine
culture prolongée ont été étudiés par microscopie confocale. Afin de visualiser les cellules, les
noyaux et le cytoplasme ont été colorées par l'intercalant fluorescent de l'ADN Hoechst 33342 et par
l'essai TRAP respectivement. L'essai TRAP est une méthode de détection d'activité de la phosphatase
acide tartrate-résistante (TRAP). La TRAP est une enzyme détectable dans le cytoplasme des
ostéoclastes de manière physiologique, mais également dans les cellules géantes multinucléées
(MGC), responsables des lésions dans le contexte de l’HL. Une faible activité TRAP se traduit par une
coloration rose, et la suractivation de TRAP par une coloration violette du cytoplasme.
Après 12 jours de culture de MoDC en présence d’IL-17A, des MGCs à quatre noyaux et à
forte activité TRAP cytoplasmique (coloration violette) ont été observées (Fig 9A, panel du milieu).
Les auteurs ont conclu à la fusion des monocytes médiée par IL-17A. Un doute peut subsister quant à
la fusion des monocytes plutôt qu’à un éventuel défaut de division. Cependant la formation des
MGCs par fusion cellulaire a été précédemment montrée et est actuellement la théorie
communément admise. La taille des MGCs et le nombre de noyaux a été augmentée en incubant les
MoDC avec Il-17A et l’interféron γ (IFN-γ, Fig 9A, panel de droite). La culture en présence d’IFN- γ
seul n’a pas eu d’effet sur les MoDC.
Dans un deuxième temps, les cellules dendritiques provenant de patients atteints de HL (HL
DCs) ont été cultivées pendant 12 jours. Les HL DCs ont subis la fusion spontanément (sans ajout d’IL17A) pour former des MGCs à 4 noyaux et à forte activité TRAP (Fig 9B, panel du milieu). L’ajout de
l’IFN-γ a également augmenté la taille des MGCs (Fig 9B, panel de droite). De plus, le comptage des
cellules a montré que l’IFN-γ augmente fortement la quantité de MGCs formés, dans le cas des MoDC
traités par IL-17A, comme dans le cas des HL DCs (Fig 9C, panel de gauche). Le comptage confirme
aussi l’augmentation du nombre moyen de noyaux par MGC, provoquée par l’IFN-γ (Fig 9C, panel de
droite).
La fusion spontanée des HL DC est comparable à celle qu’on observe avec les MoDC traités
par l’IL-17A recombinante. Cependant les MoDC ne fusionnent pas en présence d’IFN-γ seul. Il
semble donc que la fusion soit due à l’IL-17A seule, et l’interféron γ ne fait qu’augmenter son effet.
De plus, comme les HL DC semblent produire de l’IL-17A, les auteurs ont émis l’hypothèse d’un effet
autocrine de l’IL-17A endogène.
Afin de confirmer l’efficacité de l’IL-17A endogène d’une part, et la spécificité d’action de l’IL17A et de l’IFN-γ d’autre part, des expériences de transwell ont été réalisées. Une membrane
imperméable aux cellules mais perméable aux cytokines sépare deux chambres de culture cellulaire.
Les HL DC ont été cultivées dans la chambre de haut et les cellules dendritiques saines dans celle du
bas.
Pourcentage de noyaux inclus dans les MGCs /
nombre totale de noyaux au jour 12
DCs
saines
DCs saines
10 DCs saines
Figure 10 : Expérience de transwell.
Les LCH DCs sont cultivées dans la chambre du haut, les DCs saines dans celle du bas. a: Détermination de
l’activité d’IL-17A présente dans le surnageant des LCH DCs, avec ou sans IFN-γ. L’efficacité de fusion est
représentée par le nombre des noyaux inclus dans les MGCs sur le nombre total de noyaux au jour 12.
L’abscisse représente la quantité relative de cellules. b: Etude de la spécificité des effets d’IL-17A et d’IFN-γ.
Les cellules sont cultivées avec ou sans anticorps bloquants dirigées contre IL-17A ou IFN-γ (Anti-IL-17A et
Anti-IFN-γ). Ajout d’IL-17A recombinante en excès (+IL-17A). Un anticorps non-relevant (isotype ctrl) est
utilisé comme contrôle négatif.
MoDC : cellule dendritique dérivée de monocyte ; DCs : cellules dendritiques ; LCH DCs : cellules
dendritiques de patient ; IFN : interféron ; IL : interleukine
Sous l’effet des HL DC et sans ajout d’IL-17A, la fusion des cellules dendritiques saines a été observée
dans la chambre du bas (Fig 10). Ce résultat suggère que l’IL-17A produite par les HL DC est
fonctionnelle. Après traitement par des anticorps bloquants dirigés contre IL-17A, la fusion a été
abolie, et restaurée en ajoutant de l’IL-17A recombinante en excès (Fig 10). Ce résultat montre que la
fusion est bien due à l’IL-17A, de manière spécifique. L’ajout d’IFN- γ a augmenté l’efficacité de la
fusion (Fig 10). En présence d’IFN-γ et d’anticorps bloquants l’IFN-γ, la fusion s’est déroulé de même
manière qu’en l’absence d’IFN-γ (Fig 10). Ce résultat suggère la spécificité de l’effet de l’IFN-γ.
Caractérisation fonctionnelle des DCs stimulées par IL-17A :
Comme le montrent des études antérieures, les MGCs ont un profil enzymatique particulier.
Notamment, les MGCs expriment la TRAP et les métalloprotéases matricielles 9 et 12 (MMP-9 et -12)
actives. Par conséquent, l’étude des activités de ces enzymes a été réalisée sur les DCs saines traitées
par l’IL-17A.
La suractivation de la TRAP est observée par un changement rapide de la coloration
cytoplasmique du rose au violet, dans le cas des DCs saines traitées par IL-17A, mais aussi pour les HL
DCs sécrétant spontanément IL-17A. A l’inverse, le cytoplasme des ostéoclastes et des DCs saines
non traitées reste coloré en rose. L’observation de l'activité TRAP dans le surnageant des DCs saines
après 12 jours de culture avec Il-17A et IFN-γ montre une augmentation par rapport au contrôle.
Cette augmentation est bloquée par l’anticorps anti-IL-17A mais pas par l’anticorps anti-CCL20.
Cependant, en utilisant des anticorps anti-CCL20 la formation des MGC est réprimée (Fig. 11A).
La sécrétion de MMP-9 par les DCs saines augmente après traitement par l'IL-17A, mais
diminue en traitant uniquement avec de l'IFN-γ. La MMP-12 n’est détectée dans le surnageant que
lorsque l’on active les DCs saines en les traitant avec du lipopolysaccharide (LPS) (Fig 11B). La
recherche de la forme catalytique de la MMP-12 intracytoplasmique par cytométrie en flux a montré
que l'IFN-γ induit la production de la métalloprotéase active, et que l’expression augmente avec l’IL17A. Le LPS renforce cette expression et induit la sécrétion de MMP-12.
Après s’être intéressé au profil enzymatique des DCs traitées par l’IL-17A, les auteurs ont
étudié le sérum de patients atteints de différents stades de la HL. Les concentrations sériques de
RANKL et d’IL-17A sont corrélées l’une à l’autre mais ne semblent pas être liées à l'activité de la
maladie (Fig 11C). Par exemple, les quantités de ces deux composés sont très variables dans le sérum
des patients atteints de la HL de classe d’activité 3. Enfin, des DCs saines ont été cultivées en
présence d’IFN-γ et du sérum de patients atteints de différents stades de la HL. L’efficacité de la
fusion, représentée par le rapport du nombre de noyaux inclus dans les MGCs sur le nombre de
noyaux total, a été quantifiée. Une corrélation semble exister entre l’activité de la maladie et
A
C
B
D
Figure 11 : Etude fonctionnelle des cellules dendritiques, lien avec l’agressivité de l’HL
A) Des cellules dendritiques saines sont cultivées pendant 12 jours en présence d’IL-17A et d’IFN en présence
d’anticorps anti IL-17A (centre) ou d’anticorps anti CCL20 (droite). L’activité de la TRAP est révélée en rose ou violet
dans le cytoplasme par l’utilisation du kit TRAP assay et le noyau des cellules est marqué en bleu par le Hoechst.
B) Mesure de la sécrétion de MMP-9 et 12 par test ELISA de DCs cultivé pendant 12 jours en seul ou en présence
des cytokines indiquées, avec ou sans LPS.
C) Histogramme représentant l’absence de corrélation entre l’IL-17A et RANKL et la gravité de la maladie. En
abscisse sont classés les patients en fonction de l’activité de la maladie (indice de 1 à 4 ou 1 représente la forme la
moins agressive de la maladie) et en ordonnée sont présentées les concentrations sanguines d’IL-17A et de RANKL.
D) Histogramme montrant la corrélation entre la quantité de MGCs et l’agressivité de la maladie. En abscisse sont
présentés les patients classés de la même manière que dans la figure 11C. Le nombre de MGC est représenté en
ordonné.
TRAP : tartrate resistant acid phosphatase ; IFN : interféron ; MMP : métalloprotéase matricielle ; LPS :
lipopolysaccharide ; RANKL : receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand ; MGCs : cellules géantes
multinuclées ; LCH : histiocytose Langheransienne ; DC : cellule dendritique
l’efficacité de la fusion. L’ajout d’anticorps anti-IL-17A diminue drastiquement le nombre de MGCs,
ce qui semble confirmer l’implication d’IL-17A dans le phénomène. Cependant, une autre molécule,
que les auteurs ont appelé IL-17A-like a également été capable de provoquer la fusion des DCs. IL17A-like a été reconnue par les anticorps neutralisants, mais pas par ceux utilisés dans le test ELISA.
Ce fait pose la question de la spécificité des anticorps bloquants anti-IL-17A utilisés dans cette étude
(Fig 11D).
III - Projet de Recherche
Établissement du Modèle Murin :
Malgré l'amélioration des connaissances sur le HL, les facteurs et la genèse de la maladie
sont encore mal compris. Un obstacle majeur est l'absence de modèles animaux fiables, qui sont
nécessaires pour évaluer les caractéristiques pathologiques et pour fournir plus d’information
concernant l'étiologie des lésions.
Il a été déjà établi un modèle murin par transgénèse qui présente certains des symptômes
retrouvés dans la HL. Notamment, ces souris développent des lésions ostéolytiques observés chez
les patients HL : le Mushi Transgenic (Tg) mice (CD11c::SV40LgT-transgenic C57BL/6 background
mice) (Grosjean et al.,2015 ; Steiner et al.,2008) mais l'influence de la mutation BRAF V600E ne peut
pas être testé par ce modèle. Les souris Mushi montrent une apparition précoce de la maladie, et qui
évolue de manière générale vers une forme plus grave disséminée, caractérisée chez ces souris par
l'accumulation de DCs provoquant une augmentation de la taille de la rate et le foie et une
diminution de l'hématocrite. Les DCs touchés représentent un sous-type spécifique avec un
phénotype Langérine / CD207 + CD8a + CD11b- / CD24 + CD205 +. Compte tenu de la large diffusion
des DCs transformées au sein de l’organisme, ces souris peuvent servir de modèle pour l’étude de la
HL multi-système.
D'autre part, un modèle murin portant la mutation BRAF dans différents précurseurs des DCs
existe depuis 2014. Il s’agit des souris langhérine::BRAF V600E, obtenues en croisant des souris
Langhérine::CRE (elles expriment la CRE recombinase sous la dépendance du promoteur de la
langhérine) avec une souris BRAF V600E hétérozygote floxée au niveau de la séquence génique
codant la mutation(BRAF V600E
ca/wt
) et CD11c::BRAF V600E, obtenues en croisant des souris
CD11c::CRE avec une souris BRAF V600E ca/wt (Berres et al., 2014). Chez la souris, CD11c est exprimé
sur les progéniteurs engagés vers la différenciation en DCs et reste exprimé tout au long de la
différentiation. (Merad et al., 2013). La langhérine est un marqueur de différentiation des DCs, elle
n’est exprimée que chez les DCs tissulaires, y compris les LCs, mais elle est absente des précurseurs
Table 1- Groupe
des souris par
condition
Mushi
BRAF
Monocyte
BRAF
Precurseur
DCs
BRAF
DC, LC
MushiBRAF
Monocyte
Mushi-BRAF
Precurseur
DCs
MushiBRAF DC,
LC
WT
(Control)
MCPyV -
5
5
5
5
5
5
5
5
MCPyV +
5
5
5
5
5
5
5
5
MCMV +
5
5
5
5
5
5
5
5
Total
120
Tableau 1 : Nombre de souris nécessaire à la réalisation du projet.
A
B
Figure 12 : Croisement et suivi des souris
A) Nous croiserons une souris BRAF V600E ca/wt avec la souris CD11b::CRE (haut gauche) afin d’obtenir des souris
CD11b::BRAF V600E qui expriment la mutation au niveau des monocytes. Les souris encadrées en jaunes
(langhérine::BRAF V600E, CD11c::BRAF V600E, CD11b::BRAF V600E) seront croisesé avec des souris mushi (en
bleue) afin d’obtenir des modèles de l’histiocytose Langheransienneexprimant la mutation dans les différents
cellulaires étudiés (dans les cellules de Langherans, les progéniteurs des cellules dendritiques et les monocytes,
encadrées en vert)
B) Exemple deKaplan-Meyer qui sera réalisé pour le suivi de la survie des sourie. Chaque saut de palier correspond
au décès d’un animal
circulants et médullaires (Merad et al., 2008). Ainsi la souris langhérine::BRAF V600E exprimera
lamutation, sous la dépendance du promoteur de la langhérine, uniquement au niveau des DCs
matures alors que la souris CD11c::BRAF V600E exprimera la mutation, sous la dépendance du
promoteur de CD11c, chez tous les précurseurs médullaires, sanguins et tissulaires des DCs ainsi que
chez les DCs matures. L’expression de BRAF V600E dans les DCs est suffisante pour entraîner une
maladie « HL-like » chez la souris.
Les données sur l’apparition et l’évolution de la maladie obtenues chez ces souris sont
comparables à celles observées chez l'Homme. L'expression de BRAF V600E dans les progéniteurs
précoces des DCs est relié à au développement d’une forme multi systémique grave de l’HL, tandis
que l'expression du gène BRAF V600E dans les DCs matures des souris, ressemble plutôt à une forme
unifocale sans conséquence dramatique pour les patients atteints (Berres et al, 2014).
Pour l'obtention de la mutation BRAF V600E dans les monocytes, un souris BRAF V600E ca/wt
(Merad et al.,2013) sera croisé avec un souris exprimant la cre-recombinase sous le control du
promoteur CD11b et nous formeront des souris CD11b::BRAF V600E (Ferron et al.,2005). Le génotype
de ces souris sera confirmé par PCR.
Dans le but de réaliser des études sur des modèles murins plus exhaustive de la maladie,
capable d’exprimé la mutation BRAF au cours des différentes étapes de différenciation, nous
croiserons la souris Mushi avec les différents souris BRAF V600E citées ci-dessus (langhérine::BRAF
V600E, CD11c::BRAF V600E et CD11b::BRAF V600E) (Fig 12A). Des PCRs permettront génotyper la
descendance obtenue en utilisant les amorces décrient par Steiner et al 2008 pour Mushi Tg et
Szankasi et al.,2013 pour BRAF V600E transgénique. Ces PCRs seront réalisées à partir d’un morceau
de queue, prélevée à l’âge de 10 jours.
Sachant que nous avons besoin d'au moins 5 souris par groupe d`intérêt, plus un groupe de
souris sauvage (WT) contrôle (souris sur fond génétique C57BL/6), nous estimons un total d'au moins
120 souris pour tester les différentes conditions qui seront détaillées plus tard (Tableau 1).
Après l'obtention de chacune des souris, nous commencerons à observer leur évolution. Les
courbes de survie seront tracées en utilisant la méthode de Kaplan-Meier, un exemple est présenté
dans la Fig 12B, chaque saut de pallier correspond au décès d’une souris. Les critères d'euthanasie
seront basés sur une évaluation de plusieurs données : une perte de poids, rapide ou progressive, de
plus de 15 % (jeunes animaux) à 20 % (adultes) par rapport au poids initial de l’animal, une
automutilation, une diminution de la mobilité interférant avec l’activité basale de l’animal
(alimentation, toilettage) ainsi que la mise en évidence d’une réduction générale de l’activité.
Nous effectuerons un marquage d'identification dans l'oreille des souris au début des
Tableau 2 : Prélèvements sanguins en fonction du poids de la souris
A
B
C
Figure 13 : Prise de sang, marquage et dissection des souris étudiées
A) Un pipette pasteur sera insérée dans le sinus retro orbitaire (schématisé en violet) pour les prélèvements
sanguins.
B) Le marquage des souris au niveau des oreilles permettra de les différencier au cours de nos études. Il sera
réalisé à l’aide d’un poinçon particulierement conçu à cet effet.
C) Les organes prélevés seront : la peau saines et lésionnelle, les os, le cerveau, les poumons, la rate et le foie.
expériences pour un meilleur suivi (Fig 13B). Nous garderons les souris dans des conditions sans
pathogènes standard avec de la nourriture, de l'eau ad libitum et un cycle lumière-obscurité 12h12.
On logera jusqu’à cinq souris par cage en fonction de l’âge et du sexe des souris, selon les directives
de la « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals »
Prise de sang dans le sinus orbitaire
Nous prendrons en considération la fréquence des prélèvements et la vitesse de
régénération des cellules sanguines décrits dans Joint Working Group of Refinement of the
BVA/FRAME/RSPCA/UFAW 1993. Nous choisirions les volumes à extraire comme décrit dans le
Tableau 2 en suivant le protocole décrit par Parasuraman, et al.,2010 pour prélever le sang dans le
sinus orbitaire, à partir de la sixième semaines de vie, toutes les deux semaines pendant six mois (Fig
13A).
Cette technique est difficile et doit être effectuée que par du personnel ayant de l’expérience
en la matière (Parasuraman, et al.,2010). Des manipulations inadéquates peuvent provoquer des
hématomes ou une cécité. Les lésions dans le plexus rétrobulbaire, provoqués par le prélèvement
sanguin, ne guérissent en règle générale pas avant deux semaines, nous n’effectuerons pas de
nouvelle ponction du même œil pendant ce laps de temps au minimum.
Sacrifice de la souris et prélèvement des organes et du sang
Après six mois ou moins si nous considérons que l'animal souffre, les souris seront sacrifiées
par inhalation de CO2 à concentration (Conlee et al., 2005) et les organes sont prélevés (Fig 13C). Au
moment du sacrifice, les animaux seront d'abord inspectés pour l’apparence générale.
Rôle du virus : Infection par MCPyV
L'isolement de virions infectieux du MCPYV n'a pas encore été rapporté mais des particules
virales seront obtenues comme déjà décrit par Touze et al.,2010 et Pastrana et al.,2012. Un tiers des
souris seront inoculées par voie s.c. avec 1 x 104 unités formant des plages (pfu) de virus MCPyV. Les
souris seront infectées à l’âge de 4 semaines, pour se trouver dans la période normale de l'exposition
du virus observé chez l'homme, c'est-à-dire, pendant l'enfance.
Etant donné que les TLR9 des souris sont semblables à les humaines (Schneberger et
al.,2013 ; Paul, 2013), nous espérons obtenir une réponse immunitaire similaire.
Pour confirmer que, comme décrit par le groupe de Murakami, la boucle de l'IL-1 est
déclenché manière spécifique par MCPyV, nous allons vérifier sa spécificité en infectant un tiers des
souris de chaque groupe génétique avec un autre virus non relié au MCPyV : le cytomégalovirus
murin (MCMV).
Le MCMV est un virus de l'herpès de la sous-famille des herpesviridae . C’est un virus à ADN
double brin enveloppé. Il infecte spécifiquement les souris. Le groupe de Tabeta et al., 2004 ont
démontré que la voie TLR9 est activée par l'inoculation virale MCMV. Le virus sera préparé in vivo par
inoculation, (1 x 104 pfu) chez une souris BALBc âgée de trois semaines, par injection i.p. comme
décrit par Tabeta et al.,2004. Une fois que les particules virales seront isolées de la souris BALBc,
nous infecterons un tiers des souris de chaque groupe avec le même titre viral que pour le MCPyV.
Pour confirmer que les souris n'ont pas le virus avant l'inoculation, nous réaliserons une PCR
pour détecter le MCPyV et le MCMV, avec les mêmes amorces utilisées par Sroller et al.,2014 et
Vliegen et al., 2003 respectivement.
Nous allons suivre le titre des anticorps dirigés contre la protéine VP1 du MCPyV toutes les
deux semaines à partir des prélèvements sanguins. Nous suivrons le titre viral en dosant l’activité
d’un vecteur rapporteur, précédemment décrit par Pastrana et al.,2009. Les particules virales du
MCPyV encapsulent le plasmide rapporteur phGluc, codant pour la luciférase Gaussia (Gluc). Lorsque
les vecteurs infectent les cellules, le plasmide rapporteur phGluc, qui porte une origine de réplication
SV40, pourra être répliqué si le virus est présent. Cela conduit à la production de Gluc qui est sécrété
dans le milieu de culture, et pourra être facilement dosé. Cette approche permettra de caractériser
précisément les cellules préférentiellement inféctées par le MCPyV. La neutralisation du MCPyV avec
le vecteur rapporteur médiée par les anticorps conduits à une réduction de l'expression
correspondante Gluc.
À six mois, lorsque la souris est mise à mort, nous quantifierons la charge virale par l’ADN
viral présent dans les différentes types cellulaires étudiées (monocytes, différents précurseurs de
DCs, DCs et LCs) par qPCR, comme décrit par Pastrana et al.,2012. La quantification des anticorps du
MCMV sera réalisée par la technique de fixation du complément, décrite par Lussier et at, 1987.
Analyse sanguine
Comme il a été précisé, le sang sera prélevé toutes les deux semaines à partir de la sixième
semaine de vie des souris, dans tous les groupes étudiés (Tableau 1, 24 groupes). Directement à
partir de ces prélèvements, on dosera le taux de diverses cytokines (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-23,
IFN-γ, TNF-α, GM-CSF et CCL20) par test ELISA (MILLIPLEX MTH17MAG-47K, Merckmillipore) et du
RANKL. Le taux d’insuline circulante sera aussi mesuré pour suivre l’apparition progressive d’un
diabète insipide, qui est une des complications graves de la maladie, synonyme d’une aggravation de
la maladie (Chakraborty et al, 2014). La charge virale sera suivie au cours du temps, selon les
méthodes décrites ci-dessus.
Les interleukines IL-1, IL-6, IL-17A et IL-23 ainsi que l’IFN- et le TNF- sont des cytokines proinflammatoires et leurs dosages sanguins permettront de suivre l’apparition d’une réponse
inflammatoire au cours du temps. L’IL-17A et IL-23 ont était particulièrement choisies car dans leurs
études, l’équipe de Coury et al montre un impact de l’IL-17A sur la fusion des cellules dendritiques
dans l’HL, cependant, l’impact de l’IL-17A sur la maladie reste controversé (Peters et al, 2011). L’IL-23
est une cytokine favorisant la différenciation des lymphocytes T CD4+ en lymphocytes T helper 17,
ces lymphocytes Th17 sont capables de sécréter de l’IL-17A (Wilson et al, 2007) et pourraient jouer
un rôle dans la maladie. Par la suite, des études visant à caractériser la résorption osseuse seront
réalisées. Elles se baseront sur le dosage sanguin du RANKL, de la chemokine CCL20 et de l’IL-17A par
test ELISA. Une caractérisation plus approfondie sera menée plus tard par des marquages
immunohistochimiques réalisés sur des coupes tissulaires.
Analyse des prélèvements tissulaires :
A l’âge de six mois, les souris sont euthanasiée et les tissus suivants sont prélevés : peau
saine, lésions cutanées, os, foie, rate, cerveaux et poumons. Tous ces tissus, dans différentes
proportions en fonction de la gravité de la maladie, sont touchés dans le cadre de l’ HL (Morimoto et
al., 2014). Après inclusion dans la paraffine, les tissus seront coupés au microtome et déposé sur une
lame en verre. Les marquages immunohistochimiques réalisés auront pour but de caractériser le type
de DCs (mature et/ou immature) présent dans les tissus. Nous utiliserons un panel d’anticorps dirigé
contre des récepteurs spécifiques de ces cellules. Les DCs immatures sont CD14+, CD68+(marqueurs
de DCs immatures), CD83-, CD86- (marqueurs de DCs matures) et CD207+ (marqueur des LCs), tandis
que les DCs mature sont CD14-, CD68+, CD86+ et CD207+. Sachant que les LCs des patients atteint de
l’HL multifocale disséminée présentent plus souvent un phénotype indifférencié (CD14+, CD68+,
CD83-, CD86- et CD207+) par rapport aux patients atteints de forme moins grave de la maladie
(Geissmann et al., 2001). Le taux de chaque sous- type de DCs sera déterminé par FACS comme décrit
par Merad et al., 2008. Toujours sur ces coupes tissulaires, la caractérisation de la présence des
MGCs dans un premier temps et leur activité par la suite seront analysé. Le taux de MGCs sera établi
par comptage des cellules multinuclées par rapport aux cellules totales, après une coloration TRAP
(Coury et al, 2008) et un immunomarquage dirigé contre CD68, la MMP-9 et la cathepsin K (catK) (da
Costa et al., 2005). La MMP-9, la catK ainsi que la TRAP joue un rôle dans la dégradation de la matrice
extra cellulaire et permet de déterminer l’activation métabolique des cellules ostéoclastes ‘’like’’,
dont les MGCs font partie. Le nombre de MGCs positifs à la coloration TRAP et aux marquages dirigés
contre la MMP-9 et la catK sera déterminé et permettra d’avoir une idée de l’impact de ces MGCs sur
les lésions organiques observées. Le marquage contre CD68 permet de discriminer les MGCs
provenant de la fusion des DCs, des ostéoclastes (CD68-) (da Costa et al., 2005). Les données
obtenues pour le tissu osseux malades seront normalisées par rapport aux données obtenues pour
un tissu osseux sain car des ostéoclastes exprimant la TRAP, la catK et la MMP-9 y sont naturellement
présents.
Modèles cellulaires
Selon l’hypothèse émise par Murakami, l’infection des cellules mononucléées du sang par le
virus MCPyV, associée à la mutation BRAF V600E de ces cellules, pourrait induire la phosphorylation
constitutive de la protéine ERK et être à l’origine de l’HL (Murakami et al., 2015). De plus, la gravité
de l’HL semble liée à la précocité de la présence d’ERK phosphorylée dans les cellules de la lignée
myéloïde (Chakraborty et al., 2014). Nous nous proposons de tester cette hypothèse.
Deux types cellulaires seront choisis comme point de départ des expériences : les
progéniteurs hématopoïétiques (HPC) circulants CD34+ provenant du sang de donneurs sains et les
cellules souches pluripotentes induites (iPSC). D’une part, les iPSC présentent l'avantage de se diviser
de manière illimitée et permettent d'étudier tous les stades de différenciation cellulaire. Cependant,
ces cellules sont obtenues par transduction des facteurs de transcription Oct3/4, Sox2, Klf4, et c-Myc
(Takahashi et al., 2007) ce qui pourrait représenter un biais dans l’expérimentation. De ce fait,
l’utilisation des cellules de donneurs sains semble souhaitable. D’autre part, il existe des progéniteurs
hématopoïétiques circulants dans le sang humain. Cependant leur proportion est faible : ils
représentent approximativement 0,1 % des cellules mononucléées du sang périphérique (Strunk et
al., 1996). Cette faible proportion pourrait soulever des difficultés lors de la purification des HPC. En
fonction de la disponibilité des échantillons sanguins et des résultats expérimentaux, l’utilisation des
iPSC ou de HPC seules, ou bien des deux en parallèle, peut être envisagée.
La mutation BRAF V600E sera introduite dans le progéniteur hématopoïétique CD34+ à l’aide
d’un vecteur lentiviral. L’expression du transgène BRAF V600E sera inductible à la doxycycline. La
différenciation du progéniteur hématopoïétique en monocytes et en cellules dendritiques sera
induite, et les cellules seront infectées par le virus MCPyV. Les cellules obtenues seront
caractérisées : leur sécrétome sera étudié par ELISA, les éventuelles cellules géantes multinuclées
seront comptées, des tests de migration et d’invasion seront effectués.
Différenciation des progéniteurs hématopoïétiques circulants en cellules de la lignée myéloïde
La différenciation des HPC en monocytes et en cellules dendritiques sera effectuée comme
décrit par Montesoro (Montesoro et al., 2005). Après centrifugation sur gradient de densité des
échantillons sanguins, les cellules mononuclées seront récoltées et les HPC seront purifiées par tri
cellulaire magnétique en utilisant des nanoparticules greffées par des anticorps anti-CD34.
Cellules souches
hématopoïétiques
Monocytes
en suspension
Cellules
dendritiques
Figure 14 : Différenciation des cellules souches pluripotentes induites en monocytes et en cellules
dendritiques (Yanagimachi et al., 2013).
La différenciation se fait en 5 étapes, en présence des facteurs de croissance et des cytokines indiqués. Au jour
6, on obtient les progéniteurs hématopoïétiques. Entre les jours 13 et 28, les monocytes
sont prélevés dans le surnageant. Les monocytes sont différenciés en cellules dendritiques lors de la dernière
étape.
Les milieux de culture utilisés sont le mTeSR1 (STEMCELL Technologies) et le StemPro34 (Gibco).
BMP4 : Bone Morphogenetic Protein 4 ; VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor ; SCF : Stem Cell Factor ;
bFGF: basic Fibroblast Growth Factor ; FL3 : Flt-3 Ligand ; TPO : Thrombopoïétine ; M-CSF : Macrophage
Colony-stimulating Factor ; GM-CSF : Granulocyte M-CSF ; IL-3/-4 : Interleukine 3/4
Les HPCs seront cultivés en présence de M-CSF et d’IL-6 pendant deux à trois semaines, pour induire
la différenciation en monocytes. Les monocytes obtenus seront cultivés pendant 5 à 6 jours en
présence de GM-CSF et d’IL-4, afin de produire des cellules dendritiques.
Différenciation des cellules souches pluripotentes induites en cellules de la lignée myéloïde
Nous allons procéder à la différenciation des iPSC selon la méthode décrite par Yanagimachi
(Yanagimachi et al., 2013). Le principe de cette méthode est semblable à celle utilisée pour les HPC
mais comporte des étapes supplémentaires en amont. La culture se fait en 5 étapes. Les conditions
de culture (milieu de culture, cytokines et facteurs de croissance utilisés, présentées sur la Fig 14)
sont changées à chaque étape pour permettre une différenciation progressive des iPSC en cellules
dendritiques.
A la deuxième étape, au bout de 6 jours de culture, on obtient des cellules CD34+ KDR+
adhérentes, correspondant aux cellules souches hématopoïétiques. A la quatrième étape, entre les
jours 13 et 28, les cellules en suspension comportent 50 à 90 % de monocytes. A cette étape, les
cellules du surnageant sont prélevées tous les 4 jours, et sont triés par FACS : les cellules CD14+
correspondent aux monocytes.
Enfin, la culture des monocytes CD14+ pendant 5 à 6 jours en présence de GM-CSF et d’IL-4,
permet de produire des cellules dendritiques.
Transduction des iPSC par un vecteur lentiviral
Un vecteur lentiviral comportant un système d’induction Tet-On et utilisable pour transduire
des cellules souches a été précédemment décrit (Zhou et al., 2007). L’ADNc de l’allèle BRAF V600E
sera cloné dans le vecteur lentiviral en aval du promoteur inductible à la doxycycline. Les iPSC
indifférenciées et les HPC seront transduites de manière stable avec ce vecteur. Les iPSC et les HPC
non-transduites et infectés par un vecteur vide seront utilisées comme contrôle. L’induction à la
doxycycline sera déclenchée aux stades de différentiation plus ou moins précoces, à savoir le
progéniteur hématopoïétique, le monocyte et la cellule dendritique. La différentiation se poursuivra
comme décrit dans les paragraphes précédents, mais en présence continue de doxycycline, afin de
mimer des mutations somatiques BRAF V600E survenues à différents moments du développement
des cellules dendritiques.
Culture cellulaire
Les cellules dendritiques dérivées des iPSC et des HPC seront cultivées dans le milieu -MEM
complété avec 10% de sérum fœtal de veau, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg
de streptomycine, comme décrit par Coury (Coury et al., 2008). Etant donné que la différenciation
des progéniteurs en cellules dendritiques se fait en présence de cytokines, plusieurs lavages seront
effectués à l’issu de la différenciation afin d’éliminer les traces de ces cytokines.
Des puits en triplicate contenant des monocouches de cellules sous-confluentes seront
inoculés avec le MCPyV (MOI=5) (Schowalter et al.,2012). L’ADN plasmidique sera quantifié après
quatre jours par qPCR comme déjà décrit par Schowalter et al.,2011. Nous ferons des contrôles en
triplicate avec des monocouches des cellules non-traitées par MCPyV et traitées par un virus
différent pour confirmer la spécificité de virus MCPyV. Nous allons utiliser le même virus contrôle
que pour le modèle animal, le MCMV, avec un MOI = 5 (Ghazal et al 2003). Nous quantifierons l`ADN
viral par qPCR comme décrit par Wheat et al.,2003. La culture se fera en induisant ou pas
l’expression de l’allèle BRAF V600E par la doxycyline. Cette induction se fera à différentes étapes de
la différenciation : à partir du stade de progéniteur hématopoïétique jusqu’à la cellule dendritique, à
partir des monocytes jusqu’à la cellule dendritique, ou sur les cellules dendritiques directement.
La présence de la mutation BRAF V600E sera confirmée par qPCR, et la phosphorylation de la
protéine ERK sera testée par Western Blot.
Le sécrétome des cellules obtenues sera étudié par ELISA avec un kit permettant la détection
de plusieurs cytokines (e.g. MILLIPLEX MTH17MAG-47K, Merck Millipore).
Les cellules seront visualisées par microscopie confocale avec une double coloration
Hoechst/TRAP, et les éventuelles cellules géantes multinucléées seront comptées (Coury et al.,
2008). L’expression des immunomarqueurs CD14, CD68, CD83, CD86 et CD207 sera étudiée par FACS,
comme dans le cas du modèle murin.
Tests de prolifération, de migration et d’invasion
En parallèle et sur les trois types cellulaires cultivés, portant ou non la mutation BRAF V600E,
infecté ou non par le virus, seront menées des études visant à caractériser le potentiel prolifératif,
migratoire et invasif des cellules dendritiques. Ces études auront pour but de caractériser l’influence
du Polyomavirus sur les aspects néoplasiques de l’HL
Pour le potentiel prolifératif, des immunomarquages seront dirigés contre la protéine
nucléaire Ki-67. La fonction de Ki-67 reste inconnue cependant elle est exprimée dans les cellules
proliférative et est absente des cellules quiescentes, ce qui en fait un bon marqueur de la
prolifération cellulaire. Le rapport entre le nombre de noyau positif au marquage Ki-67 et les noyaux
négatifs est un indicateur utilisé en recherche et en médecine pour caractériser l’agressivité tumorale
et le risque métastatique, notamment pour le mélanome (Marinaccio et al, 2015). En parallèle, un
quadruple immunomarquage sera réalisé contre des marqueurs d’indifférenciations (CD14 et CD68)
A
B
cellules
invasives
Figure 15 : Présentation schématique des tests de migrations et d’invasions
A) Pour tester le potentiel migratoire (à gauche) et invasif (à droite), les cellules testées sont chargées dans la
chambre de boyden qui ne contient pas de molécules chimio-attractantes (CCL20). Pour le test d’invasion (à
droite), les cellules sont séparées de la membrane semi-perméable par une matrice, représentée en bleue
(matrigel).
B) Après 3H, à 37°C, les cellules migratrices (à gauche) et invasives (à droite) se retrouvent sur la face
inférieure du puit. Elles sont quantifiées soit par marquage à la rhodamine et observation au microscope à
fluorescence (pour les cellules souches hématoïétiques et les monocytes), soit par FACS (pour les cellules
dendritiques dérivées de monocytes), après un quadruple immunomarquage contre CD14, CD68, CD83 et
CD86.
CCL20 : chemokine (C-C motif) ligand ; CD : cluster of differentiation ; FACS : Fluorescence-activated cell
sorting
et des marqueurs de différenciations (CD83 et CD86) de DCs, sur les DCs dérivées de monocytes. Le
but étant de caractériser le niveau de différentiation de ces DCs obtenues in vitro, car chez les
patients ayant développés une forme multi systémique de la maladie, les LCs retrouvées présentent
un phénotype indifférencié (CD14+, CD68+, CD83- et CD86-) (Geissmann et al, 2001). De plus, elles
sont capables d’un auto-renouvellement indépendant des cellules souches hématopoïétiques de la
moelle osseuse (Chorro et al, 2009). Les résultats seront analysés par FACS et un rapport entre les
cellules marquées et les cellules non marquées par l’anticorps anti Ki-67 nous permettra de
déterminer le potentiel prolifératif de ces trois types cellulaires.
Dans un second temps, nous étudierons les capacités migratoires de ces cellules. La maladie
étant caractérisée par une infiltration excessive de DCs conduisant à la formation de granulome, on
se pose la question de l’impact que pourrait avoir la mutation BRAF V600E et le polyomavirus sur
cette infiltration. Ainsi, les CSH, les monocytes et les DCs dérivées de monocytes seront cultivées
dans une chambre de boyden (Figure 15) selon la méthode décrite par N. Bertho (Bertho et al, 2005).
La migration des cellules sera stimulée par la chemokine chimio-attractante CCL20 recombinante,
ayant la capacité d’attirer les DCs et est retrouvée au niveau des granulomes des patients malades
(Annels et al, 2003). Pour les CSH et les monocytes, une fois le test de migration terminé (3H, à 37°C),
les cellules n’ayant pas migré (présentent sur la face du haut de la membrane) sont lavées et les
cellules ayant migré sont fixées puis colorées à la rhodamine (possède une affinité aux fibres
d’actines) et comptées au microscope à fluorescence (Bertho et al, 2005). Pour les DCs dérivées de
monocytes, les mêmes étapes seront réalisées pour le lavage mis à part que les cellules migratrices
sont récupérées et comptabilisées par FACS après le quadruple immunomarquage détaillé
précédemment, afin de séparer les DCs complétement matures des DCs présentant le phénotype
immature des DCs retrouvées chez les malades.
Enfin, des tests d’invasions seront réalisés pour déterminé si les monocytes et les DCs sont
‘’suffisantes’’ pour infiltrer les tissus. Dans les granulomes, en plus des monocytes et des DCs, sont
retrouvées des MGCs (da Costa et al, 2005), qui ne sont pas étudiées ici et qui pourraient jouer un
rôle dans la sévérité de l’HL, comme cela a été montré dans des infections à Mycobacterium
tuberculosis (Lay et al, 2007). Les tests d’invasions sont très similaires aux tests de migration (Figure
15), détaillés dans le paragraphe précédent. Ils diffèrent seulement par la présence d’une matrice (du
matrigel) au fond de la chambre de boyden. Seules les cellules capables de dégrader cette matrice
pourront traverser le puit. Les CSH, les monocytes et les DCs dérivées de monocytes invasives seront
fixées ou non, marquées et comptabilisées de la même manière que pour le test de migration.
Perspectives
Une fois que nous aurons plus d'informations sur les cytokines impliquées, le rôle du virus, et
de la mutation BRAF V600E au niveau des différents progéniteurs des cellules dendritiques sur la
maladie grâce aux modèles in vitro et in vivo que nous proposons, il faudra confirmer ces résultats
sur des patients atteints de l’histiocytose Langheransienne.
Nous espérons qu’en sachant plus sur les mécanismes impliqués dans la maladie, de
nouveaux traitements pourront voir le jour afin d’améliorer la bonne prise en charge des patients.
De plus, l’étude de nouvelles thérapeutiques plus spécifiques de la maladie pourra être
réalisée à partir des modèles cellulaires et animaux que nous présentons.
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Résumé
Histiocytose langerhansienne (HL) est une maladie rare d'étiologie inconnue et manquant un
modèle animal fiable. La maladie accumule des symptômes trouvés séparément dans diverses
maladies IL-17A-liés, tels que la formation de granulome chronique agressive, la résorption osseuse
et des lésions des tissus mous avec neurodégénérescence occasionnelle.
L’HL est un trouble lympho-prolifératif des cellules anormales, en particulier des cellules de
Langerhans (LC), et se présente soit comme un HL multi-systémique (HL-MS) ou un HL à système
unique (HL-SS). Il y a beaucoup de controverse au sujet des résultats obtenus par l'analyse des
échantillons provenant de patients malades : il y a des groupes qui croient que l'IL-17A joue un rôle
majeur, et d'autres groupes qui par contre ne trouve pas d’interleukine. En outre, dans la dernière
année il a été suggéré l’intervention d'un virus dans gravité de la maladie.
Dans ce contexte, notre projet de recherche visera à clarifier l'étiologie de la maladie en
générant un modèle cellulaire et un modèle animal pour l’HL.