Electrophorèse SDS PAGE : principe et exemple d

Electrophorèse SDS PAGE : principe et exemple d'application en STL Biotechnologies
Extrait du Biotechnologie & Biologie et Physiopathologie humaine - Académie de Rouen
http://biotech.spip.ac-rouen.fr/spip.php?article155
Electrophorèse SDS PAGE :
principe et exemple
d'application en STL
Biotechnologies
- Ressources pédagogiques - Biochimie et Bio moléculaire -
Date de mise en ligne : mardi 12 juin 2012
Biotechnologie & Biologie et Physiopathologie humaine - Académie de Rouen
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Electrophorèse SDS PAGE : principe et exemple d'application en STL Biotechnologies
L'objectif de cet article est de :
recenser quelques ressources (vidéos, animations, diaporamas...) permettant d'appréhender le principe de cette
technique électrophorétique,
présenter des ressources en anglais permettant d'envisager une utilisation dans la cadre de la LV technologique
de section STL Biotechnologies,
présenter un exemple d'application pratique en STL Biotechnologies, portant sur l'identification variétale de
protéines de tissu musculaire de poisson.
Principe et mise en oeuvre de la SDS-PAGE
L'électrophorèse SDS-PAGE (électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium) est
une technique consistant à faire migrer des protéines dans un gel, sous l'influence d'un champ électrique, permettant
ainsi leur séparation.
Voir le diaporama de présentation de la SDS-PAGE (en anglais) utilisé au lycée Senghor lors de l'échange
Comenius sur la protéomique :
<a href="sites/biotech.spip.ac-rouen.fr/IMG/zip/SDS-PAGE.pps.zip" title='Zip - 1.7 Mo' type="application/zip">
SDS-PAGE Principle
La manipulation nécessite :
une cuve à électrophorèse + un générateur électrique,
un gel de polyacrylamide (précoulé en cassette ou à préparer) contenant des puits pour dépôt,
des solutions tampons adaptées au gel.
Le gel de polyacrylamide est créé par la polymérisation d'acrylamide et de bis-acrylamide, en présence d'agents de
polymérisation (TEMED, persulfate d'ammonium par exemple). Plus la concentration en acrylamide est élevée, plus
les pores seront petits et plus les molécules seront freinées dans le gel.
Comme toute technique électrophorétique, la SDS-PAGE permet la séparation des particules se fait en fonction de
leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.
Dans le cas de la SDS-PAGE, la séparation est réalisée en conditions dénaturantes en raison de l'ajout de SDS
(dodécylsulfate de sodium) : le SDS est un détergent fort possédant une longue queue hydrocarbonée hydrophobe
et une extrémité chargée négativement. Il intéragit avec les protéines par sa portion hydrocarbonée en liant leurs
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régions hydrophobes. En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette
négative.
La structure native de la protéine est donc dénaturée, et une charge apparente négative est alors conférée à
la protéine.
En présence de SDS, les protéines auront donc toutes une charge apparente négative, elles migreront donc
toutes vers l'anode. Cela signifie que seul le poids moléculaire des protéines sera le facteur de leur
séparation. Les protéines ayant un petit poids moléculaire, seront moins retenues dans les pores du gel de
polyacrylamide et migreront donc plus loin que les grosses.
Remarque : on ajoute aussi très souvent au mélange dénaturant du 2-mercaptoéthanol. Ce composé réduit les pont
disulfures unissant les différentes sous-unités des protéines oligomériques. Chaque sous-unité, une fois dissociée,
fixe le SDS et prend une charge apparente négative. Les sous-unités étant dissociées, sur le gel, apparaitrons après
migration, autant de bande qu'il y avait de sous-unités constitutives.
Exemple de simulation animée d'une électrophorèse SDS-PAGE :
Choisissez la masse moléculaire des protéines étalons A, B, C et D, puis cliquer sur "START" et immédiatement
après sur "STRAIN" pour visualiser la progression des protéines dans le gel. A tout moment il est possible d'appuyer
sur "STOP" pour arrêter la progression :
<object classid='clsid:d27cdb6e-ae6d-11cf-96b8-444553540000'
codebase='http://fpdownload.macromedia.com/pub/shockwave/cabs/flash/swflash.cab#version=6,0,0,0' width='700'
height='600'> <param name='class' value='' /> <!--[if !IE]> «--» <param name='class' value='' /> <!--» <![endif]--»
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Electrophorèse SDS PAGE : principe et exemple d'application en STL Biotechnologies
Source : www.winona.edu
Réalisation d'une électrophorèse SDS-PAGE
Les protéines, préalablement traitées en conditions dénaturantes, sont tout d'abord condensées dans un gel de
concentration puis séparées dans un gel de séparation. Lorsque les protéines ont été séparées, leur révélation sur le
gel peut être effectuée en les colorant directement (Bleu de Coomassie par exemple). Cette coloration permet de
visualiser toutes les protéines dans l'échantillon dont la concentration dépasse la limite de détection de la coloration.
Le gel coloré au bleu de Coomassie peut être ensuite transparisé par un mélange méthanol/acide acétique/eau.
Voir ci-dessous en vidéo (en anglais) les différentes étapes de progression des protéines au sein d'un gel :
<embed type='application/x-shockwave-flash' src='http://videoflash.ac-rouen.fr/player/player47.swf' width='320'
height='260' allowscriptaccess='always' allowfullscreen='true' wmode='transparent'
flashvars='duration=87&&file=SDS-PAGE_polyacrylamide_gel_electrophoresis.flv&image=http://videoflash.ac-rouen.
fr/vignettes/clap.jpg&streamer=rtmpt://fms.ac-rouen.fr/vod/biotechno' />
Source : www.geened.com
Exemple de gel après coloration au bleu de Coomasie :
Exemple d'application pratique en STL
Biotechnologies : identification variétale de poisson
par caractérisation de protéines du tissu musculaire
Intérêt de la manipulation
Grâce a la SDS-PAGE, il est possible de determiner assez finement la presence d'une proteine donnee dans
un echantillon proteique. Une proteine sera caracterisee par une masse moleculaire donnee.
L'objectif de la seance est de caracteriser, chez un poisson, une proteine du tissu musculaire, l'actine, qui est
impliquee dans les mecanismes de contraction musculaire. Dans chaque variete de poissons, on retrouvera des
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forme d'actine ayant des caracteristiques precises, permettant ainsi de comparer des varietes entre-elles : on
parle d'identification varietale. Il est ainsi possible de comparer entre-elles les proteines de differentes varietes
d'une espece en comparant leurs masses moleculaires.
Dans la seance proposée nous testerons deux echantillons :
•
•
un echantillon de reference, constitue par du tissu de saumon sauvage,
un echantillon de saumon a tester commercialise comme etant d'origine sauvage. Les saumons d'elevage,
souvent croisés avec des truites, ayant des caracteristiques sensiblement differentes des saumons sauvages,
nous allons verifier, par comparaison de leur actine, que le saumon commercialise comme etant d'origine
sauvage, n'est pas un poisson d'elevage.
Protocole et matière d'oeuvre à télécharger :
<a href="sites/biotech.spip.ac-rouen.fr/IMG/pdf/AT_-_Se_paration_de_prote_ines_par_SDS_PAGE.pdf" title='PDF 1.1 Mo' type="application/pdf">
Exemple de protocole
Exemples d'exploitation possibles :
Questions de compréhension :
Justifier le rôle des differents constituants du tampon Laemmli. Justifier le rôle du bleu de Coomassie, puis de
l'etape de transparisation sous l'eau.
Proposer un schema legende et annote du montage electrophoretique et expliquer le rôle des différents
éléments.
Reperer sur le gel les bandes correspondant a l'actine.
Expliquer les differences de migration observees pour les differentes proteines du melange etalon.
Tracer la courbe d'etalonnage (log masse moleculaire en kDa = f (distance de migration à l'aide de l'outil
informatique.
A l'aide de la courbe d'etalonnage, déterminer la masse moleculaire de l'actine des deux varietes de poissons
testés et conclure sur l'origine du saumon testé.
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