Stratégies de purification de complexes supramoléculaires
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Stratégies de purification de complexes supramoléculaires • Electrophorèse • Purification par affinité en tandem : TAP-tag P CP Electrophorèse des protéines Conditions dénaturantes (SDS-PAGE) Conditions « natives (CN et BN-PAGE) P CP Electrophorèse des Protéines • En conditions dénaturantes sur gel 1D de polyacrylamide (SDS – PAGE) : migration proportionnelle à la taille (nb charges /unité de longueur) • Le gel 2D (pI = première dimension) permet de visualiser des différences de migration dues à des modifications post-traductionnelles (phosphorylation) • Estimation de taille et de pureté • Possibilité de séparation en conditions natives P CP Gels 2D – Expression différentielle Tissu sain Tissu cancéreux 1 - 3: expression augmentée dans le tissu cancéreux P CP 4 - 11: expression diminuée dans le tissu cancéreux Cas de complexes non caractérisés Séparation à deux dimensions du complexe supramoléculaire en électrophorèse Applications : * complexes chez E. coli et Pseudomonas aeruginosa * complexe des deshydrogénases à NADH de la membrane mitochondriale interne chez S. cerevisiae P CP Blue Native / SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN/SDS-PAGE P CP BN/SDS-PAGE : Principe Séparation à deux dimensions par électrophorèse : • Méthode « native » en première dimension (le colorant apporte les charges pour la migration) • En conditions dissociantes en seconde dimension puis Analyse protéomique par LC-MS/MS BN/SDS-PAGE BN-PAGE SDS-PAGE Les protéines membres d’un même complexe co-migrent dans la première dimension et les spots correspondants sont de forme similaire, alignés dans la seconde dimension. Cas A : protéines non impliquées dans un complexe trouvées sur l’hyperbole (courbe en pointillés) Cas B : protéines impliquées dans un complexe homo-multimérique. Pas de spots de forme similaire alignés sur une verticale Cas C: protéines impliquées dans un complexe hétéro-multimérique. Spots de forme similaire alignés sur une même verticale P CP Crédit : Marc Bonneu, CGFB BN/SDS-PAGE Les principaux complexes protéiques d’E. coli ont été séparés par 2-D BN/SDSPAGE et identifiés par LC-MS/MS après clivage protéolytique “in gel” : 306 complexes répartis en : - 50 hétéro-multimériques - 256 homo-multimériques P CP BN-PAGE/Protein Correlation Profiling Total Protein Extract Desalting Separation of complexes by BN-PAGE Gel slicing (40 pieces) In-gel Proteolysis LC-MS/MS analysis Application à Pseudomonas aeruginosa 4-12% 7-12% 667 KDa 667 KDa 443 KDa 7-18% 667 KDa 443 KDa 7-18% 214 7-12% 129 69 371 150 KDa 60 62 443 KDa 103 4-12% 150 KDa 150 KDa 998 protéines identifiées par 3 peptides au moins S. Vilain et al. - Congrès EUPA 2013 PCP Dans la fraction 10 du gel 4-12%, 5 protéines présentent la même distribution sur le gel BN-PAGE Complexe incluant les NADH deshydrogénases de la membrane mitochondriale (1 int. et 2 ext.) chez S. cerevisiae Membranes Mitochondriales Test d’activité Electrophorèse « native » SDS-PAGE Clivage protéolytique in gel MS et (LC)-MS/MS Identifications Analyse d’un mélange de protéines après électrophorèse 1D et clivage protéolytique Intens. x109 G 2197,24 1,2 H 1,0 2496,32 2465,20 0,8 G G G 1611,95 2733,47 1402,72 0,6 G H G G H 1833,98 3452,48 2706,40 G H 2013,10 F 0,4 H H, 2872,48 H 0,2 0,0 1500 F F 2000 F F P CP 2500 3000 3500 m/z Analyse de complexes supramoléculaires • Complexe des NADH déshydrogénases mitochondriales de levure : 38 protéines • Implication de plusieurs ORFs • Logique de l’assemblage Déshydrogéna ses externes CYB2 DLD1 NDE1 NDI1 SDH1 MDH1 NDE2 GUT2 YOR 356W YPR 004C CIT1 ALD7 FUM1 Cycle des a cides trica rboxyliques IDH2 HSP60 YLR 089C ATP1 Méta bolisme des a cides a minés PUT2 MRF1 Grandier-Vazeille et al. Biochemistry, 40, 2001, 9758-9769 P CP Tandem Affinity Purification TAP -tag P CP Stratégie d’analyse des complexes multiprotéiques d’une cellule • Stratégie élaborée pour purifier des centaines ou milliers de protéines • Construction d’une chimère entre la protéine d’intérêt et deux étiquettes pour la chromatographie d’affinité • Robustesse et fiabilité Gavin et al., Nature 415, 2002, 141-147 P CP P CP La robustesse et la fiabilité sont acquises par l’utilisation de plusieurs points d’entrée (hameçons) différents (indiqués par des flèches sur les gels SDS-PAGE) P CP Caenorhabditis elegans interactome map, showing 5,500 protein interactions among 3,000 proteins CP N Blow Systems biology: Untangling theP protein web Nature 460, 415-418 (2009) Discussion / TAP-Tag • Première stratégie de caractérisation de complexes multiprotéiques à l’échelle d’un protéome • Chaque complexe requiert un ajustement des conditions chromatographiques • Aumoins l’une des étiquettes est de grande taille et peut affecter l’assemblage de certains complexes • Aucune information sur la stœchiométrie Objectifs?
