Séparation par électrophorèse des protéines extraites de muscles

Séparation par électrophorèse des protéines extraites de muscles squelettiques
Extraction
Un petit fragment de muscle squelettique (environ 1g) est placé dans un tube à essai en verre borosilicaté avec
5 mL de tampon d'extraction( tampon de Laemmli sans mercaptoéthanol ) . Ce tampon sert à solubiliser les
protéines. Le Sodium dodécyl sulfate qu'il contient est un détergent anionique, il désorganise les membranes en
intervenant sur les lipides qui les constituent. Il interagit avec les protéines en se liant sur les régions
hydrophobes . Les complexes protéines-SDS passent en solution.
Pour compléter l'action dénaturante du SDS il faut porter le tube au bain marie bouillant à 95-100°C pendant 5
minutes ce qui détruit les structures secondaires, tertiaires et quaternaires des protéines. Le SDS recouvre
alors la protéine en lui apportant une charge apparente négative ce qui va la faire migrer de la cathode vers
l'anode à travers le gel .
Remarque : si on prépare le tampon de Laemmli avec du mercaptoéthanol on doit utiliser la hotte de chimie
car le produit est dangereux.
Préparation du gel d'agarose
Le gel est préparé avec de l'agarose( utilisée pour l'électrophorèse de l'ADN ) à 2% dans 50 mL de tampon TGS
(tris glycérine SDS) N.B Attention il ne faut pas, à cause de la présence du SDS, faire fondre le gel au four à
micro-ondes(débordement de mousse). Après le coulage du gel encore chaud, enlever les éventuelles bulles
avec une spatule.
Laisser refroidir totalement le gel avant d'enlever le peigne et selon les modèles le papier adhésif ou les cales
en caoutchouc.
Mise en place du gel
Le gel, de part sa texture peut se manipuler facilement sans utiliser une pelle à gel, il n'est pas très fragile. Le
placer dans la cuve sur son support en mettant les puits côté cathode. La cuve est ensuite remplie avec le
tampon TGS de façon à recouvrir le gel avec une faible épaisseur de liquide ( en fonction des générateurs certains disjonctent quand la quantité de tampon recouvrant le gel est trop importante, dans ce cas la diminuer
même si le gel n'est pas complètement recouvert, par contre elle doit permettre le passage du courant
électrique donc recouvrir d'au moins 5 mm la partie centrale de la cuve où est posée le gel).
Echantillons et dépôts
Les extraits obtenus après chauffage contiennent, en solution, les protéines musculaires dénaturées
recouvertes de SDS, donc chargées négativement, le bleu de bromophénol du tampon de Laemmli permet de
suivre l'avancée de la migration, le glycérol densifie l'échantillon qui va ainsi au fond du puits lors du dépôt.
On dépose à l'aide d'une micropipette ou d'un compte-gouttes calibré 20 µL de chaque échantillon dans chacun
des puits. On peut placer un papier noir sous la cuve pour mieux voir les puits et faciliter les dépôts.
Migration
Refermer la cuve en tenant bien compte de la polarité et régler l'alimentation sur 100 Volts. L'électrophorèse a
lieu dans des conditions dénaturantes, les protéines chargés négativement se déplacent vers l'anode. Celles
ayant un poids moléculaire faible seront peu retenues par le gel et migreront plus loin que celles ayant un poids
moléculaire plus fort. La durée de migration est de 60 minutes. Le bleu de bromophénol indique la progression
de la migration mais certaines protéines peuvent migrer plus vite: en tenir compte pour arrêter la migration.
Fixation
La migration terminée, sortir le gel de la cuve, enlever le support plastique. Fixer les protéines dans l'agarose
car elles ont tendance à diffuser en plaçant le gel dans un fixateur( acide éthanoïque + éthanol) pendant 2
minutes, ce qui les précipite sur place.
Coloration
Le gel est placé dans un bain de bleu de Coomassie pendant 1 minutes
Décoloration
Le gel est placé ensuite dans une solution de décoloration pendant au moins une heure puis dans des bains
successifs d'eau distillée jusqu'à décoloration totale du support (plusieurs heures), seules les protéines
apparaissent sous forme de bandes colorées en bleu.