enzymologie – pcem1 2006-2007 s. allouche

ENZYMOLOGIE – PCEM1
2006-2007
S. ALLOUCHE
INFOS PRATIQUES
•Polycopié d’enzymologie
•Cours disponible en salle informatique (UFR médecine)
•Ouvrages disponibles à la BU: Rawn, Lehninger, Harper
• Site internet : CHUPS (Pitié-Salpétrière)
www.chups.jussieu.fr
Chapitre 1 : Les enzymes sont des catalyseurs
•
Introduction
•
Propriétés générales
•
Classification enzymatique
•
Thermodynamique d’une réaction chimique
Chapitre 1 : Les enzymes sont des catalyseurs
Enzyme (Dictionnaire Hachette)
n. fém. [selon l’Académie des sciences] ou n. masc. (gr. zumê
«levain»). Molécule protéique qui induit, maintient et régule des
réactions spécifiques de dégradation (catabolisme) ou de synthèse
(anabolisme) de la matière vivante dans des conditions de
température compatibles avec la vie. / catalyseur biologique;
diastase; zymase.
Chapitre 1 : Introduction
• Les enzymes sont des catalyseurs biologiques (pH, T° …)
• Ces sont des protéines (exception : ribozymes)
• 2 caractéristiques : - pouvoir catalytique
- spécificité
• L’activité catalytique liée : - fixation optimale du substrat
- stabilisation état de transition
• Organisation en voies métaboliques = systèmes efficaces
• Ce sont des systèmes qui sont régulés
Chapitre 1 : Introduction
• Intérêts des enzymes en médecine ?
1. Diagnostic pathologies liées à un déficit enzymatique (ex:Glc-6P
deshydrogenase : anémie hémolytique, phosphorylase : McArdle,
ornithine transcarbamylase : cycle urée)
2. Détection et quantification de lésions tissulaires (Créatine
Phospho Kinase-MB, Lactate Deshydrogenase)
3. Dosage métabolites (ex : glycémie avec glucose oxydase)
• Autres intérêts : industrie pharmaceutique (inhibiteurs, enzymes
purifiées), agro-alimentaire
Chapitre 1 : Les enzymes sont des catalyseurs
•
Introduction
•
Propriétés générales
•
Classification enzymatique
•
Thermodynamique d’une réaction chimique
Chapitre 1 : Propriétés générales
• Définition d’un catalyseur :
1. Il augmente la vitesse de la réaction (jusqu’à plusieurs millions
de fois)
2. Il ne modifie pas l’équilibre de la réaction
3. Il n’est pas modifié lors de la réaction (on le retrouve en fin
de réaction)
4. Il agit à de très faibles concentrations (+ faibles / substrat)
Chapitre 1 : Propriétés générales
• Exemple de l’anhydrase carbonique :
CO2 + H2O
«
H2CO3
• Réaction d’hydratation du gaz carbonique
• Permet transfert CO2 des tissus vers poumons via sang
• 1 molécule d’enzyme permet d’hydrater 100.000 molécules de
CO2/sec
Chapitre 1 : Propriétés générales
• Les enzymes présentent une spécificité pour leur substrat et pour la
réaction qu’ils catalysent
• Une classe d’enzyme ne reconnaît qu’un type de substrat (ex :
protéases)
• La réaction enzymatique est unique ex : coupure d ’une liaison
peptidique
Chapitre 1 : Propriétés générales
RARE
Chapitre 1 : Propriétés générales
• Exemple : les protéases
• Ces enzymes catalysent toutes l’hydrolyse d’une liaison peptidique
• La spécificité est différente selon l’enzyme
- la carboxy-peptidase : exopeptidase
-La trypsine : endopeptidase R1 = acide aminé basique (Arg, Lys)
-La chymotrypsine : R1 = acide aminé aromatique (Phe, Trp, Tyr)
Chapitre 1 : Propriétés générales
• La spécificité des enzymes : l’énantiosélectivité
• Exemple avec les protéases :
• Les acides aminés les animaux et végétaux sont de la série L (la
fonction aminée sur le carbone a asymétrique est orientée à gauche)
• Les protéases hydrolysent spécifiquement les protéines contenant les
acides aminés de la série L
• Si protéine avec des acides aminés de la série D (parois bactéries,
antibiotiques) Ä pas de coupure
Chapitre 1 : Propriétés générales
I notion énantiomères D et L différente lévogyre et dextrogyre
Chapitre 1 : Propriétés générales
•
Notion de site actif : 2 parties
- Site de fixation responsable de la liaison avec le substrat et permettent
orientation correcte du substrat
- Site catalytique responsable de la transformation du substrat (rupture
et formation liaisons chimiques)
rmq : mutagénèse dirigée pour caractériser AA impliqués
Chapitre 1 : Propriétés générales
•Le site catalytique est composé d’un petit nombre d’acides aminés
(< 10) – Les autres servent à maintenir une structure active du site
catalytique (bonne position des AA les uns / autres)
Chapitre 1 : Propriétés générales
-
•
-
•
Le site actif est généralement situé dans une « crevasse » de
l’enzyme
La « crevasse » est constituée d’AA hydrophobes (intérieur de la
molécule) alors que site actif est constitué d’AA polaires : exclusion
molécules H2O.
Le site de fixation du substrat : (pas d’interaction covalente)
Interactions entre enzyme-substrat de faible énergie (hydrogènes,
van der Waals, électrostatiques, hydrophobes) mais nombreuses ce
qui apporte de l ’E (â E d ’activation)
Notion de complémentarité entre substrat et enzyme (+ exactement
états transition de réaction)
Chapitre 1 : Propriétés générales
•
Hypothèse de Fischer (1894) : modèle clé-serrure
•
A permis le développement de l’enzymologie
•
Mais suppose une structure figée
Chapitre 1 : Propriétés générales
•
Hypothèse de Koshland (1958) : modèle de l’ajustement induit
entre l’enzyme et le substrat
•
L’enzyme a une structure flexible et change de conformation lors de
la fixation du substrat
Animation
Enz.exe
Chapitre 1 : Les enzymes sont des catalyseurs
•
Introduction
•
Propriétés générales
•
Classification enzymatique
•
Thermodynamique d’une réaction chimique
Chapitre 1 : Classification enzymatique
•
Classification par l’Union Internationale de Biochimie (1961)
•
Basée sur le type de réaction catalysée
•
6 groupes
•
Identification des enzymes par 4 chiffres précédés de EC
Chapitre 1 : Classification enzymatique
•
EC 1. Les oxydo-réductases
•
Définition : Ce sont des enzymes qui catalysent des réactions
d’oxydation ou de réduction
•
Existence de plusieurs sous-groupes (deshydrogénase, oxydase,
peroxydase, hydroxylase et catalase)
Chapitre 1 : Classification enzymatique
•
Le site actif contient composés organiques (vitamines = cofacteurs)
et inorganiques (Fe2+, Mn2+, Mg2+…) essentiels activité catalytique
•
Définitions :
- apoenzyme : partie protéique enzyme
- cofacteur ou coenzyme : partie non-protéique
enzyme
- haloenzyme = apoenzyme+cofacteur
•
Cofacteur lié apoenzyme façon covalente (groupement prosthétique)
ou non
Chapitre 1 : Classification enzymatique
• Les deshydrogénases
- Elles transforment une simple liaison en double liaison en permettant le
transfert d’hydrogène d’un substrat sur un coenzyme.
- Exemple des deshydrogénases à NAD+ qui catalysent l’oxyda-tion des fonctions alcool en fonction cétone (ex: LDH, malate
deshydrogénase)
Chapitre 1 : Classification enzymatique
Chapitre 1 : Classification enzymatique
Chapitre 1 : Classification enzymatique
Dans le deuxième cas, l’enzyme fixe la fonction aldéhyde sur
une fonction thiol pour formé un thiol-ester (ex : phosphoglycéraldéhy-de deshydrogénase) avec réduction concomitante du NAD+ en
NADH,H+.
Chapitre 1 : Classification enzymatique
• Coenzymes des deshydrogénases :
- le NADP+ (C’est le cas de la glucose6-P deshydrogénase) ou le NAD+
avec comme précurseur l’acide nicotinique
- la FMN (flavine mono-nucléotide) ou la FAD (flavine adénine
dinucléotide) avec comme précurseur la riboflavine (vitamine B2)
Les deshydrogénases qui utilisent ces derniers coenzymes
sont retrouvées dans le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire mitochon-driale.
Chapitre 1 : Classification enzymatique
Les coenzymes
Définition : molécules organiques qui sont indispensables à la réaction
en permettant soit le transport du substrat, soit en participant à la
structure de l’enzyme.
• Le coenzyme n’est pas consommé lors de la réaction
• Dérivent en général de vitamines
Chapitre 1 : Classification enzymatique
Les coenzymes
FAD / FADH2
H+
H+
Chapitre 1 : Classification enzymatique
• Les oxydases
- Ces enzymes catalysent le transfert des électrons sur l’oxygène ou
encore l’addition de l’oxygène.
- Exemple : la cytochrome c-oxydase de la chaîne respiratoire qui par
oxydation du cytochrome c va réduire l’oxygène en eau.
Chapitre 1 : Classification enzymatique
Chapitre 1 : Classification enzymatique
EC 2. Les transférases
Définition : enzymes qui transfèrent un groupement X (autre que H)
d’un substrat A sur un substrat B :
AX + B « A + BX
• Exemples : transfert d’un groupement monocarboné : méthyltransférase
• transfert d’un groupement phosphoré : phosphoryltransférase (rmq :
lorsqu’il s’agit du transfert d’une liaison riche en énergie de l’ATP à un
composé « pauvre » en énergie on parle alors de kinase).
Chapitre 1 : Classification enzymatique
Chapitre 1 : Classification enzymatique
EC 3. Les hydrolases
Définition : enzymes qui hydrolysent (par addition d’une molécule
d’eau) différentes liaisons chimiques
• Exemples : les phosphatases, les peptidases (ex: carboxypeptidases,
aminopeptidases), les protéinases (ex : pepsine, trypsine..)
Chapitre 1 : Classification enzymatique
EC 4. Les lyases
Définition : Ce sont des enzymes qui détachent certains groupements par
d’autres mécanismes que l’hydrolyse ou forment de nouvelles liaisons
chimiques indépendamment hydrolyse ATP.
• Exemple : les décarboxylases qui catalysent l’élimination du groupe-ment carboxyl sous forme de CO2 avec le phosphate de pyridoxal
(vitamine B6) comme coenzyme.
Chapitre 1 : Classification enzymatique
EC 5. Les isomérases
Définition : Les isomérases ou mutases permettent le transfert d’atomes
ou de groupements dans une même molécule.
• Exemples :
- la phosphohexose isomérase qui va catalyser l’interconversion entre le
glucose-6P et le fructose-6P
- phosphotriose isomérase qui catalyse l’interconversion entre le
phosphodihydroxyacétone et le glycéraldéhyde-3P
Chapitre 1 : Classification enzymatique
pyrannose
L ’enzyme transfère l ’H du C2 vers le C1
furannose
Chapitre 1 : Classification enzymatique
EC 6. Les ligases
Définition : enzymes qui participent aux réactions de synthèse entre :
C-O : les aminoacyl-ARNt synthétases
C-S : acétyl CoA synthétase
C-N : amide synthétase comme la glutamine synthétase
C-C : carboxylase à biotine comme la pyruvate carboxylase qui catalyse
la formation d’oxalo-acétate à partir du pyruvate + CO2 + ATP.
Chapitre 1 : Classification enzymatique
Chapitre 1 : Classification enzymatique
• Plusieurs dénominations possibles pour les enzymes :
-Fonction de la nature des partenaires de la réaction.
Exemple : la L-lactate : NAD oxydo-réductase qui est l’équivalent de
la Lactate-deshydrogénase ou LDH.
• Cette dénomination ne s’applique pas pour certains enzymes comme
la trypsine, la chymotrypsine…
ÄUtilisation d’une dénomination simplifiée :
la lactate deshydrogénase.
Chapitre 1 : Les enzymes sont des catalyseurs
•
Introduction
•
Propriétés générales
•
Classification enzymatique
•
Thermodynamique d’une réaction chimique
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
• Définition énergie chimique :
- énergie = capacité système effectuer travail
- l’énergie libre de Gibbs G exprime l’énergie potentielle
chimique d ’une molécule
- en biologie, G° ’ = énergie libre standard pH=7
- si un substrat S est transformé spontanément en P (G + faible / S)
- DG° ’ = G° ’p - G° ’s = force d ’une réaction et reflet équilibre
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
• La DG° ’ d’une réaction :
- Dépend de l’état initial et de l’état final
- Ne dépend pas du chemin réactionnel
- Ne donne pas d’indication sur la vitesse d’une réaction
- Permet de prédire si une réaction est thermodynamiquement
possible
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
• Si DG < 0 : réaction spontanée
• Si DG > 0 : réaction non spontanée mais possible si couplage à une
réaction exergonique
• Si DG = 0 : réaction à l’équilibre
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
• Réaction non catalysée par enzyme A + B « C + D
- A et B sont hydratés et mouvements par agitation thermique
pour réaction il faut : - interaction entre A et B
- vitesse suffisante
- orientation correcte A et B
è franchissement état transition mais rare
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
État de transition
Énergie
d’activation
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
• Soit la réaction suivante : S à P
• Lors de cette transformation, le substrat passe par un état activé S*
• S* est un état instable ou état de transition (mi-chemin entre S et P)
• A quoi correspond cet état ? Les modifications des liaisons
chimiques dans le substrat sont en cours de modification
• L’énergie libre de S* est > celles de S et P
• L’énergie d’activation = DG* = énergie S* - énergie S
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
• Plus l’énergie d’activation sera importante plus la vitesse de la
réaction S à P sera lente
• La DG* représente une barrière énergétique pour le passage de S
vers P (c’est l’énergie nécessaire aux réarrangements des liaisons et
aux autres transformations)
• Pour que la réaction se produise, les molécules doivent surmonter
cette barrière et franchir cet état de transition.
• Si pas de barrière énergétique Ä macromolécules complexes se redégraderaient sans production E
• Et les enzymes dans tout ça ??
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
•Réaction catalysée par enzyme A + B « C + D
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
•Réaction catalysée par enzyme A + B « C + D
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
•
Lors d’une réaction catalysée par un enzyme, il y a :
•
Formation d’un complexe ES avec un DG < 0
• Formation d’un complexe ES* avec une énergie d’activation
DG * faible car E fournit par interactions faibles
•
Formation d’un complexe EP
En présence d’enzyme, on a toujours :
DG * enzymatique < DG * chimique
L’enzyme, qui est un catalyseur, va agir en diminuant cette énergie
d’activation ce qui se traduit par une augmentation de la vitesse
Chapitre 1 : L’énergie libre DG
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Introduction
•
Equation de Michaelis-Menten
•
Paramètres enzymatiques : Vm et Km
•
Effecteurs et régulation
•
Inhibitions et allostérie
Chapitre 2 : Introduction
• Définition : la cinétique enzymatique, c’est l’étude des variations
des vitesses de la réaction en fonction de la concentration du substrat
• A quoi ça sert ?
• Elle permet de déterminer :
- Modélisation activité enzymatique
-Équation de la vitesse
-Paramètres cinétiques et leur signification
-Etudes en présence d’inhibiteurs, conditions optimales...
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Introduction
•
Equation de Michaelis-Menten
•
Paramètres enzymatiques : Vm et Km
•
Effecteurs et régulation
•
Inhibitions et allostérie
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• On considère la réaction enzymatique où S à P et où le substrat est en
excès / enzyme
• Pour suivre la réaction, on mesure soit la disparition du substrat soit
l’apparition du produit en fonction du temps
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• A t1, on mesure la quantité ou concentration du substrat S1 ou du
produit P1.
• A t2, on mesure la quantité ou concentration du substrat S2
ou du produit P2.
• La vitesse se définit par la variation de substrat ou dS (S1-S2) ou la
variation de produit dP en fonction d’une différence de temps dt (t2-t1)
Définition : La vitesse représente le nombre de moles de substrat
transformé en moles de produit dans un volume et dans un temps
donné.
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
On peut distinguer plusieurs phases de la réaction enzymatique
1. Liaison réversible enzyme et substrat
2. Transformation complexe enzyme-substrat en enzyme-produit
3. Dissociation du complexe enzyme-produit en enzyme + produit
Toutes ces étapes sont réversibles et font intervenir des complexes inter-médiaires : enzyme-substrat (ES) et enzyme-produit (EP)
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• La réaction enzymatique n’est pas uniforme dans le temps
En enzymologie, on calcule
toujours la vitesse initiale
pendant la phase stationnaire
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• On réalise d’autres expériences où on ä la quantité d’enzyme
(E3>E2>E1) mais S est toujours en excès
ä de la vitesse initiale
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• Relation linéaire entre la vitesse initiale et la concentration d’enzyme
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• Définition de l’unité enzymatique (pour une protéine dans une fraction
non purifiée) : c’est la quantité d’enzyme qui transforme 1 µmole de
substrat par min
• Définition de l’activité spécifique : c’est le nombre d’unité
enzymatique par mg de protéine purifiée (donne une indication sur la
pureté relative)
• katal : ancienne unité correspondant aux nbres mol transformées par
sec
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Introduction
•
Equation de Michaelis-Menten
•
Paramètres enzymatiques : Vm et Km
•
Effecteurs et régulation
•
Inihibitions et allostérie
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• Relations entre la vitesse initiale et la [S]
• A quantité d’enzyme constante, on fait varier la [S] et on mesure
l’apparition [P]
Pour chaque condition,
on peut mesurer la
vitesse initiale
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• Représentation graphique des vitesses initiales en fonction de la [S] et
l’on obtient une hyperbole
Hyperbole de Michaelis-Menten
Vmax / 2
Km
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• Détermination de l’équation de Michaelis-Menten
• Soit la réaction suivante :
A l’état stationnaire, on a [S] >>> [P] donc on néglige la réaction
inverse qui transforme EP
ES
Dans ces conditions, la formation de ES = est constante car on est dans
une zone linéaire et égale à la dissociation de ES
donc : K1 [E] [S] = (K-1 + K2 )[ES]
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
[E]totale = [E] + [ES]
K1 ([E]totale-[ES])X[S] = (K-1 + K2) [ES]
(([E]totale-[ES])X[S]) / [ES] = (K-1 + K2) / K1 = Km (équation 1)
La constante de Michaelis reflète l’affinité de l’enzyme pour son
substrat. Plus Km sera grand, moins bonne sera l’affinité. L’unité
de cette constante est en mol / l
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
D’après l’équation 1 :
(([E]totale / [ES]) – 1) X [S] = Km
([E]totale X [S] ) / [ES] – [S] = Km
([E]totale X [S] ) / [ES] = Km + [S]
[E]totale / [ES] = (Km + [S]) / [S]
[ES] / [E]totale = [S] / (Km + [S]) (équation 2)
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• La vitesse de la réaction, c’est la vitesse de formation du produit P.
D’après l’équation suivante, cette vitesse V = K2 [ES]
• La vitesse maximale est obtenue lorsque Etotale = ES (saturation de
l’enzyme par le substrat)
Donc, V max= K2 [Etot]
En combinant ces 2 équations, on a :
V/Vmax = [ES] / [Etot] (équation 3)
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• D’après les équations 2 et 3, on obtient :
V = Vmax [S] / (Km +[S]) : c’est l’équation de Michaelis-Menten
• La vitesse initiale dépend de la Vmax, [S] et de la constante de
Michaelis Km
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• Quand [S] =0, V = 0
• Quand [S] =Km, V = Vmax/2
• Quand [S] >>> Km, V = Vmax
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
• La détermination des paramètres cinétiques est difficile et peu précise
à partir de l’hyperbole
• Solution ? Transformation de Lineweaver-Burk (double inverse) et
représentation de 1/V en fonction de 1/S
1 / V = (Km) / (Vmax) X 1 / [S] + 1 / Vmax
• Lorsque l’on représente 1/V en fonction de 1/[S], on obtient une
équation du type y = a x + b
Chapitre 2 : Equation de Michaelis-Menten
Pente = Km / Vmax
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Introduction
•
Equation de Michaelis-Menten
•
Paramètres enzymatiques : Vm et Km
•
Détermination d’une vitesse initiale
•
Effecteurs et régulation
•
Inhibitions et allostérie
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Utilisation d’un spectrophotomètre
•
Mesure de l’absorbance d’un substrat ou d’un produit coloré
ou le NADH,H+ (340nm)
Loi de BEER-LAMBERT
• DO (densité optique) = absorbance = e X l X C
Où e est le coefficient d’extinction molaire (l.mol-1.cm-1)
l = trajet du faisceau incident à travers la cuve de mesure en cm
C = concentration de la solution à mesurer en mol/l
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
cuve de mesure
Faisceau incident
amplification
1 cm
Le spectrophotomètre mesure des absorbances
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Introduction
•
Equation de Michaelis-Menten
•
Paramètres enzymatiques : Vm et Km
•
Détermination d’une vitesse initiale
•
Effecteurs et régulation
•
Inhibitions et allostérie
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• De nombreux facteurs modulent l’activité des enzymes
-Paramètres physico-chimiques : température, pH, force ionique
-Paramètres chimiques : les métaux, agents dénaturants, modifications
covalentes, protéolyse
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Effet de la température
• On augmente la température et l’on mesure l’apparition de produit
• On observe : - ä vitesse initiale avec la T°
- Perte d’activité de + en + rapide avec la T°
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Quand on ä la T°, on va ä énergie cinétique des molécules, la
fréquence des collisions, on apporte de l’E (énergie d’activation) Ä
augmentation de la vitesse initiale (jusqu’à 30-40°c)
• Au-delà d’une certaine T°, on observe une perte souvent irréversible
de l’activité : c’est la thermolabilité (55-65 °c)
Vi
Activation
(Arrhénius)
Dénaturation
thermique
q critique
q °C
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Ceci est valable pour tous les enzymes sauf pour les organismes
thermophiles
• DNA polymérase de Thermus aquaticus : enzyme qui est utilisée pour
les PCR et qui fonctionne à haute température (72°C)
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Effet du pH
• Le pH modifie l’état d’ionisation des protéines et affecte l’activité des
enzymes
• Aux pH extrêmes, les enzymes sont dénaturés
• Aux pH neutres, les groupements essentiels à l’activité sont ionisés
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Il existe des différences de pH optimal selon les enzymes
• Exemples :
- la pepsine au niveau de l’estomac fonctionne mieux à pH acide
- la lipase du suc pancréatique a un pH optimal compris entre 7 et 7.5
- les phosphatases alcalines osseuses ou hépatiques ont un pH optimal
entre 8.6 et 9.1, c’est-à-dire basique
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
Vi
pH optimum
pepsine
trypsine
amylase
pH
pH d'arrêt
pH d'arrêt
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Métaux et cations divalents
• Les ions métalliques (Fe 2+) ou les cations divalents (Ca 2+) sont
parfois nécessaires à l’activité enzymatique
• Ils interviennent :
- Comme élement dans la catalyse
- dans la structure tridimensionnelle de l’enzyme
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Quelques exemples :
-Cu : dans la cytochrome c oxydase (enzyme de la chaîne respiratoire)
-Fe : dans les cytochromes, l’hémoglobine
-Ca : dans protéases de la coagulation
-Mg : dans les enzymes qui mettent en jeu l’ADP ou l’ATP
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Le métabolisme cellulaire est régulé par la quantité d’enzyme
(biosynthèse) et par le niveau d’activité des enzymes
• Régulation enzymatique par modifications covalentes
• La phosphorylation est courante (Ser, Thr et Tyr)
• Exemple : la glycogène phosphorylase
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Régulation enzymatique par protéolyse
• Les enzymes sont synthétisés sous forme de précurseurs inactifs
• Leur coupure par des protéases va conduire à leur activation
•Exemples : zymogènes pancréatiques, enzymes de la coagulation
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Introduction
•
Equation de Michaelis-Menten
•
Paramètres enzymatiques : Vm et Km
•
Effecteurs et régulation
•
Inhibitions et allostérie
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
On distingue plusieurs type d’inhibiteurs d’enzymes :
-
Les inhibiteurs compétitifs
-
Les inhibiteurs non-compétitifs
• Ces inhibitions peuvent être décrites d’après l’équation de MichaelisMenten
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
L’inhibition compétitive
•
Définition : on parle d’inhibiteur compétitif lorsque l’inhibiteur se
fixe sur l’enzyme en compétition avec le susbtrat
•
Le complexe EI (enzyme-inhibiteur) n’a pas d’activité
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
On définit une constante Ki qui reflète l’affinité de l’enzyme pour
l’inhibiteur.
•
Ki = [E] [I] / [EI]
•
Etot = E + ES + EI
•
Constante de Michaelis en présence d’inhibiteur Kmi
•
Kmi = Km (1 + [I] / Ki)
•
V = Vmax [S] / (Kmi + [S])
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• En présence d’une concentration fixe d’inhibiteur, on observe :
-ä du Km (Kmi > Km) = æ affinité de l’enzyme pour S
- Pas de modification de la Vmax quand [S] >>> Kmi
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Après transformation de Lineweaver-Burk, on a :
1 / V = Kmi/ (Vmax) X 1 / [S] + 1 / Vmax
Convergence des droites
sur 1/Vmax
Kmi
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Exemple :
-Inhibition compétitive de la succinate deshydrogénase (complexe II de
la chaîne respiratoire) par le malonate.
- On remarque qu’il existe une homologie structurale entre le succinate
(substrat naturel) et le malonate l’inhibiteur compétitif.
- La distance entre les deux fonctions carboxyliques du succinate et du
malonate sont équivalentes Ä fixation sur le site actif de l’enzyme
- un seul carbone central ne permet pas son oxydation
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
Il est toutefois possible de lever l’inhibition en augmentant les
concentrations de substrats. C’est une des caractéristiques de
l’inhibition compétitive.
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
L’inhibition non-compétitive
•
Définition : on parle d’inhibiteur non-compétitif lorsque
l’inhibiteur se fixe sur l’enzyme E et sur le complexe enzymesubstrat ES en compétition avec le susbtrat
•
Le complexe EI (enzyme-inhibiteur) et ESI (enzyme-substratinhibiteur) n’ont pas d’activité
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
L’inhibiteur non-compétitif se fixe sur un site totalement différent
du site actif de l’enzyme Ä pas de compétition entre le substrat et
l’inhibiteur.
• Il se produit une diminution de la vitesse maximale sans aucune
modification du Km car il n’y a pas de compétition entre le substrat et
l’inhibiteur pour le site actif
•
V = Vmi [S] / (Km + [S]) avec Vmi = Vmax / (1 + [I]/Ki)
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
Vmi
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Après transformation de Lineweaver-Burk
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Allostérie
• Certaines enzymes ne décrivent pas de relation hyperbolique entre Vi
et [S] mais sigmoïdale
Ä enzymes allostériques
Vi
[S]
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Ne concerne que les protéines composées de plusieurs sous-unités (ou
monomères) organisées de manière symétrique
• Chacune des sous-unités ne fonctionnent pas de manière indépendante
mais ensemble Ä la conformation d’une sous-unité va influencer celle
des autres
• Exemples : l’hémoglobine (pas un enzyme), la phosphorylase
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• L’hémoglobine et la myoglobine
• Myoglobine : transport O2 dans muscle, monomère
• L’hémoglobine : transport O2 et CO2 dans hématies, tétramère
• Il y a 1 molécule d’O2 transportée / myoglobine
• Il y a 4 molécules d’O2 transportées / hémoglobine
•La fixation de l’O2 sur ces 2 proteines est fonction de la pression
partielle en O2
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• La structure tertiaire entre l’hémoglobine et la myoglobine est voisine
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Relation entre saturation myoglobine
et pO2 est une hyperbole
• Relation entre saturation hémoglobine
et pO2 est une sigmoïde
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Comportement de l’hémoglobine
adapté à ses fonctions
• relargage O2 vers les tissus où
faible pO2
• transport d’O2 à partir des
poumons vers les tissus
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Pour les protéines allostériques, la fixation d’un ligand ou d’un
substrat va par coopérativité positive augmenter l’affinité pour la
deuxième molécule, puis la troisième…
• Il existe 2 modèles pour expliquer ce comportement :
- Le modèle concerté de Monod, Wyman et Changeux
- Le modèle séquentiel de Koshland, Nemethy et Filmer
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Le modèle concerté de Monod, Wyman et Changeux
- 2 conformations possibles pour les sous-unités : R (relâché, haute
affinité) et T (tendu, basse affinité)
-La fixation du ligand sur 1 des sous-unités sous forme T [ changement
de toutes les sous-unités sous forme R
ligand
T
R
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Le modèle séquentiel Koshland, Nemethy et Filmer
- En absence de ligand, il existe 1 seule conformation pour tous les
monomères
- La fixation d’un ligand sur 1 monomère induit un changement de
conformation T [ R
- Ce changement de conformation s’étend vers les monomères voisins
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Les effecteurs allostériques peuvent moduler l’équilibre entre ces
formes basse et haute affinité
• Un activateur allostérique se fixe sur la forme R et déplace
l’équilibre vers cette forme
• Un inhibiteur allostérique se fixe sur la forme T et déplace
l’équilibre vers cette forme
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• En présence d’activateur allostérique, toutes les sous-unités sont
sous forme R (haute affinité). Il n’y a plus d’effet de coopérativité et
on obtient un hyperbole
• En présence d’inhibiteur allostérique, toutes les sous-unités sont
sous forme T (basse affinité).
+ activateur
+ inhibiteur
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• Exemple : le 2,3 bi-phosphoglycérate
• C’est un effecteur allostérique négatif de la fixation de l’O2 sur
l’hémoglobine (il æ l’affinité de l’Hb pour l’oxygène)
• Ce composé est présent à l’état normal dans les hématies (à partir
du 1,3-biphosphoglycérate)
En æ l’affinité de l’Hb pour l’oxygène, il permet un relargage dans
les capillaires des tissus
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Propriétés générales des enzymes allostériques
•
•
•
•
Structure quaternaire
Cinétique non-Michalienne
Changement de conformation en fonction liaison par substrat
Régulée par effecteurs allostériques (en général, ce sont premier
enzyme d’une voie métabolique)
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
Exemple : la glycogène phosphorylase
•
La phosphorylase catalyse l’élimination séquentielle de glucose à
partir du glycogène (clivage d’une liaison par l’orthophosphate =
phosphorolyse)
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
•
L’activité de la phosphorylase est contrôlée afin d’éviter que la
dégradation et la synthèse du glycogène soient simultanée (quand
1 enzyme actif, l’autre inactif)
•
Régulation par l’adrénaline via des récepteurs dont l’activation
conduit à l’augmentation des taux d’AMPc intracellulaires
•
L’AMPc active une kinase, la PKA, qui elle-même active la
phosphorylase kinase
•
La phosphorylase existe sous 2 formes : a (phosphorylée et
active) b (non phosphorylée et inactive)
Chapitre 2 : Cinétique enzymatique
• En plus de ces régulations par phosphorylation, la phosphorylase b est
régulée par l’AMP (effecteur allostérique positif), l’ATP et le glucose6P (effecteurs allostériques négatifs)
POINTS A RETENIR…..
• Notions sur les enzymes : catalyse, site actif, spécificité, énergie d’activation,
facteurs de modulation
• Classification en 6 groupes
• Définitions et calculs des vitesses
• Relation de Michaelis-Menten, signification Vmax et Km, leur calcul
• Inhibition compétitive et non-compétitive
• L’allostérie : grands principes