Octobre n°188

Bulletin des BioTechnologies – Octobre 2001
Octobre 2001
n°188
La numérotation des paragraphes est destinée à faciliter l’utilisation des rappels dans et entre numéros de ce bulletin. Elle
permet également de voir où ont été effectuées les omissions d’articles par rapport à la version électronique disponible sur le
Web. Figurent également les délétions dans les commentaires (###) destinées à alléger ce bulletin sous sa forme «papier».
André BERKALOFF
e-mail : [email protected]r
Concepts et Techniques
1 L'annotation systématique des interactions
potentielles entre protéines est un pas de plus
dans la détermination de leurs fonctions.
La difficulté est d'être capable d'éliminer les
interactions non spécifiques tout en ne manquant
aucune de celles qui sont spécifiques. Les
méthodes à mettre en œuvre devraient pouvoir
s'appliquer à toutes les protéines sans trop
d'adaptations. De telles stratégies universelles
n'existent encore pas. Une revue, J Pelletier et al.;
Current Opinion in Biotechnology 12 (AUG01)
340-347### fait le tour des stratégies potentielles
dans ce domaine. La revue se concentre sur les
méthodes utilisant les séquences codantes.
Les bibliothèques de polypeptides basées sur la
séquence codante peuvent être utilisées, soit en les
criblant in vitro face à un ligand donné, soit in
vivo en exprimant les polypeptides en même temps
qu'une protéine donnée, la mesure de l'efficacité
étant un phénotype donné repérable.
Dans les méthodes in vitro, on a également
utilisé l'exhibition à la surface de cellules, mais
l'étape de transformation est limitante. On pourrait
tourner cette difficulté par la traduction in vitro,
encore faudrait-il pouvoir mieux standardiser la
méthode.
La méthode in vivo la plus connue est la
méthode des doubles hybrides, où deux parties
d'une molécule régulatrice ne peuvent se
réassembler (et devenir fonctionnelles) que grâce à
deux protéines capables de se lier sur lesquelles
elles ont été greffées. Ces stratégies supposent une
activation de la transcription d'un gène reporteur.
Or le signal détecté n'est pas, à proprement parler,
une conséquence directe de l'interaction et, de ce
fait, toute perturbation de la transcription va
empêcher la détection.
On peut utiliser une enzyme ou la protéine
fluorescente verte (GFP) sous la forme de deux
fragments protéiques réassociés. Dans ce dernier
cas le tri cellulaire par fluorescence à haut débit
est possible. On a, par ailleurs, développé des
techniques encore plus raffinées, en envoyant dans
la membrane l'une des protéines, tandis que l'autre
est fusionnée avec des protéines comme Sos ou
Ras dont l'activation dépend de leur localisation
membranaire. Cette activation conduit à un
phénotype repérable, comme la croissance
température dépendante (Sos de Stratagene) ou
l'expression d'un gène reporteur comme celui de la
luciférase à la suite du signal transmis par Ras.
Enfin la revue mentionne les techniques de
transfert de fluorescence ou de bioluminescence
qui exige la proximité de deux protéines
(respectivement FRET et BRET, voir le Bulletin
de Juillet §1).
Des ensembles d'interactions ont été identifiés
chez la levure, des bactéries (Helicobacter pylori
par exemple) et chez des virus (vaccine et hépatite
C). Dans ces cas, on a utilisé la technique
matricielle en affrontant un ensemble de protéines
prédéfinies avec un autre. Ceci a été réalisé chez la
levure (P Uetz et al.; Nature 403 (FEB01) 623-
627 et T Ito et al.; Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of
America 97 (01FEB00) 1143-1147, voir le
Bulletin de Mai) et laisse à penser que la technique
est encore trop peu sensible (ou que les
interactions sont plus complexes que prévues)
dans la mesure où seulement 15% des interactions
connues ont pu être détectées.

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On a commencé, par ailleurs, à s'intéresser à
des interactions multiples au sein de complexes.
C'est le cas pour l'analyse des interactions de 27
protéines de Caenorhabditis elegans impliquées
dans le développement vulvaire (AJ Walhout et
al.; Science 287 (07JAN00) 116-122). Ils ont
retrouvé 50% des interactions connues, ce qui
signifie que les faux négatifs étaient relativement
moins nombreux que dans le cas précédent.
La revue discute également des principes
d'association de protéines : ceux qui impliquent
des domaines disjoints le long de la molécule, et
ceux qui impliquent des séquences continues.
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2 Diverses techniques se développent pour
accélérer l'obtention de la conformation et de la
structure tridimensionnelle des protéines. Ceci
permet une approche rationnelle des modifications
souhaitées. Une revue porte sur l'obtention de
telles structures 3D et 4D (déformation dans le
temps) à haut-débit (relatif) par des méthodes
informatiques. Dans beaucoup de cas, les
informations ainsi obtenues peuvent être aussi
bonnes que celles qui sont obtenues à partir de la
structure cristalline, et à bien meilleur marché. ET
Maggio et al.; Trends in Biotechnology 19
(JUL01) 266-272. Les auteurs sont des chercheurs
de la firme Structural Bioinformatics de San Diego
qui gère la banque de données ProMax™ de cibles
pharmaceutiques.
C'est une des raisons de l'émergence de
plusieurs programmes dans le monde de
protéomique. C'est le cas de la Protein Structure
Initiative de 125 millions de dollars des National
Institutes of Health lancée en 2000 et destinée à
produire 10 000 structures disponibles sur
Internet. C'est également le cas du Protein Folds
Project du RIKEN à Yokohama qui va mettre en
œuvre 16 spectromètres RMN pour déterminer la
structure de plus petits peptides avec une très
haute résolution. .
Ces projets reposent sur une accélération de
l'obtention des données par des méthodes
physiques classiques comme la diffraction X.
Mais les préparations préliminaires à
l'utilisation de ces techniques sont ardues et
seulement une protéine sur vingt s'y prête. Le coût
élevé et la lenteur de l'obtention des résultats est
certainement un handicap pour des initiatives
privées dans le domaine, et pourtant elles existent.
Le modelage par analogie (homology
modeling) est une étape dans la généralisation. Il
exige qu'au moins une structure cristalline soit
établie pour chaque classe de structure protéique.
On peut estimer que de telles extrapolations
augmentent de 100 fois le nombre de structures
raisonnablement déduites. Les déductions de
structures par les méthodes informatiques posent
quand même des questions de fiabilité et de
domaines d'utilisation.
L'"homology modeling" et les techniques de
"threading" sont basées sur des connaissances
préalables, le threading étant une technique qui
va un peu au-delà du simple alignement de
séquences pour rechercher des conformations
similaires sans faire nécessairement intervenir les
homologies de séquence. Cette dernière technique
est à haut débit, mais faible résolution. La
première est bien adaptée à la détermination de la
structure du cœur de la protéine étudiée, mais peu
à celle des structures périphériques moins
contraintes. Elle est cependant en cours
d'évolution rapide vers une très bonne résolution.
Ces améliorations portent surtout sur une
meilleure détermination des structures de surface.
Les techniques de "threading" restent utilisées
quand on ne dispose pas d'assez d'informations
structurales pour pratiquer le modelage par
analogie. Elles donnent usuellement plusieurs
configurations possibles, de sorte qu'on ne sait pas
quelle est la bonne. De plus, la structure déduite
diffère la plupart du temps de plusieurs Å par
rapport à celle vérifiée par cristallographie qui,
elle même, a une imprécision de l'ordre de 1,5Å
actuellement. Les résultats sont donc inutilisables,
dans la plupart des cas, pour des raisons de
résolution. Ils sont, par contre, utilisables pour
prédire des fonctions.
L'objectif actuel est d'obtenir une image 4D.
L'accès à des super ordinateurs ouvre, dans ce
domaine des horizons nouveaux. Une nouvelle
technique dérivant des techniques spatiales
(Multi-Body OrderN Dynamics [MBOND] permet
de simuler avec une résolution dans le temps dix
fois meilleure que les techniques informatiques
plus anciennes, des oscillations lentes ( >0.5-1
nanoseconde) de structures comme des
mouvements inter-domaines. Le terme de "body"
fait référence à des éléments de structure de la
protéine comme les acides aminés ou des boucles
et hélices diverses pour intégrer les mouvements
de l'ensemble.
Les homologies de séquences ont leur
importance, car quand elle baisse entre la protéine
dont on veut déterminer la structure et le modèle
de référence (structure déterminée sur cristal), la
résolution baisse en conséquence. Au-dessous d'un
seuil d'environ 20% d'identité de séquence, on
peut encore établir la disposition des structures
secondaires, mais la résolution est de ~5-10 Å,
c'est-à-dire qu'on rejoint la résolution des
méthodes de threading, et elle peut être suffisante
pour établir, par exemple, la disposition 3D des
acides aminés de sites actifs d'enzymes. .
La revue analyse ensuite l'application de ces
techniques à des exemples "pharmaceutiques".
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3 Un commentaire très clair (H Wang et al.;
Nature Biotechnology 19 (JUL01) 622-623)
analyse un nouveau type de techniques permettant
de comparer des séquences nucléotidiques simple-
ou doubles brins en les faisant passer dans des
nanopores.
Le principe est que, dans une solution
électrolyte, la conductance des pores dans une
membrane isolante sera modifiée par l'obstruction
par une molécule, et ceci ne nécessite aucune
amplification. Il suffit de pouvoir sélectionner à
l'entrée du pore le polynucléotide à analyser. Deux
équipes ont utilisé cette technique de façons
différentes, l'une de Texas A & M l'autre de
University of California à Santa Cruz.
Le pore utilisé dans les deux cas est basé sur
l'α-hémolysine, une toxine de Staphylococcus
aureus.
S Howorka et al.; Nature Biotechnology 19
(JUL01) 636-639 utilisent un oligonucléotide
complémentaire fixé à l'entrée du canal pour
capter les acides nucléiques intéressants. Selon
qu'ils s'hybrident bien, mal ou pas du tout,
l'intensité du courant sous une différence de
potentiel donnée va varier. Les mesures à effectuer
sont scabreuses, car la modification du potentiel
dure quelques dizaines de millisecondes et le
courant induit est de l'ordre du picoampère!!!. Une
différence d'un seul nucléotide est, cependant,
perceptible.
On peut fixer, au contraire, un oligonucléotide
à séquencer et faire défiler des oligos de séquence
connue et ainsi déterminer la séquence.
W Vercoutere et al.; Nature Biotechnology 19
(MAR01) 248-252 ont analysé des épingles ADN
(donc avec un appariement localisé entre des
éléments d'un seul brin). La formation des boucles
empêche le transit de la molécule et la tige reste
coincée dans le nanopore. On peut purger le
nanopore en inversant la différence de potentiel.
Et recommencer l'opération ce qui accélère
considérablement la cadence d'analyse.
Les auteurs ont ainsi mesuré la longueur de la
zone appariée des boucles et la localisation de
misappariements. Il suffit d'"entraîner" la machine.
Dans ces conditions, il devrait être possible de
séquencer une molécule linéaire en la faisant
transiter lentement à travers le pore, et en suivant
les "signatures" électriques du passage de chaque
nucléotide ou paire de nucléotides.
On peut également jouer sur la configuration
du nanopore (voir L Movileanu et al.; Journal of
General Physiology 117 (MAR01) 239-252 de la
même équipe de Texas A & M qui se contente de
pores pour polyéthylène-glycols mais envisage
clairement d'autres molécules).Ils greffent des
molécules dans le canal pour créer des
constrictions et peuvent ainsi moduler le
mouvement, pour l'instant de protéines, avec un
polyéthylène glycol de 3,4 kDa.
Les limites actuelles de la technique résident
dans la fabrication de nanopores stables. On ne
sait pas encore en fabriquer de ce diamètre dans
des matériaux à l'état solide, ce qui serait l'idéal. Il
faudrait ensuite parfaitement maîtriser la vitesse de
passage des polynucléotides dans le pore. L
Movileanu et al.; Nature Biotechnology 18
(OCT00) 1091-1095.
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4 L'embryon du poisson zèbre présente
l'intérêt d'être transparent, et l'on peut accéder
optiquement à tous les organes. On vient de mettre
au point une technique de modulation de
l'expression d'acides nucléiques par photolyse..
H Ando et al.; Nature Genetics 28 (AUG01)
317-325.###
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6 On sait plus ou moins bien procéder à une
ablation d'un type cellulaire ou d'un tissu pour en
étudier les conséquences. On vient d'utiliser la
toxine diphtérique en exprimant son récepteur
dans les cellules cibles de souris. M Saito et al.;
Nature Biotechnology 19 (AUG01) 746-750.###).
Voir également le commentaire de R Palmiter; p.
731-732.
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7 Un problème encore mal résolu est celui de
l'organisation fonctionnelle des cellules en
déplacement. C'est le cas des lymphocytes T qui,
de cellules rondes, vont se transformer en cellules
allongées avec un pôle antérieur et un postérieur
(uropode) et une extension de la partie avant
associée à une rétraction de l'uropode. Les
récepteurs dirigeant le déplacement sont
effectivement disposés et redistribués de façon
différentielle sur la membrane plasmique grâce
aux fameux radeaux lipidiques. C Gómez-
Moutón et al.; Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of
America 98 (14AUG01) 9642-9647.
La déplétion du cholestérol qui est, avec la
sphingomyéline, un des constituants majeurs des
radeaux désorganise le déplacement cellulaire. Le
ganglioside GM3 est concentré à l'avant alors que
c'est à l'arrière que se concentre le GM1.
Cet article démontre donc qu'il n'y a pas qu'une
sorte de radeaux lipidiques à la surface des
cellules. Les images montrent que ces radeaux ne
sont pas isolés à la surface de la cellule mais
peuvent se regrouper en ce que LM Pierini et al.;
p. 9471-9473, appellent des flottilles que l'on peut
détecter au microscope optique alors que les
radeaux individuels (100 à 300nm) ne peuvent pas
l'être.
La ségrégation des radeaux des deux pôles fait
intervenir le cytosquelette d'actine. Le récepteur
transmembranaire CD44, localisé dans l'uropode,
pourrait jouer le rôle d'ancrage des radeaux sur le
cytosquelette. .###
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8 La Drosophile a la particularité d'entretenir
ses télomères avec des rétrotransposons
spécifiques, HeT-A et TART. Juste avant les
répétitions de rétrotransposons, on trouve
plusieurs kb de régions satellites particulières,
appelées TAS (Telomere-Associated Sequences)
qui jouent un rôle dans la répression de
l'expression (silencing) des gènes qui y sont
insérés.
La régulation du "silencing" au niveau des
télomères [telomeric position effect (TPE)] est
différente de celle au niveau du centromère
[position effect variegation (PEV)] du fait qu'à
part quelques allèles du groupe Polycomb, le TPE
ne répond pas aux modificateurs de PEV ou aux
"silencers" développementaux. Il doit donc exister
deux types de régulations.
En plaçant des éléments P marqués dans les
satellites subtélomériques de la Drosophile on peut
constater une expression mosaïque d'un gène
reporteur. L'addition d'éléments HeT-A ou TART
accroît son expression, et inversement. Ces
éléments ont donc un effet stimulateur. Cela fait
probablement partie d'un processus de régulation
de la transposition de ces éléments. MD
Golubovsky et al.; Genetics 158 (JUL01) 1111-
1123.
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10 On connaît plusieurs cas de groupements
d'organismes qui subissent une évolution
divergente très rapide de leur morphologie et de
leur écologie, alors que leur génome n'est
apparemment pas modifié à la même cadence.
C'est le cas des poissons Cichlides des grands lacs
africains. Cette évolution rapide est appelée
radiation adaptative, car elle correspond à une
occupation de niches différentes. Cette
diversification est, en général, si rapide que les
fossiles indiquent une apparition quasi-simultanée
des différentes branches. Il en existe des exemples
dans le domaine végétal avec, notamment, les
composées. C'est le cas des "silverswords"
hawaïennes (des Asteracées regroupant
Argyroxiphium, Dubautia et Wilkesia) comprenant
aussi bien de petites plantes en rosette, que des
buissons, des lianes ou des arbres.
L'analyse des gènes régulateurs de floraison
homologues d'APETALA3 (ASAP3/TM6) et
APETALA1 (ASAP1) ainsi que du gène de
structure CHLOROPHYLL A/B BINDING
PROTEIN9 de l'appareil photosynthétique
d'Arabidopsis, ainsi que la comparaison avec des
plantes voisines du continent américain semble
confirmer que cette diversité est plus
vraisemblablement liée à des modifications de
gènes de régulation que de gènes de structure. M
Barrier et al.; Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of
America 98 (28AUG01) 10208-10213.
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Les Productions Végétales
L'expression génique
12 Des chercheurs de Leiden ont monté un
système d'expression génique dans le riz
inductible par les glucocorticoïdes.
PB Ouwerkerk et al.; Planta 213 (JUL01) 370-
378. En fait il s'agît d'un développement du
système mis au point en 1997 par le groupe de
Nam Chua. Il est inductible par la
dexaméthazone 10 µM, et même à 1µM.
Il comporte le domaine liant l'ADN de Gal4 de
levure, le domaine activateur de VP16 du virus de
l'herpès simplex et le domaine reconnaissant le
ligand du récepteur des corticoïdes. Le tout est
incorporé dans un système de vecteur binaire.
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13 Des chercheurs de l'ETH de Zürich ont
construit un nouveau système de commande de
gènes dans les plantes, inductible par la
pristinamycine (une streptogramine). Le système
répresseur ainsi monté fait intervenir l'activateur
transcriptionnel. AD Frey et al.; Biotechnology &
Bioengineering 74 (20JUL01) 154-163.####
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14 Le Scripps Research Institute a breveté un
système de régulation de la traduction chez les
plantes basé sur la protéine RB47. Cette protéine
était connue, mais son gène n'avait pas été cloné et
donc séquencé. Le brevet couvre sa séquence,
celle du site reconnu dans la partie non traduite du
messager du gène chloroplastique pbsA de
Chlamydomonas, ainsi que celle d'une disulfure-
isomérase régulatrice, RB60. US Patent 6 294 653
(25SEP01).
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15 La "signal recognition particle" (SRP) est
un système universel de ciblage vers la membrane
et l'exportation de protéines basé sur une
nucléoprotéine. Dans son incarnation la plus
primitive (c.a.d chez les procaryotes), elle contient
une seule protéine appelée Ffh et un ARN (4,5S
chez Escherichia coli). Tous les autres types
cellulaires possèdent un tel système où plusieurs
protéines et un ARN de plus grande taille peuvent
intervenir, mais on ne sait toujours pas bien à
quoi sert l'ARN (voir par exemple RT Batey et al.,
Science 287 (18FEB00) 1232). C'est un système
co-traductionnel, la SRP se lie à au peptide signal
et arrête la traduction, le temps de rejoindre son
récepteur membranaire, puis la traduction reprend.
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La SRP du chloroplaste est une originale qui, non
seulement ne possède pas d'ARN, mais encore
intervient dans un ciblage co- et post-
traductionnel de la protéine à exporter.
Les deux composant de la SRP chloroplastique
d'Arabidopsis thaliana viennent d'être caractérisés
dans la forme impliquée dans le transport post-
traductionnel. Elle comprend la protéine cpSRP54
et la protéine spécifique du chloroplaste cpSRP43.
La partie C terminale de cpSRP54 est
nécessaire à la formation de l'hétérodimère et
cpSPR43 interagit avec des régions distinctes du
domaine M de cpSRP54. Ce domaine M contient,
au moins chez les autres SRPs, une grande poche
hydrophobe qui doit reconnaître le peptide signal,
flanquée par une boucle souple et la fente est
tapissée par de nombreuses méthionines (d'où son
nom). MR Groves et al.; Journal of Biological
Chemistry 276 (27JUL01) 27778-27786.
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La Reproduction
16 Le guidage du tube pollinique vers l'ovule, où il va assurer la double fécondation classique, a
probablement lieu en plusieurs étapes, dont la dernière est gouvernée par l'ovule lui-même. On vient de
montrer par ablation laser que les deux synergides, les cellules qui flanquent la cellule gamétique femelle
sont responsables de cette dernière phase. T Higashiyama et al.; Science 293 (24AUG01) 1480-1483.
L'attraction cesse après la fécondation bien qu'une des synergides persiste. Ceci évite probablement la
polyspermie. Voir également le commentaire de AY Cheung et al.; p.1441-1442.
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Le Développement
17 On trouvera dans OA Olsen; Annual
Reviews of Plant Physiology & Plant Molecular
Biology 52 (2001) 233–267, une revue sur le
développement de l'albumen. Celui-ci dérive de
la cellule centrale binucléée du gamétophyte
femelle. La cellule centrale subit également une
fécondation qui va donner des noyaux triploïdes,
d'abord noyés dans un cytoplasme commun
(cœnocyte) qui va ensuite se cellulariser. On verra
alors se former quatre types cellulaires : l'albumen
amylacé, l'aleurone riche en protéines de réserves
et enzymes, les cellules de transfert à vocation
vasculaire et les cellules au contact de l'embryon.
La revue porte, après un court survol du
processus de cellularisation, sur les aspects
cellulaires du cœnocyte avec les mitoses et la
suppression de la formation du phragmoplaste (la
future cloison intercellulaire), la migration des
noyaux et l'arrêt des mitose à la fin su stade
cœnocytique. ###
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18 Une revue, J Giovannoni; Annual Reviews
of Plant Physiology & Plant Molecular Biology 52
(2001) 725–749, fait le point sur les connaissances
actuelles dans le domaine de la maturation des
fruits.
Je rappelle que ce que l'on appelle fruits en tant
que consommateurs peut correspondre à un vrai
fruit, comme un pomme ou une cerise, ou au
réceptacle floral, comme dans la fraise ou
l'inflorescence comme celle de l'ananas.
Elle commence par une brève définition des
fruits climactériques, qui mûrissent sous l'action
de l'éthylène comme la tomate, et les non
climactériques qui n'en ont pas besoin, comme la
fraise.
Elle développe les mécanismes de maturation
communs à tous les fruits et souligne l'importance
de cette maturation pour les usages des fruits, avec
un détour sur l'intérêt dela parthénocarpie, c'est à
dire le développement de fruits sans graines, soit
naturellement à la suite d'anomalies génétiques
comme la triploïdie de la banane ou de déficiences
développementales sélectionnées comme dans les
fruits "seedless" appréciés des porteurs de
dentiers.
L'analyse de quelques modèles, comme la
tomate et Arabidopsis, et dans une moindre
mesure la fraise a été réalisée. On trouvera, en
particulier un tableau des mutants de maturation
de tomate connus, avec les fonctions affectées (en
réalité pas beaucoup de choses connues).
Arabidopsis, avec le développement de la silique
est actuellement le modèle probablement le plus
intéressant pour arriver à une définition
moléculaire des intervenants et plusieurs gènes à
MADSbox ont ainsi été identifiés (Agamous-like
comme FRUITFUL (AGL8). Deux gènes de
déhiscence de la silique à fonctions redondantes,
(AGL1 et AGL5 appelés maintenant
SHATTERPROOF1 et SHATTERPROOF2 ou
SHP1 et -2), sont régulés négativement par ce
gène FRUITFUL.
Les travaux sur la tomate (climactérique) ont
beaucoup porté sur le ramollissement des tissus
accompagnant la maturation, car c'est une source
de pertes (en facilitant le travail des champignons
et bactéries dégradant le fruit) et de
raccourcissement de la durée de présentation à
l'étalage. On a travaillé sur la production de
l'éthylène sur sa perception et sur les
conséquences sur l'activité des enzymes
hydrolysant les parois dans les tissus du fruit pour
permettre de libérer les graines.
La transduction du signal éthylène fait
encore intervenir Arabidopsis, car on peut
facilement revenir à la tomate.
Les résultats des observations sur tomate et
Arabidopsis sont résumés dans des schémas
simples qui souligne, en fait, qu'il doit exister
d'autres effets hormonaux que la simple action de
l'éthylène.
Un dernier point traité est le rôle de la lumière
dans la production des caroténoïdes (ß-carotène et
lycopène).
La régulation des voies impliquées dans la
maturation a donc été abordée, mais on a
également utilisé la tomate pour comprendre la
maturation de fruits comme la pomme chez qui
les délais expérimentaux sont prohibitifs.
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