ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
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ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE, SANTE, AGRONOMIE, ENVIRONNEMENT Laboratoire d'accueil: Unité Microbiologie, UR454, INRA Clermont-Ferrand-Theix. Directeur du laboratoire : Régine Talon. Directeur de thèse : Alain P. Gobert. Date d'obtention de l'HDR du Directeur de thèse : 11 Juin 2004 Titre de la thèse : Etude de l’induction et du rôle de la réponse immune mucosale intestinale lors de l’infection par les Escherichia coli entérohémorragiques : Implication de la balance iNOS/HO-1. Exposé du sujet proposé: Les Escherichia coli producteurs de Shiga-toxine (STEC) sont des bactéries commensales du tube digestif des animaux d’élevages qui peuvent se révéler pathogènes pour l’Homme. Après consommation d’aliments souillés (viande, lait, …), les STEC colonisent l’intestin et produisent une toxine particulière, la Shiga-toxine (Stx), qui induit des colites hémorragiques et franchit la barrière épithéliale intestinale afin d’être transportée jusqu’aux reins par le sang. La Stx provoque alors la mort des cellules endothéliales, la thrombose des capillaires des glomérules, induisant une insuffisance rénale aiguë pouvant évoluer vers une insuffisance chronique et une issue fatale, principalement chez les enfants. Ce symptôme est appelé syndrome hémolytique et urémique (SHU), la principale cause d’insuffisance rénale chez les enfants à travers le monde. Les souches de STEC provoquant les symptômes hémorragiques sont appelées E. coli entérohémorragiques (EHEC). Aucune thérapie n’existe à ce jour pour lutter contre l’infection ; les antibiotiques sont contre-indiqués car ils induisent la production de Stx. Seuls des traitements symptomatologiques sont administrés aux patients souffrant de SHU. Les cellules de la barrière épithéliale intestinale sont les premières au contact des EHEC lors de l’infection. En réponse aux produits bactériens, ces cellules développent une réponse immunitaire innée qui se caractérise notamment par la synthèse de molécules effectrices aux nombreuses propriétés biologiques. Ces dernières permettent le recrutement et l’activation d’autres cellules du système immunitaire et la destruction des pathogènes, mais peuvent également favoriser l’inflammation et la multiplication des bactéries. Des études in vitro ont montré que les EHEC induisent une réponse innée dans les cellules humaines épithéliales intestinales (Gobert et al. 2008). D’autres travaux ont établi que les EHEC peuvent inhiber la réponse inflammatoire de ces cellules (Vareille et al. 2008). Nous avons récemment décrit des interactions particulières entre les EHEC et le monoxyde d’azote (NO), un médiateur pro-inflammatoire et antimicrobien de la réponse immune innée : NO inhibe la production de Stx par les EHEC (Vareille et al. 2007); en retour, les bactéries diminuent l’expression de la NO synthase inductible (iNOS), et donc la production de NO, en induisant l’expression du gène hmox-1 codant pour l’hème oxygénase-1 (HO-1), un effecteur anti-inflammatoire (Vareille et al. 2008). De plus, nous avons montré dans un modèle d’infection de rats axéniques que les EHEC O157:H7 induisent l’expression de HO-1 dans la muqueuse colique. Dans ce contexte, l’étudiant en thèse devra répondre aux questions suivantes : Quel type de réponse immune est induite lors de l’infection par les EHEC ? La modulation de la balance iNOS/HO-1 dans la muqueuse intestinale peut-elle déterminer la physiopathologie de l’infection par les EHEC et le développement des dommages rénaux ? Le programme de travail sera décomposé comme suit : Tâche 1: Induction de la réponse immune mucosale intestinale par les EHEC Il s’agira pour l’étudiant de vérifier et de compléter les résultats que nous avons obtenus chez les rats axéniques en utilisant le modèle murin. Des souris sauvages préalablement traitées par la streptomycine seront infectées par des souches résistantes à la streptomycine d’EHEC O157:H7, O104:H4, ou une souche d’E. coli commensale humaine. Nous suivrons les différents paramètres cliniques et biochimiques des animaux et nous étudierons les dommages histologiques rénaux et intestinaux et la réponse immune locale (induction des cytokines/chimiokines et iNOS/HO-1 ; immunophénotypage). Les dommages histologiques rénaux et intestinaux ainsi que le passage de la Stx à travers la muqueuse intestinale seront analysés sur coupes histologiques du côlon. La colonisation bactérienne et l’expression des gènes de virulence des EHEC seront par ailleurs analysées. Enfin, l’infection des animaux par des souches bactériennes déficientes pour les principaux facteurs de virulence nous permettra d’identifier les effecteurs des EHEC impliqués dans l’induction de la réponse immune mucosale intestinale. Tâche 2: Effet in vivo du NO dans la pathophysiologie de l’infection Nous utiliserons des souris C57BL/6 traitées ou non par l’IFN-γ pour induire l’expression de la iNOS avant infection ; les souris déficientes pour la iNOS seront également utilisées. Le suivi des animaux et les analyses des tissus seront réalisés comme décrit dans la Tâche 1. L’effet du NO in vivo sur la colonisation bactérienne et l’expression des gènes de virulence des EHEC sera largement analysé. Tâche 3: Effet in vivo de HO-1 dans la pathophysiologie de l’infection Les souris déficientes pour le gène hmox-1 présentent de sévères inflammations chroniques et ne survivent que FLquelques mois et ne seront donc pas utilisées. Nous tenterons de générer et d’utiliser une lignée de souris HO-1 CRE-Vilin/FL-CRE-Vilin déficientes pour le gène hmox-1 uniquement dans l’intestin. Nous traiterons les animaux avec un inhibiteur de HO-1 ou avec des siRNA dirigés contre hmox-1. Le suivi des animaux et les analyses des tissus seront réalisés comme décrit ci-dessus. L’utilisation de modèles animaux nous permettra d’analyser le type de réponse immune induite par les EHEC in vivo (innée, Th1, Th2, Treg, Th17) et d’étudier l’implication de l’immunité mucosale intestinale dans le développement du SHU. Gobert, A. P. et al. (2008) Modulation of chemokine gene expression by Shiga-toxin producing Escherichia coli belonging to various origins and serotypes. Microbes Infect 10(2): 159-165. Vareille, M. et al. (2007) Nitric oxide inhibits Shiga-toxin synthesis by enterohemorrhagic Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 104(24): 10199-10204. Vareille, M. et al. (2008) Heme oxygenase-1 is a critical regulator of nitric oxide production in enterohemorrhagic Escherichia coli-infected human enterocytes. J Immunol 180(8): 5720-5726. Liste des 8 meilleures publications du Directeur de thèse de 2007 à 2011 1. Gobert AP, Asim M, Piazuelo MB, Verriere T, Scull BP, de Sablet T, Glumac A, Lewis ND, Correa P, Peek RM Jr, Chaturvedi R and Wilson KT. Disruption of nitric oxide signaling by Helicobacter pylori results in enhanced inflammation by inhibition of heme oxygenase-1. J. Immunol. 2011, 187 (10): 5370-5379. (IF : 6.000) 2. Chaturvedi R, Asim M, Romero-Gallo J, Barry DP, Hoge S, de Sablet T, Delgado AG, Wroblewski LE, Piazuelo MB, Yan F, Israel DI, Casero RA Jr, Correa P, Gobert AP, Polk DB, Peek RM Jr and Wilson KT. Spermine oxidase mediates the gastric cancer risk associated with Helicobacter pylori cagA. Gastroenterology 2011, 141(5): 1696-1708. (IF : 12.899) 3. Chaturvedi R, Asim M, Hoge S, Lewis ND, Singh K, Barry DP, de Sablet T, Piazuelo MB, Sarvaria AR, Cheng Y, Closs EI, Casero RA Jr, Gobert AP and Wilson KT. Polyamines impair immunity to Helicobacter pylori by inhibiting L-arginine uptake required for nitric oxide production. Gastroenterology 2010, 139 (5): 1686-1698. (IF : 12.899) 4. De Sablet T, Chassard C, Bernalier-Donadille A, Vareille M, Gobert AP and Martin C. Human microbiotasecreted factors inhibit Shiga-toxin synthesis by enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Infect. Immun. 2009, 77 (2): 783-790. (IF : 4.205) 5. Vareille M, Rannou F, Thélier N, Glasser AL, de Sablet T, Martin C and Gobert AP. Heme oxygenase-1 is a critical regulator of NO production in enterohemorrhagic Escherichia coli-infected human enterocytes. J. Immunol. 2008, 180 (8): 5720-5726. (IF : 6.000) 6. Gobert AP, Coste A, Guzman CA, Vareille M, Hindré T, de Sablet T, Girardeau JP and Martin C. Modulation of chemokine gene expression by Shiga-toxin producing Escherichia coli belonging to various origin and serotypes. Microbes Infect. 2008, 10 (2): 159-165. (IF : 2.757) 7. Gobert AP, Vareille M, Glasser AL, Hindré T, de Sablet T and Martin C. Shiga-toxin produced by enterohemorrhagic Escherichia coli inhibits PI3K/NF-κB signaling pathway in globotriaosylceramide-3-negative human intestinal epithelial cells. J. Immunol. 2007, 178 (12): 8168-8174. (IF : 6.000) 8. Vareille M, de Sablet T, Hindré T, Martin C and Gobert AP. Nitric oxide inhibits Shiga-toxin synthesis by enterohemorrhagic Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104 (24): 10199-10204. (IF : 9.980) Liste des thèses dirigées par le Directeur de thèse de 2007 à 2011 Marjolaine VAREILLE, Thèse de Science de la Vie et de la Santé, soutenue le 05/12/2008, Université d’Auvergne. Co-financement INRA-Région Auvergne. La réponse immunitaire mucosale intestinale lors de l’infection par les Escherichia coli entérohémorragiques : Rôle et régulation de la synthèse de monoxyde d’azote Liste des publications issues de la thèse des étudiants mentionnés ci-dessus 1. De Sablet T, Chassard C, Bernalier-Donadille A, Vareille M, Gobert AP and Martin C. Human microbiotasecreted factors inhibit Shiga-toxin synthesis by enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Infect. Immun. 2009, 77 (2): 783-790. (IF : 4.205) 2. Vareille M, Rannou F, Thélier N, Glasser AL, de Sablet T, Martin C and Gobert AP. Heme oxygenase-1 is a critical regulator of NO production in enterohemorrhagic Escherichia coli-infected human enterocytes. J. Immunol. 2008, 180 (8): 5720-5726. (IF : 5.646) 3. Gobert AP, Coste A, Guzman CA, Vareille M, Hindré T, de Sablet T, Girardeau JP and Martin C. Modulation of chemokine gene expression by Shiga-toxin producing Escherichia coli belonging to various origin and serotypes. Microbes Infect. 2008, 10 (2): 159-165. (IF : 2.757) 4. De Sablet T, Bertin Y, Vareille M, Garrivier A, Girardeau JP, Gobert AP and Martin C. Differential expression of stx2 alleles in Shiga toxin-producing Escherichia coli belonging to seropathotypes A and C. Microbiol. 2008, 154 (1): 176-186. (IF : 3.025) 5. Gobert AP, Vareille M, Glasser AL, Hindré T, de Sablet T and Martin C. Shiga-toxin produced by enterohemorrhagic Escherichia coli inhibits PI3K/NF-κB signaling pathway in globotriaosylceramide-3-negative human intestinal epithelial cells. J. Immunol. 2007, 178 (12): 8168-8174. (IF : 5.646) 6. Vareille M, de Sablet T, Hindré T, Martin C and Gobert AP. Nitric oxide inhibits Shiga-toxin synthesis by enterohemorrhagic Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104 (24): 10199-10204. (IF : 9.432) Devenir des anciens étudiants mentionnés ci-dessus Marjolaine Vareille: Maitre de Conférence, Université d’Auvergne. Contrats obtenus pendant la période 2007-2011 - PHC Sakura, 2010-2011, 2 ans « Analysis of commensal-pathogen interaction in the human gut. 12 000 €. Equipe coordinatrice. Porte sur le thème du sujet de thèse proposé. - FUI (fond unique interministériel) BLASTEC. 2011-2013, 3 ans. 236 900 €. Equipe participante. ème PCRDT. ProSafeBeef. 2007-2012, 5 ans. 75 426 €. Equipe participante. - Projet européen, 6 Fiche SIREDO UR454 Laboratoire de Microbiologie, INRA, centre de Clermont-Ferrand-Theix Directeur de thèse : Alain P. Gobert (CR1) : [email protected] Etude de l’induction et du rôle de la réponse immune mucosale intestinale lors de l’infection par les Escherichia coli entérohémorragiques : Implication de la balance iNOS/HO-1. Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont des pathogènes émergents responsables de toxi-infections alimentaires pouvant évoluer vers des complications plus sévères dont le syndrome hémolytique et urémique (SHU). Aucune thérapie efficace n’existe à ce jour. Comprendre les mécanismes de régulation de la réponse inflammatoire intestinale lors de l’infection par les EHEC est une étape clé pour envisager de nouvelles stratégies préventives et/ou thérapeutiques. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser des modèles animaux d’infection par les EHEC pour déterminer le type de réponse immune mucosale intestinale induite lors de l’infection. Nous étudierons également l’implication de deux médiateurs antagonistes de la réponse immune innée, la NO synthase inductible (iNOS) et l’hème oxygénase-1 (HO-1), dans la pathophysiologie de l’infection par les EHEC ; nous utiliserons des souris KO pour la iNOS et floxées au niveau intestinal pour HO-1. L’effet de ces enzymes sur la colonisation et la virulence des EHEC, la réponse immune mucosale intestinale innée et cellulaire, les dommages histologiques intestinaux et rénaux et le développement du SHU sera plus particulièrement analysé.
