Thèse de Doctorat Unique (PhD) Présentée par
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UNIVERSITE OUAGA I Pr Joseph KI-ZERBO --------------École Doctorale Sciences et Technologies --------------Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE) N° d‟ordre …….. Thèse de Doctorat Unique (PhD) Présentée par Théodora Mahoukèdè ZOHONCON Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO Option: Sciences Appliquées Spécialité: Biologie moléculaire / Virologie Epidémiologie moléculaire des Papillomavirus Humains à haut risque à Parakou (République du Bénin) et à Ouagadougou (Burkina Faso) : caractérisation par PCR en temps réel et distribution génotypique Soutenue le 23 janvier 2016 devant le jury composé de : Président : Simon A. AKPONA, Professeur Titulaire, Université de Parakou (Rapporteur) Membres : Olga Mélanie LOMPO/GOUMBRI, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KIZERBO Nicolas BARRO, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO Charlemagne OUEDRAOGO, Maître de conférences, Agrégé, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO (Rapporteur) Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO (Directeur de Thèse) DEDICACES A mes parents François Comlan et Brigitte ZOHONCON, A ma sœur et à mes frères Reine Bérénice, Jean René et Emmanuel Mahoutin, A mon tuteur Georges Zimé SACCA, Et à Christian Talsida KONE, sources d’amour, de soutien, d’encouragements et de confiance. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page ii REMERCIEMENTS A mon Directeur de Thèse, le Professeur Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique à l‟Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO anciennement appelée « Université de Ouagadougou », Directeur du Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE) labelisé Centre d‟Excellence UEMOA, Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) érigé en Laboratoire National de Référence pour le HPV (LNR-HPV), Recteur de l‟Université Saint Thomas d‟Aquin (USTA), Officier de l‟Ordre National, Officier des Palmes Académiques, Chevalier international des Palmes Académiques du CAMES, Membre de l‟Académie pontificale pour la vie, Membre de l‟Académie Africaine des sciences, des arts et des lettres du Burkina Faso, Membre de l‟Académie Africaine des Sciences ; Membre du Comité d‟éthique et de déontologie du CAMES, Consulteur du Conseil pontifical des opérateurs sanitaires du Vatican, je réitère ma profonde gratitude et mon infinie reconnaissance pour l‟encadrement, le soutien financier, les précieux conseils, les encouragements et pour la très grande disponibilité qui m‟ont permis d‟avancer sereinement et de cultiver l‟excellence sur les sentiers de la recherche. Au Professeur Nicolas BARRO, Professeur Titulaire en Biochimie-Microbiologie/Virologie à l‟Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO; Vice-Président de l‟Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO. Responsable du Laboratoire de Biologie moléculaire, d‟épidémiologie et de surveillance des bactéries et virus transmissible par les aliments (LaBESTA). C‟est un insigne honneur que vous nous faites en acceptant d‟évaluer ce travail. Soyez rassurés que vos critiques nous édifierons et contribueront à coup sûr à l‟amélioration de notre travail. Hommages respectueux ! Au Professeur Simon A. APKONA, Professeur titulaire de Biochimie, Recteur honoraire de l‟Université de Parakou (UP), Doyen honoraire de la Faculté de Médecine de Parakou, Chef de l‟Unité d‟Enseignement et de Recherche de Biochimie et de Biologie Moléculaire de l‟Université de Parakou, Chef service du laboratoire d‟analyse biomédicale du Centre Hospitalier Universitaire et Département du Borgou/Alibori (CHUD-B/A), pour la grande confiance et la haute estime placée en ma Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page iii modeste personne. Sans vous, la merveilleuse aventure au Burkina Faso n‟aurait jamais été possible. Au Professeur Prosper GANDAHO, Professeur Titulaire de Psychiatrie, Recteur de l‟Université de Parakou, Vice-Doyen honoraire de la Faculté de Médecine de Parakou, Doyen de la Faculté de Médecine de l‟UP, Vice-Recteur honoraire de l‟Université de Parakou, Chef du Département de Médecine et Spécialités Médicales, Chef du Service de Psychiatrie du CHUD-B/A, pour avoir guidé mes pas à l‟université et pour m‟avoir fait aimer les sciences de la santé. Au Professeur Olga Mélanie LOMPO/GOUMBRI, Professeur Titulaire d‟anatomie et de cytologie pathologique de l‟Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO, Chef service du laboratoire d‟anatomie et de cytologie pathologique du Centre hospitalier universitaire Yalgado Ouédraogo (CHU-YO), pour m‟avoir énormément aidé à faire avancer ma recherche en mettant à disposition tous les échantillons souhaités et pour avoir facilité nos travaux au laboratoire d‟anatomie et de cytologie pathologique du CHU-YO. Au Professeur Charlemagne OUEDRAOGO, Maître de Conférences, Agrégé en gynécologie obstétrique de l‟Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO, Consultant International en Santé de la reproduction, Chevalier dans l'Ordre de la Légion d'Honneur Française, Commandeur de l'Ordre Œcuménique de Malte (OSJ), Croix d'Or du mérite de l'Ordre Œcuménique de Malte (OSJ), Président du conseil régional de l'Ordre des Médecins de Ouagadougou, pour le précieux encadrement, les conseils avisés dispensés à mon endroit et pour la grande disponibilité. Au Dr Moutawakilou GOMINA, Maître Assistant en Biochimie à l‟Université de Parakou, infiniment merci pour vos précieux apports et conseils, vos encouragements, et vos multiples soutiens. Profonde gratitude ! Au Dr Luc Brun, Maître Assistant à l‟Université de Parakou, Responsable du laboratoire d‟Anatomie et cytologie pathologique du CHUD-B/A, pour n‟avoir ménagé aucun effort à mettre à notre disposition les échantillons nécessaires pour la bonne réalisation de nos travaux de recherche. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page iv Au Dr Djénéba Ouermi, Maitre Assistante en Biologie Moléculaire à l‟Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO, merci pour tous vos soutiens et vos précieux conseils. Au Dr Florencia DJIGMA, Assistante en Biologie Moléculaire à l‟Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO, je vous adresse mes sincères remerciements pour votre disponibilité et pour tous vos concours à ce travail de recherche qui nous a tous tenu à cœur. Profonde gratitude ! Au Dr Soulemane Ouattara, merci pour la collaboration et la disponibilité dont vous avez fait montre à notre endroit. Au Dr Nadine GHILAT, Gynécologue-obstétricienne, mes sincères remerciements. Au Dr Martial SAWADOGO, merci pour les encouragements. Au Père Albert Théophane YONLI et à Mr Valérie J.T.E BAZIE, merci pour les encouragements et les précieux soutiens. A tous mes enseignants de l’UFR/SVT de l’Université de Ouagadougou et de la Faculté de Médecine de l’Université de Parakou, je vous témoigne ma grande reconnaissance pour vos apports multiples et divers qui ont renforcé mes connaissances et aiguisé ma soif d‟apprendre davantage, A mes amis du CERBA/LABIOGENE, Maléki ASSIH, Rebeca COMPAORE, Ginette Dao, Serge SOUBEIGA, Abdoul Karim OUATTARA, Diarra BIRAMA, Missa MILLOGO, Salfo SAWADOGO, Ina TRAORE, Esther TRAORE, Clarisse OUEDRAOGO, Prosper BADO, Alice OUEDRAOGO, Edwige YELEMKOURE, mille merci pour votre amitié indéfectible qui m‟a aidé à m‟intégrer socialement. A l’UEMOA à travers son programme PACER2, et son programme de soutien à la formation et la recherche de l‟excellence, édition 2015-2016, merci pour le soutien financier. Au CERBA/LABIOGENE et à la CEI pour leur soutien financier. A tout le personnel du laboratoire d‟Anatomie et cytologie pathologique du CHD-B, Parakou, République du Bénin, en particulier Mme BOSSA Chantal et Mme Emilienne KOCHOFA, vos divers apports et appuis multiformes m‟ont été d‟une très grande utilité. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page v A tout le personnel du laboratoire d‟Anatomie et cytologie pathologique du CHU-YO, Ouagadougou, Burkina Faso, en particulier Mr Noufou ILBOUDO, Major Issa TAPSOBA, mille merci pour votre grande disponibilité et les précieuses suggestions. A tout le personnel de l‟hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO), et particulièrement au Directeur Dr Paul OUEDRAOGO et au Père Marius BELEMGNEGRE, mon infinie gratitude pour l‟accompagnement constant manifesté à mon endroit. A tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail, je vous dis mille fois merci. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page vi HOMMAGES A Monsieur le Président du Jury, Nous vous remercions pour l‟honneur que vous nous faites en acceptant de présider notre jury de soutenance de thèse. Nous sommes persuadés que vos conseils et recommandations nous serviront à parfaire ce travail. Nous vous présentons notre profond respect. Aux Honorables membres du Jury, C‟est un insigne honneur que vous nous faites en acceptant d‟évaluer ce travail. Soyez rassurés que vos critiques nous édifierons et contribueront à coup sûr à l‟amélioration de notre travail. Hommages respectueux ! Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page vii TABLE DES MATIERES DEDICACES ........................................................................................................................ ii REMERCIEMENTS ............................................................................................................ iii HOMMAGES ..................................................................................................................... vii TABLE DES MATIERES .................................................................................................. viii SIGLES ET ABREVIATIONS ........................................................................................... xiii LISTE DES TABLEAUX ...................................................................................................xvi LISTE DES FIGURES ..................................................................................................... xviii RESUME ............................................................................................................................xix ABSTRACT ......................................................................................................................... xx INTRODUCTION ..................................................................................................................2 OBJECTIFS DE LA THESE .................................................................................................5 CHAPITRE I : REVUE DE LITTERATURE .........................................................................7 I.1. Les Papillomavirus Humains ............................................................................................7 I.1.1. Définition et historique des Papillomavirus Humains .....................................................7 I.1.2. Structure et organisation du génome du HPV ................................................................8 I.1.3. Classification des HPV ................................................................................................ 10 I.1.4. Modes d‟acquisition de l‟infection au HPV.................................................................. 15 I.1.5. Cycle viral ................................................................................................................... 16 I.1.5.1. Infection primaire de l‟épithélium : récepteurs cellulaires, attachement et endocytose ........................................................................................................................ 18 I.1.5.2. Phase de maintenance ........................................................................................... 19 I.1.5.3. Phase de prolifération ............................................................................................ 20 I.1.5.4. Phase d‟amplification ............................................................................................ 21 I.1.5.5. Phase d‟assemblage ............................................................................................... 22 I.1.5.6. Intégration et carcinogénèse .................................................................................. 22 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page viii I.1.6. Propriétés biologiques des protéines des HPV ............................................................. 23 I.1.7. Mécanisme infectieux .................................................................................................. 25 I.1.8. Epidémiologie des infections à HPV et des maladies liées à ces virus .......................... 26 I.1.9. Tests HPV .................................................................................................................. 30 I.1.9.1. La méthode PCR (Polymerase Chain Reaction) .................................................... 30 I.1.9.2. La méthode par capture d‟hybrides ........................................................................ 31 I.1.9.3. L‟hybridation in situ sur des frottis cellulaires ou des coupes histologiques ........... 32 I.1.9.4. Méthode par détection des ARNm des protéines E6 et E7 ..................................... 32 I.1.9.5. Les autres méthodes virologiques .......................................................................... 32 I.1.10. Persistance ou clairance de l‟infection aux HPV ........................................................ 32 I.1.10.1. Facteur viraux ..................................................................................................... 33 I.1.10.2. Réponse immune ................................................................................................. 34 I.1.10.3. Spécificité génétique de l‟hôte et persistance virale ............................................. 36 I.1.11. Prévention de l‟infection au HPV.............................................................................. 40 I.1.11.1. La vaccination prophylactique ............................................................................. 41 I.1.11.2. La vaccination thérapeutique ............................................................................... 42 I.1.11.3. Immunogénicité et efficacité des vaccins anti-HPV ............................................. 43 I.1.11.4. Nouveaux vaccins potentiels en cours de mise au point ....................................... 44 I.2. Les néoplasies cervicales intra-épithéliales ..................................................................... 44 I.2.1. Rappel anatomique et histologique du col utérin .......................................................... 44 I.2.2. Lésions précancéreuses cervicales ou dysplasie cervicale ............................................45 I.2.2.1. Le concept ............................................................................................................ 45 I.2.2.2. Caractéristiques cliniques ...................................................................................... 46 I.2.2.3. Diagnostic des dysplasies cervicales ......................................................................47 I.3. Le Cancer du col de l‟utérus ........................................................................................... 49 I.3.1. Le cancer invasif du col ............................................................................................... 49 I.3.1.1. Histoire naturelle du cancer du col de l‟utérus ....................................................... 49 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page ix I.3.2.2. Classification anatomo-pathologique des cancers invasifs du col de l‟utérus ......... 51 I.3.2.3. Mécanismes de la carcinogénèse ........................................................................... 54 I.3.2.4. Diagnostic du cancer du col de l‟utérus et dépistage .............................................. 57 I.3.2.4.1. Les symptômes ............................................................................................... 57 I.3.2.4.2. Le diagnostic .................................................................................................. 57 I.3.2.4.3. Traitement des lésions précancéreuses du col utérin ........................................ 58 I.3.2.4.4. Traitement du cancer du col de l‟utérus ........................................................... 58 I.3.2.4.5. Pronostic du cancer du col de l‟utérus ............................................................. 61 CHAPITRE II : CADRE D‟ETUDE, MATERIEL ET METHODES ...................................63 II.1. Cadre d‟étude ................................................................................................................ 63 II.2. Matériel et Méthodes..................................................................................................... 65 II.2.1. Type d‟étude ........................................................................................................... 65 II.2.2. Période d‟étude .......................................................................................................65 II.2.3. Population d‟étude .................................................................................................. 65 II.2.3.1. Population A .................................................................................................... 65 II.2.3.2. Population B .................................................................................................... 66 II.2.3.3. Population C .................................................................................................... 66 II.2.4. Echantillonnage ......................................................................................................66 II.2.4.1. Taille de l‟échantillon ....................................................................................... 66 II.2.4.2. Ecouvillonnage du canal endocervical .............................................................. 67 II.2.4.3. Prélèvement des tissus archivés fixés au formol et inclus en paraffine .............. 67 II.2.5. Extraction de l‟ADN du HPV ................................................................................. 69 II.2.5.1. Extraction de l‟ADN du HPV à partir des échantillons obtenus par l‟écouvillonnage du canal endocervical ......................................................................... 69 II.2.5.2. Extraction de l‟ADN du HPV à partir des tissus fixés et inclus en paraffine ...... 69 II.2.6. Tests PCR en temps réel ......................................................................................... 71 II.2.6.1. Principe de la PCR en temps réel ...................................................................... 71 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page x II.2.6.2. Détection des génotypes HPV-HR par PCR en temps réel ................................ 71 II.2.7. Analyses statistiques ............................................................................................... 75 II.2.8. Considérations éthiques .......................................................................................... 75 CHAPITRE III : RESULTATS ............................................................................................ 78 III.1. Résultats des travaux de la première étude ................................................................... 78 III.1.1. Contexte et but de la première étude ......................................................................78 III.1.2. Résultats du premier article ................................................................................... 78 III.1.2.1 Conclusion partielle ......................................................................................... 84 III.2. Résultats des travaux de la deuxième étude .................................................................. 85 III.2.1. Contexte et but de la deuxième étude ..................................................................... 85 III.2.2. Résultats du deuxième article ................................................................................ 85 III.2.2.1. Conclusion partielle ........................................................................................ 91 III.3. Résultats des travaux de la troisième étude................................................................... 92 III.3.1. Contexte et but de la troisième étude .....................................................................92 III.3.2. Résultats du troisième article ................................................................................. 93 III.3.2.1. Conclusion partielle ........................................................................................ 98 III.3.3. Résultats du quatrième article ................................................................................ 99 III.3.3.1. Conclusion partielle ...................................................................................... 103 III.3.4. Résultats du cinquième article ............................................................................. 103 III.3.4.1. Conclusion partielle ...................................................................................... 109 III.4. Récapitulatif de la distribution génotypique et des prévalences des HPV-HR à Ouagadougou et à Parakou ................................................................................................. 109 CHAPITRE IV : DISCUSSION GENERALE .................................................................... 112 IV.1. Génotypes HPV-HR chez les femmes de la population générale et les femmes VIH séropositives à Ouagadougou, Burkina Faso ....................................................................... 112 IV.2. Génotypes HPV-HR chez les adolescentes sexuellement actives à Ouagadougou, Burkina Faso ...................................................................................................................... 114 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xi IV.3. Génotypes HPV-HR dans les CIN et Cancer du col de l‟Utérus à Ouagadougou (Burkina Faso) et à Parakou (République du Bénin) ........................................................... 116 CONCLUSION GENERALE ............................................................................................. 128 PERSPECTIVES ................................................................................................................ 130 SUGGESTIONS................................................................................................................. 132 REFERENCES ................................................................................................................... 134 ANNEXES ......................................................................................................................... 153 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xii SIGLES ET ABREVIATIONS ADN : Acide désoxyribonucléique AP1 : Activating Protein 1 ARN : Acide ribonucléique ARNm : ARN messager ATP : Adénosine triphosphate ASC-US : Cellules épidermoïdes atypiques de signification indéterminée ASC-H : Cellules épidermoïdes atypiques ne permettant pas d‟exclure une lésion intraépithéliale épidermoïde de haut grade Bak : Bcl2‐homologous Antagonist Killer Bax : Bcl2‐ activated X Bcl-2 : B-cell lymphoma leukemia type 2 BPV : Bovine papillomavirus CA 125 : Carbohydrate antigen 125 CCU : Cancer du col de l‟utérus CDK : Cyclin dependent Kinase CERBA : Centre de recherche biomoléculaire Pietro Annigoni CIN : Cervical intra epithelial neoplasia ou néoplasie cervicale intra-épithéliale CHUD-B/A : Centre Hospitalier Universitaire Départemental du Borgou et de l‟Alibori CHU-YO : Centre Hospitalier Universitaire Yalgado Ouédraogo CMH : Complexe majeur d‟histocompatibilité CRPV : Cottontail rabbit papillomavirus ECAD : Electroconisation à l‟anse diathermique EGF : Epidermal Growth Factor ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FFPE : Formalin-fixed, paraffin-embedded FCU : Frottis cervico-utérin FIGO : Fédération internationale de gynécologie-obstétrique Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xiii HLA : Human leukocyte antigen HOSCO : Hôpital Saint Camille de Ouagadougou HPV : Human Papillomavirus ou Papillomavirus humains HPV-HR : HPV à haut risque HSIL : High grade Squamous Intra epithelial Lesion ou lésion de haut grade HSPG : Héparanes sulfates protéoglycanes HSV : Herpes simplex virus ou virus herpès simplex hTERT : Human telomerase reverse transcriptase IARC : International Agency for Research on Cancer IC : Intervalle de confiance Ig : Immunoglobuline INF : Interféron IRM : Imagerie par résonance magnétique IST : Infection sexuellement transmissible IVA : Inspection visuelle à l‟acide acétique IVL : Inspection visuelle au lugol JPC : Jonction pavimento-cylindrique LABIOGENE : Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique LCR : Long Control Region LIEBG : Lésion intra-épithéliale épidermoïde de bas grade LIEHG : Lésion intra-épithéliale épidermoïde de haut grade LPIBG : Lésions intra-épithéliales pavimenteuses de bas grade LNR-HPV : Laboratoire National de Référence du HPV LSIL : Low grade Squamous Intra epithelial Lesion ou lésion de bas grade OMS : Organisation Mondiale de la Santé OR : Odds Ratio PCR : Polymerase Chain Reaction) ou réaction de polymérisation en chaine PML : Promyelocytic leukemia pRb : Protéine suppresseur du rétinoblastome RLU : Relative Luminescence Unit Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xiv RPA : Replication Protein A SCC : Squamous Cell Carcinoma antigen TCR : T cell receptor TLR : Toll Like Receptor TNF : Tumor Necrosis Factor Treg : Cellules T CD4 régulatrices VIH : Virus de l‟immunodéficience humaine VLP : Virus-like-particles VPN : Valeur prédictive négative Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xv LISTE DES TABLEAUX Tableau I : Pathologies associées aux papillomavirus humains, lien avec le génotype ........... 14 Tableau II : Fréquence des cancers attribuables aux papillomavirus et à certains génotypes . 15 Tableau III : Principales propriétés biologiques des protéines des HPV ................................ 24 Tableau IV : Différentes terminologies employées pour le compte-rendu des résultats de la cytologie et de l‟histologie .................................................................................................... 46 Tableau V : Caractéristiques sociodémographiques, sexuelles et comportementales des femmes infectées au HPV à haut risque ................................................................................ 80 Tableau VI : Prévalence des douze génotypes HPV-HR chez les 63 femmes de la population générale de statut HPV inconnu ............................................................................................ 82 Tableau VII : Fréquence des douze génotypes HPV-HR chez les femmes VIH séropositives et les femmes de statut VIH inconnu ........................................................................................ 83 Tableau VIII : Nombre de génotypes HPV par femme infectée ............................................. 84 Tableau IX : Caractéristiques sociodémographiques et comportementales des adolescentes .. 87 Tableau X : Associations de génotypes de HPV-HR dans les infections multiples ................ 89 Tableau XI : Présence de HPV-HR en fonction des facteurs de risque chez les adolescentes et résultats IVA/IVL ................................................................................................................. 90 Tableau XII : Résultats histologiques et PCR ........................................................................ 94 Tableau XIII : Distribution HPV-HR en fonctions des lésions histologiques CIN 2 et 3 ........ 96 Tableau XIV : Répartition HPV et tranche d'âge ................................................................... 97 Tableau XV : Relation entre résultat histologique, tranche d'âge et HPV .............................. 98 Tableau XVI : Types histologiques du cancer du col de l‟utérus en fonction des tranches d‟âge ............................................................................................................................................. 99 Tableau XVII : Fréquence des génotypes HR-HPV ............................................................ 100 Tableau XVIII : Différentes associations dans les infections multiples ................................ 101 Tableau XIX : Fréquence des génotypes HR-HPV dans les types histologiques de cancer en considérant le cumul total de génotypes .............................................................................. 102 Tableau XX : Distribution des génotypes HR-HPV selon la tranche d‟âge .......................... 102 Tableau XXI : Détection du human bêta-globine gène à la PCR des HPV-HR dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales de haut grade et dans le cancers du col de l‟utérus, Parakou, 2009-2014............................................................................................................ 104 Tableau XXII : Diagnostic histologique des lésions précancéreuses et cancéreuses du col de l‟utérus, Parakou, 2009-2014 .............................................................................................. 105 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xvi Tableau XXIII : Type de lésions précancéreuses ou cancéreuses du col de l‟utérus en fonction des classes d‟âge des femmes, Parakou, 2009-2014 ............................................................ 106 Tableau XXIV : Infections multiples ou isolées à HR-HPV dans les lésions précancéreuses de haut grade et dans le cancer du col de l‟utérus, Parakou, 2009-2014 ................................... 108 Tableau XXV : Récapitulatif de la distribution génotypique et des prévalences des HPV-HR à Ouagadougou et à Parakou ................................................................................................. 110 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xvii LISTE DES FIGURES Figure 1 : Structure des HPV et organisation génomique ........................................................9 Figure 2 : Production de pseudo-particule des HPV .............................................................. 10 Figure 3 : Classification des papillomavirus humains et animaux sur la base de la séquence du gène codant la protéine majeure de capside L1 ..................................................................... 13 Figure 4 : Cycle de multiplication des HPV .......................................................................... 17 Figure 5 : Modèle du mécanisme infectieux utilisé par l‟HPV16 .......................................... 18 Figure 6 : Répartition géographique des HPV dans le cancer du col de l‟utérus montrant la prédominance du HPV 16 ..................................................................................................... 30 Figure 7 : Physiopathologie de l‟infection et réponse immune naturelle au cours de l‟infection par un HPV .......................................................................................................................... 38 Figure 8 : Cycle viral normal et évolution vers une prolifération maligne au cours d‟une infection par un HPV muqueux génital ................................................................................. 39 Figure 9 : Développement histologique du cancer du col de l‟utérus .....................................49 Figure 10 : Coopération des protéines E6, E7 et E5 des HPV muqueux génitaux dans la persistance virale et l‟oncogenèse virale ............................................................................... 56 Figure 11 : Blocs de paraffines contenant les tissus archivés du col de l'utérus ...................... 68 Figure 12 : Microtome LEICA-RM-2135 ............................................................................. 68 Figure 13 : Illustration des principales étapes de l‟extraction d‟ADN à partir des tissus fixés et inclus en paraffine ............................................................................................................... 70 Figure 14 : Distribution des échantillons sur la plaque du SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 (Sacace Biotechnologie, Italie) ............................................................................................. 73 Figure 15 : Exemple d‟intensité de fluorescences FAM/HEX/ROX/CY5 émises en fonction du nombre de cycle ............................................................................................................... 74 Figure 16 : Interprétation des résultats pour la détection des génotypes HPV-HR ................. 74 Figure 17 : Programme Microsoft ® Excel “HPV Genotype 14 Real-TM.xls” ...................... 75 Figure 18 : Fréquence des génotypes de HPV-HR chez les adolescentes à Ouagadougou...... 88 Figure 19 : Fréquence des génotypes HPV-HR ..................................................................... 95 Figure 20 : Fréquence des génotypes HPV-HR dans le cancer du col de l‟utérus et dans les CIN-II et III, Parakou, 2009-2014 ....................................................................................... 107 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xviii RESUME L‟infection au Papillomavirus humain (HPV) est l‟infection sexuellement transmissible (IST) la plus fréquente dans le monde. En absence d‟une clairance virale, la persistance de l‟infection au HPV à haut risque (HPV-HR) peut être responsable du développement du cancer du col de l‟utérus. En Afrique Sub-saharienne, le cancer du col de l‟utérus est le premier cancer de la femme et la première cause de mortalité par cancer. Il constitue un véritable problème de santé publique. Cependant les vaccins anti-HPV disponibles couvrent uniquement deux génotypes HPV-HR (HPV 16 et 18). L‟introduction du vaccin étant d‟actualité au Burkina Faso et au Bénin, l‟objectif principal de cette recherche était de cartographier les génotypes HPV-HR chez les femmes à Parakou et à Ouagadougou. Un total de 688 échantillons provenant du col de l‟utérus d‟adolescentes et de femmes avec ou sans lésions cervico-utérines ont été prélevés à Ouagadougou et à Parakou. Des écouvillonnages endo-cervicaux et des sections de tissus archivés fixés et inclus en paraffine de cancer du col de l‟utérus (CCU) et de néoplasies cervicales intra-épithéliales (CIN) de haut grade ont fait l‟objet d‟extraction de l‟ADN du HPV suivi d‟une PCR en temps réel multiplexe pour la détection des génotypes HPV-HR. A Ouagadougou, chez les femmes sans lésions histologiques du col utérin, les génotypes les plus fréquents étaient HPV-35, 52, 31, 18, 58, 56, 51, 59, 45, 33. Chez les adolescentes la répartition était comme suit : HPV-52, 59, 39, 35, 51, 56, 16, 18 ; dans les CIN on note : HPV-39, 35, 45, 33, 51, 52, 56 et dans le CCU : HPV-18, 31, 39, 16, 45, 35, 58. A Parakou, dans les CIN et les CCU on note la présence de HPV-39, 18, 45, 35, 52, 31, 33. La prévalence de l‟infection à HPV-HR à Ouagadougou était de 30,2% (IC 95% : 19,23-43,02) chez les femmes de la population générale ; 41,5% (IC 95% : 34,59-48,66) chez les adolescentes ; 48,8% (IC 95% : 33,31-64,54) dans les CIN de haut grade et 72,3% (IC 95% : 59,81-82,69) dans le CCU. A Parakou, la prévalence de l‟infection à HPV-HR était de 76,9% (IC 95% : 64,81-86,47) dans les CIN et CCU. Les fortes prévalences de l‟infection au HPV à haut risque oncogène trouvées chez les adolescentes et les femmes avec ou sans lésions cervico-utérines nous indiquent les gros défis à relever dans la lutte contre le cancer du col de l‟utérus. De plus, les génotypes les plus fréquents chez ces jeunes adolescentes et ces femmes sont ceux de la famille des HPV-30 et 50 qui ne sont pas encore couverts par les vaccins disponibles. Néanmoins, il faudra renforcer les programmes de dépistage et assurer la couverture vaccinale des jeunes filles par les vaccins anti-HPV disponibles, voire par le futur nano-valent. Mots clés : HPV, PCR en temps réel, CIN, Cancer du col de l‟utérus, Ouagadougou, Parakou. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xix ABSTRACT Human papillomavirus infection (HPV) is the most common sexually transmitted infections (STIs) worldwide. In the absence of viral clearance, persistent high-risk HPV (HR-HPV) infection is responsible for the development of cervical cancer. In Sub-Saharan Africa, cervical cancer is the first female cancer and the leading cause of death due to cancer. This disease represents a major public health problem. Although, HPV vaccines are available, they only cover two HR-HPV genotypes (HPV 16 and 18). While the vaccine is being introduced in Burkina Faso and Benin, the main objective of this research was to map the HR-HPV genotypes in women in Parakou (Benin) and Ouagadougou (Burkina Faso). A total of 688 samples from the uterine cervix of teenage girls and women with and without cervical uterine lesions were collected in Ouagadougou and Parakou. DNA has been extracted from endocervical swabs, archived paraffin embedded tissue sections of cervical cancer (CC) and high grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN) followed by a multiplex real-time PCR for the detection of HR-HPV genotypes. In Ouagadougou, among women without histological cervical lesions, the most common genotypes were HPV-35, 52, 31, 18, 58, 56, 51, 59, 45, and 33. Among teenage girls, the distribution was as follows: HPV 52, 59, 39, 35, 51, 56, 16, 18. When genotyping HR-HPV genotypes among CIN we note a high prevalence of: HPV-39, 35, 45, 33, 51, 52, 56 and for the CC: HPV-18, 31, 39, 16, 45, 35, 58 are more common. In Parakou, among CIN and CC, we note the presence of HPV-39, 18, 45, 35, 52, 31, and 33. The prevalence of HR-HPV infection in Ouagadougou was about 30.2% (95% CI: 19,23- 43,02) among women in the general population; about 41.5% (95% CI 34.59 to 48.66) in adolescents; 48.8% (95% CI 33.31 to 64.54) in the high-grade CIN and about 72.3% (95% CI 59.81 to 82.69) in the CC. In Parakou, the prevalence of HR-HPV infection was about 76.9% (95% CI 64.81 to 86.47) in CIN and CC. High prevalence of HR-HPV infection found in adolescents and women with and without cervical uterine lesions indicate the big challenges in the fight against cervical cancer. In addition, the most common genotypes among these adolescent girls and women are those of the families HPV-30 and 50 which are not yet covered by available vaccines. Nevertheless there is a need to strengthen the screening programs and ensure the coverage of girls by a future nano-valent HPV vaccine. Keywords: HPV, real time PCR, CIN, cervical cancer, Ouagadougou, Parakou. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page xx INTRODUCTION INTRODUCTION Les Papillomavirus humains (Human Papillomavirus ou HPV) de la famille des Papillomaviridae sont des petits virus à ADN qui infectent les muqueuses cutanées et anogénitales de l‟Homme. Il en existe deux grands groupes, les HPV à haut risque et les HPV à bas risque (Alain et al., 2010). Bien qu‟il existe une clairance virale de l‟infection, au cas où l‟on assiste à une persistance virale, il y a une possibilité qu‟elle évolue vers des lésions bénignes ou précancéreuses et des années plus tard au développement d‟un cancer. Il peut s‟agir du cancer du col de l‟utérus, du cancer de l‟anus, du vagin, de la vulve, du pénis, ou du cancer de l‟oropharynx. Le taux d‟incidence du cancer du col utérin est beaucoup plus élevé que ceux des autres cancers (incidence mondiale estimée du cancer anal est de 1 pour 100 000 environ, avec 27 000 cas par an) (de Martel et al., 2012). En effet, dans le monde, le cancer invasif du col de l‟utérus est responsable chaque année de plus de 275 000 décès dont 88% surviennent dans les pays à ressources limitées. En Afrique sub-saharienne, il y a plus de 75 000 nouveaux cas de cancer invasif du col de l‟utérus et plus de 50 000 décès par ans (Ferlay et al., 2010). Le cancer du col de l‟utérus (CCU) constitue la première cause de mortalité par cancer chez les femmes en Afrique sub-saharienne. Il représente le cancer le plus fréquent chez la femme en Afrique subsaharienne et constitue la deuxième tumeur maligne la plus fréquente chez la femme à travers le monde. L‟estimation de l‟incidence des cancers induits par l‟infection au HPV a été de 12,7 millions en 2008 (Forman et al., 2012). Au Bénin, les estimations actuelles indiquent une incidence annuelle de 925 cas de CCU et 616 d‟entre elles en meurent. Au Burkina Faso, chaque année, 1230 femmes ont un diagnostic positif au cancer du col et 838 d‟entre elles en meurent (WHO/ICO, 2010 ; Piras et al., 2011). L‟infection au HPV constitue l‟infection sexuellement transmissible (IST) la plus fréquente au monde, avec 660 millions de personnes infectées selon l‟Organisation Mondiale de la Santé (OMS, 2007). En Afrique, la prévalence de l‟infection au HPV atteint 21,3 % avec des variations notables en fonction des régions : 21,5 % en Afrique de l‟Ouest, 33,6 % en Afrique de l‟Est et 21 % en Afrique australe (WHO/ICO, 2009). Ainsi, l‟infection au HPV et le CCU constituent un véritable problème de santé publique dans le monde et surtout en Afrique. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 2 Cependant, il existe des moyens de prévention de l‟infection au HPV parmi lesquels la vaccination occupe une place importante ainsi que le dépistage précoce et le traitement des lésions précancéreuses. Les vaccins actuellement disponibles protègent contre les HPV-16, HPV-18, HPV-6 et HPV-11, parmi lesquels deux types sont des HPV à haut risque (HPVHR). Il s‟agit des HPV-16 et 18. Selon la littérature, dans le monde, notamment en Europe et dans certains pays africains les génotypes les plus fréquents sont HPV-16 et HPV-18 (Guan et al., 2012 ; Heard et al., 2013 ; Denny et al., 2014) ; suivi de HPV-31, 52, et 58 (Ogembo et al., 2015). Cependant, certaines études au Burkina Faso, ont trouvé une prédominance des génotypes HR-HPV autres que les HPV-16 et 18 (Sagna et al., 2010 ; Djigma et al., 2011 ; Ouédraogo et al., 2011). On se demande alors si les génotypes HPV-HR responsables des lésions précancéreuses et cancéreuses au Burkina Faso sont surtout des HPV-HR autres que ceux pris en compte par le vaccin. Dans nos recherches bibliographiques, il n‟existe pas d‟études sur les HPV-HR impliqués dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales de haut grade et dans le cancer invasif du col de l‟utérus, à partir de pièces histologiques archivées, fixées et inclus en paraffine, au Burkina Faso et au Bénin. Au Bénin, Parakou est le centre-ville de la région septentrionale et siège du Centre Hospitalier Départemental et Universitaire de référence du Nord-Bénin. Alors, quelle serait la tendance à Parakou, au Bénin ? Au moment où l‟introduction des vaccins anti-HPV est d‟actualité, ne serait-il pas bénéfique d‟avoir une cartographie des HPV circulant au Burkina Faso et au Bénin ? C‟est ainsi que, l‟objectif principal de ces travaux de recherche était d‟établir la cartographie des génotypes HPV à haut risque chez les femmes à Parakou et à Ouagadougou. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 3 OBJECTIFS DE LA THESE OBJECTIFS DE LA THESE Objectif général Contribuer à l‟élaboration d‟une cartographie des génotypes HPV à haut risque chez les femmes à Parakou et à Ouagadougou. Objectifs spécifiques 1. Caractériser par PCR en temps réel les génotypes HPV au sein des familles 30‟S et 50‟S chez les femmes de la population générale et les femmes VIH séropositives à Ouagadougou. 2. Déterminer la prévalence de l‟infection au HPV-HR chez les femmes de la population générale à Ouagadougou. 3. Déterminer la prévalence des génotypes HPV-HR chez les adolescentes à Ouagadougou. 4. Détecter les génotypes HPV-HR dans les CIN de haut grade et dans le cancer invasif du col de l‟utérus à Ouagadougou et à Parakou. 5. Comparer les génotypes HPV-HR détectés dans les différentes populations d‟étude. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 5 CHAPITRE I : REVUE DE LITTERATURE CHAPITRE I : REVUE DE LITTERATURE I.1. Les Papillomavirus Humains I.1.1. Définition et historique des Papillomavirus Humains Les papillomavirus, du latin « papilla », diminutif de « papula » signifiant bouton et du suffixe grec « ome » désignant le caractère tumoral, constituent une vaste famille de plus de 200 petits virus à ADN (acide désoxyribonucléique) non enveloppés, capables d‟infecter l‟Homme et de nombreux mammifères, avec une spécificité d‟espèce étroite (Alain et al., 2010). Les papillomavirus humains ou HPV (Human Papilloma Virus) sont des virus nus de petite taille, 45 à 55 nm de diamètre, appartenant à la famille des Papillomaviridae (Duport, 2008). En 1933, SHOPE et HURST ont isolé l‟ADN de CRPV (Cottontail rabbit papillomavirus), à partir d‟une verrue de lapin, mettant en évidence la corrélation entre les papillomes cutanés observés chez le lapin et une infection virale. Ensuite, les papillomes cutanés (verrues) et muqueux (condylomes) qui sont des tumeurs épithéliales bénignes furent attribués aux papillomavirus humain. De 1960 à 1970, les données épidémiologiques ont montré que la maladie était transmise par un contact sexuel, ce qui a inspiré la recherche pour une identification de l‟agent microbien responsable des néoplasies cervicales. Ainsi, le virus herpès simplex (HSV) a été mis en cause à cette époque, mais dans les années 1980, l‟attention s‟est portée progressivement vers le papillomavirus humain, appuyé par des solides expérimentations de la biologie moléculaire impliquant certains types de virus comme agents responsables de la transformation cellulaire (Monsonego, 1988). Les premiers types de HPV (HPV-16 et HPV-18) ont été directement isolés à partir des pièces biopsiques du cancer du col de l‟utérus (Zur Hausen, 2009). La responsabilité des papillomavirus humains dans le développement d‟un cancer du col utérin a été suggérée pour la première fois par HARALD ZUR HAUSEN en 1976 et confirmée ultérieurement par les études épidémiologiques et fondamentales (Alain et al., 2010). C‟est à HARALD ZUR HAUSEN et son équipe que revient le mérite d‟avoir isolé le papillomavirus de type 16 dans plusieurs cas de cancer du col de l‟utérus. En 1970 il a été considéré comme un héros au sein de la communauté des chercheurs. Les types HPV-16 et HPV-18 ont été respectivement clonés en 1983 et en 1984 (Zur Hausen, 2002). En 1984, ces génotypes HPV ont été placés au Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 7 sommet du classement des agents infectieux les plus sexuellement transmissibles. En 1995, l‟IARC (International Agency for Research on Cancer) a classé les HPV 16 et 18 comme agents carcinogènes chez l‟homme (IARC, 1995). Le risque relatif de l‟association entre le HPV et le cancer du col de l‟utérus est de 2 à 3 fois plus élevé que celui d‟autres facteurs de risque puissants de cancer (Bosch et de Sanjose, 2003). I.1.2. Structure et organisation du génome du HPV Les HPV ont en commun une structure compacte (environ 55 nm de diamètre), comportant un génome circulaire de petite taille (8 000 paires de bases), codant 8 à 9 protéines selon le génotype (figure 1) (Alain et al., 2010). Ce génome est associé à des histones cellulaires pour former un minichromosome. Il est entouré d‟une capside constituée de pentons comportant une protéine majeure, L1, associée à une protéine mineure plus interne, L2. Ces protéines portent des antigènes de groupe, cibles des anticorps neutralisants. L1 possède la capacité de s‟assembler spontanément en pseudo-particules virales (figure 2), propriété exploitée dans la fabrication des vaccins (Hantz et al., 2006 ; Alain et al., 2010), mais aussi dans l‟étude des mécanismes d‟entrée et de diffusion cellulaire du virus. Le génome viral comporte une origine de réplication associée à une région régulatrice dite LCR (Long Control Region) portant des séquences cibles pour de nombreux facteurs de transcription cellulaire et pour la protéine E2, et code plusieurs protéines, dites précoces «early» ou E, et tardives « late » ou L. Les protéines précoces (E1, E2, E4, E5, E6 et E7) régulent la réplication virale et le maintien de l‟infection. Parmi celles-ci, les protéines E1 (hélicase) et E2 sont impliquées dans la réplication du génome viral, et les protéines E5, E6 et E7 sont impliquées dans la prolifération et la transformation cellulaire (figure 1) (Lazarczyk et al., 2009 ; Kadaja et al., 2009 ; Howley et Lowy, 2007 ; Doorbar et al., 2005). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 8 Figure 1 : Structure des HPV et organisation génomique (Alain et al., 2010) Légende : A) Virions : les papillomavirus sont des virus de petite taille, 55 nm, reconnaissables en microscopie électronique ; B) modèle de structure des papillomavirus. La capside icosaédrique est constituée de pentons de protéine majeure L1. Cette protéine est capable de s’auto-assembler dans la cellule ou en solution. Cible d’anticorps neutralisants protecteurs contre les réinfections, elle constitue la base des vaccins anti-papillomavirus. La protéine mineure de capside L2 est associée à L1 et interagit avec la molécule d’ADN viral. Le génome est constitué d’une molécule d’ADN double brin circulaire de 8 000 pb associée à des histones cellulaires ; C) structure du génome des alphapapillomavirus humains (papillomavirus à tropisme génital, type HPV 16) et fonction des protéines virales. C1 : Au cours de l’infection productive, le génome est sous forme épisomale dans la cellule infectée (ADN circulaire double brin). Il comporte une région de régulation (LCR), six phases ouvertes de lecture codant des protéines de régulation précoces « early » (E1, E2, E4, E5, E6, E7) et deux protéines de capside L1 et L2. La phase ouverte de lecture E5 est absente chez les papillomavirus du groupe (à tropisme cutané, prototype HPV8). Une protéine E8 est codée par certains HPV génitaux. La région de régulation de la réplication virale LCR comporte de nombreux sites pour des facteurs de transcription cellulaires, et plusieurs sites de fixation pour la protéine E2. La composition de la région LCR diffère entre les papillomavirus génitaux et cutanés ; C2 : génome Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 9 viral dans sa forme intégrée : l’intégration au génome cellulaire interrompt la phase ouverte de lecture E2, supprimant la régulation négative de l’expression de E6 et E7 et plaçant E6 et E7 sous contrôle direct de la région de régulation. Figure 2 : Production de pseudo-particule des HPV (Brun et Riethmuller, 2007) I.1.3. Classification des HPV Les caractéristiques génétiques et moléculaires particulières des papillomavirus ont amené à les regrouper dans une famille unique, les Papillomaviridae, dont la taxonomie a été revue (de Villiers et al., 2004 ; Alain et al., 2010). Parmi les papillomavirus, on distingue les papillomavirus à tropisme muqueux et les papillomavirus à tropisme cutané et au sein de ces groupes, des types associés à un risque élevé de cancer. À ce jour, plus de 200 types de papillomavirus humains (HPV) et de nombreux papillomavirus animaux ont été classés sur la base du séquençage de la région codant la protéine majeure de capside L1 et le génome de 112 HPV a été intégralement séquencé (de Villiers et al., 2004 ; Bernard, 2005 ; Bernard et al., 2006 ). Malgré leur structure identique, le degré d‟homologie génomique entre les différents papillomavirus n‟est que de 40 %, témoignant de la grande dispersion de cette famille. Les papillomavirus sont regroupés en genres définis par un degré d‟homologie inférieur à 60 % de la séquence L1, parmi lesquels cinq correspondent aux HPV α, β, γ, μ et ν, et sept aux papillomavirus animaux. Au sein des genres, on distingue des espèces (60 à 70 % Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 10 d‟homologie) et des types (71 à 89 % d‟homologie, soit au moins 10 % de divergence). Au sein des types, existent des variants qui peuvent ne différer des autres virus du même type que par une ou quelques paires de bases (moins de 2 % de divergence) (de Villiers et al., 2004). Cette classification est corrélée au tropisme et au pouvoir pathogène des virus (figure 3 et tableau 1). L‟analyse phylogénique indique que les papillomavirus ont co-évolué depuis des centaines de milliers d‟années avec les différentes espèces. L‟adaptation progressive du virus à son hôte au fil de l‟évolution aboutis à une « spécialisation » de certaines espèces virales en termes de tropisme et de pathogénicité. Les papillomavirus humains et animaux se trouvent ainsi dans des genres distincts pour la plupart. Chez l‟Homme, la très grande majorité des HPV infectant les muqueuses (HPV muqueux génitaux ou non) et quelques HPV cutanés (HPV-2,-3,-10) appartiennent au genre α. A l‟opposé, les HPV α 4 et ceux des genres β, γ, μ, et ν n‟infectent pas la sphère génitale. Les HPV cutanés responsables d‟épidermodysplasie verruciforme, laquelle correspond à une susceptibilité génétique aux HPV à tropisme non génital conduisant à des cancers cutanés, appartiennent tous au genre β (Mansour, 2005; Howley et Lowy, 2007; Lazarczyk et al., 2009). Toutefois, certains HPV, qui se comportent comme des virus commensaux isolés des phanères ou de la peau en l‟absence de lésion, appartiennent également au genre β. L‟appartenance à un genre ou à une espèce ne permet pas de préjuger du caractère oncogène des papillomavirus. Celui-ci dépend essentiellement du type. Dans la sphère muqueuse, parmi plus de 40 types décrits au sein du genre α, 18 types oncogènes sont retrouvés au sein de lésions de haut grade ou de cancers et sont dits à haut risque oncogène (12 types) ou potentiellement à haut risque (6 types) (Munoz et al., 2003) ; d‟autres types, non oncogènes dits à bas risque sont associés à des lésions de bas grade ou à des condylomes, et une infection à HPV peut associer des HPV à haut risque et des HPV à bas risque. Au sein des papillomavirus muqueux à haut risque, HPV 16 est le plus prévalent dans les cancers du canal anal, les dysplasies vulvaires de haut grade et les cancers de l‟oropharynx liés aux HPV (Kreimer et al., 2005; Partridge et al., 2006; Srodon et al., 2006) (tableau 2). Les HPV 16 et HPV 18 sont, à eux seuls, responsables de 70 % des cancers du col utérin et de plus de 60 % des néoplasies cervicales intra-épithéliales (CIN) de grade 3. Les types 16, 18, 31, 33 et 45 sont à l‟origine de plus de 80 % des cancers du col (92 % en France), des cancers épidermoïdes, mais aussi des adénocarcinomes, et de plus de 80 % des cancers anogénitaux (Munoz et al., 2004; Castellsague et al., 2006; Pretet et al., 2008 ; Jacquard et al., 2009). Ces HPV à haut risque se répartissent dans les espèces 5, 6, 7, 9 et 11. HPV 16 et HPV 18 appartiennent aux espèces 9 et 7 ; HPV 31 et HPV 45 sont respectivement proches de HPV 16 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 11 et de HPV 18. A l‟opposé, parmi les HPV à bas risque, HPV 6 et HPV 11, qui représentent plus de 85 % des HPV impliqués dans les condylomes anogénitaux (Aubin et al., 2008) et qui sont les agents de la papillomatose laryngée juvénile transmise lors de l‟accouchement, sont proches et se trouvent tous deux dans l‟espèce 10. Dans les lésions de dysplasie génitale de bas grade, parmi les HPV responsables, on retrouve soit les types à haut risque 16 et 51 (espèces 9 et 5) soit les types bas risque par exemple HPV 53 de l‟espèce 6 (de Villiers et al., 2004). L‟appartenance à une espèce n‟est donc pas un critère strict de pathogénicité, mais reflète plutôt une proximité phylogénique et certaines caractéristiques moléculaires communes. Le caractère pathogène, et en particulier oncogène, est lié aux caractéristiques du type, voire à des propriétés particulières de certains variants au sein d‟un même type. La répartition géographique des HPV illustre l‟adaptation des HPV au terrain génétique. Ainsi, l‟écologie des HPV muqueux génitaux étudiée chez les femmes à frottis normaux montre une hétérogénéité inter-continents : HPV 16 reste le plus fréquent sur tous les continents, surtout en Europe (21%) où la fréquence des autres HPV est faible, au contraire de l‟Asie ou de l‟Afrique subsaharienne où tous les autres types sont retrouvés avec une fréquence de 4 à 6 % (Clifford et al., 2006). Cette variabilité géographique est également constatée pour les localisations oropharyngées (Kreimer et al., 2005). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 12 Figure 3 : Classification des papillomavirus humains et animaux sur la base de la séquence du gène codant la protéine majeure de capside L1, d‟après De Villiers et al., 2004 Légende : Cette classification illustre la très grande variété des papillomavirus humains et animaux et montre la distance phylogénétique entre les groupes HPV α et β ou γ, ainsi qu’entre les papillomavirus humains et animaux. Les virus impliqués dans les principales pathologies humaines sont repérés par les cercles. On remarque la proximité phylogénique entre HPV 16 et HPV31, HPV 18 et entre HPV 45 et HPV6 et HPV11. BPV : bovine papillomavirus ; CRPV : Cotton tail Rabbit papillomavirus ; ROPV : rodent papillomavirus, COPV : canine papillomavirus, EEPV : Equine papillomavirus; DPV : Deer (cervidés) papillomavirus. (Alain et al., 2010). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 13 Tableau I : Pathologies associées aux papillomavirus humains, lien avec le génotype Lésions Génotypes HPV associés Verrues palmoplantaires 1 Verrues vulgaires 2 (26, 27, 65, 78) Verrues planes 3, 10 (27, 28, 49) Verrue des bouchers 7 Condylomes acuminés 6, 11 (70, 83) Papulomatose Bowenoïde 16 Néoplasies cervicales intraépithéliales, cancers du col, cancers anogénitaux 16 et 18 ; mais aussi 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58, 66, 69, (30, 34, 40, 42-44, 53-57, 59, 61, 62, 64, 67, 68, 71-74, 82) Papillomatose orale 6,11 Hyperplasie épithéliale focale orale 13, 32 Papillomatose laryngée récurrente 6, 11 Carcinome cutané à cellules squameuses 41, 48 (29) Carcinome laryngé 16, 18 Carcinome verruqueux 16, 6, 11 Épidermodysplasie verruciforme (EV) 3, 5, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 36, 46, 47, 50 (37, 38) Cancers associés à l‟épidermodysplasie verruciforme 5, 8 Verrues vulgaires chez les patients Types de l‟EV et 75, 76, 77, 60 Immunodéprimés, Kystes épidermiques Verrue de Myrmecia 63 D‟après (De Villiers et al., 2004; Munoz et al., 2004; Kreimer et al., 2005; Bernard et al., 2006). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 14 Tableau II : Fréquence des cancers attribuables aux papillomavirus et à certains génotypes Cancers Sexe Association Place aux HPV (%) HPV 16+18 (%) Col de l’utérus F 100 70 Anal H, F 90 92 Vulvo-vaginal F 40 80 Pénis H 40 63 Bouche H, F 3 95 Oropharynx H, F 12 89 Tous cancers H, F 5 72 D‟après (Munoz et al., 2004). I.1.4. Modes d’acquisition de l’infection au HPV Les papillomavirus étant dépourvus d‟enveloppe, la structure de leur capside les rend extrêmement résistants, dans le milieu extérieur, à la congélation et à la dessication, facilitant leur transmission par contact cutané ou muqueux, mais aussi leur transmission indirecte, par les sécrétions génitales, les surfaces de contact, le linge souillé ou les mains (Mansour, 2005 ; Alain et al., 2010). Les infections à HPV sont le plus souvent transmises lors de contacts intimes peau à peau. Les rapports sexuels avec pénétration vaginale et anale sont propices à cette dissémination. De nombreuses études ont montré que les rapports sexuels sont le premier mode de transmission génitale des HPV (Czegledy, 2001; Thomas, 2001). Les voies mineures de contamination sont la transmission par vêtements et surfaces de contact et la transmission mère-enfant. La transmission sexuelle des HPV est favorisée par la forte charge virale présente au niveau des voies anogénitales à la phase productive de l‟infection, ce qui fait de l‟infection par les HPV muqueux génitaux la plus fréquente des infections sexuellement transmises. Les hommes sont également infectés au niveau pénien ou anal et sont donc des vecteurs majeurs des papillomavirus génitaux (Dunne et al., 2006 ; Palefsky, 2007 ; Alain et al., 2010). Les Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 15 HPV génitaux sont également retrouvés dans les poils pubiens et les sécrétions génitales. Les infections externes peuvent migrer secondairement au niveau du col, l‟infection est possible même en l‟absence d‟acte sexuel et de pénétration, et une lésion au niveau du col doit faire rechercher une autre localisation au niveau de l‟ensemble du périnée. Ceci explique également les données controversées concernant la protection conférée par l‟usage de préservatifs, en particulier chez la femme (Manhart et al., 2002 ; Dunne et al., 2006 ; Alain et al., 2010 ). Du fait de leur mécanisme de transmission identique, plusieurs espèces d‟HPV peuvent être simultanément ou successivement transmises, et les co-infections sont fréquentes (20 à 30%) dans la population générale féminine (Clifford et al., 2006 ; Alain et al., 2010). Les hommes peuvent également être infectés par plusieurs types d‟HPV (51% de co-infections) et peuvent donc transmettre plusieurs types, simultanément ou successivement (Dunne et al., 2006 ; Alain et al., 2010 ). La transmission verticale, au moment de l‟accouchement, d‟un HPV 6 ou 11, à partir de lésions génitales ou de condylomes maternels à forte charge virale, peut être à l‟origine d‟une papillomatose laryngée juvénile responsable de détresse respiratoire ou de papillomatose récurrente chez l‟enfant. D‟autres HPV, dont certains HPV à haut potentiel oncogène comme HPV 16, peuvent également être transmis de cette manière. L‟infection est en général transitoire, mais peut persister jusqu‟à deux ans chez l‟enfant (Mant et al., 2003 ; Alain et al., 2010). Elle est parfois associée à la survenue d‟un cancer oropharyngé. En cas de lésion orale ou génitale chez les enfants, la distinction entre transmission périnatale et inoculation secondaire par contamination indirecte manuportée ou oropharyngée, familiale ou au contact d‟autres enfants, voire sexuelle, est difficile. Plusieurs études démontrent en effet un portage oropharyngé d‟HPV à haut risque chez les enfants de moins de 11 ans, avec une prévalence pouvant aller jusqu‟à 60% selon les méthodes, ainsi que la présence de coinfections, qui suggère des modes de contamination multiples (Cason et al., 2005 ; Syrjanen et al., 2005 ; Alain et al., 2010). Concernant l‟infection des voies sexuelles par les HPV génitaux, le pic d‟infection est observé au moment des premiers rapports sexuels, soulignant la transmission sexuelle de l‟infection. I.1.5. Cycle viral Le cycle viral des HPV est lié au programme de différenciation des cellules infectées ce qui implique une coordination entre l‟expression des différents produits des gènes viraux et la progression des cellules infectées vers la surface de l‟épithélium. La figure 4 présente le cycle de multiplication des HPV. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 16 Figure 4 : Etapes de multiplication des HPV (Monsonégo, 2007) Légende : (A) L’infection des cellules souches épithéliales par les HPV peut se faire directement au niveau de la zone de jonction ou grâce à une microlésion présente au niveau de l’exocol. Les virions ciblent les cellules souches qui possèdent un (ou des) récepteurs ad boc. (B) Le génome viral est répliqué sous forme épisomale dans le noyau des cellules épithéliales (cercle). Au fur et à mesure de la différenciation épithéliale, les protéines tardives des HPV sont produites et permettent l’assemblage des virions. Ceux-ci sont libérés de façon concomitante à la desquamation des cellules épithéliales. (C) L’intégration de l’ADN viral (dessin de ressort dans les noyaux) est une caractéristique des HPV à haut risque. Elle conduit à une expression accrue de E6 et E7, oncoprotéines virales responsables de la perte de points de contrôle du cycle cellulaire. Finalement, c’est l’action combinée de E6 et de E7 qui est responsable de l’immortalisation puis de la transformation de la cellule infectée par un HPV à haut risque. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 17 I.1.5.1. Infection primaire de l’épithélium : récepteurs cellulaires, attachement et endocytose Pour que l‟infection ait lieu, les particules virales doivent avoir accès aux cellules de la couche basale de l‟épithélium (Sapp et Day, 2009). En effet, ces cellules s‟avèrent peu différenciées et mitotiquement très actives (Figure 5). Figure 5 : Modèle du mécanisme infectieux utilisé par l’HPV16 (d‟après Sapp et Day, 2009) Légende : 1. La particule virale se lie à son récepteur primaire d’attachement : les héparanes sulfates protéoglycanes de type 1 (HSPG1), présent au niveau de la matrice extracellulaire ou à la surface de la cellule. 2. La capside virale est transférée à un second site de liaison aux HSPG2 présent à la surface de la cellule. Le changement conformationnel induit conduit à l’exposition de la partie N‐terminale de la protéine L2 et au clivage de la furine. La cyclophiline B va favoriser cette étape. 3. Ces évènements semblent induire d’autres changements conformationnels qui conduisent à une perte d’affinité pour les HSPG et conduisent à l’endocytose. La nature précise des récepteurs impliqués dans ce mécanisme reste inconnue. Cependant, les héparanes sulfates protéoglycanes (HSPG) joueraient un rôle dans l‟attachement à la cellule hôte et dans l‟internalisation virale (Joyce et al., 1999; Patterson et al., 2005 ; Johnson et al., 2009). Deux familles d‟HSPG de surface existent : les syndécanes et les glypicanes. Des pseudo‐particules virales d‟HPV16 ne semblent cependant pas montrer de préférence pour Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 18 l‟une ou l‟autre forme (Shafti‐Keramat et al., 2003). Du fait de la prédominance des syndécanes dans les tissus épithéliaux et donc de leur haut niveau d‟expression au niveau de la cellule cible, ils pourraient servir de récepteur primaire (Elenius et al., 1991) (Figure 5 , étape 1). De plus, il a été montré in vitro, que les papillomavirus lient également des composés de la matrice extracellulaire sécrétés par les kératinocytes. Comme pour d‟autres virus, un récepteur secondaire serait requis et ce rôle serait tenu par l‟intégrine α6 (Culp et al., 2007) (Figure 5, étape 2). Les particules de papillomavirus sont internalisées lentement et ce, par un mécanisme dépendant de l‟endocytose par la voie des clathrines pour HPV16 (Day et al., 2003 ; Culp et Christensen, 2004) (Figure 5, étape 3). Cependant, ce mode d‟entrée ne semble pas être conservé entre les différents types d‟HPV (Sapp et Day, 2009). Le transfert de l‟ADN viral au noyau est alors facilité par la protéine mineure de la capside L2 et par le démantèlement des ponts disulfures intra‐capsomérique dans l‟environnement réducteur de la cellule (Li et al., 1998). I.1.5.2. Phase de maintenance Suite à l‟endocytose des particules virales au sein de l‟épithélium, le génome viral est maintenu sous forme épisomique dans les cellules basales. Deux protéines virales précoces vont jouer un rôle clé dans ce processus : les protéines E1 et E2 (Wilson et al., 2002). En se liant à l‟origine de réplication virale, elles vont permettre le recrutement de la machinerie réplicative cellulaire de l‟hôte et leur expression va faciliter la ségrégation des génomes au cours de la division cellulaire. La protéine E1 est une hélicase ATP‐dépendante dont l‟activité est essentielle à la réplication du génome virale. Son recrutement au niveau de l‟origine virale va être dépendant de la liaison préalable de la protéine E2. Suite à cette interaction, E1 va lier les protéines cellulaires nécessaires à la réplication, incluant la RPA (Replication Protein A), l‟ADN polymérase α primase (Han et al., 1999; Loo et Melendy, 2004). La protéine E2 joue plusieurs rôles durant la production virale. Ainsi, dans les cellules basales, son expression est requise pour initier la réplication virale et la ségrégation des chromosomes. E2 est une protéine de liaison à l‟ADN qui reconnaît les motifs palindromiques présents dans la LCR du génome (Dell et al., 2003). L‟ADN de HPV16 contient quatre motifs de liaison à E2 au niveau de sa région LCR. Deux de ces motifs bordent l‟origine de réplication virale et servent au recrutement de la protéine E1. E2 intervient également dans l‟ancrage du génome viral au chromosome mitotique et dans Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 19 la ségrégation des chromosomes viraux (Wu et Chiang, 2007). De plus, en tant que facteur de transcription, elle régule l‟expression des protéines E6 et E7 en modulant l‟activité de leur promoteur. A forte concentration, E2 agit comme un répresseur en empêchant la fixation d‟autres facteurs de transcription (Bouvard et al., 1994). E2 interagit également avec les deux oncoprotéines E6 et E7 (Gammoh et al., 2009). Exprimées à partir du promoteur précoce, les protéines E1 et E2 participent ainsi au contrôle du nombre de copies du génome viral dans les cellules différenciées. I.1.5.3. Phase de prolifération L‟entrée du papillomavirus dans la cellule hôte est suivie d‟une période d‟hyperprolifération des cellules de l‟épithélium supra‐basal. Les oncogènes E6 et E7 seraient responsables de cette croissance. Ainsi, au cours de l‟infection, l‟activité de ces gènes permet à quelques cellules de la couche basale de se diviser afin de former une couche de cellules entretenant le virus sous forme épisomique. Dans les épithéliums sains, les cellules de la couche basale migrent vers les couches supra‐basales. Elles quittent alors le cycle cellulaire et débutent un processus de différenciation terminal afin de produire une barrière de protection. Au sein de kératinocytes infectés par HPV, ce processus de différenciation n‟a pas lieu et le cycle cellulaire est maintenu (Sherman et al., 1997). Le mécanisme par lequel les papillomavirus stimulent la progression du cycle cellulaire est très bien connu et est similaire à d‟autres virus tumorigènes. Il implique les deux oncoprotéines E6 et E7. La liaison de E7 à la protéine pRb et la dégradation de sa forme hypophosphorylée induit une libération du facteur de transcription E2F, qui peut alors transactiver les protéines cellulaires requises pour la réplication virale et cellulaire telles que les cyclines A et E. La protéine E7 s‟associe également à d‟autres protéines impliquées dans la prolifération cellulaire, telles que les histones dé‐acétylases, les inhibiteurs des kinases dépendantes des cyclines p21 et p27 et le complexe de transcription AP1 (Activating Protein 1). Durant le processus naturel d‟infection, la propriété d‟E7 à induire la prolifération cellulaire est cependant inhibée dans de nombreuses cellules, de manière dépendante du taux de p27 et p21. En effet, un haut niveau d‟expression de ces protéines dans les kératinocytes différenciés conduit à la formation d‟un complexe E7‐cycline E inactif (Funk et al., 1997). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 20 Les fonctions d‟E6 sont complémentaires à celles d‟E7 au sein des HPV de haut risque (Stacey et al., 2000). La principale fonction d‟E6 est de lier la protéine suppresseur de tumeur p53 et d‟induire sa dégradation par le système du protéasome empêchant ainsi l‟entrée des cellules en apoptose. Ce rôle anti‐apoptotique est renforcé par son interaction avec les protéines Bak (Bcl2‐homologous Antagonist Killer) ou Bax (Bcl2‐ activated X) (Thomas et Banks, 1998). E6 possède également un rôle dans l‟hyperprolifération indépendamment d‟E7. Cette activité est portée par son extrémité Cterminale qui constitue un motif de liaison aux protéines à domaine PDZ. La liaison d‟E6 à certaines protéines à domaine PDZ va entrainer une prolifération des cellules supra‐basales ce qui contribue au développement des tumeurs métastasiques par perturbation de l‟adhérence cellulaire (Nguyen et al., 2003). I.1.5.4. Phase d’amplification Les évènements qui vont déclencher l‟amplification du génome viral sont peu connus mais ils semblent dépendre de changements dans l‟environnement cellulaire lors de la migration des cellules vers la surface de l‟épithélium. L‟activation des promoteurs dépendants de la différenciation conduit à une expression accrue des protéines virales nécessaires à la réplication, c'est‐à‐dire E1 à E5. En effet, bien que les protéines E1 et E2 jouent un rôle essentiel, les protéines E4 et E5 sont également importantes. E5, protéine transmembranaire, s‟associe aux pompes à protons ATPases et retarde le processus d‟acidification endosomal (Hwang et al., 1995). Cela va affecter le recyclage des récepteurs aux facteurs de croissance et induire une augmentation de la voie de signalisation issue des récepteurs à l‟EGF (Epidermal Growth Factor), contribuant ainsi au maintien des conditions favorables à la réplication. E4 s‟accumule dans la cellule au moment de l‟amplification virale mais son rôle n‟est pas encore défini. Une partie des effets connus d‟E4 serait liée à sa capacité d‟association au complexe cycline B‐cdk2 (cyclin dependent kinase 2) ce qui induit un arrêt du cycle à la transition G2/M (Davy et al., 2005 et 2006). Elle agirait donc comme un antagoniste d‟E7. Ainsi il a été suggéré que l‟expression continue d‟E7 dans une cellule exprimant fortement E4 entraine le maintien de la phase S et l‟accumulation de génomes viraux. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 21 I.1.5.5. Phase d’assemblage La dernière phase du cycle virale va consister en l‟assemblage de particules virales et à leur libération à la surface de l‟épithélium. Les deux protéines de structure L1 et L2 sont exprimées uniquement dans les cellules exprimant E4 et dans des tissus où la phase d‟amplification virale est terminée (Doorbar et al., 1997). Les évènements liant l‟amplification à l‟assemblage des particules ne sont pas encore connus mais dépendent de changements dans l‟épissage des ARN messagers. Le génome viral doit être inclus dans une capside icosaédrique contenant 360 copies de L1 et 12 copies de L2 (Modis et al., 2002). Dès son expression, la protéine L2 s‟accumule avec E2 au niveau de structures nucléaires : les PML (ProMyelocytic Leukemia) (Florin et al., 2002). L‟assemblage des particules virales va avoir lieu lorsque les capsomères de L1 vont pénétrer dans le noyau et être recrutés par L2 au sein des PML. L‟accumulation de protéines de capside à leur niveau faciliterait ainsi l‟assemblage des particules. Bien que des particules virales puissent être assemblées en l‟absence de L2, sa présence augmente l‟efficacité d‟encapsidation (Stauffer et al., 1998; Zhou et al., 1993). Du fait de la nature non lytique du papillomavirus, la libération des particules virales ne survient que lorsque les cellules infectées atteignent la surface de l‟épithélium. Cette rétention des particules virales limite la détection des particules virales par le système immunitaire (Ashrafi et al., 2002). I.1.5.6. Intégration et carcinogénèse L‟un des évènements majeurs conduisant au développement tumoral est l‟intégration du génome viral au sein du chromosome de la cellule hôte. Dans les cellules infectées, le génome viral peut être retrouvé soit sous forme épisomique, soit sous forme intégrée, plus stable ou un mélange des deux (Doorbar, 2006). L‟intégration virale se fait généralement au niveau des régions E1 ou E2 en aval d‟E6 et E7 et conduit à une linéarisation du génome. Dans ce cas, la perte de l‟expression d‟E2 induit une perte du contrôle négatif qu‟elle exerce sur le promoteur précoce. Les oncoprotéines E6 et E7 voient alors leur stabilité et leur expression augmentées. Les sites d‟intégration sont distribués au hasard dans le génome de la cellule hôte (Ziegert et al., 2003), avec malgré tout une certaine préférence pour des régions dites fragiles (Thorland et al., 2000; Wentzensen et al., 2004). Ainsi, par exemple, l‟intégration peut survenir sur le chromosome 8q4 (région FRA8C) proche du locus du proto‐oncogène c‐myc. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 22 Le mécanisme moléculaire conduisant à l‟intégration de l‟ADN viral dans le génome cellulaire reste peu exploré. En effet, il ne s‟agit pas d‟une conséquence du cycle viral mais elle est détectable dans 90 % des cancers cervicaux. Il a été montré que les kératinocytes cervicaux contenant des formes intégrées de HPV apparaissent après une diminution de l‟expression d‟E2. La perte de l‟expression épisomale d‟E2 est associée à l‟activation endogène de l‟antigène viral et est accélérée par l‟interféron β exogène. Elle conduit à une surexpression des deux oncogènes E6 et E7 dans les cellules contenant la forme intégrée du génome (Thorland et al., 2000). De plus, l‟expression dérégulée des deux oncoprotéines peut induire une instabilité chromosomique en termes de nombre ou de structure. Cela augmente potentiellement l‟accumulation de changements génétiques cellulaires ou épigéniques. Ces altérations conduisent à l‟activation des oncogènes et à la répression de gènes suppresseurs de tumeur. La population cellulaire acquiert alors la capacité de proliférer et d‟être immortalisée ce qui favorise sa progression vers un phénotype malin. In vitro, l‟expression d‟E6 et E7 d‟HPV de haut risque est capable d‟induire l‟immortalisation de kératinocytes primaires. Les E7 d‟HPV de haut risque et de bas risque vont être capables de se lier au la protéine suppresseur du rétinoblastome pRb mais l‟affinité sera beaucoup plus faible dans le cas des HPV de bas risques. Au sein des cellules saines, la progression du cycle cellulaire est régulée par la protéine pRb sous sa forme hypophosphorylée qui est capable d‟interagir avec le facteur de transcription E2F. Lors de la phase G1, la protéine Rb est progressivement phosphorylée par les kinases dépendantes des cyclines (CDK). Une fois hyperphosphorylée, pRB ne peut plus lier E2F. Le facteur de transcription ainsi libéré peut activer la transcription des gènes impliqués dans la poursuite du cycle cellulaire. Au sein des cellules infectées par HPV, E7 interagit avec pRb sous forme hypophosphorylée et empêche la liaison à E2F. E2F est active de manière constitutive et le cycle cellulaire n‟est plus soumis à un contrôle. Cette activation est de plus renforcée par la stabilisation des complexes cyclines A et E/ CDK et par l‟inhibition de CDK p21 et p27. I.1.6. Propriétés biologiques des protéines des HPV Les protéines précoces interviennent dans la réplication virale (E1, E2 et E4) ou dans les processus de transformation cellulaire (E5, E6 et E7). L1 et L2 sont les protéines de structure de la capside. Lorsqu‟elle est exprimée in vitro, seule ou en association avec L2, la protéine L1 s‟auto-assemble pour former des pseudo-particules virales. Les protéines de structure L1 et L2, permettant l‟assemblage des particules virales et l‟encapsidation de l‟ADN viral, sont Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 23 exprimées dans les zones différenciées plus ou moins kératinisées selon l‟épithélium. La protéine E4, responsable des modifications du cytosquelette associées au trafic intracellulaire des constituants viraux, est exprimée tout au long de la différenciation cellulaire (Alain et al., 2010). Les principales propriétés biologiques des protéines des papillomavirus à haut risque codées par les différentes POL (Monsonégo, 2006 et 2007) sont résumées dans le tableau III. Tableau III : Principales propriétés biologiques des protéines des HPV (Monsonégo, 2006 ; 2007) Protéines HPV à bas risque HPV à haut risque E1 Activation de la réplication de l‟ADN viral Localisation nucléaire : activation de la réplication de l‟ADN viral en synergie avec E1 E2 Répression de la transcription de E6 et E7 Localisation cytoplasmique : induction d‟apoptose, d‟instabilités génomiques E3 Pas de fonction connue E4 Maturation des virions Stimulation de la prolifération cellulaire : recyclage des récepteurs à l‟EGF et au PDGF E5 Inhibition de l‟expression membranaire du CMH de classe I Liaison à p53 : répression de son activité transcriptionnelle E6 Protéine oncogène, favorise la dégradation de p53 par le protéasome Liaison à p130 : favorise l‟entrée en cycle des cellules E7 Protéines oncogène, favorise la dégradation de la protéine de susceptibilité au rétinoblastome p105Rb (tumeur maligne de la rétine) E8 Pas de fonction connue L1 Protéine majeure de capside ; auto-assemblage si in vitro L2 Protéine mineure de capside Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 24 I.1.7. Mécanisme infectieux Les HPV pénètrent les épithéliums à la faveur de microlésions ou de traumatismes, lors de rapports sexuels par exemple, et infectent les cellules de la couche basale au niveau de la zone de remaniement. Le cycle viral peut ensuite évoluer selon trois différents scénarios : soit vers une infection productive avec excrétion virale, soit vers une infection latente, soit vers une intégration du génome viral conduisant aux lésions précancéreuses et au cancer. Même si les facteurs déterminant l‟évolution du cycle sont méconnus, il semble que le cycle soit étroitement lié à l‟état de différenciation de l‟épithélium (Alain et al., 2010) . Lors de l‟infection, le virus pénètre dans les cellules par endocytose. Le transport cytosolique se fait par les réseaux de microtubules et de filaments d‟actine jusqu‟au noyau. Puis, la translocation de l‟ADN des HPV dans le noyau cellulaire nécessite le démantèlement de la capside virale. La carcinogenèse du col de l‟utérus liée aux HPV a toujours comme point de départ l'infection des cellules basales de la jonction endocol-exocol. Le virus HPV infecte les cellules basales de l‟épithélium cervical. Leur différenciation progressive les fait migrer vers la surface et cette différenciation est nécessaire à la reproduction intracellulaire du virus. Intégration du génome viral dans la cellule basale Le génome de l‟HPV est une double hélice d‟ADN de 8 kilo bases, qui se maintient dans les cellules sous forme d‟un épisome, sur un seul brin de l‟ADN de l‟hôte. Il existe plusieurs sites de transcription de gènes variés s‟exprimant de façon précoce (Early) ou tardive (Late) lors de l‟infection. Lors de l‟intégration du génome viral, l'ADN viral circulaire s'interrompt au niveau du gène E2 et s'intègre au génome de la cellule-hôte, ce qui induit une dérépression des gènes E6 et E7 de l'HPV, lesquels inactivent les protéines p53 et pRb de la cellule-hôte, protéines impliquées dans le contrôle de la prolifération cellulaire et de l'apoptose. La protéine codée par le gène E6 se lie à la protéine p53, empêchant son activité de gardien du génome. De même, la protéine codée par le gène E7 se lie à la protéine pRb (du rétinoblastome) empêchant son activité habituelle de régulateur de la division cellulaire La protéine codée par le gène E5 modifie la dégradation des récepteurs EGF après activation, entretenant ainsi la stimulation qu'ils ont engendrée. La protéine codée par le gène E2 se fixe Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 25 au niveau du segment LCR de l‟ADN viral, augmentant considérablement sa transcription. Enfin, la protéine codée par le gène E1 favorise la multiplication virale. I.1.8. Epidémiologie des infections à HPV et des maladies liées à ces virus L‟infection à HPV constitue l‟infection sexuellement transmissible (IST) la plus fréquente au monde, avec 660 millions de personnes infectées selon l‟Organisation Mondiale de la Santé (OMS, 2007). Dans le monde, le cancer invasif du col de l‟utérus est responsable de plus de 275 000 décès par an dont 88% surviennent dans les pays à ressources limitées. En Afrique sub-saharienne, le cancer invasif du col de l‟utérus est le plus fréquent des cancers chez la femme avec plus de 75 000 nouveaux cas et plus de 50 000 décès par an (Ferlay et al., 2010). En Afrique, la prévalence de l‟infection à HPV atteint 21,3 % avec des variations notables en fonction des régions : 33,6 % en Afrique de l‟Est, 21,5 % en Afrique de l‟Ouest et 21 % en Afrique australe (WHO/ICO, 2009). Les estimations récentes indiquent que chaque année, 1230 femmes sont diagnostiquées positives au cancer du col et 838 d‟entre elles en mourront ; au Bénin, 925 femmes sont diagnostiquées positives au cancer du col et 616 d‟entre elles en mourront (WHO/ICO, 2010). La figure 6 illustre la répartition géographique des HPV dans le cancer du col de l‟utérus montrant la prédominance du HPV 16. Prévalence des HPV dans les prélèvements cervicaux féminins: A partir d‟une méta-analyse, il a été estimé la prévalence ajustée des HPV dans le monde chez les femmes présentant des résultats cytologiques normaux à 11,7% (intervalle de confiance (IC) à 95%: 11,6-11,7%) (Bruni et al., 2010). La plus forte prévalence ajustée a été observée dans certaines régions d‟Afrique subsaharienne (24%; IC à 95%: 23,1-25,0%), en Amérique latine et dans les Caraïbes (16,1%; IC à 95%: 15,8-16,4%), en Europe orientale (14,2%; IC à 95%: 14,1-14,4%) et en Asie du Sud-Est (14%; IC à 95%: 13,0-15,0). Néanmoins, la prévalence des HPV ajustée par pays dans les échantillons cervicaux variait de 1,6% à 41,9% à travers le monde. La prévalence des HPV selon l‟âge culminait dans les tranches d‟âge les plus jeunes (<25 ans), avec des valeurs de 21,8% (IC à 95%: 21,3-22,3%) pour le chiffre brut et de 24,0% (IC à 95%: 23,5-24,5%) pour le chiffre ajusté, puis atteignait un plateau plus bas aux âges moyens. En Amérique centrale et en Amérique du Sud, une augmentation de cette prévalence dans les tranches d‟âge Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 26 les plus vieilles (≥45 ans) a été attestée. Dans certains pays à faible revenu d‟Asie et d‟Afrique, la prévalence du HPV reste très similaire chez les femmes dans toutes les tranches d‟âge (Smith et al., 2007). Les HPV de types 16 et 18 étaient les plus fréquents à l‟échelle mondiale. Le HPV 16 était le plus courant sur l‟ensemble des régions et le HPV 18 ainsi que les autres types oncogènes 31, 39, 51, 52, 56, 58 et 59 présentaient une prévalence analogue et faisaient partie des types les plus courants après le HPV 16 (Bruni et al., 2010) Les femmes infectées par un type donné de HPV peuvent être co-infectées ou infectées ultérieurement par plusieurs autres types, capables de provoquer des lésions du col. (Insinga et al., 2007). Prévalence du HPV chez l’homme Une revue systématique des données sur les infections à HPV génitales chez les hommes en Afrique subsaharienne a constaté que la prévalence de ces virus, quel qu‟en soit le type, se situait entre 19,1 et 100% (Olesen et al., 2014). La prévalence poolée estimée d‟un HPV de type quelconque était de 78,2% (IC à 95%: 54,291,6%) chez les hommes positifs pour le virus de l‟immunodéficience humaine (VIH) et de 49,4% (IC à 95%: 30.4-68.6%) parmi ceux négatifs pour le VIH (p=0,0632). Aucune tendance claire en fonction de l‟âge n‟a été observée. Les types de HPV à haut risque les plus courants étaient le HPV-16 et le HPV-52, tandis que le type à faible risque le plus fréquent dans la population générale était le HPV-6. Une revue systématique portant sur la prévalence de l‟ADN des HPV génitaux chez l‟homme a examiné des données se limitant généralement aux hommes ayant plus de 18 ans vivant en Europe ou en Amérique du Nord (Smith et al., 2011). La prévalence estimée des HPV chez l‟homme atteignait un maximum à des âges légèrement plus vieux que chez la femme et restait constante ou en faible diminution avec la progression en âge. Elle était élevée dans toutes les régions, mais variait de 1 à 84% chez les hommes à faible risque et de 2 à 93% chez les hommes à haut risque (hommes se présentant dans les dispensaires antivénériens, séropositifs pour le VIH ou partenaires de femmes présentant une infection à VIH ou une cytologie anormale, par exemple). Les plus fortes valeurs de la prévalence ont été relevées chez les hommes positifs pour le VIH et ayant des rapports sexuels avec d‟autres hommes. Les infections à HPV anales sont très courantes chez les hommes ayant des rapports avec des personnes du même sexe et sont presque universellement présentes chez ceux qui, en outre, sont infectés par le VIH (Schim et al., 2014). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 27 Un essai clinique multicentrique (mené dans 18 pays d‟Afrique, de la région Asie-Pacifique, d‟Europe, d‟Amérique latine et d‟Amérique du Nord) a étudié la prévalence de référence des infections à HPV péniennes, scrotales et périnéales/péri-anales chez l‟homme hétérosexuel. La prévalence des HPV, tous types confondus, était de 18,7% au niveau du pénis, de 13,1% pour le scrotum, de 7,9% dans la région périnéale/péri-anale et de 21,0% en un site quelconque. La plus forte prévalence des HPV chez l‟homme était enregistrée en Afrique, tandis que la plus faible prévalence de ces virus s‟observait chez les hommes de la région Asie-Pacifique. L‟âge n‟était pas associé à un risque de positivité pour les HPV des types 6, 11, 16, 18 ou de tout type testé. Avoir au moins 3 partenaires féminins sur la durée de vie était le facteur ayant la plus forte incidence sur la prévalence des HPV: odds ratio (OR) = 3,2 (IC à 95%: 2,1-4,9) pour les types 6, 11, 16 et 18 et OR = 4,5 (IC à 95%: 3,3-6,1) pour l‟ensemble des types de HPV testés (Vardas et al., 2011). Cancer du col de l’utérus associé au HPV chez la femme Il existe une association forte entre une infection persistante par un HPV appartenant à un génotype oncogène à haut risque et l‟apparition d‟un cancer du col (Walboomers et al., 1999 ; Bosch et al., 2002). Le risque de voir apparaître un carcinome épidermoïde est environ 400 fois plus important après une infection par le HPV 16 et près de 250 fois plus grand après une infection par le HPV18 que chez une femme non infectée (De Sanjose et al., 2010). Le HPV 16 et le HPV 18 ont été les types de HPV les plus couramment impliqués dans le cancer du col utérin invasif sur la période 1940-2007, sans variation statistiquement significative de leurs contributions relatives ajustées entre les intervalles 1940-1959 et 20002007 (contribution du HPV 16 passant de 61,5 à 62,1% et contribution du HPV 18 passant de 6,9 à 7,2%) (Alemany et al., 2014). Les types 16, 18, 45, 31, 33, 52 et 58 sont responsables d‟approximativement 90% des carcinomes épidermoïdes positifs pour l‟ADN du HPV (De Sanjose et al., 2010). Si l‟infection par un HPV oncogène d‟un type à haut risque est la cause sous-jacente de presque tous les cas de cancer du col utérin, de telles infections n‟entraînent pas toujours un cancer. La plupart des femmes infectées par un HPV à haut risque ne développent pas pour autant un cancer car la majorité de ces infections, ont une durée de vie courte et le virus s‟élimine habituellement spontanément en l‟espace de 2 ans. Les infections par des HPV à haut risque ne persistent que chez un faible pourcentage des femmes; seule une fraction réduite de ces infections chroniques évolue vers un pré-cancer et parmi ces pré-cancers, un nombre encore plus faible vers un cancer invasif. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 28 La grande majorité (<80%) des cas de cancer du col apparaissent dans les régions les moins développées, où ils représentent près de 12% des cancers féminins. Les régions à haut risque, avec des taux de cancer du col estimés standardisés selon l‟âge > 30 pour 100 000, sont notamment l‟Afrique orientale (42,7), la Mélanésie (33,3), l‟Afrique septentrionale (31,5) et l‟Afrique centrale (30,6). Les valeurs les plus basses sont atteintes en Australie/NouvelleZélande (5,5) et en Asie occidentale (4,4). On estime à 266000 le nombre de décès par cancer du col survenus dans le monde en 2012, ce qui représente 7,5% des décès féminins par cancer. Les taux de mortalité varient d‟un facteur allant jusqu‟à 18 entre les différentes régions du monde, passant de <2 pour 100000 femmes dans les pays industrialisés à >20 pour 100000 femmes dans certains pays en développement (WHO, 2014). Des programmes de dépistage convenablement mis en œuvre contribuent à la faible mortalité relevée dans certains pays. Les taux de mortalité plus élevés dans certains autres pays sont dus au moins en partie à une co-infection par le VIH ou d‟autres infections sexuellement transmissibles (IST). Maladies associées aux HPV chez l’homme et la femme Les infections anogénitales par un HPV peuvent entraîner des cancers malins ou des tumeurs cutanées ou mucosales bénigne, dont des condylomes ano-génitaux chez les individus des deux sexes. Même si des HPV de types très divers peuvent être à l‟origine de condylomes ano-génitaux, les types 6 et 11 sont responsables de jusqu‟à 90% des cas (Greer et al., 1995 ; Sturegard et al., 2013). Une revue systématique a constaté que l‟incidence globale (pour les hommes et les femmes) annuelle rapportée des condylomes ano-génitaux (nouveaux et récurrents) allait de 160 à 289 pour 100000, avec une valeur médiane de 194,5 pour 100000. L‟incidence médiane annuelle des nouveaux condylomes ano-génitaux était estimée à 137 pour 100 000 chez les hommes et à 120,5 pour 100000 chez les femmes (Patel et al., 2013). L‟infection par certains types spécifiques de HPV est aussi la cause d‟une fraction des cancers de l‟anus, de l‟oropharynx, de la vulve, du vagin et du pénis. Les taux d‟incidence de ces cancers sont beaucoup plus bas que ceux du cancer du col utérin (incidence mondiale estimée du cancer anal de 1 pour 100 000 environ, avec 27000 cas par an) (de Martel et al., 2012). La plupart des cancers épidermoïdes de l‟anus (80%) sont dus à un HPV, notamment le HPV16 (WHO, 2014). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 29 Figure 6 : Répartition géographique des HPV dans le cancer du col de l’utérus montrant la prédominance du HPV 16 (Alain et al., 2010) I.1.9. Tests HPV Il a été clairement établi que les HPV dits à haut risque sont responsables des lésions précancéreuses et du cancer du col de l‟utérus. Il s‟est révélé important de rechercher l‟ADN de ces virus par un test biologique. Ce test HPV utilise actuellement l‟Hybrid capture®2 ou la PCR. Il est simple, reproductible et objectif. En association avec le frottis cervico-utérin (FCU), le test HPV permet d‟augmenter (Blanc, 2005) : la valeur prédictive négative (VPN) (99 %) pour les lésions de haut grade. Ceci signifie que si le test est négatif sur un frottis (absence d‟HPV), on peut affirmer en toute sécurité qu‟il n‟y a pas de lésions précancéreuses, ce que le test FCU seul ne permet pas. Il permet également d‟augmenter la sensibilité (≥ 95 % contre moins de 66 % pour le FCU seul) du frottis pour les lésions de haut grade ou précancéreuses, c‟est-à-dire que si le test HPV est positif, on ne peut méconnaître une lésion précancéreuse. Le test HPV n‟est pas encore utilisé en routine dans cette association. I.1.9.1. La méthode PCR (Polymerase Chain Reaction) La PCR (Polymerase Chain Reaction) ou réaction de polymérisation en chaine est une technique d‟amplification d‟ADN in vitro. Elle permet d‟obtenir un très grand nombre de Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 30 copies d‟une séquence d‟ADN choisie. Chaque cycle de PCR est constitué de trois étapes : la dénaturation, l‟hybridation des amorces aux extrémités de la séquence recherchée puis une élongation grâce à l‟action d‟une ADN polymérase. Ce cycle est répété un grand nombre de fois pour obtenir une multiplication exponentielle de la séquence d‟ADN cible. Elle est très sensible et correspond à la technique de référence pour le diagnostic de l‟infection au HPV. C‟est une technique qui est d‟une grande sensibilité et demande donc une mise en œuvre très rigoureuse pour éviter des contaminations, sources de faux positifs. La PCR peut permettre deux types de diagnostics : un diagnostic d‟infection à HPV sans précision du type ou du groupe. Dans ce cas, les amorces (“primers”) utilisées portent un matériel génétique commun aux différents HPV (ex : primers les plus utilisés : MY09/MY11 ; GP5+/GP6+ et SPF) ; et un diagnostic de type ou génotypage où des primers spécifiques sont utilisés. La PCR peut être pratiquée sur un matériel cellulaire frais ou conservé dans une solution de transport ou de fixation. La PCR en temps réel est très sensible pour la détection de l‟ADN du HPV (Arney, 2010). Tous les systèmes de PCR en temps réel reposent sur la détection et la quantification d‟un émetteur fluorescent pendant le processus d‟amplification et l‟augmentation du signal d‟émission fluorescente est directement proportionnelle à la quantité d‟amplicons produits durant la réaction. Il existe deux principes généraux pour la détection quantitative des amplicons : les agents se liant à l‟ADN double brin et les sondes fluorescentes (Poitras, 2002). I.1.9.2. La méthode par capture d’hybrides Cette méthode consiste à capturer sur les parois d‟un micro-puits des hybrides d‟ADN de virus HPV présents dans le milieu étudié et d‟ARN complémentaires. Cette technique est commercialisée sous le nom d‟Hybrid Captur®2 par le laboratoire Digene. Principe : Les hybrides du milieu sont reconnus par des anticorps anti-hybrides. Un second anticorps couplé à une phosphatase alcaline reconnaît le premier anticorps. La phosphatase alcaline réagit avec un substrat luminescent et la détection se fait par chimioluminescence. L‟intensité du signal luminescent correspond à l‟abondance de virus dans le milieu. On estime la charge virale en fonction de cette intensité en RLU ou Relative Luminescence Unit. Le seuil de positivité correspond à 1 RLU soit 1 picogramme d‟ADN viral par millilitre. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 31 I.1.9.3. L’hybridation in situ sur des frottis cellulaires ou des coupes histologiques Elle se fait sur des cellules isolées déposées sur des lames ou sur des coupes tissulaires à partir de prélèvements obtenus par la méthode conventionnelle ou en milieu liquide. Principe : les doubles hélices d‟ADN de l‟échantillon sont dissociées par chauffage. Elles sont déposées sur une préparation d‟un excès d‟ADN viral monocaténaire marqué. Puis, on ré-apparie les brins d‟ADN complémentaires, on rince pour éliminer les dépôts non spécifiques et enfin, on révèle la présence des brins d‟ADN marqués par une réaction colorimétrique. D‟après cette méthode, si on obtient un marquage nucléaire en grains “dot”, cela correspond à l‟intégration du matériel viral dans le génome de l‟hôte. Si on a un marquage diffus du noyau plus intense, cela correspond à une réplication virale abondante. Cette technique est commercialisée sous le nom d‟Inform®-HPV par la firme Ventana. I.1.9.4. Méthode par détection des ARNm des protéines E6 et E7 Un nouveau test basé sur la détection des ARNm des oncoprotéines E6 et E7 a été développé (NucliSENS EasyQ® HPV, Biomérieux). Ce test présenterait l‟avantage de détecter directement l‟activité oncogénique des HPV, mais son utilisation clinique n‟est pas encore validée. I.1.9.5. Les autres méthodes virologiques La culture des HPV est très difficile. La microscopie électronique et la détection directe d‟antigènes manquent de sensibilité. La sérologie utilise des tests ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) et des techniques de “Western blot” pour la recherche d‟anticorps spécifiques des différents types de HPV. Tous ces examens restent du domaine de la recherche. I.1.10. Persistance ou clairance de l’infection aux HPV Tous les HPV sont à l‟origine de lésions ou proliférations de bas grade. Au contraire, les lésions de haut grade et les cancers invasifs sont majoritairement associés à la présence d‟HPV à haut risque oncogène (Alain et al., 2010) . Au niveau des muqueuses, la survenue Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 32 d‟une lésion de haut grade ou d‟un cancer est en général précédée de l‟apparition d‟une lésion de bas grade, que ce soit au niveau des muqueuses génitales ou des muqueuses oropharyngées (Syrjanen, 2005 ; Snijders et al., 2006 ; Alain et al., 2010) . Si la persistance de l‟infection par un HPV est un facteur indispensable de l‟évolution vers un cancer, l‟infection par un HPV à haut risque et l‟existence de cofacteurs liés au terrain est un phénomène fondamental dans la genèse des cancers liés à ces virus. Les déterminants de la persistance sont à la fois viraux (type ou variant, charge virale, intégration de l‟ADN et caractéristiques des protéines E6 et E7) et liés au terrain (réponse immune, génétique, cocarcinogènes). Au niveau du col utérin, la grande majorité des HPV est éliminée spontanément en un à deux ans. Les études de cohortes montent que 10% seulement des infections par un HPV muqueux génital progressent vers une lésion de haut grade et un cancer, et ce en 10 à 20 ans (Mougin et al., 2006 ; Howley et Lowy, 2007). Dans certains cas cependant, la période d‟évolution entre dysplasie légère et lésion de haut grade peut être courte, d‟un à deux ans, et certaines lésions peuvent s‟avérer d‟emblée de haut grade, évoluant très rapidement vers un cancer (Woodman et al., 2001) (figure 5). I.1.10.1. Facteur viraux Le type viral est un élément essentiel de l‟évolution vers un cancer. L‟infection par un HPV à haut risque oncogène est un élément fondateur de la carcinogénèse. Toutefois, le potentiel oncogène diffère entre ces virus. Dans les infections par des HPV muqueux, quelle que soit la région du globe, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, et 58 sont les plus présents dans les lésions précancéreuses et les cancers du col (Clifford et al., 2006 ; Jacquard et al., 2009). L‟infection par un HPV 16, 18, 31 ou 33 est un facteur de risque d‟évolution d‟une lésion de bas grade vers une lésion de haut grade, la présence d‟HPV 16 étant un facteur majeur d‟évolution défavorable dans les études prospectives (Khan et al., 2005). La fréquence de détection d‟HPV 16, et, à un moindre degré, celle d‟HPV 18 et d‟HPV 45 augmentent avec le degré de dysplasie pour être maximales dans les cancers, alors que la fréquence relative des autres types diminue, témoignant de la capacité oncogène d‟HPV 16 (Clifford et al., 2006 ). En cas d‟immunodépression, chez les personnes infectées par le VIH ou chez les transplantés, on observe une diminution apparente de la prévalence du type 16 au profit d‟autres types, dont le pouvoir oncogène est favorisé par l‟immunodépression (Strickler et al., 2003). Les types à haut risque oncogène diffèrent des types non oncogènes par leur capacité de persistance, du fait de différences génétiques, conférant des propriétés transformantes accrues Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 33 aux protéines E6 et E7. En outre, certains variants oncogènes possèdent des mutations d‟échappement aux défenses immunitaires et aux barrières naturelles contre l‟infection. Par ailleurs, l‟étude comparée des HPV génitaux et des HPV cutanés montre que les mécanismes de progression vers un cancer diffèrent entre les HPV α et les HPV β. Au cours du cycle viral normal, la protéine E5, pour les HPV muqueux génitaux et la protéine E1, favorisent la persistance virale. E5 stimule la production de E6 et E7, et E1 permet la persistance de l‟ADN épisomal dans les cellules basales (Cote-Martin et al., 2008). Le maintien d‟une infection latente par certains types viraux après clairance de l‟infection productive pourrait expliquer la réapparition de l‟infection avec le même virus, observée dans les cohortes de femmes suivies plus de 10 ans. La sénescence de l‟immunité cellulaire et l‟immunodépression pourraient participer à ces réactivations, expliquant le pic d‟infection observé chez les femmes ménopausées ou la réapparition de l‟infection chez les sujets infectés par le VIH. Chez les HPV génitaux oncogènes, une protéine virale issue d‟un ARN transcrit codant une protéine de fusion entre E8 et E2 pourrait inhiber la réplication du génome viral et favoriser le maintien de la latence. I.1.10.2. Réponse immune L‟échappement viral à la réponse immune favorise la persistance virale. L‟étude des modèles animaux et l‟analyse des réponses immunes dans la genèse des cancers du col ont montré le rôle majeur de l‟immunité cellulaire dans la régression de l‟infection et la prévention des réinfections avec un même type viral. La réponse humorale par la présence d‟anticorps neutralisants, prévient l‟infection de nouveaux sites et les réinfections. La réponse immune est essentiellement spécifique de type, reflétant la nature spécifique de type des épitopes B et T. L‟existence d‟une protection croisée, observée cliniquement lors des essais vaccinaux, pourrait correspondre à la présence d‟épitopes communs à des types d‟HPV phylogénétiquement proches (HPV 16 et HPV 31). D‟une façon générale, la réponse immune contre les HPV au niveau des épithéliums est peu efficace. Les kératinocytes sont de mauvaises cellules présentatrices d‟antigènes et les cellules dendritiques sont peu nombreuses. Le déroulement intraépithélial du cycle viral, peu lytique avec une faible production des protéines virales et un relargage des virions uniquement en surface de l‟épithélium, ainsi que l‟absence de virémie, exposent peu le virus au système immunitaire, en particulier aux cellules de Langerhans et aux cellules dendritiques. La production de cytokines proThèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 34 inflammatoires est donc peu ou pas stimulée, ce qui favorise un état de tolérance immunitaire. Enfin, les protéines E6 et E7, notamment pour HPV 16, diminuent l‟expression des récepteurs de surface de type TLR 9 (Toll Like Receptor 9), reconnaissant les ADN viraux ou bactériens. S‟y associent l‟inhibition du système interféron par les protéines E6 et E7, la diminution par la protéine E5 de la présentation des antigènes par les molécules HLA de classe II, qui favorisent l‟échappement immunologique (Stern et al., 2005 ; Frazer, 2007 ; Howley et Lowy, 2007 ; Frazer, 2009 ; Einstein et al., 2009a). La réponse immune est donc modérée et retardée, ce qui favorise l‟installation et la persistance de l‟infection. Plusieurs observations illustrent l‟importance des réponses cellulaires : ainsi l‟élimination d‟une verrue conduit à l‟élimination des autres verrues, probablement par stimulation de l‟immunité par les virions relargués. Les traitements stimulant la réponse immunitaire T locale tels que l‟Imiquimod ont montré une efficacité dans le traitement des lésions cutanées et muqueuses (Winters et al., 2008). L‟altération des défenses immunitaires cellulaires, physiologique (grossesse, ménopause) ou acquise (infection par le VIH, tranplantation) augmente la persistance et la fréquence, non seulement des infections HPV à haut risque oncogène, mais aussi des infections bénignes, condylomes ou lésions cutanées (Palefsky, 2009; Kjaer et al., 2009). Dans les modèles animaux comme chez l‟Homme, les réponses cytotoxiques sont faibles ou indétectables dans les lésions cancéreuses. Au contraire, la régression des lésions est associée à une réponse cytotoxique et T helper intense, dirigée contre les protéines E1, E2, E6, E7 et L2 (Howley et Lowy, 2007 ; Einstein et al., 2009a). La dérégulation de la réponse cellulaire spécifique par les HPV associe l‟inhibition des réponses Th1 et Th2, l‟inhibition par E7 de l‟expression du transporteur TAP1 qui permet le chargement des peptides antigéniques sur les molécules HLA de classe I avant leur transfert vers la surface cellulaire, diminuant la présentation des antigènes et la réponse cytotoxique, l‟induction de cellules T CD4 régulatrices (Treg), favorisant la tolérance de l‟infection et sa persistance (Einstein et al., 2009a). La réponse humorale naturelle, dirigée contre plusieurs protéines virales (E6, E7, E2, L1, L2), est peu intense, avec des taux d‟anticorps circulant beaucoup plus faibles que ceux obtenus par la vaccination, y compris vis-à-vis de L1 protéine constitutive majeure du virion, et donc exposée au système immunitaire. Lors de l‟immunisation naturelle ou après administration de vaccins prophylactiques, les anticorps neutralisants, essentiellement dirigés contre L1, bloquent les sites de fixation du virus. Ils peuvent, dans le cas d‟une porte d‟entrée muqueuse, agir soit par transsudation soit par exsudation, au niveau de microlésions de l‟épithélium Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 35 (figure 7). La protection post-vaccinale contre les condylomes externes liés à HPV 11 et HPV 6, situés en zone non muqueuse suggère une protection suffisante obtenue par exsudation au niveau des microlésions. L‟importance clinique des anticorps neutralisants est également suggérée par la corrélation entre les génotypes HPV et les sérotypes neutralisés par différents anticorps. Cependant, l‟absence de tests standardisés de mesure de la réponse humorale, en particulier des anticorps neutralisants, ainsi que la possibilité d‟infections antérieures inaperçues, rendent difficile l‟appréciation de la réponse humorale efficace en situation clinique (Hantz et al., 2006). Le développement de vaccins prophylactiques repose sur l‟instauration d‟une mémoire immunitaire à la suite de la vaccination. Des incertitudes demeurent sur les mécanismes de la protection « mémoire » au cours de l‟infection naturelle. L‟absence de virémie et le caractère localisé de l‟infection ne sont pas en faveur d‟une réponse anamnestique, même si un rappel vaccinal survenant des années après la vaccination entraîne une remontée très rapide et à un niveau très élevé d‟anticorps. La présence d‟anticorps neutralisant sur le site au moment de l‟exposition pourrait constituer un mécanisme important dans la protection, mais le mécanisme de protection n‟est pas complètement élucidé. I.1.10.3. Spécificité génétique de l’hôte et persistance virale Le polymorphisme génétique du système immunitaire de l‟hôte, en particulier le polymorphisme HLA de classe II, influence la réponse immune, la persistance virale et la survenue de tumeurs, vraisemblablement en rapport avec le type viral ou certains variants viraux. Ainsi le CRPV, responsable de tumeurs bénignes chez le lapin « cottontail » (sauvage), provoque des cancers chez le lapin domestique et la survenue de cancers chez le lapin sauvage est étroitement liée au polymorphisme de classe II. De même, les patients ayant développé un cancer lié aux HPV ont un risque plus élevé de développer un cancer lors d‟une réinfection. Le phénomène de restriction allélique HLA II pourrait jouer un rôle important dans l‟adéquation de la réponse immune à certains variants HPV expliquant pourquoi parmi deux variants HPV 16 différant par le polymorphisme des protéines E6 et E7, l‟un persiste et l‟autre non. Des variants d‟échappement HPV16 portant des mutations dans un épitope T HLA B7 restreint ont été retrouvés dans les lésions cancéreuses de femmes porteuses de l‟allèle HLA B7 (Ellis et al., 1995 ; Einstein et al., 2009 b). D‟autres gènes peuvent être Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 36 impliqués en plus du polymorphisme HLA de classe I et II : les allèles Tap1, Tap2 et KIR notamment (Hildesheim et Wang, 2002 ; Cao et al., 2005 ; Einstein et al., 2009 b) influencent la protection ou la survenue de dysplasies cervicales ou de cancers du col. Les maladies génétiques favorisant les infections HPV illustrent bien la spécificité génétique de l‟hôte. L‟épidermodysplasie verruciforme en particulier confère une sensibilité particulière à certains types d‟HPV, sans être associée à un déficit immunitaire qui favoriserait d‟autres infections virales. Elle constitue un modèle d‟étude spécifique des HPV cutanés, qui a permis de mettre récemment en évidence l‟existence d‟une défense naturelle contre les HPV cutanés via le contrôle du métabolisme du zinc, impliqué dans la transcription et la réponse immune, par les protéines EVER (Lazarczyk et al., 2009). Cette barrière serait défectueuse du fait de mutations des gènes EVER au cours de l‟épidermodysplasie verruciforme. Chez les HPV muqueux génitaux, la protéine E5 dégrade les protéines EVER et permet de contourner cette barrière naturelle. D’autres facteurs peuvent favoriser la persistance virale L‟influence de cofacteurs exogènes peut favoriser l‟évolution vers un cancer. L‟administration d‟un cocarcinogène alimentaire au bétail infecté par un Bovine papillomavirus 1 (BPV-1) normalement non carcinogène provoque l‟apparition de cancer de l‟œsophage. Chez l‟Homme, le tabac, par son rôle cocarcinogène ou immunosuppresseur et l‟immunodépression acquise, notamment au décours de certains traitements immunosuppresseurs en transplantation ou au cours de l‟infection par le VIH, favorisent le développement de lésions malignes (Wright et al., 2005). L‟imprégnation oestrogénique du col, acquise ou intervenant lors de la grossesse, favorise la métaplasie malpighienne et pourrait faciliter l‟évolution vers un cancer (Fife et al., 1996 ; Fife et al., 1999 ; Castellsague et al., 2003). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 37 Figure 7 : Physiopathologie de l’infection et réponse immune naturelle au cours de l’infection par un HPV (Alain et al., 2010) Légende : TCR : T cell receptor, CMH classe I : complexe majeur d‟histocompatibilité, Ig : immunoglobuline, TNF : Tumor Necrosis Factor ; INF : Interféron. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 38 Figure 8 : Cycle viral normal et évolution vers une prolifération maligne au cours d’une infection par un HPV muqueux génital (Alain et al., 2010) Le cancer du col ne survient qu’en présence d’une infection persistante par un papillomavirus. Parmi les femmes infectées par un HPV à haut risque, l’infection régresse spontanément dans 90 % des cas. Une infection persistante se développe dans 3 à 10% des cas, et évolue vers une lésion de haut grade sous l’influence du type viral (oncogène), mais aussi de l’âge, du terrain immunologique. Une infection sexuellement transmise associée, Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 39 l’imprégnation oestrogénique ou un déficit immunitaire sont des facteurs favorisant la persistance de l’infection. Le tabac joue à la fois un rôle immunosuppresseur et cocarcinogène. L’évolution se fait en général lentement, en 7 à 30 ans. Dans certains cas, l’infection peut évoluer très rapidement en deux à trois ans vers une lésion précancéreuse (CIN II ou III), puis poursuivre son évolution vers un cancer. A) Évolution des lésions au niveau de l’épithélium ; B) modifications du cycle viral au cours de la progression vers un cancer : à gauche le cycle viral est productif, les lésions sont bénignes et spontanément régressives ; à droite, au cours de la persistance virale le cycle viral est abortif, avec maintien du virus dans les cellules basales et risque d’intégration. * Certaines lésions peuvent évoluer en deux à trois ans vers une lésion de haut grade précurseur de cancer. CIN I ou LSIL (Low Grade Squamous Intra Epithelial Lesion ; lésion de bas grade) : à ce stade on observe une prolifération virale, avec koïlocytose, dysplasie modérée, et une extension des lésions ne dépassant pas le tiers de l’épithélium, l’ADN viral est sous forme épisomale, les protéines E6 et E7 favorisent la prolifération. CIN II-III ou HSIL (High grade Squamous Intra Epithelial Llesion ; lésion de haut grade): dysplasie sévère à modérée, avec extension à la totalité de l’épithélium, et instabilité génomique sous l’influence de E6 et E7. L’ADN viral est présent sous forme intégrée. La réplication virale est réduite. La régression des lésions est moins fréquente. Le nombre de copies de génome HPV est corrélé avec le potentiel évolutif des lésions. Cancer : les cellules transformées, du fait de la prolifération et de l’instabilité génétique constamment entretenue par la synthèse déréprimée des protéines E6 et E7, ont acquis les propriétés nécessaires au développement de la tumeur, telles que la perte d’inhibition de contact et la capacité d’envahissement de la basale permettant le passage dans le tissu conjonctif puis l’atteinte ganglionnaire et la dissémination de métastases. I.1.11. Prévention de l’infection au HPV Le préservatif diminue en grande partie la transmission des papillomavirus et la fréquence des infections persistantes à HPV. Cependant, il peut y avoir contamination par contact avec des zones cutanées non couvertes par le préservatif (Winer, 2006). Il semblerait également que l‟utilisation du préservatif augmenterait la clairance de l‟infection à HPV et de ses conséquences (Hogewoning, 2003). La circoncision jouerait un rôle protecteur et diminuerait la prévalence de l‟infection (Hernandez, 2008). Des règles d‟hygiène strictes surtout dans les Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 40 centres à hautes prévalences de HPV notamment pour les colposcopes et le matériel pour la pathologie cervicale (utilisation de matériel à usage unique comme le speculum, les écouvillons jetables et les gants) sont très importantes pour réduire le risque de transmission des HPV. Il existe une relative diminution d‟infection néonatale par HPV lorsque les patientes présentent des lésions condylomateuses et qu‟elles accouchent par césarienne (Silverberg, 2003). I.1.11.1. La vaccination prophylactique L‟étiologie du cancer du col de l‟utérus étant étroitement lié à une infection par les HPV, des vaccins de types prophylactiques ont été développés. Leur principe est d‟administrer une molécule capable de déclencher une réponse immunitaire. La mémorisation de cette réponse par le système immunitaire permet alors lors d‟une infection ultérieure une mobilisation plus rapide des acteurs du système immunitaire tumoral. Ainsi, il a été démontré que des anticorps spécifiques de la capside virale L1 ou L2 sont capables de prévenir une nouvelle infection par HPV (Bousarghin, 2009). Les vaccins prophylactiques ont été conçus grâce à la découverte de la propriété d‟auto assemblage en grande quantité de la protéine majeure de capside L1 du virus HPV dans différents systèmes eucaryotes (Stanley, 2009). Cette propriété permet la formation de Viruslike-particles (VLP) qui ont la même morphologie que les virions mais ne contiennent pas de génome viral. Elles ne présentent donc aucun risque infectieux ou oncogène. La surexpression des protéines L1 conduit à leur auto‐assemblage et à la formation de pseudoparticules virales. Ces pseudo‐virus dépourvus de matériel génétique, sont capables après vaccination de l‟hôte de déclencher de fortes réponses immunitaires. Malgré tout, le risque de multiplication ou de virulence est totalement écarté. C‟est grâce à ce procédé que deux vaccins prophylactiques ont été mis au point. Ces vaccins à base de VLP sont produits par l‟insertion du gène L1 dans des cellules d‟insectes (infectées par des baculovirus) ou dans des levures (Saccharomyces cerevisiae). L‟injection des VLP chez l‟homme permet la production de titres élevés d‟anticorps neutralisants dirigés contre la protéine L1 (Stanley, 2009). Ces anticorps vont transsudés à travers les muqueuses génitales et être présents dans les sécrétions cervico-vaginales pour neutraliser le virus au moment de la première exposition. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 41 Les deux vaccins utilisant la technologie des VLP sont: le vaccin quadrivalent Gardasil® (Sanofi Pasteur MSD, West Point Pennsylvanie) qui est une formulation au sel d‟aluminium dirigé contre les papillomavirus type 6, 11, 16 et 18 et le vaccin bivalent Cervarix® (GlaxoSmithkline, Rixensart, Belgique/Medimmune, Maryland) qui est dirigé contre les HPV oncogènes à haut risque 16 et 18. Ce dernier vaccin utilise un adjuvant original l‟ASO4 qui aurait la particularité de stabiliser les pseudo-particules virales au cours du stockage et d‟induire un pic de titre d‟anticorps avec de plus faible doses d‟antigènes. La vaccination concerne surtout les adolescentes avant les premières relations sexuelles, soit à l'âge de 14 ans. La vaccination ne manque pas d'intérêt à un âge plus avancé, chez des femmes qui n'ont jamais été infectées par au moins un des types viraux contenus dans le vaccin ; dans ce cas, le vaccin a la même efficacité protectrice que chez des sujets plus jeunes. Elle ne dispense pas de la poursuite du dépistage du cancer du col de l'utérus ni de l'utilisation du préservatif. Après administration selon un calendrier en 3 doses, les 2 vaccins sont hautement immunogènes, les réponses immunitaires les plus fortes étant observées chez des filles de 9 à 15ans (Schiller et al., 2012). Les titres d‟anticorps restent élevés pendant 8,4 ans au moins pour le vaccin bivalent, avec une séropositivité de 100%, et pendant 8 ans au moins pour le vaccin quadrivalent (WHO, 2014). I.1.11.2. La vaccination thérapeutique Le but de la vaccination thérapeutique est de sensibiliser les cellules immunocompétentes pour neutraliser l‟infection HPV déjà installée et faire régresser les lésions précancéreuses, voire le cancer du col utérin. Les vaccins thérapeutiques peuvent être formés à partir de peptides libres, de protéines recombinantes, de virus ou de bactéries recombinants associés à des gènes codants pour certains types de HPV, à partir de fragments de plasmide ADN ou de cellules dendritiques sensibilisées par des antigènes viraux. Tous stimulent l‟immunité T cellulaire en présentant les antigènes vaccinaux à la surface des cellules qui les ont intégrés en association avec les molécules HLA de classe I ou II, afin de stimuler respectivement les lymphocytes T CD8+ et CD4+. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 42 I.1.11.3. Immunogénicité et efficacité des vaccins anti-HPV Réponse immunitaire suite à la vaccination D‟après les données provenant de modèles animaux, on suppose que le mécanisme de protection conféré par les vaccins anti-PVH fait appel à des anticorps polyclonaux neutralisants dirigés contre la protéine d‟enveloppe principale, L1 (Suzich et al., 1995 ; Breitburd et al., 1995 ; Dochez et al., 2014) . Lors des essais cliniques des 2 vaccins, on a observé un pic du titre d‟anticorps 4 semaines après la troisième dose, puis une baisse sur approximativement une année de ce titre et une stabilisation sous forme de plateau. La réponse sérologique après la vaccination est beaucoup plus forte (supérieure de 1 à 4 unités logarithmiques) que la réponse à une infection naturelle, pour des raisons qui sont peu claires, mais probablement liées à un ciblage/une activation plus efficace des cellules des ganglions lymphatiques par les vaccins parentéraux que par les infections mucosales; et à l‟utilisation d‟adjuvants dans les vaccins existants. Les cellules plasmatiques à longue durée de vie, qui résident principalement dans la moelle osseuse, continuent de produire des anticorps IgG et sont responsables de la persistance à long terme d‟anticorps spécifiquement dirigés contre des HPV (Mamani-Matsuda et al., 2008 ; Ahuja et al., 2008). On pense que les anticorps circulants générés par la vaccination atteignent le site de l‟infection par transsudation active des IgG, tout au moins dans les voies génitales féminines, et par exsudation passive au niveau des sites de traumatisme que l‟on croit nécessaires à l‟initiation d‟une infection à HPV. La vaccination suscite aussi la formation de cellules mémoires B, qui résident principalement dans la rate et les ganglions lymphatique (Giannini et al. 2006). L‟efficacité de la protection dépend non seulement de la quantité mais également de la qualité (affinité) des anticorps dont la production est induite par l‟administration du vaccin (Dauner et al., 2010). Les cellules mémoires B dont l‟apparition est provoquée par la première dose de vaccin nécessitent au moins 4 à 6 mois pour murir et se différencier en cellules B à forte affinité. Cela implique que tout calendrier de vaccination doit comprendre au moins un intervalle de 4 mois entre la primo-vaccination (première dose) et le rappel (dernière dose) pour réactiver efficacement les cellules mémoires B et déclencher leur différenciation en cellules plasmatique sécrétant des anticorps. Les calendriers de vaccination en 2 doses prévoyant des intervalles plus courts (primovaccination-primovaccination) pourraient ne pas permettre la Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 43 maturation de l‟affinité, d‟où le risque que la durée de l‟efficacité protectrice soit abrégée. Néanmoins, des études récentes ont constaté que la réponse à une dose unique de vaccin conférait une bonne protection, avec un plateau stable du titre d‟anticorps sur une durée allant jusqu‟à 4 ans (Safaeian et al., 2013). La persistance des anticorps, c‟est-à-dire la présence d‟un plateau du titre d‟anticorps produits par les cellules plasmatiques à longue durée de vie, est estimée au moins à 6 mois et de préférence à 30 mois après la dernière dose de vaccin. Vaccination des individus immunodéprimés et/ou infectés par le VIH On dispose d‟informations limitées sur l‟immunogénicité des vaccins anti-HPV chez les personnes immunodéprimées et/ou infectées par le VIH. Les données sur l‟utilisation de ces vaccins dans le cadre d‟un calendrier en 3 doses chez des femmes (Kahn et al., 2013 ; Kojic et al., 2014) et des hommes (Wilkin et al., 2010) séropositifs pour le VIH ainsi que chez des enfants de 7 à 12 ans (Levin et al., 2010) infectés par ce virus sont rassurantes sur le plan de l‟innocuité. Les taux de séropositivité chez les personnes vaccinées, infectées par le VIH, sont comparables à ceux des personnes vaccinées séronégatives pour ce virus, qu‟elles reçoivent ou non un traitement antirétroviral (Denny et al., 2013). I.1.11.4. Nouveaux vaccins potentiels en cours de mise au point Pour accroître la protection conférée par les vaccins anti-HPV, il a été mis au point un vaccin dans lequel le nombre de types de HPV est passé à 9 par addition des types 31, 33, 45, 52 et 58 au vaccin quadrivalent. Ce vaccin nano-valent est actuellement en cours d‟évaluation réglementaire en vue d‟une éventuelle autorisation de mise sur le marché. Plusieurs autres approches sont aussi explorées, dont un vaccin reposant sur la protéine de capside L2 du HPV (WHO, 2014 ; Dochez et al., 2014). I.2. Les néoplasies cervicales intra-épithéliales I.2.1. Rappel anatomique et histologique du col utérin Deux épithéliums composent le col de l‟utérus : au niveau de l‟exocol chargé en glycogène, l‟épithélium est de type pavimenteux ou malpighien pluristratifié de couleur rose, il est en continuité avec l‟épithélium de la muqueuse vaginale. Au niveau de l‟endocol, l‟épithélium Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 44 est de type cylindrique glandulaire unistratifié de couleur rouge et muco-sécrétant. Entre les deux épithéliums se trouve la jonction pavimento-cylindrique (JPC) (Blanc, 2005). La JPC ou jonction exo-endocol correspond exactement à l‟orifice cervical externe c‟est-à dire la réunion de deux épithéliums de hauteur différente: l‟un malpighien pluristratifié et l‟autre cylindrique unistratifié. Mais, en pratique, sa structure et sa topographie varient avec l‟âge. I.2.2. Lésions précancéreuses cervicales ou dysplasie cervicale I.2.2.1. Le concept Le concept de maladie pré-invasive du col a été introduit pour la première fois en 1947. Il a été reconnu que des transformations épithéliales ayant l‟apparence d‟un cancer invasif pouvaient être identifiées uniquement au niveau de l‟épithélium (Pund, 1947). Des études ultérieures ont montré que si ces lésions ne sont pas traitées, elles peuvent progresser vers le cancer du col (Koss, 1963). Les progrès de la cytologie ont conduit à l‟identification des lésions précoces appelées dysplasies, qui impliquent le développement futur probable d‟un cancer. Le concept de néoplasie cervicale intra-épithéliale du col (CIN) a été introduit en 1968, quand Richart a indiqué que toutes les dysplasies étaient susceptibles d‟évoluer (Narducci, 2000). Il est actuellement admis que la plupart des CIN régressent spontanément, sans traitement (Ostor, 1993). Néanmoins, le terme CIN fait référence à une lésion qui pourrait progresser vers le cancer. Ce terme est équivalent à celui de dysplasie. La « néoplasie cervicale intra-épithéliale » (CIN) était une nomenclature de plus en plus utilisée permettant de représenter le large spectre de la maladie. Dans de nombreux pays en développement, la nomenclature dysplasie/carcinome in-situ de l‟OMS est toujours largement en cours. Celle de Papanicolaou est universellement abandonnée car obsolète et celle du Système Bethesda doit être utilisée pour les résultats du frottis. La classification du Système Bethesda a été modifiée en 2001 en considérant l‟infection HPV (au même titre que les CIN I) comme lésions intra épithéliales pavimenteuses de bas grade (LPIBG). L‟OMS recommande la classification Bethesda de 2001 pour le compte-rendu de la cytologie (OMS, 2007). Le tableau IV montre les différentes terminologies employées pour le compte-rendu des résultats de la cytologie et de l‟histologie. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 45 Tableau IV : Différentes terminologies employées pour le compte-rendu des résultats de la cytologie et de l’histologie (OMS, 2007) Classification cytologique Classification histologique (employée pour le dépistage) (employée pour le diagnostic) Pap (frottis) Système Bethesda CIN Classifications descriptives OMS Classe I Normal Normal Normal Classe II ASC-US Atypie Atypie CIN 1, y compris Koïlocytose condylome plan Dysplasie légère ASC-H Classe III LIEBG Classe III LIEHG CIN 2 Dysplasie modérée Classe III LIEHG CIN 3 Dysplasie sévère Classe IV LIEHG CIN 3 Carcinome in situ Classe V Cancer invasif Cancer invasif Cancer invasif Légende: CIN : néoplasie cervicale intraépithéliale ; LIEBG : lésion intraépithéliale épidermoïde de bas grade ; LIEHG : lésion intraépithéliale épidermoïde de haut grade ; ASCUS : cellules épidermoïdes atypiques de signification indéterminée ; ASC-H : cellules épidermoïdes atypiques ne permettant pas d‟exclure une lésion intraépithéliale épidermoïde de haut grade. I.2.2.2. Caractéristiques cliniques Il n‟existe pas de symptômes spécifiques permettant de déceler la présence de dysplasie cervicale. Cependant, il est possible que certaines patientes se plaignent d‟écoulements excessifs par le vagin, ce qui peut être le fait d‟une infection surajoutée. Il n‟existe pas de caractéristiques cliniques spécifiques de lésions précurseurs de cancers cervicaux pouvant être Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 46 décelées à l‟examen au spéculum, mais nombre de ces lésions peuvent blanchir à l‟application d‟une solution fraîchement préparée d‟acide acétique à 5%, ou peuvent être iodo-négatives à l‟application de la solution de Lugol (puisqu‟elles ne contiennent pas de glycogène). I.2.2.3. Diagnostic des dysplasies cervicales Le diagnostic des dysplasies cervicales repose essentiellement sur leur dépistage précoce. Technique - Inspection simple du col L‟inspection du col de l‟utérus après la pose d‟un spéculum permet de noter la largeur du col, sa longueur, l‟état de l‟orifice cervical ; l‟aspect de la muqueuse exocervicale, de la muqueuse endocervicale, de la glaire cervicale. - Le test à l’acide acétique (Inspection visuelle à l‟acide acétique ou IVA) L‟examen au spéculum est amélioré par l‟application de l‟acide acétique à 4 %. Il s‟agit d‟inspecter le col utérin pour détecter les anomalies après avoir appliqué l‟acide acétique dilué à 4 % qui dissout les secrétions protéiques, permettant ainsi la mise en évidence de la zone blanchâtre d‟une lésion précancéreuse ou d‟un cancer. L‟IVA a une très grande sensibilité, ce qui l‟a fait proposer comme méthode alternative au frottis dans les contextes où les ressources sont limitées. - Le test de Schiller (Inspection visuelle au lugol ou IVL) Le test de Schiller consiste à badigeonner au lugol, le col utérin exposé par le spéculum. Le col apparaît alors uniformément coloré en brun acajou. Toute zone iodo-négative située au niveau de la zone de transformation indique la pratique d‟un frottis cervico-vaginal ou d‟une colposcopie avec biopsie dirigée à la recherche d‟une dysplasie. - Le frottis cervico-vaginal ou pap-test C‟est un examen microscopique des cellules cervicales sur un frottis coloré par la technique de Papanicolaou et qui permet d'identifier les CIN. Longtemps utilisé comme moyen de dépistage de masse dans les pays développés, son coût élevé reste un handicap sérieux à son accessibilité dans les pays pauvres. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 47 - La colposcopie Il s‟agit d‟une nouvelle procédure de dépistage des lésions précancéreuses et cancéreuses du col. La colposcopie est un examen simple non invasif du vagin et du col de l‟utérus à la recherche de toute sorte de lésions en particulier les lésions pouvant conduire au développement du cancer du col (lésions précancéreuses), mais aussi des cancers déjà installés. Elle permet de localiser la lésion et de diriger la biopsie sur la zone suspecte du col. Elle nécessite un matériel coûteux, appareil microscopique à fort grossissement, appelé Colposcope et un personnel qualifié formé et entraîné. La colposcopie présente plusieurs avantages : l‟exploration se fait directement sur le col en entier et les parois vaginales ; le résultat est immédiat ; en cas de lésions, des biopsies (prélèvement) ciblées peuvent se faire. C‟est très efficace pour le suivi des lésions antérieurement identifiées. L'examen colposcopique comprend trois ou quatre temps : Examen sans préparation du col utérin avant et après nettoyage avec un coton sec. L'examen du col utérin sous agrandissement optique et après utilisation de filtres de lumière spécifiques, on peut mettre en évidence et étudier les réseaux de micro-vaisseaux sanguins qui se trouvent sur la surface de l'exocol (la partie intra-vaginale du col utérin), les anomalies de ces réseaux (la néovascularisation et l'anarchie de répartition) permettent de localiser les zones anormales de l'exocol et de la zone de jonction. Examen après application d'acide acétique à 4 % : les anomalies des revêtements du col utérin apparaissent (elles prennent une coloration blanchâtre grâce à la coagulation des protéines : zone blanche, mosaïque). Examen après badigeonnage du col utérin au lugol : le lugol se fixe sur le revêtement normal de l'exocol porteur de glycogène, cette fixation colore l'exocol en couleur brunâtre sauf les lésions du revêtement de l'exocol qui sont dépourvues de glycogène et qui ne prennent pas cette coloration (test négatif). Biopsie colpoguidée du col utérin : suite à l'ensemble des observations précédentes, le médecin peut parfois juger nécessaire de réaliser des biopsies au niveau des zones lésionnelles individualisées, ces biopsies sont effectuées à l'aide des pinces à biopsies. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 48 - La biopsie cervicale dirigée : C‟est le prélèvement d‟un fragment de tissu cervical à l‟aide d‟une pince à biopsie sous contrôle d‟un examen colposcopique sur les zones paraissant les plus pathologiques. La biopsie doit avoir intéressé la zone de transformation où la majorité des lésions précancéreuses du col débutent. Cela est confirmé à l‟histologie par la présence de glandes endocervicales dans le stroma. La figure 9 présente le développement histologique du cancer du col de l‟utérus. Figure 9 : Développement histologique du cancer du col de l’utérus (Syrjänen et al., 2000) I.3. Le Cancer du col de l’utérus I.3.1. Le cancer invasif du col I.3.1.1. Histoire naturelle du cancer du col de l’utérus Le « Cancer » est un terme utilisé pour désigner la prolifération maligne, autonome et anarchique de cellules. Une telle prolifération entraîne la formation de tumeurs qui peuvent envahir des organes voisins ou distants, en détruisant les tissus normaux et en rivalisant pour l‟utilisation de l‟oxygène et des nutriments. On parle de métastases quand de petits groupes de Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 49 cellules se détachent de la tumeur originelle et sont transportés par voies sanguine et lymphatique vers des sites distants, pour y former de nouvelles tumeurs similaires à la tumeur originelle. L‟infection persistante ou chronique avec un ou plusieurs types de HPV dits à « haut risque » ou oncogéniques est la principale cause de carcinome cellulaire épidermoïde. Les types de HPV oncogéniques les plus fréquents sont les types 16 et 18 que l‟on retrouve dans 70% de tous les cas de cancer du col notifiés. Les autres types oncogéniques (31, 33, 45 et 58) sont moins courants et leur prévalence varie selon les régions géographiques. Les types de HPV à faible risque (6 et 11) ne sont pas associés au développement du cancer du col, mais sont à l‟origine de verrues génitales. Les facteurs déterminants de l‟infection par le HPV, à la fois chez l‟homme et chez la femme, sont directement liés au comportement sexuel, à savoir : la précocité des rapports sexuels, la multiplicité des partenaires sexuels et si les partenaires ont eux-mêmes plusieurs partenaires sexuels. L‟infection par des types de HPV à haut risque est plus fréquente chez les jeunes femmes, avec un pic de prévalence de 25Ŕ30% chez les moins de 25 ans. Dans la plupart des régions, cette prévalence décroît rapidement avec l‟âge. Si l‟infection par des types de HPV à haut risque constitue la cause sous-jacente du cancer du col, la plupart des femmes infectées ne vont pas développer cette maladie pour autant. En effet, indépendamment du type viral, la plupart des infections HPV sont passagères et seul, un petit nombre vont persister et encore moins nombreuses sont celles qui déboucheront sur des lésions précancéreuses ou un cancer invasif du col (OMS, 2007): cofacteurs liés au HPV : type viral ; infection simultanée avec plusieurs types oncogéniques ; quantité importante de virus (forte charge virale). facteurs d‟hôte : statut immunitaire : chez les individus souffrant d‟immunodéficience (comme celle provoquée par l‟infection VIH), les infections à HPV ont plus souvent tendance à persister et le développement de lésions précancéreuses et cancéreuses est plus rapide ; parité : le risque de cancer du col augmente avec une parité plus importante. facteurs exogènes : tabagisme ; co-infection avec le VIH ou d‟autres germes transmis sexuellement, comme le virus herpes simplex 2 (HSV-2), Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae ; utilisation prolongée de contraceptifs oraux (> 5 ans) (OMS, 2007). Les patientes atteintes d‟un cancer du col utérin ont souvent un ou plusieurs des symptômes suivants : saignements inter menstruels, saignement post-coïtal, saignement postThèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 50 ménopausique, écoulement séro-purulent excessif, douleurs dorsales, douleurs abdominales basses (OMS, 2007). I.3.2.2. Classification anatomo-pathologique des cancers invasifs du col de l’utérus Le système de classification en stades du cancer du col utérin actuellement utilisé est celui proposé par la Fédération internationale de gynécologie-obstétrique (FIGO) (OMS, 2007). L‟OMS a proposé également une classification histologique des cancers du col de l‟utérus. Classification clinique des cancers du col utérin selon la FIGO : Stade I : carcinome limité au col utérin Stade IA : cancer invasif identifié par analyse microscopique uniquement. L‟invasion est limitée à l‟invasion stromale mesurée, avec une extension maximale en profondeur de 5mm et une extension latérale ne dépassant pas les 7mm. Stade IB : les lésions cliniques sont limitées au col ou bien les lésions précliniques sont plus importantes que dans le stade IA. Toute lésion clinique, macroscopique, visible et confinée au col, même avec une invasion microscopique superficielle, est classée stade IB. Stade II Le stade II désigne le carcinome s‟étendant au-delà du col mais sans atteindre les parois pelviennes. Le carcinome a atteint le vagin, mais pas au-delà du tiers inférieur. Stade IIA : pas d‟atteinte paramétriale évidente. L‟invasion touche les deux tiers supérieurs du vagin. Stade IIB : atteinte paramétriale évidente, mais pas jusqu‟à la paroi pelvienne. Stade III Stade IIIA : pas d‟extension à la paroi pelvienne mais atteinte du tiers inférieur du vagin. Stade IIIB : extension à la paroi pelvienne ou hydronéphrose. Stade IV Stade IVA : extension de la tumeur aux organes pelviens adjacents. Stade IVB : extension aux organes distants. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 51 Classification OMS histologique des tumeurs du col utérin (OMS, 2004) : Tumeurs épithéliales Tumeurs épidermoïdes et précurseurs Carcinome épidermoïde (SAI) Kératinisant 8070/3 8071/3 Non kératinisant 8072/3 A cellules basales Verruqueux 8083/3 8051/3 Condylomateux 8051/3 Papillaire 8052/3 Lymphoépithélial 8082/3 A cellules transitionnelles 8120/3 Carcinome épidermoïde avec invasion précoce (micro invasif) 8076/3 Néoplasie intraépithéliale épidermoïde Néoplasie cervicale intraépithéliale (CIN3) 8077/2 Carcinome épidermoïde in situ 8070/2 Lésions cellulaires épidermoïdes bénignes Condylome accuminé Papillome épidermoïde 8052/0 Polype fibroépithélial Tumeurs glandulaires et précurseurs Adénocarcinome 8140/3 Adénocarcinome mucineux 8480/3 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 52 Endocervical 8482/3 De type Intestinal 8144/3 A cellules en bague à chaton 8490/3 A déviation minimale 8480/3 Villeux 8262/3 Adénocarcinome endométrioïde 8380/3 Adénocarcinome à cellules claires 8310/3 Adénocarcinome séreux 8441/3 Adénocarcinome mésonéphroïde 9110/3 Adénocarcinome avec invasion précoce Adénocarcinome in situ 8140/3 8140/2 Dysplasie glandulaire Lésion glandulaire bénigne Papillome Müllerien 8560/3 Polype de l'endocol 8015/3 Autres tumeurs épithéliales 8015/3 Carcinome adénosquameux Carcinome à cellules vitreuses Carcinome adénoïde kystique 8200/3 Carcinome adénoïde basal 8098/3 Tumeurs neuro-endocriniennes Carcinoïde 8240/3 Carcinoïde atypique 8249/3 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 53 Carcinoïde à petites cellules 8041/3 Carcinome neuroendocrine à grandes cellules 8013/3 Carcinome indifférencié 8020/3 I.3.2.3. Mécanismes de la carcinogénèse Les papillomavirus sont des virus lytiques. La transformation cellulaire résulte d‟une prolifération cellulaire exagérée, stimulée par les protéines E6 et E7, en réponse à l‟infection abortive associée à la persistance virale. De tels cycles abortifs sont observés en particulier au niveau des zones de jonction entre épithélium malpighien et épithélium glandulaire. L‟évolution d‟une infection par un HPV oncogène vers un cancer nécessite la coopération de plusieurs protéines virales interférant avec le cycle cellulaire normal. Deux oncoprotéines, E6 et E7, dont les propriétés transformantes ont été démontrées in vitro et in vivo, sont essentiellement impliquées. E5 possède également des propriétés transformantes, mais son mécanisme d‟action est moins connu. Selon le type viral, cutané ou muqueux, les mécanismes moléculaires impliqués sont différents (Doorbar, 2005 ; Lazarczyk et al., 2009 ; Yugawa et Kiyono, 2009). HPV génitaux muqueux L‟infection par un HPV est une condition nécessaire au développement d‟un cancer du col utérin, comme en témoigne la présence du génome viral, retrouvée dans 99,9 % des cancers du col et dans plus de 80 % des lésions de haut grade (Alain et al., 2010). L‟évolution d‟une lésion de bas grade vers une lésion de haut grade puis un cancer nécessite la persistance de l‟infection virale et s‟étend en général sur plusieurs années. Au niveau cellulaire, l‟évolution d‟une dysplasie de bas grade vers une lésion de haut grade est associée à phase initiale de prolifération cellulaire, avec production persistante des oncoprotéines E6 et E7 et diminution de la réplication virale et de l‟expression des autres protéines virales. Puis surviennent des anomalies de ségrégation des chromosomes, avec duplication des centrosomes, et divers phénomènes épigénétiques entraînant une instabilité génétique et une aneuploïdie, sous l‟influence des protéines E6 et E7, dérégulant l‟expression des protéines oncogènes virales. Cet événement est associé à une augmentation de la dysplasie, et précède l‟intégration. L‟intégration du génome viral dans le génome cellulaire constitue un événement majeur, qui Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 54 intervient dans les premières phases d‟évolution vers un cancer. C‟est un événement terminal qui interrompt la réplication virale. Au cours de l‟intégration, le génome viral est clivé au sein de séquences codant E1 ou E2, préservant les séquences codant E6 et E7. Cela affranchit la synthèse de E6 et E7 du contrôle exercé par E2 au cours du cycle viral normal et contribue à augmenter la dérégulation du cycle cellulaire. L‟intégration du génome viral est constamment observée dans les cancers liés à HPV 18 alors qu‟elle n‟est pas systématique dans les cancers liés à HPV 16. Les HPV muqueux oncogènes se caractérisent essentiellement par les propriétés particulières de leurs oncoprotéines E6 et E7 qui coopèrent pour assurer le maintien de la réplication virale dans les cellules différenciées. E6 favorise la dégradation de la protéine p53, qui active notamment l‟apoptose en cas de lésions de l‟ADN cellulaire, mais aussi celle d‟autres protéines régulant le cycle cellulaire. E6 se lie à p53 en favorisant son ubiquitination et sa destruction empêchant ainsi p53 de bloquer le cycle cellulaire en phase G1 et d‟induire l‟apoptose cellulaire en réponse à l‟infection. Un second mécanisme, impliquant la télomérase, inhibe la sénescence cellulaire liée à l‟érosion des chromosomes. E6 active l‟expression de la sous-unité catalytique de la télomérase humaine (hTERT) qui porte la fonction transcriptase inverse de cette protéine en dégradant son inhibiteur. Cette sous-unité hTERT est naturellement activée dans les cellules souches, et dans certains cancers. Les protéines E6 des HPV à haut risque oncogène possèdent également un motif capable de se lier au domaine « PDZ » de nombreuses protéines régulatrices du cycle cellulaire. La protéine E7 interagit avec la protéine suppresseur de tumeur pRb en favorisant sa liaison à la calpaine, qui dégrade partiellement pRb et provoque sa dégradation par le proteasome. Ceci empêche sa liaison avec le facteur de transcription E2F dont l‟activité est régulée par pRb. Le relargage de E2F favorise la transcription de nombreux gènes cellulaires impliqués dans la réplication de l‟ADN et la progression de la cellule vers la phase S. E7 interagit également avec p16, p21, p107 et p130, qui inhibent la réplication cellulaire. E7 interagit également avec p600, facteur associé à pRb qui régule la dépendance d‟ancrage cellulaire et l‟expression des intégrines. Elle favorise également l‟aneuploïdie, en dérégulant le contrôle des centrosomes, essentiel pour la ségrégation des chromosomes au cours de la mitose. E6 serait également capable d‟induire une polyploidie indépendamment de p53 (Yugawa et Kiyono, 2009). Les protéines E6 des HPV à bas risque oncogène diffèrent des protéines des HPV à haut risque, notamment par l‟absence de liaison à p53 et l‟absence de motif de liaison au domaine PDZ (Lazarczyk et al., 2009). De même, le moindre pouvoir transformant des protéines E7 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 55 des HPV à bas risque oncogène est associé à une substitution d‟un acide aminé dans le site de liaison à pRb. Enfin, les protéines E7 des HPV à bas risque n‟entraînent pas de surduplication des centrosomes. Essentiellement étudiée chez HPV 16, E5 joue un rôle certain dans la prolifération et la persistance virale. Elle intervient précocement dans l‟évolution des lésions et se trouve fréquemment délétée en cas d‟intégration. Elle augmente les récepteurs EGF à la surface de la cellule, facilite le trafic des vésicules intracellulaires, stimule plusieurs facteurs de transcription et augmente la synthèse de E6 et E7. Son rôle promoteur de la réplication virale, en facilitant l‟activité des facteurs de transcription AP1 dépendants du Zn2+ par liaison aux protéines EVER dans la cellule, ouvre la voie ver de nouvelles recherches. Figure 10 : Coopération des protéines E6, E7 et E5 des HPV muqueux génitaux dans la persistance virale et l’oncogenèse virale (Alain et al., 2010) Les protéines E5, E6 et E7 coopèrent non seulement pour favoriser l’échappement du virus à la réponse immune mais aussi pour transformer les cellules basales et supra-basales. L’activation de la prolifération cellulaire par inactivation des répresseurs de l’entrée en Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 56 phase S, la dérégulation de la ségrégation des chromosomes et l’augmentation de l’activité télomérase contribuent à augmenter la fréquence des mutations dans les cellules en phase de croissance. L’inhibition des facteurs cellulaires suppresseur de tumeur p53 et pRB empêche la destruction des cellules transformées. I.3.2.4. Diagnostic du cancer du col de l’utérus et dépistage I.3.2.4.1. Les symptômes Les cancers du col de l‟utérus sont généralement asymptomatiques et sont découverts, le plus souvent, suite à un dépistage habituel par frottis cervico-utérin (FCU). Les cancers in situ sont totalement asymptomatiques, tandis que les cancers micro-invasifs peuvent également être asymptomatiques. Cependant, ils peuvent parfois entraîner des symptômes qui pousseront la patiente à consulter. Les signes cliniques peuvent être : Une métrorragie provoquée, post-coïtale, c‟est-à-dire un saignement génital survenant après une relation sexuelle ; Une métrorragie spontanée, survenant en dehors de la période des règles ; Une leucorrhée ; Une dyspareunie, douleur lors des rapports sexuels ; Et dans les formes plus avancées, on peut observer des douleurs, une difficulté à uriner ou de faux besoins d‟aller à la selle. I.3.2.4.2. Le diagnostic Le diagnostic est porté, avec une fiabilité à 95 %, par le trépied frottis-colposcopie-biopsie. Le diagnostic est histologique, le prélèvement est réalisé par biopsie qui est elle-même guidée par un bilan colposcopique proposé après les résultats d‟une cytologie évocatrice. La cytologie (FCU) est essentielle. L‟absence de signes évocateurs prouve l‟importance du frottis et du suivi. C‟est pourquoi, le FCU est recommandé à raison de deux frottis normaux à un an d‟intervalle, dès l‟âge de 20-25 ans, puis d‟un frottis tous les trois ans et ce, jusqu‟à l‟âge de 65 ans. Au Bénin et au Burkina Faso, des campagnes de dépistage de masse du cancer du col de l‟utérus sont périodiquement organisées dans les structures sanitaires des différentes régions urbaine et rurale. Ces campagnes de dépistage de masse se font généralement par IVA/IVL. Et les femmes chez qui IVA/IVL est positif, bénéficient d‟une colposcopie et de la réalisation Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 57 de biopsies selon les résultats de la colposcopie. Puis selon le cas, la femme reçoit un traitement et/ou suivi des lésions du col de l‟utérus. La détection des lésions précancéreuses par le frottis cervical et leur traitement conduit à une réduction de 91 % du risque de cancer si on suit les recommandations et que l‟on se fait dépister tous les trois ans (Kjaer et al. 2005 ; Hill et Vielh, 2005). Il est à noter que le dépistage est une démarche en partie subjective qui dépend de la qualité du prélèvement, des techniques de fixation et de coloration du frottis, de la compétence et de l‟expérience du cytopathologiste. I.3.2.4.3. Traitement des lésions précancéreuses du col utérin Une dysplasie légère (CIN 1) dont le diagnostic a été confirmé par des examens histologiques n‟est en général pas immédiatement traitée, en raison de la possibilité, pour bon nombre de ces lésions, de régresser spontanément. Les patientes atteintes de telles lésions sont donc réexaminées à intervalle allant de 3 à 6 mois et, si la lésion persiste sur une période de 1 à 2 ans, un traitement peut alors être envisagé. Cependant, dans les régions du monde où un suivi correct ne peut être assuré, les lésions de bas grade pourront être traitées sans délai. Les lésions de haut grade (CIN II et CIN III) confirmées histologiquement, sont traitées rapidement, car elles représentent un risque plus élevé d‟évoluer vers des lésions plus graves. Dans le cas des lésions précurseurs du cancer du col, différents traitements peuvent être envisagés. Ces traitements sont en général répartis en deux catégories : traitements par destruction et traitements par exérèse. Les traitements par destruction comprennent la cryothérapie, la coagulation à froid, la diathermo-coagulation et la vaporisation au laser. Les traitements par exérèse sont l‟électroconisation à l‟anse diathermique (ECAD), l‟excision au laser, la conisation à froid et l‟hystérectomie. Il est important d‟effectuer un examen colposcopique de la lésion avant traitement. I.3.2.4.4. Traitement du cancer du col de l’utérus Le traitement du cancer du col de l‟utérus dépend avant tout du stade. Il est fonction du stade évolutif du cancer. D‟autres critères sont également à prendre en compte dans le choix thérapeutique, tels que l‟âge de la patiente, son état de santé, la nulliparité et le désir de conservation de la fertilité. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 58 La chirurgie et la radiothérapie associées ou non à la chimiothérapie, représentent les principales méthodes de traitement du cancer du col de l‟utérus (OMS, 2007). Le bilan d’extension Comme pour tous les autres cancers, un bilan d‟extension doit être fait. Il permet d‟effectuer un bilan de départ de l‟extension de la maladie, afin d‟adapter au mieux le choix thérapeutique ainsi que le suivi. Il permet d‟évaluer la taille de la tumeur ainsi que son stade. L‟extension du cancer du col est principalement loco-régionale. La tumeur s‟étend de proche en proche vers le vagin, la vessie, le rectum, les uretères. L'extension lymphatique se fait vers les ganglions pelviens. L‟essaimage à distance est plus tardif et se fait essentiellement vers le foie et les poumons. C‟est pourquoi le bilan d‟extension comporte : Un toucher vaginal et rectal, qui permet d‟évaluer l‟évolution locale ; Une IRM pelvienne ; Une radiographie pulmonaire ; Une échographie abdomino-pelvienne ; Une recherche de marqueurs tumoraux : SCC (Squamous Cell Carcinoma antigen) pour le cancer épidermoïde et CA 125 pour l‟adénocarcinome ; Une cystoscopie et rectoscopie en cas de suspicion d‟atteinte vésicale et rénale. Les traitements Il s‟agit d‟un traitement multidisciplinaire, associant plusieurs traitements, tels que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. La stratégie thérapeutique va être envisagée en fonction du stade initial de la tumeur, de l‟âge de la patiente, de son état général, de son désir de conserver sa fertilité, du bilan d‟extension et des facteurs histo-pronostiques de la tumeur (taille, type histologique, extension ganglionnaire, extension métastatique). La décision des modalités du traitement est une décision collégiale qui implique plusieurs spécialistes. La chirurgie Le traitement chirurgical consiste en l‟ablation de la tumeur et des ganglions lymphatiques pelviens. La chirurgie peut être : Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 59 Une conisation, c‟est-à-dire une exérèse d‟une partie du col correspondant à un cône ou un cylindre dont la base est exocervicale et le sommet endocervical, passant à distance de la jonction pavimento-cylindrique ; Une amputation du col utérin ; Une hystérectomie. La chirurgie est effectuée soit par voie vaginale, soit par coelioscopie ou par laparotomie. Le traitement chirurgical peut être exclusif. La radiothérapie Deux types de radiothérapies peuvent être utilisées et associées : La curiethérapie utéro-vaginale ou radiothérapie interne : une source radioactive est introduite dans la cavité utérine et vaginale au contact de la tumeur ; La cobaltothérapie ou radiothérapie externe : la source radioactive est externe, à distance de la tumeur. La radiothérapie est parfois exclusive. Elle peut être utilisée avant la chirurgie (radiothérapie néo-adjuvante) ou après (radiothérapie adjuvante). La radiothérapie néo-adjuvante est réalisée avant la chirurgie. Elle peut être utilisée seule ou en association à une chimiothérapie (radio-chimiothérapie concomitantes). Son but est de détruire la tumeur ou de réduire sa taille afin qu‟elle soit plus facilement opérable. La radiothérapie adjuvante est réalisée 4 à 6 semaines après la chirurgie. Elle peut aussi être associée à une chimiothérapie. Le but est d‟éradiquer toutes les cellules cancéreuses qui pourraient être restées dans la sphère génitale après la chirurgie. La chimiothérapie On l‟associe généralement à la radiothérapie (avant ou après) pour augmenter l‟efficacité de cette dernière, mais elle peut être exclusive. La surveillance Le but est de déceler une éventuelle récidive de la tumeur et ce, le plus précocement possible. Les visites du suivi post-thérapeutique ont lieu trois mois après le traitement, puis tous les six mois pendant cinq ans, puis une fois par an. Elles comprennent un examen clinique, un Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 60 examen au spéculum, un frottis, un toucher vaginal et rectal. Parfois des examens associés sont prescrits : radiographie pulmonaire, échographie abdomino-pelvienne, scanner abdomino-pelvien, recherches des marqueurs tumoraux (SCC ou CA 125). La majorité des récidives survient dans 75 à 80% des cas au cours de la première année et dans 90 à 95% des cas à la fin de la deuxième année de surveillance. I.3.2.4.5. Pronostic du cancer du col de l’utérus Le pronostic du cancer du col de l‟utérus dépend essentiellement du stade de la maladie lors de sa détection, de la taille de la tumeur et de l‟envahissement ganglionnaire. Le taux de survie diminue également en fonction de l‟âge, de l‟état de santé de la patiente et de son état nutritionnel. Des patientes anémiques ou VIH positif réagissent faiblement au traitement. Les stades cliniques avancés sont associés à une fréquence accrue d‟invasion des vaisseaux sanguins et lymphatiques, et par conséquent, à une dissémination dans les ganglions lymphatiques pelviens et para-aortiques, et à des métastases à distance. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 61 CHAPITRE II : CADRE D’ETUDE, MATERIEL ET METHODES CHAPITRE II : CADRE D’ETUDE, MATERIEL ET METHODES II.1. Cadre d’étude Les travaux de recherche se sont déroulés à Ouagadougou, capitale politique du Burkina Faso avec des échantillons collectés dans la ville de Ouagadougou et dans celle de Parakou (République du Bénin). Tous les échantillons ont été acheminés au laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE) et au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) à Ouagadougou (Burkina Faso), où toutes les analyses de Biologie moléculaire ont été réalisées grâce au plateau technique de pointe du CERBA/LABIOGENE, Université de Ouagadougou. La collecte des échantillons a été faite à Parakou (République du Bénin) dans le service d‟anatomie et cytologie pathologique du Centre Hospitalier Universitaire Départemental du Borgou et de l‟Alibori (CHUD-B/A) et à Ouagadougou (Burkina Faso) précisément à l‟Hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO, anciennement appelé Centre Médical Saint Camille (CMSC)), au Centre d‟écoute pour jeunes de l‟Association Burkinabé pour le Bien-Etre Familial (ABBEF) et dans le service d‟anatomie et cytologie pathologique du Centre Hospitalier Universitaire Yalgado Ouédraogo (CHU-YO). La République du Bénin est un pays francophone situé au Sud-Est de l‟Afrique occidentale avec une superficie de 112 622 km2, il fait front au Sud, sur les eaux de l'Océan Atlantique du Golfe de Guinée, sur 124 kilomètres, et s'allonge du Nord au Sud sur une distance d'environ 672 km. Il est limité au Nord-Ouest par le Burkina Faso, au Nord-Est par le Niger, à l'Ouest par le Togo, à l'Est par le Nigeria et au Sud par l'Océan Atlantique (INSAE, 2004). La population du Bénin compte 9 983 884 habitants dont 5 115 704 personnes de sexe féminin soit 51,2% de la population totale. Parakou est la plus grande ville de la région septentrionale du Bénin, elle compte plus de 200 000 habitants et elle est la préfecture du département du Borgou (INSAE, 2013). Parakou abrite le CHUD-B/A. Le CHUD-B/A est l‟hôpital de référence situé dans la partie septentrionale de la République du Bénin. Il dispose d‟un service d‟Anatomie et cytologie pathologique ; d‟un service de Gynécologie - Obstétrique ; d‟un service de Pédiatrie et de Néonatologie ; d‟un laboratoire de Biochimie et de Biologie moléculaire ; d‟un laboratoire de Bactériologie, Hématologie, Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 63 Parasitologie ; d‟une unité d‟Urgence médicale, d‟un service d‟Anesthésie-réanimation et des urgences; d‟un service de Médecine générale ; d‟un service de Chirurgie viscérale ; d‟un service de Traumatologie ; d‟une unité de kinésithérapie et de rééducation fonctionnelle ; d‟un service de Neurochirurgie ; d‟un service de Psychiatrie ; d‟un service de Dermatologie ; d‟un service d‟Oto-rhino-laryngologie et de chirurgie cervico-faciale ; d‟un service d‟Ophtalmologie ; d‟un service de Stomatologie ; d‟un service de Radiologie et d‟Imagerie médicale ; d‟une Unité de prise en charge des personnes vivant avec le VIH/Sida ; etc. Le Burkina Faso est un pays enclavé au cœur de l‟Afrique de l‟Ouest. Il fait frontière avec le Mali, le Niger, le Bénin, le Togo, le Ghana et la Côte d‟Ivoire avec une superficie de 274 000 km2 pour une population d‟environ 17 millions d‟habitants. La population est en majorité jeune (plus de la moitié de la population à moins de 20 ans) et rurale avec 57,1 % de femmes (INSD, 2009). Le Burkina Faso est un pays en développement; dont l‟économie repose sur l‟agriculture, l‟élevage et l‟exploitation de l‟or. La capitale Ouagadougou est située au centre du pays avec une population d‟environ 1.900.000 habitants. L‟espérance de vie était de 55,8 ans pour les hommes et de 57,5 ans pour les femmes en 2006. LABIOGENE est un laboratoire de recherche rattaché à l‟Ecole Doctorale Sciences et Technologies (ED/ST) de l‟Université de Ouagadougou. Il a reçu le label de Centre d‟Excellence de l‟UEMOA. Le CERBA est situé au secteur 51 de la ville de Ouagadougou. C‟est le Laboratoire National de Référence du HPV (LNR-HPV) depuis février 2015. Le CERBA œuvre à la promotion du développement de la santé au Burkina Faso et en Afrique par la formation de jeunes médecins, pharmaciens et biologistes provenant de la sous-région Ouest Africaine. Ils possèdent un plateau technique bien fourni et moderne. Le CHU-YO est l‟hôpital de référence de la capitale du Burkina Faso (Ouagadougou). Il dispose de plusieurs services dont le service d‟Anatomie et cytologie pathologique. L‟HOSCO est une structure hospitalière située à Ouagadougou dans le district sanitaire de Bogodogo. La ville de Ouagadougou se découpe en 5 districts sanitaires (Signoghin, Baskuy, Nongremassom, Boulmiougou et Bogodogo). L‟HOSCO est situé au Secteur quatorze (14) et comprend une maternité, un service de pathologie néonatale, un service de pédiatrie, un service de santé maternelle et infantile (SMI), un dispensaire adulte, un dépôt pharmaceutique, un cabinet dentaire, un service d'imagerie médicale avec tomodensitométrie Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 64 et IRM, des consultations spécialisées et un laboratoire d'analyse biomédicale (parasitologie, bactériologie, biochimie, hématologie, sérologie, immuno-virologie, biologie moléculaire). Le centre d’écoute pour jeunes de l’ABBEF de Ouagadougou a été créé le 19 décembre 1979 et reconnu par le gouvernement burkinabè en 1981. Des fléaux vécus en milieu jeune tels que les naissances rapprochées, les infanticides, les grossesses précoces et non désirées, les avortements provoqués clandestins et la propagation des IST en milieu jeune, ont contribué à la prise de conscience et à la nécessité de créer un cadre organisé pour l‟information et la sensibilisation de la population. L‟ABBEF a pour mission de contribuer de façon significative à l‟épanouissement de la population en général, et des groupes les plus vulnérables en particulier, par l‟offre de services de santé de la reproduction de qualité. Le centre d‟écoute pour jeunes de l‟ABBEF a été choisi parce qu‟il est particulièrement fréquenté par les adolescentes, du fait de sa situation géographique proche de plusieurs établissements scolaires et de l‟université de Ouagadougou. II.2. Matériel et Méthodes II.2.1. Type d’étude Il s‟est agi d‟études transversales descriptives et analytiques pour les différents travaux menés. De plus, en ce qui concerne la troisième étude, il y a une particularité de collecte rétrospective des données. II.2.2. Période d’étude La première étude s‟est déroulée sur une période de trois mois, allant du 10 novembre 2012 au 10 janvier 2013. La deuxième étude s‟est déroulée sur une période de trois mois, allant du 05 septembre 2013 au 04 décembre 2013. La troisième étude s‟est déroulée sur une période de 6 mois, allant du 02 octobre 2014 au 10 31 mars 2015. II.2.3. Population d’étude II.2.3.1. Population A La population de la première étude était constituée d‟une part, de femmes de la population générale sans distinction d‟âge et en activité sexuelle, au statut HPV et VIH inconnu. Et Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 65 d‟autre part, de femmes VIH séropositives et de la population générale sans distinction d‟âge et en activité sexuelle, toutes positives au HPV 30‟S et /ou 50‟S selon deux études antérieures (Djigma et al., 2011 ; Ouédraogo et al., 2011), par la technique PCR suivie d‟une reverse hybridation sur des bandelettes nitrocellulosiques mais dont le kit ne permettait pas de préciser les génotypes 31, 33, 35, 39 pour les HPV30‟S et les génotypes 51, 52, 56, 58, 59 pour les HPV50‟S. II.2.3.2. Population B La population de la deuxième étude était constituée d‟adolescentes sexuellement actives âgées de 15 à 19 ans, vues dans le centre de santé pour jeunes à Ouagadougou, soit en consultation gynécologique soit pour un dépistage volontaire du VIH. II.2.3.3. Population C La population d‟étude était constituée de tissus archivés fixés dans du formol et enrobés de paraffine, de janvier 2009 à juillet 2015 au service d‟anatomie et cytologie pathologique résultant des pièces de biopsie, d‟hystérectomie ou de conisation du col de l‟utérus des femmes, ayant un diagnostic histologique confirmant un cancer du col de l‟utérus ou une CIN2 et CIN3. Ces tissus archivés étaient répartis en deux grands groupes à savoir : les tissus provenant du service d‟anatomie et cytologie pathologiques du CHU-YO (Burkina Faso) et ceux provenant du service d‟anatomie et cytologie pathologiques du CHUD-B/A (République du Bénin). II.2.4. Echantillonnage II.2.4.1. Taille de l’échantillon Au total 688 échantillons du col de l‟utérus ont été analysés par PCR en temps réel et sont répartis comme suit : Première étude : 180 échantillons endocervicaux de femmes de la population générale et de femmes VIH séropositives ; ayant fait l‟objet d‟une publication scientifique (1 er article issu de la thèse). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 66 Deuxième étude : 200 adolescentes sexuellement actives ; ayant fait l‟objet d‟une publication scientifique (2ème article issu de la thèse). Troisième étude : 78 tissus archivés de cancer du col de l‟utérus et de CIN de haut grade à Parakou (République du Bénin) ; ayant fait l‟objet d‟une publication scientifique (3 ème article issu de la thèse. Article soumis) ; 118 tissus archivés de CIN de haut grade à Ouagadougou ; ayant fait l‟objet d‟une publication scientifique (4ème article issu de la thèse. Article soumis) ; 112 tissus archivés de cancer du col de l‟utérus à Ouagadougou ; ayant fait l‟objet d‟une publication scientifique (5ème article issu de la thèse. Article soumis). II.2.4.2. Ecouvillonnage du canal endocervical Après avoir mis en évidence le col de l‟utérus à l‟aide d‟un spéculum, on introduit un écouvillon stérile à bout cotonné dans l‟endocol et à l‟exocol au niveau de la zone de jonction. Puis après trois mouvements de rotation dans le sens contraire des aiguilles d‟une montre, nous avions prélevé les cellules de la jonction pavimento-cylindrique où débutent toutes les lésions précancéreuses du col de l‟utérus. L‟échantillon ainsi collecté est ensuite introduit dans un tube d‟extraction de 1,5mL contenant le milieu de transport (Transport medium) et conservé à - 20°C en attendant l‟extraction de l‟ADN. II.2.4.3. Prélèvement des tissus archivés fixés au formol et inclus en paraffine Les registres du service d‟anatomie et cytologie pathologique du CHUD-B/A et du CHU-YO ont servi à l‟identification des blocs de paraffine contenant les tissus archivés au diagnostic histologique de CIN et de cancer du col de l‟utérus. Les blocs contenant les tissus de CIN 2, CIN3 et de cancer du col utérin de Parakou et de Ouagadougou ont fait l‟objet de coupe au microtome dans le service d‟anatomie et cytologie pathologique du CHU-YO à Ouagadougou au Burkina Faso. Quatre à cinq sections de tissus d‟épaisseur ≤ à 20 µm ont été coupées pour chaque échantillon éligible. Avant de procéder à la section des tissus au microtome, les blocs ont été placés à -20°C pendant 1heure. Les sections de tissus obtenues ont été introduites dans des Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 67 tubes eppendorfs nuclease-free après avoir enlevé l‟excès de paraffine. Les échantillons ainsi collectés ont été acheminés au laboratoire de Biologie moléculaire et de génétique (CERBA/LABIOGENE, Université de Ouagadougou) pour les analyses moléculaires. Les figures 11 et 12 présentent respectivement les blocs de paraffine contenant les tissus du col de l‟utérus et le microtome, appareil ayant servi à faire les sections de tissus. Figure 11 : Blocs de paraffines contenant les tissus archivés du col de l'utérus Figure 12 : Microtome LEICA-RM-2135 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 68 II.2.5. Extraction de l’ADN du HPV II.2.5.1. Extraction de l’ADN du HPV à partir des échantillons obtenus par l’écouvillonnage du canal endocervical L‟ADN du HPV a été extrait à partir du liquide biologique contenant les cellules de la jonction pavimento-cylindrique issu de l‟écouvillonnage endocervical conservé dans le Transport medium à -20°C. Cette extraction a été faite à l‟aide du kit «DNA-Sorb-A» (Sacace biotechnologies®, Italie, Ref K-1-1/A, lot 12J12I705), en suivant le protocole fourni par le fabricant (confère Annexe 6). II.2.5.2. Extraction de l’ADN du HPV à partir des tissus fixés et inclus en paraffine Le kit FFPE DNA Purification (NORGEN BIOTEK, Canada) a servi à extraire l‟ADN du HPV à partir des tissus archivés fixés au formol et inclus en paraffine et conservés de 2009 à 2015. Avant de procéder à l‟extraction proprement dite, les échantillons ont été déparaffinés avec du xylène. Déparaffinage des échantillons du Bénin: il a consisté à ajouter 1mL de xylène aux échantillons, mixer au vortex et incuber à 50°C pendant 5 min ; centrifuger à 14000 RPM pendant 2min ; jeter le surnageant sans perturber le culot ; ajouter 1mL d‟éthanol absolu, mixer au vortex et centrifuger pendant 2min à 14000 RPM ; jeter le surnageant et répéter cette étape puis sécher le culot à température ambiante. Il est important de faire évaporer complètement l‟éthanol à cette étape. Déparaffinage des échantillons du Burkina Faso : les échantillons de Ouagadougou étaient fixés au Bouin dans la majorité des cas. Le bouin est connu pouvant rendre impossible l‟immunohistochimie ou inhiber la PCR. Alors les échantillons ont été traités avec du PBS 10% et le protocole de déparaffine a été donc modifié comme suit : Un (1) mL de xylène a été ajouté à l‟échantillon, mixé au vortex et incubé à 50°C pendant 10 minutes puis centrifuger à 14000 RPM pendant 2 minutes. Après centrifugation, le surnageant été éliminé et l‟étape a été répété avec le xylène pour une deuxième fois. Après l‟étape de xylène, nous avons ajouté 1 mL d‟éthanol absolu à l‟échantillon que nous avons ensuite mixé au vortex puis centrifugé à 14000 RPM pendant 2 minutes. Le surnageant a été jeté et l‟étape à l‟éthanol a été répété pour une seconde fois. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 69 Après l‟élimination de l‟éthanol la deuxième fois, nous avons ajouté 1 mL de solution de PBS 10%, que nous avons passé au vortex, puis centrifugé à 14000 RPM pendant 2 minutes. Nous avons éliminé le PBS et repris une deuxième fois cette étape. Nous avons ensuite fait sécher l‟échantillon à la température ambiante car il est important de faire disparaître toute trace de PBS. Le séchage peut prendre environ 3 heures. Extraction proprement dite : après le déparaffinage au xylène, l‟extraction proprement dite de l‟ADN du HPV a consisté en l‟application des étapes suivantes : la lyse des cellules, le chauffage par incubation à 50°C pendant 1heure suivi de 90°C pendant 1 heure pour faire libérer le matériel génétique, la précipitation de l‟ADN avec l‟éthanol absolu, la fixation de l‟ADN aux colonnes suivie de trois séries de lavage des colonnes et l‟élution de l‟ADN. Cette extraction a été faite en suivant le protocole décrit par le fabricant (confère annexe 7). L‟extrait d‟ADN ainsi obtenu a été conservé au congélateur à -80°C en attendant l‟amplification par PCR. La figure 13 illustre les différentes étapes de l‟extraction de l‟ADN à partir des tissus fixés et inclus en paraffine. 4 1 5 2 6 3 Figure 13 : Illustration des principales étapes de l’extraction d’ADN à partir des tissus fixés et inclus en paraffine (Qiagen, 2010) Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 70 II.2.6. Tests PCR en temps réel II.2.6.1. Principe de la PCR en temps réel Le principe de la PCR en temps réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction d‟amplification enzymatique au moyen d‟une molécule reporter fluorescente capable d‟émettre dans des conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l‟intensité sera directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR (Tse, 2003). II.2.6.2. Détection des génotypes HPV-HR par PCR en temps réel La PCR a été faite sur l‟appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 (Sacace Biotechnologie, Italie). La durée de l‟amplification était de 1heure 45 minutes pour une plaque. Une plaque de 96 puits correspondait à 21 échantillons. Au total pour la PCR des 688 échantillons, nous avons réalisée plus de 3000 réactions PCR en sachant qu‟il faut 4 réactions PCR pour chaque échantillon et 8 à 12 réactions PCR pour les contrôles à chaque plaque. Détection des génotypes avec le kit « HPV High Risk Typing Real-TM» Ref TV26100FRT, lot 17J12P486 (Sacace biotechnologies®, Italie) La première et la deuxième étude ont utilisé un kit d‟amplification permettant de rechercher 12 génotypes HPV à haut risque. Le protocole de préparation du mélange réactionnel PCR était le suivant : nous avons ajouté 60 μL de Hot Start DNA Polymerase dans 1,1 mL de PCRbuffer-FRT et mixé au vortex. Quatre-vingt-dix (90) μL de ce Mix a été ajouté dans chacun des quatre tubes PCR-mix-1 à savoir : PCR-mix-1 « 16, 18, 31 », PCR-mix-1 « 39, 45, 59 », PCR-mix-1 « 33, 35, 56 » et PCR-mix-1 « 51, 52, 58 » puis nous avons mixé au vortex. Ensuite, nous avons introduit 8μL de cette réaction Mix « 16, 18, 31 » dans le premier tube PCR, 8μL de la réaction Mix « 39, 45, 59 » dans le deuxième tube PCR, 8μL de la réaction Mix « 33, 35, 56 » dans le troisième tube PCR et 8μL de la réaction Mix « 51, 52, 58 » dans le quatrième tube PCR. Nous avons ajouté 5μL d‟ADN des différents échantillons dans les quatre tubes PCR correspondant à l‟échantillon. Nous avons préparé 4 contrôles négatifs et 4 contrôles positifs en ajoutant 5μL de DNA-buffer dans les 4 tubes PCR correspondant au contrôle négatif et 5μL de Positive Controls C+ dans les 4 tubes PCR correspondant au contrôle positif. Le volume total de la réaction était de 13 μL. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 71 Détection des génotypes avec le kit « HPV Genotypes 14 Real-TM Quant » (Sacace biotechnologies®, Italie, Ref V67-100FRT) Pour la troisième étude sur les lésions précancéreuses et cancéreuses histologiquement confirmées à Parakou et à Ouagadougou, nous avons utilisé un kit d‟amplification permettant de rechercher 14 génotypes HPV à haut risque. Il s‟agit du kit « HPV Genotypes 14 Real-TM Quant » qui est un test PCR en temps réel multiplexe in vitro, pour la détection qualitative et quantitative et le génotypage de 14 HPV-HR (HPV-16 ; 18 ; 31 ; 33 ; 35 ; 39 ; 45 ; 51 ; 52 ; 56 ; 58 ; 59 ; 66 et 68). Ces génotypes HPV-HR (de la famille des Papillomaviridae), analysés dans cette étude appartiennent au genre Alphapapillomavirus et aux espèces Human papillomavirus 5, 6, 7 et 9. Chaque échantillon a fait l‟objet d‟amplification multiplexe dans 4 tubes et chaque tube contenait des amorces des régions cibles (gène L1 et oncoprotéines E6 et E7) de trois ou quatre types de HPV-HR et du gène bêta-globine humain comme contrôle interne. S‟il y a un excès de paraffine ou une quantité insuffisante de cellules épithéliales, le contrôle interne peut ne pas être détecté. Pour chaque échantillon nous avons respectivement pour les 4 tubes : PCR-mix-1 16, 18, 31, IC ; PCR-mix-1 39, 45, 59, IC ; PCR-mix-1 33, 35, 56, 68 ; PCR-mix-1 51, 52, 58, 66. Les étapes pré-PCR ont consisté à : préparer la solution Mix (PCR-buffer-FRT + Hot Start DNA Polymerase) et la solution Reaction Mix (solution Mix + chaque PCR-mix-1). Introduire, pour chaque échantillon, 15 μL de la solution Reaction Mix dans les 4 tubes et ajouter 10 μL de l‟ADN extrait. Le volume total de la réaction était de 25 μL. Ce mélange réactionnel PCR contenu dans des microtubes stériles de 0,2 mL a été introduit sur la plaque du SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 (Sacace Biotechnologie, Italie) pour amplification. Le programme d’amplification était le même pour les deux kits d‟amplification: un (1) cycle de 95°C pendant 15 minutes ; cinq (5) cycles de 95°C pendant 5secondes suivi de 60°C pendant 20 secondes et de 72°C pendant 15 secondes ; et enfin 40 cycles de 95°C pendant 5secondes suivi de 60°C pendant 30 secondes et 72°C pendant 15 secondes. La figure 14 montre distribution des échantillons sur la plaque du SaCycler-96. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 72 Figure 14 : Distribution des échantillons sur la plaque du SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 (Sacace Biotechnologie, Italie) (Sacace, 2014) Interprétation des résultats Nous avons quatre types de fluorescences à savoir : Fam, Hex/Joe, Rox et Cy5. La PCR est valide si les contrôles positifs et les standards ont un signal pour tous les fluorochromes Fam, Hex/Joe, Rox et Cy5 et aucun signal pour le contrôle négatif. La figure 15 montre un exemple de l‟‟intensité des fluorescences Fam, Hex, Rox, Cy5 émises en fonction du nombre de cycle. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 73 Figure 15 : Exemple d’intensité de fluorescences FAM/HEX/ROX/CY5 émises en fonction du nombre de cycle (Sacace, 2014) Les résultats sont interprétés avec le Programme Microsoft Excel „„HPV Typing Real-Time Results Matrix.xls’’ du kit « HPV High Risk Typing Real-TM» (Sacace biotechnologies®, Italie) et le programme Microsoft Excel « HPV Genotypes 14 Real-TM.xls » du kit « HPV Genotypes 14 Real-TM Quant » (Sacace biotechnologies®, Italie) fournis par le fabricant. Les figures 16 et 17 illustrent le programme Microsoft Excel « HPV Genotypes 14 RealTM.xls » (Sacace biotechnologies®, Italie). Figure 16 : Interprétation des résultats pour la détection des génotypes HPV-HR (Sacace, 2014) Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 74 Legende : FAM détecte les génotypes HPV 16, 39, 33,58 ; JOE/HEX détecte les génotypes HPV 31, 45, 35,52 ; ROX détecte les génotypes HPV 18, 59, 68, 66 ; Cy5 détecte les génotypes HPV 56 et 51 (dans les tubes PCR-mix-1 “33-35-56-68” et PCRmix-1 “51-52-5866”). Figure 17 : Programme Microsoft ® Excel “HPV Genotype 14 Real-TM.xls” (Sacace, 2014) II.2.7. Analyses statistiques Les données ont été traitées et analysées sur micro-ordinateur à l‟aide des logiciels SPSS 17 .0, Epi Info 6. et Microsoft Office Excel 2007. Le test de Chi carré a été utilisé pour les comparaisons des proportions. La différence a été significative pour p <0,05. L‟intervalle de confiance à 95%, (95% CI) de la prévalence des pathologies a été calculé pour déterminer la précision des données. II.2.8. Considérations éthiques Cette étude a obtenu l‟approbation du Comité d‟Ethique pour la Recherche en Santé du Burkina Faso (CERS), du comité d‟éthique de l‟Hôpital Saint Camille, du Comité d‟Ethique de Recherche CER-ISBA de la République du Bénin et l‟autorisation des responsables des services d‟anatomie et de cytologie pathologiques du CHUD-B/A et du CHU-YO. L‟étude a Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 75 été réalisée en tenant compte du consentement libre et éclairé des femmes et des adolescentes. Le respect de la confidentialité et l‟anonymat par rapport aux informations fournies était de mise. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 76 CHAPITRE III : RESULTATS CHAPITRE III : RESULTATS III.1. Résultats des travaux de la première étude Prévalence des génotypes HPV à haut risque dans trois populations de femmes à Ouagadougou (Burkina Faso). L‟objectif de cette étude était de caractériser par PCR en temps réel les génotypes HPV au sein des familles 30‟S et 50‟S et leur prévalence chez les femmes de la population générale et les femmes VIH séropositives à Ouagadougou. III.1.1. Contexte et but de la première étude Deux études antérieurs réalisées dans notre laboratoire à Ouagadougou en 2011 par Djigma et al., et Ouédraogo et al., avaient montré une prévalence élevée des HPV-HR 30‟S et 50‟S (Djigma et al., 2011 ; et Ouédraogo et al., 2011). Mais le kit utilisé ne permettait pas de préciser les différents génotypes HPV au sein des familles 30‟S et 50‟S. Cette première étude était en partie, une suite des deux études antérieures. Le but de cette étude était de déterminer d‟une part, les différents génotypes au sein des familles HPV-30‟S et HPV-50‟S détectés dans deux de nos études antérieures par la technique PCR/Hybridation et d‟autre part, de diagnostiquer par PCR en temps réel, douze génotypes HPV-HR chez des femmes de la population générale à Ouagadougou. III.1.2. Résultats du premier article Prévalence des genotypes HPV à haut risque (HPV-30’s et HPV-50’s) dans trois populations de femmes à Ouagadougou (Burkina Faso). Theodora M. Zohoncon, Cyrille Bisseye, Florencia W. Djigma, Albert T. Yonli, Tegwinde R. Compaore, Tani Sagna, Djeneba Ouermi, Charlemagne M.R. Ouédraogo, Virginio Pietra, Jean-Baptiste Nikiéma, Simon A. Akpona and Jacques Simpore. Prevalence of HPV HighRisk Genotypes in Three Cohorts of Women in Ouagadougou (Burkina Faso). Mediterr J Hematol Infect Dis 2013; 5(1):e2013059. doi: 10.4084/MJHID.2013.059. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 78 Population d’étude Cent quatre-vingt (180) femmes réparties en trois (3) populations ont été retenues dans cette étude. La population générale 1 était constituée de 63 femmes de statut HPV inconnu recrutées de novembre 2012 à janvier 2013. Ces femmes ont également bénéficié d‟un dépistage des lésions précancéreuses par IVA/IVL. La population générale 2 était constituée de 34 femmes dépistées positives pour les HPV à haut risque HPV30‟S et HPV50‟S par l‟étude de Ouédraogo et al. en 2011. La population de femmes VIH-1 séropositives était constituée de 83 femmes diagnostiquées positives au HPV 30‟S et/ou HPV50‟S par l‟étude de Djigma et al. en 2011. Caractéristiques sociodémographiques, sexuelles et comportementales des femmes infectées au HPV-HR Le tableau V présente les caractéristiques sociodémographiques des femmes incluses dans l‟étude. Les moyennes d‟âge des femmes des populations générales 1 et 2 infectées au HPVHR étaient respectivement de 33,2 ± 8,3 ans (21-51) et de 31,5 ± 10,3 ans (19-60). Chez les femmes VIH-1 séropositives, l‟âge moyen était de 33,7 ± 6,2 ans (20-53). La majorité des femmes infectées au HPV-HR était mariée et avait un faible niveau d‟éducation. La quasi-totalité des femmes de l‟étude avait un seul partenaire sexuel. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 79 Tableau V : Caractéristiques sociodémographiques, sexuelles et comportementales des femmes infectées au HPV à haut risque Age ≤ 30 ans >30 ans Age au moment du premier rapport sexuel ˂ 20 ans ≥ 20 ans Non précisé Utilisation de préservatif Oui Non Parfois Non précisé Contraception orale Oui Non Non précisé Nombre de partenaires sexuels Aucun 1 ≥2 Non précisé Situation matrimoniale Célibataire Mariée Veuve Divorcée Niveau d’éducation Aucun Primaire Secondaire Supérieure Consommation de tabac Oui Non Statut VIH Inconnu Négatif Positif Femmes de la population générale 1 HPV positif n (%) Femmes de la population générale 2 HPV positif n (%) Femmes VIH séropositives 8(42,1) 11(57,9) 21(61,8) 13(38,2) 27(32,5) 56(67,5) 11(57,9) 8(42,1) - 25(73,5) 9(26,5) - 50(60,2) 19(22,9) 14(16,9) 3(15,8) 12(63,2) 4(21 ,0) - 2(5,9) 19(55,9) 8(23,5) 5(14,7) 31(37,3) 14(16,9) 15(18,1) 23(27,7) 1(5,3) 18(94,7) - 5(14,7) 29(85,3) - 61(73,5) 21(25,3) 1(1,2) 0(0,0) 19(100) 0(0,0) - 0(0,0) 28(82,4) 1(2,9) 5(14,7) 0(0,0) 52(62,7) 0(0,0) 31(37,3) 6(31,6) 11(57,9) 2(10,5) - 9(26,5) 24(70,6) 1(2,9) - 12(14,5) 43(51,8) 18(21,7) 10(12,0) 10(52,6) 4(21,1) 2(10,5) 3(15,8) 12(35,3) 5(14,7) 10(29,4) 7(20,6) 28(34,1) 29(35,4) 22(26,9) 3(3,7) 0(0,0) 19(100) 0(0,0) 34(100) 0(0,0) 83(100) 7(36,8) 9(47,4) 3(15,8) - 0(0,0) 0(0,0) 83(100) Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 HPV positif n (%) Page 80 Prévalence des génotypes HPV-HR Les douze (12) génotypes HPV ont été identifiés chez les femmes. Le Tableau VI montre la répartition des génotypes HPV-HR chez les femmes de la population générale 1. Les génotypes HPV-HR les plus fréquents chez l‟ensemble des 180 femmes étaient respectivement HPV 35 (29,4%) et HPV 52 (29,4%) suivi de HPV 31 (26,1%), HPV-18 (25,0%), HPV 58 (20,6%), HPV 56 (18,9%), HPV 51 (14,4%), HPV 59 (13,9%), HPV 45 (12,8%) et HPV 33 (11,1%). Les génotypes les moins fréquents étaient les HPV 16 (7,2%) et HPV 39 (6,7%). Chez les femmes VIH-1 séropositives, le génotype le plus fréquent, était le HPV 35 avec une prévalence de 49,4% tandis que HPV 39 (9,6%) était le génotype le moins fréquent. Parmi les femmes de la population générale 1, nous avons 30,20% (19/63) de femmes qui étaient infectées par au moins un HPV-HR. HPV 52 (15, 9%) était le plus prévalent chez ces dernières et HPV16 (1,6%) le moins fréquent. La prévalence cumulée des HPV30‟S et HPV50‟S était de 43,0% dans la population générale 1. Tandis que le génotype le plus fréquent dans la population générale 2 était le HPV 52 (14,50%) suivi des génotypes HPV 58 (13,3%), HPV 35 (10,8%) et HPV 31 (8,4%) (Tableau VI). Le tableau VII présente les fréquences des douze génotypes HPV-HR chez les femmes VIH séropositives et les femmes de statut VIH inconnu. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 81 Tableau VI : Prévalence des douze génotypes HPV-HR chez les 63 femmes de la population générale de statut HPV inconnu HPV Génotypes HPV-52 10 (15,9) Intervalle de Confiance 95% 8,3-27,7 HPV-18 4 (6,3) 2,1-16,3 HPV-31 4 (6,3) 2,1-16,3 HPV-35 3 (4,8) 1,2-14,2 HPV-45 3 (4,8) 1,2-14,2 HPV-51 3 (4,8) 1,2-14,2 HPV-39 2 (3,2) 0,6-12,0 HPV-56 2 (3,2) 0,6-12,0 HPV-58 2 (3,2) 0,6-12,0 HPV-16 1 (1,6) 0,1-9,7 HPV-59 1 (1,6) 0,1-9,7 HPV-33 0 (0,0) 0,0-7,2 19 (30,2) 19,6-43,2 Total HPV-HR Prévalence n (%) Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 82 Tableau VII : Fréquence des douze génotypes HPV-HR chez les femmes VIH séropositives et les femmes de statut VIH inconnu VIH+ Statut VIH inconnu N = 83 N = 53 HPV Fréquence Intervalle de Confiance Génotypes n (%) 95% Fréquence Odds Ratio n (%) Intervalle de Confiance 95% HPV-35 41 (49,4) 38,3-60,5 12 (22,6) 12,7-36,6 3,3 (1,5-7,8) <0,01 HPV-18 36 (43,4) 32,7-54,7 9 (17,0) 8,5-30,3 3,7 (1,5-9,5) <0,01 HPV-31 36 (43,4) 32,7-54,7 11 (20,8) 11,3-34,5 2,9 (1,2-7,0) <0,01 HPV-52 31 (37,3) 27,2-48,7 22 (41,5) 28,4-55,8 0,8 (0,4-1,8) NS HPV-56 25 (30,1) 20,8-41,3 9 (17,8) 8,5-30,3 2,1 (0,8-5,4) NS HPV-58 24 (28,9) 19,7-40,1 13 (24,5) 14,2-38,6 1,3 (0,5-3,0) NS HPV-59 19 (22,9) 14,7-33,7 6 (11,3) 4,7-23,7 2,3 (0,8-7,1) NS HPV-33 18 (21,7) 13,7-32,4 2 (3,8) 0,7-14,1 7,0 (1,5-46,3) <0,01 HPV-51 18 (21,7) 13,7-32,4 8 (15,1) 7,2-28,1 1,6 (0,6-4,3) NS HPV-45 15 (18,1) 10,8-28,4 8 (15,1) 7,2-28,1 1,2 (0,5-3,5) NS HPV-16 10 (12,0) 6,2-21,5 3 (5,7) 1,5-16,6 2,3 (0,5-11,1) NS HPV-39 8 (9,6) 4,6-18,6 4 (7,5) 2,5-19,1 1,3 (0,3-5,5) NS (Intervalle de Confiance 95%) p values Légende: NS = non significatif Nombre de génotypes HPV-HR par femme infectée Le nombre de génotypes HPV-HR par femme variait de 1 à 7, chez les femmes VIH-1 séropositives et de 1 à 5 chez les femmes de la population générale. La moyenne du nombre de génotype HPV-HR était significativement plus élevée chez les femmes VIH-1 séropositives (3,5 ± 1,52) comparativement aux femmes de la population générale (2,1 ± 1,17) (p<0,001). En plus la majorité des femmes VIH-1 séropositives (74,1%) avait au Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 83 minimum 3 génotypes HPV-HR tandis que la majorité des femmes de la population générale (66,7%) avait au maximum 2 génotypes HPV-HR (tableau VIII). L‟infection multiple au HPV-HR a été observée chez 78,03% des femmes de l‟étude, mais elle était de 90,1% chez les femmes VIH-1 séropositives. Tableau VIII : Nombre de génotypes HPV par femme infectée Nombre de génotypes HPV identifiés chez chaque femme Nombre de femmes VIH positif Effectif 1 2 3 4 5 6 7 Total 08 13 24 16 12 05 03 81 (%) 09,9 16,0 29,6 19,8 14,8 06,2 03,7 100 Nombre de femmes de la population générale Nombre absolu 21 13 10 05 02 00 00 51 (%) 41,2 25,5 19,6 09,8 03,9 00,0 00,0 100 III.1.2.1 Conclusion partielle Les résultats de cet article montrent une prédominance des génotypes HPV-35, HPV-52, HPV-31 et HPV-18 dans les trois groupes de population, tant chez les femmes VIH séropositives que chez les femmes de la population générale 1 et 2. De plus le génotype le plus fréquent était HPV-35 chez les femmes VIH séropositive et HPV-52 chez les femmes de la population générale. Le HPV-16 était moins fréquent dans les trois groupes de population. Des infections multiples étaient notées dans les différents groupes surtout chez les femmes VIH séropositives. De même, la moyenne du nombre de génotypes HPV-HR par femme, était significativement plus élevée chez les femmes VIH séropositives que chez les femmes de la population générale. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 84 III.2. Résultats des travaux de la deuxième étude Epidémiologie et caractérisation des génotypes à haut risque de Papillomavirus Humain dans une population d’adolescentes sexuellement actives à Ouagadougou. L‟objectif de cette étude était de déterminer les génotypes et la prévalence de l‟infection à HPV-HR chez les adolescentes à Ouagadougou. III.2.1. Contexte et but de la deuxième étude Les adolescentes constituent une couche vulnérable aux infections sexuellement transmissible (IST) car elles courent un grand risque de contracter une infection au HPV (considérée comme l‟IST la plus fréquente au monde) lors des premiers rapports sexuels. L‟infection au HPV survenant sur des tissus encore fragiles comme ceux des adolescentes, favorise le portage chronique. Cette étude avait pour but d‟étudier le portage des génotypes HPV-HR circulant et leur prévalence chez les adolescentes à Ouagadougou. III.2.2. Résultats du deuxième article Epidémiologie et caractérisation des génotypes de Papillomavirus humains à haut risque dans une population d’adolescentes sexuellement actives à Ouagadougou. Ouédraogo CM, Rahimy RM, Zohoncon TM, Djigma FW, Yonli AT, Ouermi D, Sanni A, Lankoande J, Simpore J. Epidemiology and characterization of high-risk genotypes of human Papillomavirus in a population of sexually active adolescents in Ouagadougou. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris). 2015 Jan 27. pii: S0368-2315(15)00004-6. doi:10.1016/j.jgyn.2014.12.021. Population d’étude La participation à l‟étude a été proposée à 219 adolescentes. Deux cent (200) adolescentes avaient donné leur consentement et ont été incluses dans l‟étude soit un taux de participation de 91,3% (200/219). Pour les 19 adolescentes non incluses, 7 ont décliné leur participation, 9 étaient enceintes et 3 étaient en période menstruelle. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 85 Caractéristiques sociodémographiques et comportementales des adolescentes L‟âge des adolescentes variait de 15 à 19 ans avec une moyenne de 18,7 ± 0,7 ans. Les adolescentes âgées de 19 ans représentaient 77,5% des cas (155/200). Toutes les adolescentes incluses dans l‟étude résidaient en milieu urbain à Ouagadougou. Dans 99,0% des cas, les adolescentes étaient instruites, c'est-à-dire scolarisées (198/200). Seulement 5,5% (11/200) des adolescentes étaient en situation de vie maritale. L‟âge déclaré au premier rapport sexuel variait de 13 à 19 ans avec une moyenne de 17,2 ± 1,4 ans. Le nombre de partenaires sexuels déclarés par les adolescentes depuis le début de leur vie sexuelle, variait de 1 à 10 avec une moyenne de 2,1 ± 1,6. Dans 56,5% des cas, les adolescentes avaient déclaré avoir eu deux partenaires ou plus depuis le début de leur vie sexuelle (113/200). Les adolescentes de 19 ans représentaient 82,3% de celles ayant eu deux partenaires sexuels ou plus depuis le début de l‟activité sexuelle (93 /113). L‟évaluation du niveau de connaissance des adolescentes sur le cancer du col de l‟utérus et les IST, a montré que : les adolescentes n‟avaient jamais entendu parler du cancer du col de l‟utérus et du HPV dans respectivement 34,5% et 97,5% des cas. Dans 95,5% des cas, les adolescentes savaient ce qu‟est une IST et citaient le préservatif comme un moyen de prévention. Le tableau IX montre les caractéristiques sociodémographique et comportementale des adolescentes. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 86 Tableau IX : Caractéristiques sociodémographiques et comportementales des adolescentes Caractéristiques Niveau d’instruction Non instruites Primaire et post-primaire Secondaire Universitaire Statut marital Mariée ou en concubinage Seule Age au moment du premier rapport sexuel ˂ 14 ans 14 ans ˂ âge ˂ 16 ans 16 ans ˂ âge ˂ 18 ans ≥ 18 ans Utilisation du préservatif Jamais Occasionnellement Toujours Connaissance du HPV comme agent responsable du cancer du col de l’utérus Oui Non A déjà entendu parler du cancer du col de l’utérus Oui Non A déjà fait un test de dépistage du cancer du col utérin Oui (IVA / IVL) Non Utilisation de moyen de contraception Oui Non Antécédent d’infection génitale Oui Non A déjà eu une IST Oui Non A déjà fait un test VIH Oui Non Nombre Pourcentage (%) 02 58 98 42 01 29 49 21 11 189 05,5 94,5 03 19 80 98 01,5 09,5 40 49 24 102 74 12 51 37 05 195 02,5 97,5 131 69 65,5 34,5 01 199 00,5 99,5 162 38 81 19 179 21 89,5 10,5 17 183 08,5 91,5 130 70 65 35 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 87 Caractéristiques cliniques Les principaux motifs de consultation étaient : les leucorrhées (58,5%) ; le dépistage du cancer du col de l‟utérus (16,5%) ; les dysménorrhées (14,5%) ; les troubles du cycle (11,5%) ; la contraception (8%) et le dépistage volontaire du VIH (6%). Parmi les adolescentes, 4,5% (9/200) avaient des condylomes au niveau du col de l‟utérus. L‟IVA / IVL était positive chez 6,0% des adolescentes (12/200). Prévalence de l’infection à HPV et caractérisation des génotypes de HPV à haut risque La prévalence de l‟infection au HPV à haut risque était de 41,5% (83/200). Le nombre de génotypes par adolescente variait de 1 à 5 avec une moyenne de 1,6 ± 0,6 génotypes. L‟infection multiple au HPV à haut risque était de 42,17% (35/83) chez les adolescentes. Le HPV-52 représentait 23,8% des génotypes présents dans les infections multiples (21/88). La co-infection par HPV-16 et 18 n‟a pas été retrouvée. La figure 18 présente la fréquence des différents HPV-HR et le tableau X présente la fréquence des différentes associations de génotypes de HPV-HR dans les infections multiples. Figure 18 : Fréquence des génotypes de HPV-HR chez les adolescentes à Ouagadougou Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 88 Tableau X : Associations de génotypes de HPV-HR dans les infections multiples Associations HPV 35 + 39 HPV 52 + 59 HPV 39 + 52 + 59 HPV 31 + 33 HPV 35 + 45 HPV 52 + 16 HPV 52 + 18 HPV 52 + 31 HPV 52 + 39 HPV 52 + 56 HPV 52 + 51 HPV 56 + 18 HPV 56 + 35 HPV 56 + 51 HPV 56 + 59 HPV 59 + 39 HPV 59 + 51 HPV 31 + 51 + 56 HPV 31 + 45 + 51 HPV 18 + 39 +59 HPV 39 + 51 +52 HPV 51 + 52 + 59 HPV 18 + 51 + 52 HPV 35 + 39 + 52 + 59 HPV 35 + 39 + 52 + 58 HPV 16 + 39 + 52 + 59 HPV 16 + 18 + 31 + 52 + 59 Effectif Pourcentage (%) 3 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8,6 8,6 5,7 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 Portage du HPV-HR en fonction des résultats de l’IVA / IVL Les génotypes retrouvés chez les adolescentes ayant l‟IVA/IVL positive et un test HPV positif, étaient par ordre décroissant HPV 56, HPV 51, HPV 52, HPV 59, HPV 31, HPV 35 et HPV 45. Le HPV 56 était retrouvé dans 25,0% des cas (3/12), suivi de HPV 51, HPV 52, HPV 59 à 16,7% chacun. Aucune association entre le portage de HPV et un résultat IVA positive et /ou IVL positive n‟a été trouvée (p ˃ 0,05). Le tableau XI présente l‟infection au HPV-HR en fonction des facteurs de risque chez les adolescentes. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 89 Tableau XI : Présence de HPV-HR en fonction des facteurs de risque chez les adolescentes et résultats IVA/IVL Facteurs de risque Présence de HPV HPV - N (%) HPV+ N (%) Non instruites 01 (50,0) 01 (50,0) Primaire et post-primaire 33 (56,9) 25 (41,1) Secondaire 59 (60,2) 39 (39,8) Universitaire 24 (57,1) 18 (42,9) Jamais 14 (58,3) 10 (41,7) Occasionnellement 58 (56,9) 44 (43,1) Toujours 45 (60,8) 29 (39,2) 03 à 10 27 (51,9) 25 (48,1) Non 58 (60,4) 38 (39,6) oui 59 (56,7) 45 (43,3) Non 110 (60,1) 73 (39,9) Oui 07 (41,2) 10 (58,8) Négatif 112 (59,6) 76 (40,4) Positif 05 (41,7) 07 (58,3) Négatif 111 (59,4) 76 (40,6) Positif 06 (46,2) 07 (53,8) p value Niveau d‟instruction 0,90 Utilisation du préservatif 0,87 Tabagisme passif 0,58 Antécédents IST 0,13 Résultat IVA 0,36 Résultat IVL Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 0,35 Page 90 Portage du HPV en fonction des facteurs associés à l’infection Aucune association n‟a été trouvée entre le portage du HPV et les facteurs suivant : l‟âge (p = 0,82) ; l‟âge au premier rapport sexuel (p = 0,53) ; le changement récent de partenaire sexuel (p = 0,72) ; la fréquence des rapports sexuels (p = 0,86) ; l‟utilisation ou la non utilisation du préservatif (p = 0,87) ; le statut matrimonial (p = 0,12) ; le niveau de connaissance sur le HPV et le cancer du col de l‟utérus (p ˃ 0,05). Néanmoins une association significative a été retrouvée entre le portage du HPV et le nombre de partenaires sexuels (p = 0,01). III.2.2.1. Conclusion partielle La prévalence de l‟infection au HPV-HR chez les adolescentes sexuellement actives à Ouagadougou était de 41,5%. Les adolescentes n'ayant pas encore fait leur clairance virale, cela explique la prévalence élevée du HPV-HR. La majorité des adolescentes n‟avait jamais entendu parler de l‟infection à HPV et la quasi-totalité de celles qui étaient infectées, avait une infection multiple au HPV-HR. Le HPV-52 était le génotype le plus fréquent chez les adolescentes, suivi des génotypes HPV-59, 39, 35, 51 et 56. On constate une faible fréquence des HPV-16 et 18. Aucune association n‟a été trouvée entre le portage du HPV et l‟IVA/IVL positif. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 91 III.3. Résultats des travaux de la troisième étude Distribution génotypique des HPV-HR dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales de haut grade et dans le cancer invasif du col de l’utérus, à Ouagadougou et à Parakou. L‟objectif de cette étude était de détecter les génotypes HPV-HR dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales et dans le cancer invasif du col de l‟utérus, à Ouagadougou et à Parakou. III.3.1. Contexte et but de la troisième étude Le cancer du col de l‟utérus est une tumeur maligne évitable dont la prévention repose sur la vaccination, le diagnostic et la prise en charge très précoce des lésions bénignes ou précancéreuses. Sachant que la persistance de l‟infection au HPV peut conduire aux lésions précancéreuses et cancéreuses du col de l‟utérus, il nous a paru important de connaitre les génotypes responsables de ces lésions précurseurs et cancéreuses, afin que ces génotypes soient pris en compte dans le développement des vaccins prophylactiques anti-HPV. Ainsi les tissus archivés qui sont une richesse inestimable pour les études rétrospectives, particulièrement dans le domaine de la biologie moléculaire et de la génétique, ont été retenus pour cette étude rétrospective. Au Burkina Faso, aucune étude n‟avait encore porté sur la distribution et la fréquence des HR-HPV dans les tissus archivés du cancer du col de l‟utérus et des CIN de haut grade, confirmés à l‟histologie. Cependant des études jusqu‟alors réalisées n‟ont porté que sur des prélèvements cellulaires du col de l‟utérus chez des femmes à statut anatomo-pathologique méconnu et/ou VIH positif. Ces études ont indiqué une prédominance des HPV 35, 52, 31 (Djigma et al., 2011; Ouédraogo et al. 2011 ; Zohoncon et al., 2013 ; Ouédraogo et al. 2015) et une faible prévalence des HPV16 et 18. Sur la base de ces résultats, nous avons émis l‟hypothèse d‟une possible émergence des HR-HPV autres que le HPV16 et 18. Dans le but d‟établir progressivement une cartographie des génotypes HPV circulant dans la sous-région, il était alors important d‟investiguer les pays voisins dont la république du Bénin, précisément la ville de Parakou. Ainsi, cette étude avait pour but : - d‟identifier les génotypes de HPV-HR associés aux lésions dysplasiques de haut grade du col de l'utérus à Ouagadougou, Burkina Faso ; Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 92 - de faire la distribution génotypique et de déterminer la prévalence des HPV-HR dans des cas de cancers du col de l‟utérus histologiquement confirmés à Ouagadougou (Burkina Faso) ; - de détecter les génotypes HPV-HR impliqués dans les néoplasies cervicales intra- épithéliales de haut grade et dans le cancer du col de l‟utérus histologiquement diagnostiqués à Parakou, République du Bénin. III.3.2. Résultats du troisième article Distribution des génotypes du Papillomavirus humain à haut risque dans les lésions précancéreuses du col de l’utérus, à Ouagadougou au Burkina Faso. Charlemagne Ouédraogo, Théodora Mahoukèdè Zohoncon, Esther M. A. Traoré, Souleymane Ouattara, Prosper Bado, Clarisse T. Ouedraogo, Florencia Djigma, Djénéba Ouermi, Dorcas Obiri-Yeboah, Simon A. Akpona, Olga Mélanie Lompo/Gombri, Jacques Simpore. Distribution of high-risk Human Papillomavirus genotypes in precancerous cervical lesions in Ouagadougou, Burkina Faso. Article soumis. Caractéristiques des échantillons collectés Cent dix-huit (118) tissus diagnostiqués lésions précancéreuses de haut grade selon le compte rendu du résultat d‟histologie ont été collectés. L‟âge des patientes variait de 22 à 74 ans avec une moyenne de 41,5 ± 9,8 ans. Histologie et PCR en temps réel Suite à l‟examen histologique, les différents échantillons ont été répartis selon la classification de Bethesda comme étant des néoplasies cervicales intra-épithéliales (CIN) de grade 2 ou 3 soit CIN 2 ou CIN 3. Parmi les échantillons, 46,6% ont présenté une cervicite (aigüe, subaigüe ou chronique). Ont été classés β-globine (-) les échantillons dont le gène du contrôle interne β-globine n‟a pas pu être amplifié. Dans notre étude, 63,6% soit 75/118 des échantillons sont β-globine (-) ; ils ont été déclarés inadéquats. Le résultat histologique et le résultat de la PCR sont indiqués dans le tableau XII. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 93 Tableau XII : Résultats histologiques et PCR Nombre % IC 95% p value Diagnostic histologique CIN 2 CIN 3 32 86 27,1 72,9 19,3 - 36,1 63,9 - 80,7 p < 0,001 Présence de β-globine β-globine + β-globine - 43 75 36,4 63,6 27,8 - 45,8 54,2 - 72,2 21 22 75 17,8 18,6 63,6 11,4 - 25,9 12,1 - 26,9 54,2 - 72,2 118 100 p < 0,001 Statut HPV HPV + HPV Inadéquat Total p < 0,001 Distribution des génotypes HPV-HR Les femmes qui étaient positives à au moins un génotype de HPV-HR étaient au nombre de 21 sur les 118, soit une proportion de 17,8%. Cependant, en tenant compte des résultats adéquats de la PCR, sur les 43 résultats adéquats, la prévalence des infections par HPV-HR était de 48,8% (21/43). Nous ne tiendrons compte que des résultats adéquats. Fréquence des différents génotypes de HPV-HR retrouvés Le kit utilisé permettait de caractériser 14 génotypes de HPV-HR. Il s‟agissait des HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 et 68. En cumulant les génotypes de HPV-HR, compte tenu du fait que certaines femmes étaient infectées par plus d‟un génotype, le nombre total de génotypes retrouvés était de 23 et 11 types de HPV-HR ont été trouvés sur les 14 recherchés. La figure 20 montre la fréquence des différents génotypes HPV-HR trouvés. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 94 Figure 19 : Fréquence des génotypes HPV-HR La prévalence de l‟infection à HPV 39 était la plus élevée avec une fréquence de 21,7%. Le génotype HPV 16 n‟a pas été détecté dans la population d‟étude. La prévalence des génotypes HPV 35 et HPV 45 était de 13% chacun. Les génotypes HPV 33, 51, 52 et 56 ont également la même prévalence de 8,7%. Les génotypes HPV 18, HPV 59 et HPV 68 représentaient respectivement 4,3%. Relation entre le diagnostic histologique et le génotype du HPV-HR Les génotypes HPV-HR trouvés au niveau des CIN 2 représentent 37,5% des 32 cas de CIN 2 diagnostiqués, tandis que les HPV-HR retrouvés au niveau des CIN 3 ne représentent que 12,8% des 86 cas de CIN 3 diagnostiqués (p = 0,003). On constate donc une différence statistiquement significative de la fréquence des HPV-HR entre les CIN 2 et les CIN 3. Les génotypes les plus fréquents au sein des CIN 2 étaient les HPV 39 et 45 tandis qu‟au sein des CIN 3 les génotypes les plus fréquents étaient les HPV 35, 39 et 52. Le tableau XIII donne les cas de CIN 2 et CIN 3 et le portage de HPV-HR correspondant. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 95 Tableau XIII : Distribution HPV-HR en fonctions des lésions histologiques CIN 2 et 3 Types histologiques CIN 2 Génotypes HPV HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 Total CIN 3 n= 32 % n = 86 % 0 0 0 1 1 3 3 1 0 1 0 1 0 1 12 0,0 0,0 0,0 3,1 3,1 9,4 9,4 3,1 00 3,1 0,0 3,1 0,0 3,1 37,5 0 1 1 1 2 2 0 1 2 1 0 0 0 0 11 0,0 1,2 1,2 1,2 2,3 2,3 0,0 1,2 2,3 1,2 0,0 0,0 0,0 0,0 12,8 Distribution des génotypes HPV-HR dans les cas d’infections multiples Les deux cas d‟infections multiples sont portés par des femmes de 31 et de 40 ans. Elles ont représentés 9,5% contre 90,5% pour les infections simples. Les deux associations étaient HPV 39 et 45 puis HPV 39 et 59. Le génotype HPV 39, qui est le génotype le plus représenté était présent dans 100% des cas d‟infections multiples. Répartition du portage du HPV-HR en fonction de la tranche d’âge Les femmes de la trentaine et la quarantaine sont les plus représentées. Il n‟a pas été observé de positivité à HPV dans la tranche d‟âge 20 à 29 ans. Le portage ou non du HPV est représenté dans le tableau XIV. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 96 Tableau XIV : Répartition HPV et tranche d'âge Tranche d’âge (%) 20 à 29 30 à 39 40 à 49 50 à 59 60 et plus Inconnu Total HPV + 0 (0) 8 (38,1) 8 (38,1) 2 (9,5) 2 (9,5) 1 (4,8) 21 HPV - 3 (13,6) 8 (36,4) 8 (36,4) 2 (9,1) 0 (0) 1 (4,5) 22 Le génotype HPV 39 était le seul que l‟on retrouve dans presque toutes les tranches d‟âge. Le génotype HPV 18 était retrouvé au niveau de la tranche d‟âge 30 à 39 ans. L‟infection à HPV-HR est généralisée à presque toutes les tranches d‟âge. Cependant, les tranches d‟âge de 30 à 39 ans et 40 à 49 ans étaient les plus représentatives. Les femmes de 30 à 39 ans ayant une dysplasie modérée CIN 2, ont totalisé 5 types de HPV, dont 3 génotypes sont le type HPV 45. La tranche d‟âge de 40 à 49 ans totalise 6 génotypes HPV-HR soit la moitié des génotypes retrouvés dans les cas de CIN 2, contre 3 génotypes au niveau des CIN 3. La tranche d‟âge de 50 à 59 ans diagnostiqués CIN 3 ont enregistré 2 types de génotypes HPV-HR à savoir HPV 39 et HPV 52. Celles diagnostiquées CIN 2 n‟ont enregistré aucun génotype. Les femmes de plus de 60 ans totalisent 2 types de HPV de la famille des 30 à savoir les génotypes HPV 39 et HPV 33. La tranche d‟âge 20 à 29 ans est la seule tranche d‟âge qui n‟a reporté aucun génotype. Le tableau XV montre la relation entre le résultat histologique, la tranche d‟âge et le portage du génotype HPV. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 97 Tableau XV : Relation entre résultat histologique, tranche d'âge et HPV Histologie et génotypes CIN 2 CIN 3 Tranche d’âge 20 à 29 30 à 39 40 à 49 50 à 59 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 HPV 51 HPV 56 HPV 59 HPV 68 Total 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 1 0 0 0 5 1 1 1 0 0 1 1 1 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 et plus 0 0 1 0 0 0 0 0 1 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 51 HPV 52 HPV 56 Total 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 4 0 0 0 2 0 0 0 1 3 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 1 Inconnu Total 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 3 3 1 1 1 1 12 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 1 2 1 11 III.3.2.1. Conclusion partielle La prévalence de l‟infection au HPV-HR était de 48,8% dans les CIN de haut grade, en considérant les résultats adéquats à la PCR. Nous avons noté une différence statiquement significative de la fréquence des HPV-HR entre les CIN 2 et les CIN 3. Le génotype le plus fréquent était HPV-39 suivi de HPV-35, 45, 33, 51, 52, 56, 18, 31, 59 et 68. Les HPV-16, 58 et 66 n‟ont pas été détectés. Les génotypes HPV prédominant dans les CIN 2 étaient les HPV 39 et 45 tandis que ceux plus fréquents dans les CIN 3 étaient les HPV 35, 39 et 52. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 98 III.3.3. Résultats du quatrième article Prévalence et distribution génotypique des Papillomavirus humains à haut risque dans des échantillons de cancers du col de l’utérus à Ouagadougou, Burkina Faso. Théodora Mahoukèdè Zohoncon, Prosper Bado, Esther M. A. Traoré, Souleymane Ouattara, Florencia Djigma, Djénéba Ouermi, Charlemagne Ouédraogo, Simon A. Akpona, Olga Mélanie Lompo/Gombri, Jacques Simpore. Prevalence and distribution of high-risk Human Papillomavirus genotypes in cervical cancer samples in Ouagadougou, Burkina Faso Article soumis. Un total de 112 blocs de tissus du col de l‟utérus inclus en paraffine diagnostiqués et archivés entre 2009 et 2015 ont été inclus dans l‟étude. La moyenne d‟âge des femmes concernées était de 46,36 ± 12,94 ans (21 à 84 ans). Le tableau XVI montre les types histologiques du cancer du col de l‟utérus en fonction des tranches d‟âge. Tableau XVI : Types histologiques du cancer du col de l’utérus en fonction des tranches d’âge Types histologiques Tranche d’âge Carcinome Adénocarcinome Total (%) épidermoïde <25 2 (01,98) 0 (00,00) 02 (01,79) 25 à 34 15 (14,85) 2 (18,18) 17 (15,18) 35 à 44 35 (34,65) 0 (00,00) 35 (31,25) 45 à 54 22 (21,78) 3 (27,27) 25 (22,32) ≥ 55 27 (26,73) 6 (54,55) 33 (29,46) Total 101 11 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 112 (100,00) Page 99 Les carcinomes épidermoïdes (SCC) étaient plus fréquents que les adénocarcinomes (ADC). Cinquante pourcent (50,00%) des SCC étaient retrouvés chez les femmes âgées de 35 à 54 ans. A l‟issue de la caractérisation moléculaire des 112 échantillons, 41,96% (47/112) des échantillons avaient un résultat inadéquat (ni HPV-HR détecté ni bêta-globine détecté) et 58,04% (65/112) avait un résultat adéquat (PCR positifs et PCR négatifs). Parmi les résultats adéquats, 47 (72,31% ; 47/65) échantillons étaient positifs au HPV et 18 (27,69% ; 18/65) échantillons étaient négatifs. En cumulant les génotypes de HPV-HR, compte tenu du fait que certaines femmes étaient infectées par plus d‟un génotype, le nombre total de génotypes retrouvés était de 70. Au total, 11 génotypes sur les 14 génotypes recherchés ont été identifiés avec une fréquence variant entre 25,71% et 1,43% (Tableau XVII). Parmi les génotypes retrouvés, les plus fréquents, dans l‟ordre décroissant, étaient les HPV18 (25,71%), HPV31 (15,71%), HPV39 (12,86%), HPV16 (12,86%) et HPV45 (12,86%), HPV35 (7,14%) et HPV58 (5,71%) (Tableau XVII). Tableau XVII : Fréquence des génotypes HR-HPV Génotype Effectifs HPV N (%) HPV18 18 (25,71) 16,01-37,56 HPV31 11 (15,71) 08,11-26,38 HPV39 09 (12,86) 06,05-23,01 HPV45 09 (12,86) 06,05-23,01 HPV16 09 (12,86) 06,05-23,01 HPV35 05 (07,14) 02,36-15,89 HPV58 04 (05,71) 01,58-13,99 HPV52 02 (02,86) 00,35-09,85 HPV51 01 (01,43) 00,04-07,70 HPV56 01 (01,43) 00,04-07,70 HPV59 01 (01,43) 00,04-07,70 HPV33 00 (00,00) 00,00-00,00 HPV66 00 (00,00) 00,00-00,00 HPV68 00 (00,00) 00,00-00,00 70 100 Total 95%IC Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 100 Les HR-HPV recherchés ont été identifiés dans 47/65 des échantillons, parmi lesquels nous avons 65,96% (31/47) d‟infections isolées et 34,04% (16/47) d‟infections multiples avec un nombre de génotypes variant de 1 à 4 par individu. Le HPV18 était le plus fréquent aussi bien dans les infections multiples (50% ; 8/16) que dans les infections isolées (36% ; 9/25). Dans ces infections multiples le HPV18 était associé avec 6 autres génotypes contre 3 chez le HPV16 (Tableau XVIII). Tableau XVIII : Différentes associations dans les infections multiples Génotypes Effectifs HPV N (%) 16, 31 01 (06,25) 16, 31, 39 01 (06,25) 16, 31, 39, 58 01 (06,25) 18, 31, 45, 58 01 (06,25) 18, 35 01 (06,25) 18, 39 02 (12,50) 18, 45 02 (12,50) 18, 51 01 (06,25) 18, 58 01 (06,25) 31, 39 04 (25,00) 31, 39, 45, 52 01 (06,25) Total 16 Les HPV16 et 18 ont été détectés dans 38,57% (27/70) des échantillons et les autres HR-HPV (HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 et 59) étaient présents dans 61,43% (43/70) des échantillons. Les HPV autres que 16 et 18 soit HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 et 59 étaient plus fréquents aussi bien dans les carcinomes épidermoïdes que dans les adénocarcinomes. Le HPV16 était absent dans les adénocarcinomes. Le tableau XIX présente la fréquence des génotypes HR-HPV dans les types histologiques de cancer en considérant le cumul total des génotypes. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 101 Tableau XIX : Fréquence des génotypes HR-HPV dans les types histologiques de cancer en considérant le cumul total de génotypes Type histologique Génotypes HR-HPV 16 Total 18 Autres Carcinome épidermoïde 09 (12,85%) 15 (21,43%) 36 (51,43%) 60 Adénocarcinome 00 (00,00%) 03 (04,29%) 07 (10,00%) 10 9 18 43 70 Total Le tableau XX indique la répartition des génotypes suivant les tranches d‟âge (Tableau XX). La fréquence du cancer induit par le HPV est plus élevée dans la tranche d‟âge de 35 à 54 ans. Le HPV18 était plus fréquent dans la tranche d‟âge supérieure ou égale à 45 ans alors que le HPV16 était fréquent dans la tranche de 25 à 44 ans (Tableau XX). Tableau XX : Distribution des génotypes HR-HPV selon la tranche d’âge Tranche d‟âge Génotypes HPV Total (année) 16 18 Autres 25-34 02 (02,86%) 02 (02,86%) 07 (10,00%) 11 35-44 05 (07,14%) 03 (04,28%) 12 (17,14%) 20 45-54 00 (00,00%) 08 (11,43%) 12 (17,14%) 20 ≥55 02 (02,86%) 05 (07,14%) 12 (17,14%) 19 Total 9 18 43 70 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 102 III.3.3.1. Conclusion partielle Les génotypes les plus fréquents dans le cancer du col de l‟utérus chez les femmes à Ouagadougou sont les HPV-18, HPV-31, HPV-39, HPV-45, HPV-16 et HPV-35. Nous constatons bien que la famille des «HPV-30 » et le HPV-45 sont plus prépondérants que le HPV-16, alors qu‟ils ne sont pas couverts par les vaccins anti-HPV disponibles pour le moment. III.3.4. Résultats du cinquième article Epidémiologie moléculaire des Papillomavirus humains à haut risque dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales et dans le cancer du col de l’utérus à Parakou, République du Bénin. Zohoncon Théodora Mahoukèdè, Ouédraogo T. Clarisse, Brun Luc VC, Djigma W. Florencia, Salifou Kabibou, Ouattara Souleymane, Gomina Moutawakilou, Yonli Albert T., Bazié Valérie JTE, Djénéba Ouermi, Obiri-Yeboah Dorcas, Ouédraogo Charlemagne, Lompo Olga, Akpona Simon A, Simpore Jacques. Molecular epidemiology of high-risk human papillomavirus in high-grade cervical intraepithelial neoplasia and in cervical cancer, in Parakou, Republic of Benin. Pakistan Journal of Biological Sciences. Article No. 76414PJBS-ANSI (Accepté). Parmi les échantillons du col de l‟utérus reçus au service d‟anatomie et cytologie pathologique du CHUD-B/A de Janvier 2009 à Juillet 2014 et ayant fait l‟objet d‟analyse histologique, 149 cas de CIN et de cancer du col de l‟utérus ont été enregistrés dont 43,62% (65 cas) de cancer du col de l‟utérus et 56,38% (84 cas) de CIN. Sur les 149 échantillons, 78 échantillons ayant un diagnostic de CIN-II, CIN-III et CCU, ont fait l‟objet de PCR pour la recherche des HPV-HR. Les 71 échantillons restants (diagnostiqués CIN-I) ont été exclus. Parmi les 78 échantillons, 13 (16,66%) avaient un résultat PCR inadéquat ; 65 (83,34%) avaient un résultat adéquat à la PCR dont 50/65 (76,92%) échantillons étaient positifs aux HR-HPV et 15/65 (23,08%) échantillons étaient négatifs (Tableau XXI). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 103 Tableau XXI : Détection du human bêta-globine gène à la PCR des HPV-HR dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales de haut grade et dans le cancers du col de l’utérus, Parakou, 2009-2014 PCR HPV-HR Présent Positif Négatif Inadéquat Total 50 15 0 65 ˂0,001 β-globin gene Absent Total p value 0 0 13 13 50 15 13 78 Légende : PCR négative (HPV-HR non détectés ; bêta-globine détecté) ; PCR inadéquate (ni HPV-HR détecté ni bêta-globine détecté) ; PCR positive (HPV-HR détectés) ; HPV-HR (HPV à haut risque). Caractéristiques des femmes et types de lésions précancéreuses ou cancéreuses du col utérin L‟âge des femmes variait de 18 à 88 ans avec une moyenne d‟âge à 40,05 ±13,99 ans. La classe d‟âge la plus représentée était celle des femmes âgées de 30 à 39 ans (35,57%) suivie des classes d‟âge de 40 à 49 ans (22,15%) ; de 20 à 29 ans (20,13%) ; de 50 à 59 ans (10,07%) ; de 60 à 69 ans (8,05%) ; de 80 à 89 ans (2,01%) ; de 70 à 79 ans (1,34%) et de 15 à 19 ans (0,67%). Les motifs de demande de l‟analyse histologique étaient variés : saignement au contact, IVA positif, IVL positif, cervicite chronique, suspicion de dysplasie du col utérin, suspicion de cancer du col utérin. Le type de prélèvement variait également : biopsie du col utérin, pièce de conisation et pièce d‟hystérectomie. Parmi les échantillons ayant un diagnostic histologique de cancer du col de l‟utérus, 55/65 soit 84,62% (95% CI 73,52-92,38) étaient des carcinomes épidermoïdes, 8/65 soit 12,31% (95% CI: 05,47-22,82) des adénocarcinomes et 2/65 soit 3,08% (95% CI: 0,37-10,68) des carcinomes adéno-squameux. Le tableau XXII montre les différents diagnostics histologiques Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 104 des lésions précancéreuses et cancéreuses du col de l‟utérus. Et le tableau XXIII montre les principaux résultats histologiques en fonction des classes d‟âge des femmes. Tableau XXII : Diagnostic histologique des lésions précancéreuses et cancéreuses du col de l’utérus, Parakou, 2009-2014 Diagnostic histologique des lésions du col de l’utérus * Adénocarcinome * Carcinome adéno-squameux *Carcinome épidermoïde *CIN Effectif (%) 95% IC Adénocarcinome in situ 07 (04,70) (01,90-09,44) Adénocarcinome Villoglandulaire papillaire 01 (00,67) (00,00-03,68) Carcinome adéno-squameux infitrant 02 (01,34) (00,16-04,76) Carcinome épidermoïde bien différencié kératinisant infiltrant 22 (14,77) (09,49-21,50) Carcinome épidermoïde bien différencié non kératinisant infiltrant 21 (14,09) (08,94-20,73) Carcinome épidermoïde moyennement différencié infiltrant 07 (04,70) (01,90-09,44) Carcinome épidermoïde peu différencié infiltrant 01 (00,67) (00,00-03,68) Carcinome épidermoïde micro invasive 04 (02,69) (00,74-06,73) CIN-I 52 (34,90) (27,28-43,13) CIN-II 20 (13,42) (08,40-19,97) CIN-III 12 (08,05) (04,23-13,65) Total *P value ˂ 0,001 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 149 (100,0) Page 105 Tableau XXIII : Type de lésions précancéreuses ou cancéreuses du col de l’utérus en fonction des classes d’âge des femmes, Parakou, 2009-2014 Cancer du col de l’utérus Classe d’âge (ans) CIN Carcinome épidermoïde Adénocarcinome Carcinome adénosquameux Total CIN-I CIN-II CIN-III 15_19 0 0 0 0 1 0 1 20_29 3 2 0 20 3 2 30 30_39 18 2 0 17 9 7 53 40_49 10 3 0 9 5 3 33 50_59 9 1 2 2 1 0 15 60_69 9 0 0 2 1 0 12 70_79 2 0 0 0 0 0 2 80_89 Total 3 0 0 0 0 0 3 55 8 2 52 20 12 149 Détection des génotypes HPV-HR et leurs fréquences Parmi les 65 résultats adéquats à la PCR, 50/65 soit 76,92% (95% CI : 64,52-86,10) des échantillons étaient positifs à au moins un génotype HPV-HR. Sur les 14 génotypes HPV-HR recherchés dans les échantillons, 10 ont été identifiés à savoir HPV-39, 18, 45, 35, 52, 31, 33, 51, 58 et 66 à des proportions différentes. Les génotypes HPV-HR les plus fréquents dans le cancer du col de l‟utérus et dans les CIN, étaient HPV-39 avec des fréquences respectives de 38% et 37,50% ; suivi respectivement des HPV-18 (35% et 31,30%), HPV-45 (35% et 31,30%), HPV-35 (9% et 25%) et HPV-52 (9% et 12,50%). Le génotype HPV-16 n‟a pas été détecté dans la population d‟étude (ni dans les cas de cancer du col utérin, ni dans les CIN). De même, les génotypes HPV-56, 59 et 68 n‟ont pas été détectés. Le génotype HPV-66 a été identifié dans un cas de cancer du col de l‟utérus (un cas de carcinome épidermoïde). La figure 21 montre les distributions des génotypes HPV-HR dans le cancer du col de l‟utérus et dans les CIN de haut grade. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 106 Figure 20 : Fréquence des génotypes HPV-HR dans le cancer du col de l’utérus et dans les CIN-II et III, Parakou, 2009-2014 Infections multiplse ou isolées à HPV-HR Le nombre de génotypes HPV-HR par femme infectée variait de 1 à 3. Les infections multiples à HPV-HR étaient retrouvées dans 36% des cas ; tandis que, l‟infection isolée a été notée dans 64% des cas. Parmi les cas d‟infections isolées ou multiples à HPV-HR, l‟infection isolée au génotype HPV-39 était la plus fréquente (20%) avec respectivement 16% dans les cas de cancer du col de l‟utérus et 4% dans les cas de CIN de haut grade (tableau XXIV). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 107 Tableau XXIV : Infections multiples ou isolées à HR-HPV dans les lésions précancéreuses de haut grade et dans le cancer du col de l’utérus, Parakou, 2009-2014 Génotypes Total HPV-HR n (%) Cancer du col de l’utérus CIN-II et III n (%) n (%) p value HPV-39 10 (20%) 8 (16%) 2 (4%) NS HPV-18 8 (16%) 6 (12%) 2 (4%) NS HPV-45 5 (10%) 3 (6%) 2 (4%) NS HPV-35 4 (8%) 2 (4%) 2 (4%) NS HPV-18, -45 4 (8%) 4 (8%) 0 (0%) NS HPV-18, -39 2 (4%) 1 (2%) 1 (2%) NS HPV-18, -39, -45 2 (4%) 1(2%) 1 (2%) NS HPV-39, -45 2 (4%) 2 (4%) 0 (0%) NS HPV-52 2 (4%) 1 (2%) 1 (2%) NS HPV-45, -52 1 (2%) 1 (2%) 0 (0%) NS HPV -45, -51, -52 1 (2%) 1 (2%) 0 (0%) NS HPV-18, -39, -52 1 (2%) 0 (0%) 1 (2%) NS HPV-31 1 (2%) 1 (2%) 0 (0%) NS HPV -31, -35 1 (2%) 1 (2%) 0 (0%) NS HPV-31, -39, -45 1 (2%) 0 (0%) 1 (2%) NS HPV-33 1 (2%) 0 (0%) 1 (2%) NS HPV-33, -35, -58 1 (2%) 0 (0%) 1 (2%) NS HPV-33, -39 1 (2%) 1 (2%) 0 (0%) NS HPV-35, -45, -51 1 (2%) 0 (0%) 1 (2%) NS HPV-66 1 (2%) 1 (2%) 0 (0%) NS TOTAL 50 (100%) 34 (68%) 16 (32%) Légende : NS = non significatif Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 108 III.3.4.1. Conclusion partielle La majorité des échantillons (tissus archivés fixés et inclus en paraffine) avait un diagnostic histologique de carcinome épidermoïde. Parmi les résultats adéquats à la PCR, on note un taux de positivité au HPV-HR de 76,92%, confirmant ainsi l‟étiologie virale de ces lésions précancéreuses et cancéreuses. Les génotypes HPV-HR détectés étaient HPV-39, 18, 45, 35, 52, 31, 33, 66, 51 et 58 respectivement dans l‟ordre décroissant. Les HPV-16, 56, 59 et 68 n‟ont pas été détectés. L‟infection multiple a été notée dans 36% des cas. III.4. Récapitulatif de la distribution génotypique et des prévalences des HPV-HR à Ouagadougou et à Parakou Le tableau XXV présente la synthèse de la distribution génotypique et des prévalences des HPV-HR à Ouagadougou et à Parakou. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 109 Tableau XXV : Récapitulatif de la distribution génotypique et des prévalences des HPV-HR à Ouagadougou et à Parakou Année Population d’étude Taille échantillon Nature échantillon Age moyen (ans) Cytologie / histologie Pays HPV-HR les plus fréquents Prévalence HPV-HR (95% IC) 2013 Femmes de la population générale et femmes VIH+ 180 Ecouvillonnage endo-cervical 33,2± 8,3* Absent Burkina Faso HPV-35, 52, 31, 18, 58, 56, 51, 59, 45, 33 30,2% (19,2343,02)* 2015 Adolescentes 200 Ecouvillonnage endo-cervical 18,7± 0,7 Absent Burkina Faso HPV-52, 59, 39, 35, 51, 56, 16, 18 41,5% (34,59-48,66) 2015 Tissus de CIN 2 et 3 118 Rubans ou sections de tissus fixés et inclus en paraffine 41,5 ± 9,8 Histologie Burkina Faso HPV-39, 35, 45, 33, 51, 52, 56 48,8% (33,3164,54)** 2015 Tissus de CCU 112 Rubans de tissus fixés et inclus en paraffine 46,3 ± 12,9 Histologie Burkina Faso HPV-18, 31, 39, 16, 45, 35, 58 72,3% (59,8182,69)** 2015 Tissus de CIN 2 et 3 et de CCU 78 Rubans de tissus fixés et inclus en paraffine 40,1 ± 14,0 Histologie Bénin HPV-39, 18, 45, 35, 52, 31, 33 76,9% (64,8186,47)** Légende : * femmes de la population générale ; **résultats adéquats à la PCR ; CIN : néoplasie cervicale intra-épithéliale ; CCU : cancer du col de l’utérus. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 110 CHAPITRE IV : DISCUSSION GENERALE CHAPITRE IV : DISCUSSION GENERALE La taille des échantillons (688) est assez représentative pour déterminer les génotypes HPVHR circulant dans notre population étude. Cependant, les kits d‟amplification utilisés pour la PCR en temps réel, ne détectent qu‟une dizaine de génotypes HPV-HR. Néanmoins, la technique PCR en temps réel a une spécificité et une sensibilité de 100% chacune. C‟est un outil très fin de diagnostic, qui permet également des études rétrospectives d‟épidémiologie moléculaire sur des échantillons archivés. Les différents travaux de cette thèse révèlent que les génotypes HPV-HR de la famille des HPV-30 et 50 viennent en tête parmi ceux détectés chez les femmes quel que soit le type de l‟échantillon et la présence ou non de lésions du col de l‟utérus à Ouagadougou et à Parakou. IV.1. Génotypes HPV-HR chez les femmes de la population générale et les femmes VIH séropositives à Ouagadougou, Burkina Faso Les génotypes HPV- 35, 52, 31, 18, 58, 56, 51, 59, 45, 33, 16, 39 détectés dans notre étude chez les femmes de la population générale et chez les femmes VIH séropositives, sont ceux retrouvés en Italie chez les femmes venue de l‟Europe de l‟Est, de l‟Afrique et de l‟Asie du Sud (Tornesello et al., 2015). Ces douze génotypes classés carcinogènes pour l‟homme, représentaient plus de 80% des infections à HPV parmi les trente-neuf génotypes dépistés chez ces femmes émigrées en Italie. Cependant, chez ces femmes infectées aux HPV, Tornesello et al. (2015) avaient rapporté pour le génotype HPV-16 une fréquence de 15,4% et 51,4% respectivement en Afrique et en Europe. Le HPV-16 était donc moins fréquent en Afrique qu‟en Europe. Cette relative faible fréquence du HPV-16 en Afrique, corrobore celle de notre étude, où le HPV-16 fait partie des génotypes les moins fréquents. La prédominance du génotype HPV-52 dans la population générale, suivi des génotypes HPV 58, 35, 31 et 18 avec HPV 16 moins fréquent, soutiennent ceux rapportés en Chine par Chen et al. (2012) qui avaient trouvé une prévalence élevée des HPV 52 (33.4%) et 58 (15.93%) et une relative faible prévalence des HPV 16 (20.95%) et 18 (8.36%). De même, au Burkina Faso, Didelot-Rousseau et al. (2006) avaient rapporté que HPV 52 (14,7%), HPV 35 (9,4%), HPV 58 (9,4%), HPV 51 (8,6%), HPV 16 (7,8%), HPV 31 (7,5%), HPV 53 (6,7%) et HPV 18 (6,4%) étaient les génotypes les plus fréquents parmi 35 types de Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 112 HPV identifiés dans une population de femmes avec ou sans lésion cervicale intraépithéliale et séropositives ou non au VIH. Chez ces femmes la prévalence de l‟infection à HPV était de 66,1% (soit 238/360). La prévalence de 30,2% de l‟infection par HPV à haut risque observée dans la population générale 1 de notre étude, est comparable aux prévalences de 33,2% et 27,9% rapportées respectivement au Bénin par Piras et al. (2011) et en Colombie par Bedoya et al. (2012) (p > 0,649). Elle est inférieure à la prévalence de 72,6% rapportée par Ouédraogo et al. (2011) au Burkina Faso (p= 0,001). A l‟inverse, cette prévalence de 30,2% de l‟infection par HPV à haut risque est supérieure à celle de 7,9% rapportée par Chen et al. (2012) en Chine (p <0,001). Nous avons examiné le portage des génotypes HPV-HR chez les femmes des 3 populations. Nous avons trouvé un nombre significativement plus élevé de génotypes HPV-HR chez les femmes VIH séropositives comparativement à celles de la population générale. Le nombre de génotypes HPV-HR par femme variait de 1 à 7, chez les femmes VIH-1 séropositives et de 1 à 5 chez les femmes de la population générale. La majorité des femmes VIH séropositives (74,1%) avait au minimum 3 génotypes HPV-HR tandis que la majorité des femmes de la population générale (66,7%) avait au maximum 2 génotypes HPV-HR. Nos résultats corroborent ceux d‟Adler et al. (2008), en Afrique du Sud qui ont rapporté que les femmes VIH séropositives avaient en moyenne 2,4 génotypes HPV par échantillon tandis que les femmes VIH séronégatives avaient en moyenne 0,7 génotype HPV. Des études antérieures avaient rapporté des prévalences plus élevées de HPV chez les femmes VIH séropositives (Baay, 2004 ; Tornesello, 2008 ; Moodley, 2009 ; Averbach, 2010 ; Banura, 2011 ; Araùjo, 2012 ; Teixeira, 2012). Le VIH augmenterait le risque du développement des néoplasies cervicales intra- épithéliales et du cancer du col de l‟utérus (Jamieson, 2002). La plupart des génotypes HPV à haut risque trouvés chez les femmes VIH séropositives de notre étude étaient détectés au Portugal, chez des femmes ayant un cancer invasif du col utérin et CIN 2 et 3 (Pista et al., 2013). L‟infection multiple au HPV à haut risque a été observée chez 78,03% des femmes infectées dans notre étude. Parmi les femmes VIH séropositives, 90,1% avaient une infection multiple au HPV à haut risque. Nous constatons donc, que les infections multiples au HPV sont fréquentes, surtout chez les femmes VIH séropositives. Nos résultats sont en accord avec Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 113 ceux de Schmitt et al. (2013) qui avaient rapporté que les infections multiples par HPV sont fréquentes. Deux études faites au Bénin et en Italie, respectivement par Piras et al. (2011) et Sammarco et al. (2013) avaient rapporté que 40,2% et 53,2% des femmes avaient une infection multiple au HPV. IV.2. Génotypes HPV-HR chez les adolescentes sexuellement actives à Ouagadougou, Burkina Faso La prévalence de l‟infection au HPV à haut risque était de 41,5% chez les adolescentes à Ouagadougou. Cette prévalence est supérieure au 33,2% de Piras et al. (2011) ; au 33,8% rapporté par Chatuverdi et al. (2011) et au 35% trouvé par Howell-Jone et al. (2012). Par contre elle est inférieure au 54% rapporté par Alder et al. (2013) et au 74% de Watson-Jones et al. (2013). Cette haute prévalence de l‟infection à HPV-HR chez les adolescentes pourrait s‟expliquée par l‟âge moyen des adolescentes de notre étude qui était inférieur à celui des populations d‟étude de ces différents auteurs. En effet, l‟infection à HPV est importante chez les jeunes filles au début d‟activité sexuelle où l‟on observe un pic de l‟infection, et diminue par la suite lorsque l‟âge augmente du fait, à la fois de la clairance virale et de l‟acquisition d‟une immunité (Monsonego, 2007). Les génotypes les plus fréquemment retrouvés chez les adolescentes de notre étude étaient dans l‟ordre décroissant HPV-52, 59, 39, 35, 51, 56. Les génotypes les moins fréquents par ordre décroissant étaient HPV-16,18, 58, 31, 45 et 33. C‟est donc dans la série des HPV moins fréquents qu‟on retrouve les deux génotypes HPV-16 et 18 qui sont couverts par les vaccins anti-HPV existants et disponibles. De ce constat, faut-il comprendre que les adolescentes de la ville de Ouagadougou qui seront vaccinées par Cervarix ou Gardasil ne seront pas protégées contre les génotypes les plus fréquents dans leur population? Nos résultats diffèrent de ceux de la littérature selon laquelle le génotype HPV-16 serait le plus fréquemment retrouvé dans le monde (Tornesello et al., 2015, Heard et al., 2013) . Ainsi, Panatto et al. (2013) en Italie trouvaient que le HPV-16 était le plus fréquent avec une cytologie cervicale normale, suivi de HPV-52, 56, 31, 51 et 18. De même Clifford et al. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 114 (2005) retrouvaient en Europe des résultats similaires avec comme génotypes les plus fréquemment retrouvés par ordre décroissant les HPV-16, 31, 18, 56, 45 et 35. L‟infection multiple était retrouvée chez 42,17% des adolescentes infectées au HPV-HR. Ce taux d‟infection multiple est supérieur à celui de Monsonego et al. (2012) qui retrouvaient 19,8% d‟infection multiple dues au HPV à haut risque chez les femmes de moins de 25 ans. Notre résultat est également supérieur à celui de Panatto et al. (2013) qui retrouvaient 24,3% d‟infection multiple, tous génotypes confondus avec une cytologie normale. Notre résultat est cependant similaire à celui de Rousseau et al. (2003) qui retrouvaient 35,7% d‟infection multiple et à celui de Kavanagh et al. (2013) qui retrouvaient 48,1% d‟infection multiple au HPV à haut risque. Nous avons trouvé que le nombre de génotype HPV par adolescente variait de 1 à 5, tout comme nous l‟avons trouvé chez les femmes de la population générale de notre étude. Chatuverdi et al. (2011) trouvaient jusqu‟à huit (08) génotypes de HPV (haut risque et bas risque confondus) dans les infections multiples. Kavanagh et al. (2013) retrouvaient également huit (08) génotypes par femmes dans les infections multiples, ceux qui étaient au nombre de deux génotypes représentaient 58,4%, ceux au nombre de trois génotypes représentaient 25,6%, ceux au nombre de quatre génotypes représentaient 9,9%, ceux au nombre de cinq génotypes représentaient 4,3% et ceux au nombre de six génotypes représentaient 1,8%. Le faible pourcentage d‟IVA/IVL dans notre étude ne nous permettait pas de tirer une conclusion quant à la présence de HPV associée aux lésions précancéreuses surtout que le col de l‟utérus des adolescentes est beaucoup plus difficile à mettre en évidence. Selon la littérature, les facteurs favorisant les infections à HPV seraient : une activité sexuelle précoce, l‟existence de nombreux partenaires sexuels, l‟immunodépression au VIH, le tabac, une contraception orale prolongée, d‟autres IST associées, un faible niveau socio-économique (Hibbitts et al., 2006). Mais dans notre étude, nous n‟avons pas trouvé une association entre le portage du HPV et l‟âge ; l‟âge au premier rapport sexuel; le changement récent de partenaire sexuel ; la fréquence des rapports sexuels ; l‟utilisation ou la non utilisation du préservatif ; le statut matrimonial ; le niveau de connaissance sur le HPV et le cancer du col de l‟utérus. Il en est de même pour la contraception orale. Surtout que les adolescentes ne sont pas exposées sur une longue période aux oestro-progestatifs du fait de leur jeune âge. Cependant, le nombre de partenaires sexuels qu‟avaient pu avoir les adolescentes, depuis le début de leur vie sexuelle était statistiquement associé au portage du HPV. En effet, 56,5% Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 115 des adolescentes de notre étude avaient eu deux partenaires sexuels ou plus. Notre résultat corrobore celui de la littérature selon laquelle le nombre de partenaires sexuels est l‟un des déterminants majeurs du risque de l‟infection à HPV tant chez les femmes que chez les hommes (Jin-Kyoung, 2014). Ainsi, Ramanakumar et al. (2010) trouvaient que le portage du HPV était plus important chez les femmes ayant eu plus de deux partenaires sexuels. De même, Rousseau et al. (2003) trouvaient que le risque d‟infection à HPV augmentait avec le nombre de partenaire sexuels. Bien que l‟utilisation ou la non utilisation du préservatif n‟a pas été significativement associée au portage du HPV dans notre étude, le port du préservatif confère une protèction et demeure un principal moyen de lutte contre les IST dont les HPV. IV.3. Génotypes HPV-HR dans les CIN et Cancer du col de l’Utérus à Ouagadougou (Burkina Faso) et à Parakou (République du Bénin) Les échantillons CIN 2 et CIN 3 positifs au HPV-HR étaient de 48,8%, en considérant les résultats adéquats. Ce taux de positivité est inférieur à la plupart des résultats selon de nombreuses études (Kirschner et al., 2013; Siddiqa et al., 2014; Gouveia et al., 2014; Bateman et al., 2015). Cela amène à se demander si la qualité des échantillons n'en n'était pas la raison. Il en est de même pour la durée de conservation de certains échantillons qui pourrait jouer un rôle important. De plus la durée de fixation n‟était pas uniforme et cela a probablement contribué à rendre certains échantillons inadéquats ou négatifs à HPV. En outre, l‟utilisation du formol et du bouin aurait pu détériorer l‟ADN. En Zambie, Bateman et al., (2015) trouvaient une prévalence de 31% des dysplasies modérées à sévères (65 cas positifs à HPV sur 75 testés, et 69 cas jugés adéquats) (p<0,001). Il existe donc une différence avec notre série. Cette étude pourtant avait des échantillons d‟une même durée d‟âge que les nôtres et également à peu près le même nombre d‟échantillons. Seulement, dans cette étude le milieu de fixation des prélèvements n'a pas été discuté. Déjà, dans les années 90, Ben-Ezra et al., (1991) démontraient qu‟après 6 heures de fixation par le bouin, la PCR ne donnait aucun résultat. Plus tard, cette conclusion a été mise en cause par une équipe au Brésil (Gouveia et al., 2014), qui a montré avec deux protocoles différents qu‟il était possible d‟obtenir entre 33,3% à 80% de positivité à la PCR malgré l‟utilisation d‟une solution de bouin. Cette même équipe a montré que des tissus fixés au formol donnaient des taux de positivité à la PCR compris entre 87,5% et 100% ; et l‟utilisation du formaldéhyde comme fixateur a donné entre 17,6% et 73,7% de positivité. Cette équipe a extrait l‟ARN au Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 116 lieu de l‟ADN dans notre cas. Il faut également noté que dans cette étude, le type de tissus n‟a pas été précisé. Notre taux de positivité à HPV était de 48,8% soit 21 sur 43. Au Pakistan, Siddiqa et al., (2014) trouvaient 94,8% (73/77) de positif au HPV. Dans cette étude, il s‟agissait d‟échantillons de tissus cancéreux, de lésions de bas grade et de lésions de haut grade tout confondu, alors que nos échantillons concernait uniquement les lésions de haut grade (p<0,001) témoignant d‟une différence significative du taux de positivité supérieur à celui de notre étude. Dans cette étude, le kit permettait de détecter 44 génotypes de HPV alors que le nôtre ne permettait de détecter que 14. En plus l‟utilisation d‟amorces spécifiques a sans doute permis d‟obtenir un taux de positivité aussi élevé. Le kit de détection de 14 génotypes HPV a réduit nos chances de retrouver d‟autres génotypes et les 43 échantillons adéquats constituaient une taille très faible. Chez des femmes danoises, une étude trouvait 276 résultats adéquats sur 290 échantillons cervicaux de lésions de haut grade dont 100% de positivité à HPV contre 48,8% de positivité à HPV dans notre série (p<0,001) (Kirschner et al., 2013). Dans cette étude, 82,3% des échantillons étaient des lésions CIN 3 et les 17,7% étaient des CIN 2, CIN 2 à 3, et les adénocarcinomes in situ, alors que dans notre étude il n‟y avait que cinq CIN 3 adéquat soit 11,6% et un seul a été positif à HPV. Dans notre étude, le génotype le plus fréquemment rencontré était le type 39 (21,7%). Le HPV-18 (4,3%) était moins représenté avec un seul cas au niveau de la tranche d‟âge 30 à 39 ans. Le grand absent était le génotype HPV-16, pourtant retrouvé dans de nombreuses études, reconnu comme une des prévalences les plus élevées et faisant l'objet des vaccins prophylactiques actuellement disponibles. En Zambie, Bateman et al., (2015) trouvaient 55,4% de positivité à HPV-16 et 7,7% pour HPV-18. Les autres HPV-HR représentaient 40,9% dans cette étude. Le génotypage de HPV-HR dans des lésions précancéreuses de haut grade chez des femmes danoises a donné des fréquences différentes des nôtres ; en effet, Kirschner et al., (2013), avaient montré que les génotypes HPV-16 (54,0%), HPV-33 (13,5%), HPV-31 (10,7%), HPV-18 (7,9%) et HPV-52 (4,7%) étaient les plus représentés. En Afrique du Sud, McDonald et al., (2012) avaient montré la proportion élevée des lésions cervicales (respectivement CIN2 et CIN3) attribuables aux HPV-16 (22,58% et 40,28%), Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 117 HPV-35 (31,18% et 19,44%) et HPV-33 (12,90% et 12,50%). Cependant, cette équipe a trouvé que les génotypes HPV-56, 59, 51 et 68 étaient peu fréquents au sein des lésions CIN 2 à 3. Il faut signaler que dans cette étude, ont été incluses uniquement des femmes ayant un statut sérologique HIV négatif. L'équipe de Garcia-Espinosa et al., (2012) trouvait aussi que HPV-16 était le plus fréquent avec un taux de 45, 2% dans les CIN 2 à 3, suivi de HPV-31, HPV-52, HPV-58, HPV-18, HPV-51, HPV-68, HPV-35, HPV-39, HPV-45 et HPV-56. En Nouvelle Zélande, Simonella et al., (2013) avaient montré que HPV-16 était le plus représenté avec 44,1% suivi de HPV-52 (16,8%), HPV-31 (15,2%), HPV-33 (13%), et HPV18 (12%). HPV-39 qui est pourtant prépondérant dans notre étude ne représentait que 9,2% au niveau des CIN 2 et 5,4% au niveau des CIN 3. De façon générale, surtout au niveau des études dans les pays développés, on constate que les génotypes qui reviennent à chaque fois sont les HPV-16, HPV-31, HPV-52, HPV-33 et aussi HPV 18. Au Burkina Faso, les différentes études donnent des résultats différents de ceux de ces pays. Une étude menée sur des femmes séropositives au VIH (Sagna et al., 2010), a montré que les génotypes HPV dominants étaient ceux de la famille 50‟S (24,1%), suivi de HPV-18 (21,3%), la famille 30‟S (18,4%), HPV-16 (5,7%) et HPV-6 (4,3%). L‟équipe de Djigma et al., (2011) avec une population de 250 femmes séropositives au VIH, trouvait fréquemment les génotypes de la famille 50‟S (25,5%) suivi de très près par HPV-18 (25%), la famille 30‟S (20,8%), autres HPV-HR (8,5%), HPV bas risque (5,2%), HPV-16 (4,7%), HPV-6 (5,7%), HPV-45 (3,7%) et HPV-11(0.9%). Dans une population de femme suivi en consultation gynécologique, Ouedraogo et al., (2011) trouvaient comme génotype fréquemment rencontré la famille 50‟S dans 31% des cas. Il est suivi de HPV-18 (14,3%), HPV-16 (10,7%), la famille 30‟S (5,9%), autres HPV-HR (5,9%), HPV-45 (3,6%), HPV-6 (17,9%) et HPV bas risque (10,7%). Les génotypes prépondérants dans ces études étaient ceux de la famille 50‟S et 30‟S, ainsi que les génotypes 18 et 16. Cependant, il faut savoir que le kit de détection du HPV que ces auteurs avaient utilisé ne leur permettait pas de préciser les génotypes. Nous avons rencontré 2 cas d‟infections multiples (double HPV) dans 9,5% des cas. GarciaEspinosa et al., (2012) trouvaient 18,4% d‟infections multiples. Dans cette étude, il a été trouvé des cas d‟infections multiples entre HPV-16 et 58 (2 cas); suivi de HPV-16 et 31 (5 cas) ; HPV-16 et 18 (4 cas) et HPV-16 et 52 (1 cas). Au Pakistan, les différentes associations se sont observées entre les génotypes HPV-16, 18 et 19 (Siddiqa et al., 2014). En Afrique du Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 118 Sud, 24% de cas d‟infections multiples ont été observé (McDonald et al., 2012). Les génotypes les plus impliqués étaient HPV-35, 16 et 58 : associations HPV-35 et 16 ; et HPV35 et 58. Au Burkina Faso, dans notre étude chez les femmes de la population générale et les femmes VIH séropositives, 78,03% de cas d‟infections multiples étaient observés, mais 90,1% des patientes étaient infectées par le VIH (Zohoncon et al., 2013). Plusieurs cas d‟infections multiples (42,2%) étaient trouvés chez les adolescentes de notre série. Le HPV 52 était le génotype le plus présent dans ces infections multiples, tandis que, nous avons trouvé dans les CIN de haut grade, que le génotype HPV 39 était présent dans les deux cas d‟infections double soit 100%. En Afrique du Sud, une étude a montré que les femmes séropositives au VIH présentaient fréquemment des associations de plus de deux génotypes (Adler et al., 2008). Cela pourrait expliquer le fait que les études ayant inclus des femmes infectées par le VIH présentent plus d‟infections multiples. Nous n‟avons pas remarqué de corrélation entre les différentes associations de génotypes HPV. Ce phénomène n‟étant pas encore bien compris. Nous n‟avons pas trouvé de lien significatif entre la lésion histologique et le portage du HPV. Dans notre étude, la prévalence des lésions précancéreuses était nettement inférieure à la plupart des études (Garcia-Espinosa et al., 2012; Kirschner et al., 2013; Bateman et al., 2015). Cela pourrait s‟expliquer par la taille de notre échantillon mais surtout par la qualité de nos échantillons ; ou d‟autres facteurs autres que HPV comme par exemple les bactéries, les parasites, les champignons, autres virus, ou simplement d‟autres génotypes HPV que notre kit de détection n‟a pas permis de caractériser. La taille de notre échantillon n‟est pas assez importante pour apprécier correctement cette relation entre l‟âge et le portage du HPV. Cependant, nous pouvons faire quelques appréciations. Les génotypes HPV 18, 51 et 56 est représenté uniquement dans la tranche d‟âge 30 à 39 ans. Quant aux génotypes HPV 56 et 35, ils étaient retrouvés uniquement au niveau de la tranche d‟âge 40 à 49 ans. En Afrique du Sud, McDonald et al., (2012) avaient fait le lien que les jeunes femmes de moins de 30 ans avaient des prévalences plus élevées que les femmes plus âgées notamment les types 18 et 58. La taille des échantillons dans cette étude était bien plus importante que dans la nôtre, ce qui a facilité la comparaison entre les différentes tranches d‟âge. A Ouagadougou, dans notre étude chez les adolescentes nous avons trouvé un âge moyen de 18,7 ans une prévalence de 41,5%. Et dans notre série, chez les femmes ayant CIN 2 et 3 histologiquement confirmés, il n‟y avait pas de femmes de moins de 20 ans et la majorité avait entre 30 et 50 ans. L‟âge élevé chez les femmes ayant CIN 2 et 3 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 119 histologiquement confirmés, pourrait être la raison pour laquelle nous n‟avions pas trouvé certains génotypes du faite de la clairance et aussi l‟explication au taux de prévalence à HPV faible. A présent, en abordant notre série sur le cancer du col de l‟utérus histologiquement confirmé, à Ouagadougou, nous avons eu 58,04% (65/112) d‟échantillons adéquat à la PCR. Ce taux de détection du HPV à haut risque est certes inférieur à ceux d‟autres auteurs (Kirschner et al., 2013; Gouveia et al., 2014; Siddiqa et al., 2014; Bateman et al., 2015), mais nous a permis de détecter la présence de 11 génotypes HPV-HR impliqués dans le cancer invasif du col de l‟utérus. Sur la base des résultats adéquats, la prévalence de l‟infection à HPV-HR était de 72,31% (47/65). Cette prévalence est proche de celle (76,92%) que nous avons trouvé dans les lésions précancéreuses et cancéreuses à Parakou, et également similaire au 77,59% rapproté par Steinau et al. (2011). Par contre elle est inférieur au 98% (49/50) rapporté par Attoh et al. (2010) dans les cas de cancer du col de l‟utérus. Cette variation de la prévalence de l‟infection à HPV-HR dans les tissus de cancer du col de l‟utérus et de lésions précancéreuses, pourrait se justifier par la qualité des échantillons des différentes études. L‟âge moyen des femmes ayant un cancer du col de l‟utérus à Ouagadougou était de 46,36 ± 12,94 ans. Cet âge moyen est similaire au 41,5 ± 9,8 ans que nous avons trouvé chez les femmes de Ouagadougou ayant les lésions précancéreuses de haut grade. Cette similitude pourrait s‟expliquer par le fait que les parmi les lésions précancéreuses certaines persistent et évoluent vers le cancer du col de l‟utérus. Ce qui conforte le fait que nous avons constaté que le cancer du col de l‟utérus (principalement le carcinome épidermoïde) est plus fréquent chez les femmes de la tranche d‟âge 35 à 54 ans à Ouagadougou. A Ouagadougou, dans les cas de cancer du col de l‟utérus, les génotypes les plus fréquents étaient par ordre décroissant les HPV-18, 31, 39, 45, 16, 35 et 58. Ces génotypes sont proches de ceux retrouvés par Li et al. (2011) lors d‟une méta-analyse de 243 articles publiés dans le monde sur la prévalence de l‟infection à HPV dans les cas de cancer invasif du col de l‟utérus (30848 cas). Ces génotypes identifiés par Li et al. étaient au nombre de douze, à savoir, dans l‟ordre décroissant, HPV-16, 18, 58, 33, 45, 31, 52, 35, 59, 39, 51 et 56. Li et al. avaient également noté que dans 70 à 76% des cas, le cancer invasif du col de l‟utérus était associé aux HPV-16 et/ou 18. Dans le cancer du col de l‟utérus à Ouagadougou, nous avons constaté que les HPV-31, 39 (famille des « HPV 30 ») et HPV-45 sont autant voir plus prédominants que le HPV-16. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 120 Au Pakistan, Gual et al. (2015) avaient trouvé que HPV-18 était le génotype le plus fréquent dans les carcinomes épidermoïdes du col de l‟utérus histologiquement confirmé à partir de tissus archivés. Gual et al. avaient également noté la prédominance du HPV-16 qui suivait le HPV-18. La prévalence des infections multiples à HPV-HR (jusqu‟à 04 génotypes par femme) dans les cas de cancer du col de l‟utérus à Ouagadougou (34,04%) est supérieure au 11,2% rapporté par Li et al. (2011) qui n‟avaient pas trouvé une différence statistiquement significative entre la prévalence des infections multiples à HPV et le type histologique 30848 cas de cancer invasif du col de l‟utérus. Cela pourrait s‟expliqué par le fait que le nombre total de génotype par femme n‟est forcément synonyme de la sévérité ou du type de lésion, mais plutôt le type ou le caractère oncogénique du génotype présent chez la femme. Quels commentaires pouvons-nous faire de la présence de HPV-HR dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales (lésions précancéreuses) de haut grade et dans le cancer du col de l‟utérus histologiquement confirmés à Parakou dans la République du Bénin ? La moyenne d‟âge des femmes de l‟étude étaient de 40,05 ±13,99 ans. Ce résultat est proche de ceux rapportés dans d‟autres études : 54,1 ±7,6 ans au Ghana (Attoh et al., 2010) ; 51,9 ± 12,3 ans au Mali et au Sénégal (Ndiaye et al., 2012) ; 44,3 ± 8,2 ans au Congo (Boumba et al., 2014) et 46,4 ans en Thaïlande (Supho et al., 2014). L‟écart-type n‟a pas été précisé dans l‟étude de Supho et al., en Thaïlande. Dans cette étude, 16,66% (13/78) des PCR étaient inadéquats car la β-globine était absente ainsi que la détection de HPV. Missaoui et al., (2010) en utilisant également les tissus fixés au formol et inclus en paraffine, avaient rapporté que la β-globine était négative dans 25/146 (17,1%) échantillons considérés ainsi comme non contributifs. Ce résultat est similaire au nôtre (p = 0,931) bien que dans l‟étude de Missaoui et al., les lésions histologiques ont fait l‟objet d‟une double lecture par deux anatomopathologistes. De même, avec l‟utilisation du xylène pour le déparaffinage, Steinau et al. (2011) avaient trouvé des résultats similaires (p = 0,622), 19,33% (29/150). Dans le même sens, Bateman et al. (2015), avaient constaté que la méthode d‟extraction utilisant le xylène donnait des résultats de moindre qualité que celle utilisant la chaleur et 88% de ces résultats (100/114 cas de cancer du col utérus) étaient valides à la PCR. Cette possibilité d‟avoir des échantillons non contributifs pourrait s‟expliquer par une dégradation de l‟ADN des tissus archivés fixés au formol. En effet, il est connu que le formol peut altérer la structure des acides nucléiques, de sorte que le rendement de l‟extraction à partir d‟échantillons fixés Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 121 au formol et inclus en paraffine, puisse être de faible quantité et de basse qualité (Gouveia et al., 2014). La paraffine est comme une barrière physique et un inhibiteur de la PCR. Bien que l'ADN des tissus archivés soit conservé généralement sur de longues périodes, sa fragmentation et sa liaison aux protéines par exposition du formaldéhyde, aussi bien que la présence de paraffine, pourraient avoir des effets négatifs considérables sur le rendement d‟ADN et l‟efficacité de l'amplification (Steinau et al., 2011). Le contrôle interne (human βglobine gene) peut ne pas être détecté en cas d‟excès de paraffine ou d‟une quantité insuffisante de cellules épithéliales. L‟extraction d‟ADN qui utilise la chaleur (sans xylène) serait plus prospère que celle basée sur l‟usage du xylène. Les résultats inadéquats dans cette étude pourraient être également expliqués par la présence d‟autres génotypes HPV non détectables par le kit d‟amplification utilisé, qui ne permettait que la détection de 14 génotypes HR-HPV. Cependant, le taux de détection du HR-HPV dans cette étude était de 76,92% (50/65). Ce résultat corrobore respectivement (p = 0,919 et 0,614) les taux de détection du HPV de 77,59% et 73,60% rapportés par Steinau et al. (2011) en Georgie et Missaoui et al. (2010) en Tunisie, dans des tissus fixés au formol et inclus en paraffine. Bien que ces auteurs aient recherché des HPV à haut risque et à bas risque, il n‟existe pas une différence statistiquement significative entre les résultats. Au Ghana, Attoh et al. (2010) avaient rapporté 98% (49/50) d‟infection au HPV dans les cas de cancer du col de l‟utérus. Ce taux élevé de détection des HPV dans le cancer du col de l‟utérus pourrait s‟expliquer par le fait que les sections de tissus utilisées à la PCR ont été préalablement contrôlées au microscope pour s‟assurer qu‟elles contiennent effectivement les cellules tumorales. De même, Ndiaye et al. (2012) avaient rapporté des taux de détection du HPV respectivement à 88,1% (28/32) et 86,5% (110/132) au Mali et au Sénégal. Ces taux de détection relativement élevés des HPV pourraient s‟expliquer par une bonne technique de conservation des blocs de tissus, une double lecture histologique, une vérification de la présence et la quantification de tumeur nécrosée, le pourcentage de tumeur dans la section de tissus et donc l‟adéquation de l'échantillon pour un éventuel test de l‟ADN du HPV. Les CIN de haut grade et le cancer du col de l‟utérus étaient plus fréquentes dans la classe d‟âge de 30 à 39 ans (35,6%) suivie des classes d‟âge de 40 à 49 ans (20,1%) ; de 20 à 29 ans (20,1%) ; et de 50 à 59 ans (10,07%). Ces résultats sont proches de ceux rapportés par Siddiqa et al. (2014) au Pakistan qui avaient trouvé une forte incidence du cancer du col de l‟utérus chez les femmes de 41 à 50 ans suivie des classes d‟âge de 31 à 40 ans et 50 à 60 ans. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 122 La fréquence du cancer du col de l‟utérus dans cette étude (43,62% or 65/149) est supérieure (p < 0,001) au 16,71% (133/796) rapporté par Lesnikova et al. (2009) au Denmark et inférieure (p = 0,013) au 61,10% (47/77) rapporté par Siddiqa et al. (2014) au Pakistan, tous issus de tissus archivés et fixés en paraffine. Cette différence significative pourrait s‟expliquer par la variation de la taille des échantillons et des techniques utilisées. Quelque soient les études, parmi les cas de cancer invasif du col de l‟utérus, les carcinomes épidermoïdes sont plus fréquents que les adénocarcinomes et les carcinomes adéno-squameux tel que constaté dans cette étude (p < 0,001). Dans cette d‟étude, les carcinomes épidermoïdes représentaient 84,62% (55/65) des cas de cancer du col de l‟utérus ; les adénocarcinomes représentaient 12,31% (8/65) et les carcinomes adéno-squameux 3,08% (2/65). D‟autres auteurs avaient rapporté des résultats similaires (p ˃ 0,05) : Lesnikova et al. (2009) avaient rapporté 79% de cas de carcinomes épidermoïdes et 21,05% de cas d‟adénocarcinomes ; Siddiqa et al., (2014) avaient identifié parmi les cas de cancer du col de l‟utérus, 91,49% de cas de carcinomes épidermoïdes, 2,12% d‟adénocarcinomes et 6,38% de carcinomes adéno-squameux ; Pirek et al. (2015) au Cameroun avaient rapporté 91,7% de carcinomes épidermoïdes et 6,6% d‟adénocarcinomes. Les génotypes HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,58, 59, 66, 68 et 73 sont connus carcinogéniques (Zur Hausen, 2002). Dans cette d‟étude, les HPV-39, 18, 45, 35, 52, 31, 33, 51, 58 et 66 ont été détectés, à des fréquences décroissantes, dans le cancer du col de l‟utérus et dans les CIN de haut grade. Les génotypes HR-HPV les plus fréquents dans le cancer du col de l‟utérus et dans les CIN-II et III, étaient HPV-39 avec des fréquences respectives de 38% et 37,50% ; suivi respectivement des HPV-18 (35% et 31,30%) et HPV-45 (35% et 31,30%) et HPV-35 (9% et 25%). Ces génotypes sont proches de ceux trouvés dans certains pays africains où les génotypes les plus fréquents étaient HPV-16, HPV-18, HPV-35 et HPV45 (Guan et al., 2012 ; Denny et al., 2014) ; à la différence que le HPV-16 n‟a pas détecté dans cette étude. Au Pakistan, en 2015, Gul et al. (2015) avaient rapporté une prévalence de 32,8% de HPV-18 dans le cancer du col de l‟utérus, ce résultat est similaire au 35% trouvé dans cette étude. Gul et al. (2015) avaient constaté que le HPV-16 était le plus fréquent avec une prévalence de 44,8% dans le cancer du col de l‟utérus contrairement à cette étude où le HPV-16 n‟a pas été détecté ni dans le cancer du col de l‟utérus, ni dans les CIN-II et III. D‟autres auteurs ont également rapporté la prédominance des HPV-16, HPV-18 et HPV-45 dans les cas de cancer du col de l‟utérus : 32,69% de HPV-16, 34,62% de HPV-18 et 25% de HPV-45 (Haghshenas Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 123 et al., 2013); 52,5% de HPV-16 et 11,8% de HPV-18 (Boumba et al., 2014) ; 15,4% de HPV16 dans un groupe de femmes d‟origine africaine (Tornesello et al., 2014). Au Bénin, Baba-Moussa et al. (2006) en comparant les résultats de l‟analyse cytologique (test de Papanicolaou) à ceux de la PCR classique (produits de PCR soumis à une électrophorèse sur gel d‟agarose), avaient rapporté que sur 99 frottis testés, 88 étaient positifs à la PCR avec des amorces consensus GP5+/GP6+ ; et les types de HPV déterminés par l‟utilisation d‟amorce spécifique, étaient HPV 33 (56%), suivi de HPV 16 (18.2%), HPV 6/11 (18%) et HPV 18 (17%). Ces résultats différents pourraient s‟expliquer par le fait que les types d‟échantillons ne sont pas les mêmes, ni les techniques d‟amplification. Dans la littérature, les HR-HPV, essentiellement le type 16 et 18, sont reconnus comme les principales causes à l‟origine du cancer invasif du col utérin et de ses lésions précurseurs (Zur Hausen, 1996 ; 2002). Plusieurs méta-analyses ont confirmé que les cinq HR-HPV de l'être humain, les plus actuels chez les femmes avec et sans maladies néoplasiques du col de l‟utérus sont les HPV-16, 18, 31, 52, et 58 (Ogembo et al., 2015). Cependant c‟est le génotype HPV-39 qui prédomine dans cette étude, suivi du HPV-18 et du HPV-45 quel que soit le type histopathologique du cancer du col de l‟utérus. Ils sont suivi des HPV-35, HPV52 , HPV-33, HPV-51 et HPV-58 dans les CIN-II et III tandis qu‟ils sont suivi des HPV-35, HPV-52, HPV-31, HPV-33, HPV-51 et HPV-66 dans les cas de cancer du col utérin. Le génotype HPV-39 a été également détecté dans d‟autres études parmi les HPV les plus fréquents. En Afrique du Sud, Lebelo et al., (2015) avaient rapporté que HPV-39 (18,7%) était parmi les génotypes les plus fréquents dans les tissus archivés fixés et inclus en paraffine ; ils avaient également détecté HPV-18, HPV-16 et HPV-56. Mais ils ont également noté comme dans cette étude, l‟absence du HPV-68. Boumba et al., (2014) avaient également détecté en plus des HPV-16 et -18, les génotypes HPV-31, HPV-33 et HPV-35 dans les cancer invasif du col de l‟utérus. Les génotypes HPV-51, HPV-58 et HPV-66 étaient les moins fréquents dans cette étude. Par contre le HPV-58 a été l‟un des génotypes les plus fréquents (HPV-16, -52 et -58) dans une province de la Chine chez des femmes asymptomatiques (Xue et al., 2015). De même dans le Nord-Est de la chine, les HPV-58 et HPV-16 étaient les plus fréquents (Sun et al., 2014). Le seul génotype HPV-66 détecté dans un cas de cancer du col de l‟utérus dans cette étude, a été également rapporté dans une autre étude réalisée chez des adolescentes en Belgique où les génotypes les plus fréquents étaient HPV-16 (16,7%), HPV-51 (14,6%), HPV-66 (10,4%), Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 124 HPV-31 (9,9%), et HPV-39 (9,1%) (Merckx et al., 2014). Une autre étude menée par Attoh et al. (2010) au Ghana avaient rapporté une faible prévalence de 2% de l‟infection par le HPV66, similaire à celle de cette étude. L‟infection au HPV peut être isolée ou multiple. En effet dans cette étude, le nombre de génotype par femme infectée variait de 1 à 3 avec 36% d‟infection multiple. Tornesello et al. (2014) avaient rapporté un taux d‟infection multiple de 33,3% chez les femmes d‟origine africaine, résultat similaire au 36% de cette étude ; tandis que Lebelo et al. (2015) avaient rapporté que la majorité des femmes Sud-africaines ayant un carcinome épidermoïde du col de l‟utérus avait une infection multiple au HPV. Cependant, Attoh et al. (2010) avaient rapporté 26% d‟infection multiple dans les cas du cancer du col de l‟utérus au Ghana. Cette variation pourrait s‟expliquer par le statut du virus de l‟immunodéficience humaine (VIH) des femmes Sud-africaines. En effet, l‟infection par le VIH serait un facteur de risque des lésions précancéreuses du col de l‟utérus et aussi probablement pour le cancer invasif du col utérin (Sahasrabuddhe et al., 2007). Les patientes atteintes par le VIH étant plus sensibles aux infections multiples par HPV. La distribution des HPV à haut risque varie selon les facteurs géographiques et démographiques. Cette variation de la distribution géographique des génotypes des HPV pourrait influencer l‟efficacité de la vaccination (Clifford et al., 2003). Il est généralement admis que la réponse immune aux Virus-like-particles (VLP) des HPV est spécifique du type et par conséquent, que la protection par vaccination devrait être limitée aux types inclus dans le vaccin. Au regard de tout ce qui précède, la comparaison de la distribution génotypique des HR-HPV dans les deux grands sites de nos recherches à savoir Ouagadougou (Burkina Faso) et Parakou (République du Bénin), évoque le constat de la présence des HPV-18, 31, 33, 35, 39, 45 et 52 dans la plupart des études quel que soit le type d‟échantillon du col de l‟utérus analysé, l‟existence ou non de lésion précancéreuse ou cancéreuse et quel que soit l‟âge de la population d‟étude. Ces génotypes étaient également rapportés dans certaines études et métaanalyses regroupant plusieurs articles publiés en Afrique et dans le monde (Li et al., 2011 ; Guan et al., 2012 ; Denny et al., 2014 ; Ogembo et al., 2015). De plus, l‟infection à HPV demeure un grand problème de santé publique au Burkina Faso et au Bénin de par les fortes prévalences trouvées au cours de nos travaux de recherches chez les Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 125 femmes et les adolescentes avec ou sans lésions cervico-utérines. Il en découle que de grands défis restent à relever dans la lutte contre le cancer du col de l‟utérus afin de préserver la vie de toutes les femmes. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 126 CONCLUSION GENERALE CONCLUSION GENERALE Les différentes études nous ont permis de détecter les génotypes HPV-HR circulant chez les femmes et les adolescentes de notre population d‟étude, et ceux impliqués dans le développement des néoplasies cervicales intra-épithéliales de haut grade ou lésions précancéreuses de haut grade et dans le cancer du col de l‟utérus histologiquement confirmés. Toutefois, il est à retenir qu‟il faut optimiser les techniques et les conditions de conservation des échantillons histologiques afin d‟avoir un excellent rendement des acides nucléiques tel que l‟ADN lors d‟une éventuelle étude rétrospective. Au regard de tous ces travaux sur l‟infection au HPV à haut risque chez des populations de femmes avec ou sans lésions du col de l‟utérus, à Ouagadougou et à Parakou, nous pouvons dire que les génotypes HPV-HR de la famille des HPV 30 et 50 sont plus incriminés ou autant incriminés que les HPV-16 et 18 dans le développement du cancer du col de l‟utérus dans nos populations. Que ce soit les adolescentes, les femmes de la population générale, les femmes VIH séropositives ou au sein des tissus précancéreux et cancéreux du col de l‟utérus, le constat semble être le même. Cela nous appelle à élargir la cartographie des génotypes HPV à l‟Afrique Subsaharienne qui est victime du plus lourd tribut de décès liés au cancer du col de l‟utérus. Jusqu‟alors, en Afrique, les vaccins anti-HPV disponibles sont Cervarix® et Gardasil® qui protègent efficacement uniquement contre les HPV-16 et 18, lesquels ne sont pas toujours les plus fréquents dans nos populations. Il devient donc nécessaire de trouver le moyen de rendre le nouveau vaccin anti-HPV nano-valent actuellement d‟actualité, disponible et accessible à nos populations afin de mieux lutter contre le cancer du col de l‟utérus et ainsi préserver la vie de nos mères, de nos femmes, de nos sœurs et de nos filles. Des efforts restent encore à fournir pour atteindre une prophylaxie efficace à large spectre, accessible, tout en maintenant la sensibilisation et le renforcement des bonnes pratiques d‟hygiène de vie saine, le dépistage des lésions précancéreuses, le diagnostic précoce et traitement des lésions précancéreuses et cancéreuses afin d‟atteindre l‟objectif zéro nouvelle infection à HPV. Cependant, les hommes ont un rôle crucial à jouer pour une lutte efficace contre l‟infection à HPV. Car, les hommes, au regard de leurs habitudes sexuelles, pourraient constituer un réservoir d‟infection à HPV pour les femmes. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 128 PERSPECTIVES PERSPECTIVES A l‟issu de ce travail, nous envisageons pour nos futures recherches : 1. Séquencer les types de HPV à haut risque isolés dans notre étude dans les lésions précancéreuses de haut grade et dans le cancer invasif du col de l‟utérus, afin de définir le variant auquel ils appartiennent ; 2. Etablir une cartographie sous-régionale du HPV à haut risque chez les femmes ; 3. Déterminer la distribution génotypique et la prévalence des HR-HPV dans les échantillons de cancer invasif du col de l‟utérus coïnfectés par le VIH ; 4. Faire le point de l‟infection au HPV chez les femmes enceintes, déterminer la charge virale de l‟infection et évaluer le risque de transmission verticale du HPV ; 5. Détecter les génotypes HPV impliqués dans les papillomatoses laryngées chez les enfants ; 6. Dépister le portage de l‟infection à HPV chez les hommes ; 7. Développer un partenariat avec le département d'ORL et de pathologie digestive pour une recherche active des HPV dans la sphère ORL et digestive ; 8. Inciter les firmes pharmaceutiques à développer des vaccins anti-HPV polyvalents à large spectre prenant en compte tous les génotypes de la cartographie. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 130 SUGGESTIONS SUGGESTIONS Nous ne saurions mettre un terme à ce travail sans faire des suggestions en vue d‟apporter notre contribution à la lutte contre le cancer du col de l‟utérus, ainsi nous recommandons : A l‟endroit du Ministère de la santé du Burkina Faso et du Ministère de la santé de la République du Bénin, de renforcer les campagnes de sensibilisation et de dépistage du cancer du col de l‟utérus ; de rendre accessible la PCR pour la détection de l‟infection à HPV ; de rendre disponibles et accessibles les vaccins anti-HPV couvrant le maximum de génotypes ; de vacciner les jeunes filles ; de soutenir la recherche ; A l‟endroit des chercheurs, de fournir la cartographie des HPV circulant dans la région Africaine aux firmes pharmaceutiques, de poursuivre les recherches sur le HPV et de maintenir la veille épidémiologique de l‟infection à HPV ; A l‟endroit de la direction du LNR-HPV, de renforcer les recherches sur les HPV, d‟établir la cartographie de toute l‟étendue du territoire, de faciliter l‟accessibilité du test PCR de l‟ADN du HPV pour la population dans le cadre des dépistages à visée préventive pré-vaccinale et/ou diagnostique ; A l‟endroit des populations de femmes, de jeunes filles et des hommes, d‟adopter une hygiène de vie saine, une hygiène sexuelle, de se faire dépister, de se faire vacciner. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 132 REFERENCES REFERENCES AHUJA, A., ANDERSON, S. M., KHALIL, A. & SHLOMCHIK, M. J. 2008. Maintenance of the plasma cell pool is independent of memory B cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 105, 4802-7. ALEMANY, L., DE SANJOSE, S., TOUS, S., QUINT, W., VALLEJOS, C., SHIN, H. R., BRAVO, L. E., ALONSO, P., LIMA, M. A., GUIMERA, N., KLAUSTERMEIER, J., LLOMBART-BOSCH, A., KASAMATSU, E., TATTI, S. A., FELIX, A., MOLINA, C., VELASCO, J., LLOVERAS, B., CLAVERO, O., LERMA, E., LACO, J., BRAVO, I. G., GUARCH, R., PELAYO, A., ORDI, J., ANDUJAR, M., SANCHEZ, G. I., CASTELLSAGUE, X., MUNOZ, N., BOSCH, F. X. & GROUP, R. H. T. S. 2014. Time trends of human papillomavirus types in invasive cervical cancer, from 1940 to 2007. Int J Cancer, 135, 88-95. ASHRAFI, G. H., TSIRIMONAKI, E., MARCHETTI, B., O'BRIEN, P. M., SIBBET, G. J., ANDREW, L. & CAMPO, M. S. 2002. Down-regulation of MHC class I by bovine papillomavirus E5 oncoproteins. 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Compaore, Tani Sagna, Djeneba Ouermi, Charlemagne M.R. Ouédraogo, Virginio Pietra, Jean-Baptiste Nikiéma, Simon A. Akpona and Jacques Simpore. Prevalence of HPV High-Risk Genotypes in Three Cohorts of Women in Ouagadougou (Burkina Faso). Mediterr J Hematol Infect Dis. 2013; 5(1):e2013059. doi: 10.4084/MJHID.2013.059. 2. Zohoncon Théodora Mahoukèdè, Ouédraogo T. Clarisse, Brun Luc VC, Djigma W. Florencia, Salifou Kabibou, Ouattara Souleymane, Gomina Moutawakilou, Yonli Albert T., Bazié Valérie JTE, Djénéba Ouermi, Obiri-Yeboah Dorcas, Ouédraogo Charlemagne, Lompo Olga, Akpona Simon A, Simpore Jacques. Molecular epidemiology of high-risk human papillomavirus in high-grade cervical intraepithelial neoplasia and in cervical cancer, in Parakou, Republic of Benin. Pak. J. Biol. Sci. 2016. ISSN 1028-8880. DOI: 10.3923/pjbs.2016. 3. Ouédraogo CM, Rahimy RM, Zohoncon TM, Djigma FW, Yonli AT, Ouermi D, Sanni A, Lankoande J, Simpore J. Epidemiology and characterization of high-risk genotypes of human Papillomavirus in a population of sexually active adolescents in Ouagadougou. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris). 2015 Oct;44(8):715-22. doi: 10.1016/j.jgyn.2014.12.021. 4. Charlemagne Ouédraogo, Théodora Mahoukèdè Zohoncon, Esther M. A. Traoré, Souléman Ouattara, Prosper Bado, Clarisse T. Ouedraogo, Florencia Djigma, Djénéba Ouermi, Dorcas Obiri-Yeboah, Simon A. Akpona, Olga Mélanie Lompo/Gombri, Jacques Simpore. Distribution of High-risk Human Papillomavirus Genotypes in Precancerous Cervical Lesions in Ouagadougou, Burkina Faso. (En soumission). 5. Théodora M. Zohoncon, Prosper Bado, Esther M. A. Traoré, Souléman Ouattara, Florencia Djigma, Djénéba Ouermi, Charlemagne Ouédraogo, Simon A. Akpona, Olga Mélanie Lompo/Gombri, Jacques Simpore. Prevalence and distribution of High-risk Human Papillomavirus genotypes in samples of cervical cancer in Ouagadougou. (En soumission). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 153 Annexe 2 : Autres publications 1. Douamba Z, Dao NG, Zohoncon TM, Bisseye C, Compaoré TR, Kafando JG, Sombie BC, Ouermi D, Djigma FW, Ouedraogo P, Ghilat N, Pietra V, Colizzi V, Simpore J. Mother-to-ChildrenPlasmodium falciparum Asymptomatic Malaria Transmission at Saint Camille Medical Centre in Ouagadougou, Burkina Faso. Malaria Research and Treatment. 2014;2014:390513. doi: 10.1155/2014/390513. 2. M. Gomina Assoumanou, T. M. Zohoncon, S. A. Akpona. Evaluation de la teneur en iode des sels de cuisine dans les ménages de deux zones d‟endémie goitreuse du Bénin. Int. J. Biol. Chem. Sci. 2011; 5(4): 1515-1526. 3. Tao I, Compaoré TR, Diarra B, Djigma F, Zohoncon TM, Assih M, Ouermi D, Pietra V, Karou SD, Simpore J. Seroepidemiology of hepatitis B and C viruses in the general population of burkina faso. Hepat Res Treat. 2014;2014:781843. doi: 10.1155/2014/781843. Epub 2014 Aug 5. 4. Sanou M, Soubeiga ST, Bationo F, Compaore TR, Zohoncon TM, Diatto GN, Ouedraogo P, Pietra V, Nagalo BM, Bisseye C, Traore RO, Simpore J. A decade of follow-up and therapeutic drug monitoring in HIV-2 immunocompromised patients at St Camille and General Lamizana Military Medical Centers, Burkina Faso, West Africa. Pak J Biol Sci. 2014 Dec;17(12):1219-24. 5. Oumar Guira, Delwendé S R Kaboré, Ginette Dao, Nicaise Zagré, Théodora M Zohoncon, Virginio Pietra, Joseph Y Drabo, Jacques Simpore. The modalities of nonadherence to Highly Active Antiretroviral Therapy and the associated factors related to patients‟sociodemographic characteristics and their Caregiving perceptions in Ouagadougou (Burkina Faso). Journal of the International Association of Providers of AIDS Care. 11/2015; DOI:10.1177/2325957415616492. 6. Ina Marie Angèle Traore, Théodora Mahoukèdè Zohoncon, Adama Dembele, Florencia W Djigma, Dorcas Obiri-Yeboah, Moussa Bambara, Charlemagne Ouédraogo, Yves Traore, Jacques Simpore. Caractérisation moléculaire des papillomavirus humains à haut risque chez des femmes à Bobo-Dioulasso, Burkina Faso. (Soumis). Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 154 Annexe 3 : communications orales et affiches réalisées lors de rencontres scientifiques 1. Zohoncon TM, Bisseye C, Djigma FW, Yonli AT, Compaore TR, Sagna T, Ouermi D, Ouédraogo CM, Pietra V, Nikiéma JB, Akpona SA, Simpore J. Molecular diagnosis by real-time PCR, of Human Papillomavirus (HPV) high-risk (HPV-30 and HPV-'S 50'S) among HIV seropositive and seronegative women‟s in Ouagadougou (Burkina Faso). 17th International Conference on AIDS and STIs in Africa. Cape Town South Africa, 07-11 december 2013. Poster n°142. 2. Zohoncon TM, Bisseye C, Djigma FW, Yonli AT, Compaore TR, Sagna T, Ouermi D, Ouédraogo CM, Pietra V, Nikiéma JB, Akpona SA, Simpore J. Diagnostic moléculaire, par PCR en temps réel, des papillomavirus humains (HPV) à haut risque (HPV-30‟S et HPV-50‟S) chez des femmes VIH séropositives et séronégatives à Ouagadougou. 17èmes Journées des Sciences de la Santé de Bobo. Bobo-Dioulasso 06-09 mai 2014. Communication orale n°109. 3. Zohoncon TM, Bisseye C, Djigma FW, Yonli AT, Compaore TR, Sagna T, Ouermi D, Ghilat N,Ouédraogo P, Pietra V, Ouédraogo CM, Akpona SA, Lankoandé J, Simpore J. Epidémiologie des Papillomavirus Humains à Haut Risque (HPV-HR) chez les femmes au Burkina Faso. IVème journées régionales de gynécologie obstétrique. Koudougou, Burkina Faso 04 Ŕ 05 juin 2015. Communication orale. 4. Zohoncon Théodora M, Ouédraogo T Clarisse, Brun Luc VC, Djigma W Florencia, Salifou Kabibou, Ouattara Souleymane, Gomina Moutawakilou, Compaoré Rebeca T, Yonli Albert T, Bazié Valérie JTE, Djénéba Ouermi, ObiriYeboah Dorcas, Ouédraogo Charlemagne, Lompo Olga, Akpona Simon A, Simpore Jacques. Epidémiologie moléculaire des Papillomavirus humains à haut risque dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales de haut grade et dans le cancer du col de l‟utérus, à Parakou, République du Bénin. 2èmes Journées Scientifiques du CAMES. Dakar, Sénégal, 23 - 25 novembre 2015. Communication orale N°208. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 155 Annexes 4 : fiches de collecte Fiche individuelle de collecte pour l’étude sur la prévalence des génotypes HPV à haut risque dans trois populations de femmes à Ouagadougou (Burkina Faso). Fiche d’enquête N°…… I- Données sociodémographiques Date / / / / 1- Nom et Prénom(s)………………………………………………....... 2- Age………………………………………………………………….. 3- Ethnie …………………………………………………………. 4- Profession : ménagère artisane ; ; commerçante Etudiante 5- Religion : catholique ; fonctionnaire ; Professionnelle du sexe ; protestante ; musulmane ; animiste ; autre préciser……………………….. 6- Adresse : Téléphone…………… ……… Quartier………………... 7- Education…………………………………………… (1 : Aucune ; 2 : Primaire ; 3 : Secondaire ; 4 : Université) 8- Situation matrimoniale : Célibataire Mariée Divorcée Veuve 9- Avez Ŕvous un emploi stable présentement ? Oui 10- Source de revenu : époux propre salaire ; non partenaires multiples parents 11- Consommation de tabac (fumé ou chiqué) : Oui Non II- ATCD gynécologiques et obstétricaux 12- Quand avez-vous eu vos dernières règles ?. (j)................................... 13- A quel âge avez-vous eu votre premier rapport sexuel ? (an)……. 14- 1 : Gestité….. ; 2 : Parité…… ; 3 : Enfants vivants…... ; 4 : Fausse Couche…… ; 5 : Avortements provoqués………… Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 156 15- Nombre de partenaires sexuels : ………………………… 16- Utilisez-vous un préservatif lors des rapports sexuels ? Oui ; Non ; Parfois 17- Utilisez-vous des Contraceptifs oraux ? 18- Autres que 16, et 17 Oui Non précisez…………………………… 19- Avez-vous déjà fait un dépistage du cancer du col de l‟utérus ? Oui Non 20- Si oui, précisez le résultat……………………………………….. 21- Avez-vous eu d‟IST ? Oui ; Non 22- Combien de fois allez-vous chez le gynécologue par an ?.............. 23- Avez-vous déjà eu une infection gynécologique ? Oui ; Non Si oui préciser……………………………….. 24- Avez-vous déjà eu une intervention chirurgicale sur le col ou sur l‟utérus ? si oui préciser le type………………………………………………. 25- Êtes-vous sous antibiotiques depuis au moins une semaine ? Oui ; Non III- Statut VIH : Négatif Positif sous ARV pas sous ARV Inconnu IV- Signes génitaux 26- Souffrez-vous de l‟un des signes suivants ? (Cocher la case si la réponse est oui) Leucorrhées Ulcération dans la région ano-génitale externe Végétation Saignement post coïtal Saignement entre les règles Y a-t-il un saignement au contact ? V- Inspection visuelle Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 157 27- Résultats de l‟inspection visuelle avant IVA/IVL (Cocher la case si la réponse est oui) Jonction pavimento-cylindrique entièrement visible Polype cervical Kystes de naboth Cervicite Leucoplasie Condylome Cancer 28- Résultats une minute après l‟application d‟acide acétique à 5% (IVA) : Négatif ; Positif ; Cancer invasif 29- Si l‟IVA est positive, la lésion acidophile pénètre-t-elle dans le canal endocervical ? Oui ; Non 30- Schéma (zone A et /ou B) B B B A A Avant coloration IVA A IVL 31- Résultats après l‟application du soluté de lugol (IVL) Négatif ; Positif ; Cancer invasif 32- Si l‟IVL est anormale, est ce que la région non iodée s‟étend dans le canal endocervical ? Oui ; Non VI- Résultats de la PCR en temps réel du HPV Génotypes HPV Merci pour votre participation Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 158 Fiche individuelle de collecte de données pour l’étude portant sur l’épidémiologie et de la caractérisation moléculaire des génotypes à haut risque du papillomavirus humain chez les adolescentes à Ouagadougou Fiche d‟enquête N° /_/_/_/ Date:/___/___/___/ Données sociodémographiques Nom et Prénoms :………………………………………………………………… Age (ans) :………………… Ethnie : ……………………… Profession : ménagère /_/ commerçante /_/ artisane /_/ élève /_/ étudiante /_/ autre (préciser)…………………. Adresse : téléphone : ………………………… Quartier : …………………. Religion : musulmane/_/ catholique/_/ protestante/_/ animiste/_/ autre (préciser) : …………. I Situation matrimoniale : Mariée /_/ vie maritale /_/ Célibataire /_/ Etes-vous scolarisée ? OUI /_/ NON /_/ Niveau scolaire : …………………………………………… II- Motif de consultation : ……………………………………………………………………………………………… III- Antécédents Quand avez-vous eu vos dernières règles ? (jours)…………...… date non connue/_/ Avez-vous déjà eu des relations sexuelles ? OUI /_/ NON /_/ Si oui : de façon volontaire /_/ par contrainte ou viol /_/ A quel âge avez-vous eu votre premier rapport sexuel ? ………… ans Combien de partenaires sexuels avez-vous eu ? : ………………………….. Nombre de partenaires sexuels au cours du dernier mois :………… Quelle est la fréquence de vos rapports sexuels ?............................. Utilisez-vous le préservatif ? A chaque fois /_/ Episodiquement /_/ non/_/ Utilisez-vous une méthode contraceptive ? OUI /_/ NON /_/ Si oui, laquelle ? Préservatif /_ / pilule /_ / spermicide /_/ stérilet /_ / implant /_ Avez-vous déjà eu recours à la pilule du lendemain ? OUI /_/ NON /_/ Avez-vous déjà eu des grossesses ? OUI /_/ NON /_/ Si oui, combien de grossesses ?_ _ nombre d‟enfants vivants __ avortements provoqués__ avortements spontanés__ Etes-vous enceinte actuellement ? OUI /_/ NON /_/ NE SAIT PAS /_/ Quelle est la date de votre dernier rapport sexuel ? Consommez-vous du tabac (fumé ou chiqué) ? OUI /_/ NON /_/ Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 159 Si oui quantité par jour ?.........................Depuis combien d‟années……… ? Y-a-t „il un ou des fumeurs dans votre entourage immédiat (tabagisme passif) ? OUI /_/ NON /_/ Souffrez-vous de l‟un des signes suivants ? - Leucorrhées - Ulcération dans la région ano-génitale externe - Végétation - Saignement post coïtal - Saignement entre les règles - Y a-t-il un saignement au contact ? Avez-vous déjà eu recours à un traitement local par des ovules ? OUI /_/ NON /_/ Etes-vous actuellement sous traitement antibiotique depuis au moins une semaine? OUI /_/ NON /_/ si oui, préciser ………………………………….. IV-Niveau de connaissance sur les IST, le VIH, le cancer du col de l’utérus et la planification familiale NON /_/ Avez-vous déjà eu une consultation gynécologique ? OUI /_/ Si oui, combien de fois consultez-vous le gynécologue par an ? Savez-vous ce qu‟est une IST ? OUI /_/ NON /_/ Si oui, définir brièvement, donner le nom d‟une IST et un moyen de la prévenir: …………………. ……………………………………………….. Quel est votre statut VIH : Négatif /_/ Positif /_/ sous ARV /_/ pas sous ARV Inconnu /_/ A quand remonte votre dernier test VIH ? ‹03mois /_/ ›03 MOIS /_/ Avez-vous déjà eu une IST ? OUI /_/ NON /_/ Si oui, préciser le type…………………………………………………………………………. Avez-vous déjà entendu parler du papillomavirus humain (HPV) ? OUI /_/ NON /_/ NON /_/ Avez-vous déjà entendu parler du cancer du col de l‟utérus ? OUI /_/ Comment attrape-t-on le cancer du col de l‟utérus ? …………………………………………………………….. Avez-vous déjà fait un test de dépistage du cancer du col de l‟utérus ? ? OUI /_/ NON /_/ Si oui de quelle nature ? : IVA/IVL /_/ FCV/_/ autre (préciser) ........................................... Il y a combien de temps ………………………………………. Avez-vous déjà eu une intervention chirurgicale sur le col ou sur l‟utérus? Si oui préciser le type…………………………………………………………………….. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 160 V- Examen au spéculum : Inspection directe : (Cocher la case si la réponse est oui) - Jonction pavimento-cylindrique entièrement visible /_/ Polype cervical /_/ Kystes de naboth /_/ Cervicite /_/ Leucoplasie /_/ Condylome /_/ Cancer /_/ Saignement au contact /_/ Ectropion /_/ Prélèvement au niveau de l‟endocol à l‟aide d‟un écouvillon Résultats une minute après l‟application d‟acide acétique à 5% (IVA): Négatif /_/ Positif /_/ Cancer invasif /_/ Si l‟IVA est positive, la lésion acidophile pénètre-t-elle dans le canal endocervical ? Oui /_/ Non /_/ Résultats après l‟application du soluté de Lugol (IVL) : Négatif /_/ Positif /_/ Cancer invasif /_/ Si l‟IVL est anormale, est ce que la région non iodée s‟étend dans le canal endocervical ? Oui /_/ Non /_/ VI- Résultats du diagnostic moléculaire du HPV par PCR en temps réel Négatif /_/ Positif /_/ Si positif : génotype(s) ……………………………………………………………… Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 HPV : Page 161 Fiche de collecte pour les travaux sur la distribution génotypique des HPV-HR dans les néoplasies cervicales intra-épithéliales de haut grade et dans le cancer invasif du col de l’utérus à Ouagadougou et à Parakou. Code : Date de réception du prélèvement : Age de la patiente : Profession : Ethnie : Adresse complète : Motif de demande : Renseignements cliniques : Contraception : Frottis Cervico-Vaginal antérieur : Autres antécédents : Aspect macroscopique du col : Résultat de l‟examen anatomopathologique Résultat de la recherche des HPV à haut risque par PCR en temps réel Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 162 Annexe 5 : Approbation du comité d’éthique Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 163 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 164 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 165 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 166 Annexe 6 : protocole d’extraction de l’ADN à l’aide du kit « DNASorb-A » Préparation de la quantité requise de tubes en polypropylène de 1,5 ml, y compris un tube pour le contrôle négatif de l'extraction Ajout de 300 μl de solution de lyse dans chaque tube, Ajout de 100 μl d'échantillons dans le tube approprié Préparation des contrôles par l‟ajout de 100 μl de C- (Neg contrôle fourni avec le kit d'amplification) dans le tube étiqueté Cneg Mélange au vortex et incubation pendant 5 min à 65 ° C. Centrifugation pendant 5-7 sec. Mélange vigoureux au vortex du « Sorbent » et l‟ajout de 20 μl dans chaque tube Mélange au vortex pendant 5-7 secondes et incubation de tous les tubes pendant 3 min à température ambiante (étape à répéter). Centrifugation de tous les tubes pendant 30 secondes à 5000g et à l'aide d'une micropipette muni de cône à filtre, retrait délicat du surnageant suivi de son jet dans chaque tube sans perturbation du culot (changer les cônes entre les tubes). Ajout de 500 μl de la solution de lavage dans chaque tube. Mélange vigoureux au vortex centrifugation pendant 30 secondes à 10000g. retrait délicat du surnageant suivi de son jet dans chaque tube. Répétition de l'étape 9 et incubation de tous les tubes avec bouchon ouvert pendant 510min à 65 ° C. Suspension du culot dans 100 μl de DNA éluent. Incubation pendant 5 min à 65°C et mélange périodique au vortex. Centrifugation des tubes pendant 1 min à 12000g. Le surnageant contient de DNA prêts pour l'amplification. L‟ADN ainsi obtenu peut être utilisé pour la PCR ou conservé à -20ºC pour une utilisation ultérieure. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 167 Annexe 7 : protocole d’extraction de l’ADN à l’aide du kit FFPE DNA Purification de Norgen Biotek Corp Déparaffinage au xylène, séchage à température ambiante, ajout de 300μl de Digestion Buffer et 10 μl de Protéinase K puis 1 μl de RNase aux échantillons. Mélange au vortex et incubation à 55°C pendant 1 heure suivie d‟une autre incubation à 90°C pendant 1 heure ; mélange au vortex occasionnellement. Ajout de 300 μl de Binding Solution ; mélange au vortex. Ajout de 250 μl d‟éthanol absolu ; mélange au vortex. Prélèvement de 600 μl du lysat qui a été introduit dans les tubes gDNA purification micro column muni de tube collecteur. Centrifugation pendant 1min ; jeter le liquide contenu dans le tube collecteur. Etape à répéter une deuxième fois. Puis passer à trois séries de lavage en ajoutant à chaque fois 400 μl de Wash solution dans les tubes column suivi d‟une centrifugation pendant 1min. A la fin des trois séries de lavage, centrifuger pendant 2min pour faire passer le résidu de liquide à travers la column puis jeter les tubes collecteurs. Monter les column sur les tubes d‟élution. Procéder à l‟élution en ajouter 50 μl de la solution Elution buffer dans la column ; incuber pendant 1min à température ambiante et centrifuger à 14000 RPM. Jeter les tubes column. L‟ADN extrait est dans le tube d‟élution et est prêt pour amplification ou peut être conservé à -20°C pendant quelques jours avant l‟amplification. Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 168 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 169 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 170 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 171 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 172 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 173 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 174 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 175 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 176 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 177 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 178 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 179 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 180 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 181 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 182 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 183 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 184 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 185 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 186 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 187 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 188 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 189 Thèse Doctorat Unique, PhD _ ZOHONCON Théodora M. _ 2015 Page 190
