ENZYMES CO

1/22
UNIVERSITE DE RENNES I
~~~~~~~~~~
FACULTE DE MEDECINE
~~~~~~~~~~
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE
~~~~~~~~~~
PCEM 1
Biochimie Structurale
ENZYMES
CO-ENZYMES
~~~~~~~~~~
Pr Marc Denis
Année Universitaire 2007-2008
2/22
ENZYMOLOGIE
1. GENERALITES
1.1. Définitions
1.1.1. Enzyme
1.1.2. Substrat – Produit
1.1.3. Site actif
1.2. Mode d’action
Diagramme d'une réaction catalytique qui montre l'énergie (E) requise à différentes
étapes suivant l'axe du temps (t).
1.3. Caractéristiques
CH 2 OH
O
O
β
R
+ H2O
β Galactosidase
β D Galactoside
2. CLASSIFICATION DES ENZYMES
2.1. Oxydo-réductases – EC1
2.2. Transférases – EC2
2.3. Hydrolases – EC3
2.4. Lyases – EC4
2.5. Isomérases – EC5
2.6. Ligases (ou synthétases) – EC6
CH 2OH
O OH
+ R
β D Galactose
OH
3/22
3. CINETIQUE DES REACTIONS ENZYMATIQUES A UN SUBSTRAT MODELE DE MICHAELIS
3.1. Généralités
3.1.1. Influence de la concentration en enzyme
v
v2
v1
E1
E2
[E]
Concentrations
3.1.2. Influence de la concentration en substrat
a) Variation de [S], [P] et [ES] au cours du temps
S
P
ES
0
tA
tB
b) Variation de la vitesse en fonction de [S]
v
VM
Enzyme saturé
[S]
COURBE DE SATURATION
Temps
4/22
3.2 . Aspect théorique – Equation de Michaelis
v=
VM [S ]
[S ] + KM
3.3. Signification des paramètres cinétiques
3.3.1 Constante de Michaelis KM
ENZYME
SUBSTRAT
Glucose phosphate isomérase
Aldolase
Triose phosphate isomérase
Glucose-6-phosphate
Fructose1,6-diphosphate
Glycéraldéhyde-3phosphate
Glycéraldéhyde-3phosphate
3-Phosphoglycérate
Glycéraldéhyde-3-phosphate
deshydrogénase
Phosphoglycérate kinase
CONCENTRATION
(µM)
450
32
3
KM
(µM)
700
100
460
3
70
60
1200
3.3.2 Vitesse maximale VM
3.4. Détermination des paramètres cinétiques
1
1 KM 1
=
+
v VM [S ] VM
Représentation de Lineweaver et Burk
5/22
3.5. Activité enzymatique
3.5.1. Définitions et unités
3.5.2. Activité spécifique
4. EFFECTEURS DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE
Activité enzymatique
4.1. Influence de la température
4.1.1. Effet de la température sur la vitesse
4.1.2. Inactivation thermique des enzymes
4.1.3. Résultante des deux effets
Activation
Dénaturation
θ opt
Température
ACTIVITE ENZYMATIQUE EN
FONCTION DE LA TEMPERATURE
Activité enzymatique
4.2. INFLUENCE DU pH
pH
pH opt
ACTIVITE ENZYMATIQUE EN
FONCTION DU pH
4.3. INFLUENCE DES IONS METALLIQUES
4.4. INHIBITEURS DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE
4.4.1. Inhibition compétitive
+S
I
E
E
S
+I
EI
ES
E+P
6/22
v=
V M [S ]
⎛
I ⎞
[S ] + KM ⎜⎝ 1 + [K] ⎟⎠
I
⎛
[I ]⎞⎟
K'M = KM ⎜ 1 +
⎝
KI ⎠
1
KM ⎜⎛
1
[I ]⎞⎟
=
+
1+
KI ⎠
v VM VM [S ] ⎝
4.4.2. Inhibition non compétitive simple
E
S
E
I
+S
+I
ES
E+P
+I
EI
ESI
+S
7/22
v=
V M [S ]
⎛
I ⎞
(KM + [S ])⎜⎝ 1 + [K] ⎟⎠
I
1
1
=
v VM
'
VM=
⎧⎛
[I ]⎞⎟ ⎛⎜ KM ⎞⎟ ⎫
1+
⎨⎜ 1+
⎬
KI ⎠ ⎝
[S ] ⎠ ⎭
⎩⎝
4.4.3. Autres types d'inhibitions
4.5. Modèle allostérique
Forme
Forme R
VM
⎛
⎜ 1 + [I ]⎞⎟
⎝
KI ⎠
8/22
4.6. Rôle biologique des effecteurs enzymatiques
NH 2
NH 2
COOH
SO 2
Acide
p-aminobenzoïque
NH 2
Sulfamide
NH 2
SH
N
N
N
N
NH
N
NH
N
6 mercaptopurine
Adénine
5. LES ISOENZYMES
6. LE SITE ACTIF
6.1. Topologie du site actif
R153
R170
R152
R151
R 39
R 40
R150
S
R
R31
R35 R
32
R38
Squelette peptidique
de l'enzyme
R149
R37
chaines latérales
des acides aminés
R36
R34
R33
Substrat
liaison devant
être coupée
REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU SITE ACTIF
9/22
6.2. Nature de l'interaction enzyme-substrat
6.2.1. Interactions hydrogène
6.2.2. Transfert de charge
6.3. Mise en évidence du site actif
6.3.1. Réactifs de groupes
6.3.2. Marquage par le substrat ou ses analogues
7. REGULATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE
7.1. Contrôle génétique de la synthèse des enzymes
7.2. Régulation par modification structurale de l'enzyme
7.2.1. Systèmes réversibles
a) Phosphorylation - déphosphorylation : Ser, Thr, Tyr
ATP
ADP
Enz—Ser—O—PO3 H2
Enz—Ser—OH
b) Adénylylation - désadénylylation : Tyr
ATP
PPi
Enz—Tyr—O—AMP
Enz—Tyr—OH
c) Méthylation - déméthylation : Glu
R—CH3
R
Enz—Glu—CO—O—CH3
Enz—Glu—COOH
d) MonoADP-ribosylation : Arg, Asn, Lys, Cys
NAD
Nicotinamide
Enz—Arg
Enz—Arg—ribosyl—ADP
7.2.2. Systèmes irréversibles
a) Activation des proenzymes en enzymes par protéolyse limitée.
b) Activation des proenzymes par addition de coenzymes
7.3. Régulation au niveau du site catalytique
7.3.1. En fonction de KM et de la concentration en substrat
7.3.2. Inhibiteurs et activateurs
10/22
7.4. Régulation allostérique
7.4.1. Inhibition par le produit final
E1
A
E2
B
E3
C
E4
D
E5
E
P
7.4.2. Activation par le précurseur
E1
A
E2
B
E3
C
E4
D
E5
E
+
7.4.3. Activation ou inhibition par des métabolites
8. UTILISATION DES ENZYMES EN BIOLOGIE
8.1. Enzyme de Conversion de l'Angiotensine (ECA)
8.2. Amylase
8.3. Créatine phosphokinase (CPK)
8.4. Lactate-déshydrogénase (LDH)
8.5. Phosphatases alcalines (PAl)
P
11/22
LES COENZYMES
1. DEFINITION ET PROPRIETES
2. CLASSIFICATION
COENZYMES DE TRANSFERT DE GROUPES
1. PYRIDOXAL PHOSPHATE (PLP)
1.1. Structure
CHO
HO
R=
Pyridoxal
O
5
H3 C
H
CH 2 O—R
+
N 1
R=
P
OH
Pyridoxal
phosphate
OH
H
1.2. Source
1.3. Réactivité
1.3.1. Transamination entre un α aminoacide et un α cétoacide
COOH
R1
CH
+ R2
NH 2
COOH
C
COOH
R2
O
1.3.2. Décarboxylation
1.3.3. Racémisation
CH
+ R1
NH 2
COOH
C
O
12/22
2. PYROPHOSPHATE DE THIAMINE (TPP)
2.1. Structure
4'
2
3'
H3 C
R=
+
N3
CH 2
2'
R=
5'
6'
N 1'
NH 2
N
5
1
S
CH 2
CH 2
Thiamine
H
O
P
CH 3
4
O
O
P
OH
Pyrophosphate de
thiamine
OH
OH
2.2. Source
2.3. Principaux types de réactions catalysées
2.3.1. Décarboxylation d'acides α cétoniques
2.3.2. Réactions de transcétolisation
3. BIOTINE
3.1. Structure
O
2'
HN
1'
H
3'
3
H
4
2
NH
5
1
S
3.2. Réactivité
3.2.1. Carboxylation
3.2.2. Décarboxylation
3.2.3. Transcarboxylation
(CH 2 ) 4
COOH
10
OR
13/22
4. FOLATES (vit B9)
4.1. Structure
OH
5'
N
N
4
5
3
6
2
7
H2 N
R=
OH
R=
NH
1
8
N
N
CH
NH
2 10
9
1'
3'
2'
Acide ptéroïque
CH
(CH 2 ) 2
COOH
4.2. Source
4.3. Réactions catalysées
O
6'
4'
COOH
Acide ptéroyl glutamique
C
R
14/22
5. COBALAMINE (vitamine B12)
5.1. Structure
- le cobamide coenzyme B12
R = — 5' désoxyadénosine
- les vitamines B12 :
R = — CN pour la cyanocobalamine (vit B12)
R = — OH pour l'hydroxycobalamine (vit B12a)
R = — CH3 pour la méthylcobalamine (méthyl B12)
5.2. Source
5.3. Types de réactions où intervient le coenzyme B12
5.3.1. Isomérisations
5.3.2 Transfert de groupe CH3
15/22
6. COENZYME A
6.1. Structure
NH 2
N
N
7
1
9
3
N
N
O
O
3' 5' diphospho
adénosine
5'
O
P
O
P
H 2C O
O
4'
H2 C
OH
1'
OH
3'
H3 C C
Acide
pantoïque CH
CH 3
CO
NH
2'
H 2 PO 3 O
OH
(CH 2 ) 2
CO
OH
NH
β Alanine
(CH 2 )2
SH
Cystéamine
Acide pantothénique
Pantéthéine
6.2. Réactions catalysées
6.2.1. Réactions d'acylation
Acyl AMP
R
O
O
+ CoASH
C
O
R
AMP
C
Acyl CoA
6.2.2. Réactions de condensation
7. NUCLEOSIDES 5' MONO ET POLYPHOSPHATES
7.1. Structure de l'ATP
ATP
ADP
AMP
NH 2
N
N
7
1
9
3
O
O
N
N
O
5'
HO
P
γ
OH
O
P
β
OH
liaisons
anhydrides
O
P
α
O
O
H2 C
4'
OH
1'
3'
liaison
ester
2'
OH OH
Adénosine
+ AMP
SCoA
16/22
6.2. Propriétés de l'ATP
6.2.1 Hydrolyse de l'ATP
R
O
O
O
Pα O
P
β
OH
OH
O
O
ou
Pγ
OH
H
OH
°°
OH
6.2.2. Complexation
6.3. Principaux types de réactions ou intervient l'ATP
6.3.1. Transfert de phosphate
R — OP + ADP
Adénine-ribose — P — P — P + R — OH
6.3.2. Transfert de pyrophosphate
R — O — P — P + AMP
Adénine-ribose — P — P — P + R — OH
6.3.3. Transfert d'adénosine monophosphate
R — AMP + Ppi
Adénine-ribose — P — P — P + R
O
ATP + R
O
C
R
OH
CO
CH
R
NH 2
Acyl AMP
O
PP i
COOH
ATP + R
C
CH
PP i
P
O
ribose-adénine
P
ribose-adénine
Aminoacyl AMP
NH 2
6.4. Autres nucleosides phosphates
6.4.1. Nucléosides diphospho – oses
6.4.2. Nucléosides monophosphate cycliques
17/22
MODE D'ACTION DE L'AMP CYCLIQUE
SECOND MESSAGER HORMONAL
H
NH 2
N
N
Hormone
Récepteur
de l'hormone
+
Adénylate
cyclase
N
N
extérieur
Membrane
plasmique
AMP cyclique
intérieur
O
5'
O
H2 C
3'
ATP
3'5' AMP
HO
+
Protéine kinase
inactive
Protéine kinase
active
P
O
+
Enzyme déphosphorylé
inactif
Enzyme phosphorylé
actif
responsable des effets
biologiques
O
18/22
COENZYMES D'OXYDO-REDUCTION
1. COENZYMES NICOTINIQUES
1.1.
Structure
O
C
OH
N
1.1.1. Nicotinamide adénine dinucléotide NAD+
O
Nicotinamide nucléotide
C
4
3
2
1
O
N
5'
HO
P
O
H 2C
O
O
NH 2
+
NH 2
N
N1
9
2
3
N
N
5'
HO
P
O
H 2C
O
O
2'
AMP
O—R
R=—H
R = — PO H
3
2
+
NAD
NADP+
1.1.2. Le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NADP+
19/22
H
°°
ion hydrure
−
H
O
O
H
4
4
Attaque
nucléophile
C
H
C
NH 2
NH 2
N+
N
R
R
H
H
H
+ 2 H+ + 2 e -
+ H+
+
N
N
Ox
E' = - 0,32 V
°
R
Red
R
1.2. Sources
Absorption
1.3. Propriétes optiques des coenzymes pyridiniques
NAD+
NADH
260
340
420
λ (nm)
1.4. Principaux types de réactions catalysées par les coenzymes
pyridiniques
1.4.1. Oxydation d'alcools primaires
R — CH 2 OH
R — CHO
NAD + NADH + H +
1.4.2. Oxydation d'alcools secondaires
O
R — CH — R'
OH
R — C — R'
NAD + NADH + H +
20/22
1.4.3. Oxydation d'aldéhydes hydratés
H
H
R—C
+ H 2O
R
C
O
O
R
OH
C
NAD + NADH + H +
OH
OH
1.4.4. Transformation d'amines primaires en cétones
imine
R
CH
R'
NH 2
R
C
R'
R
NH
NAD + NADH
+H+
H2 O
C
O
NH 3
2. COENZYMES FLAVINIQUES
2.1. Structure
O
H 3C
N
5
4
10
6
3
Riboflavine
7
2
8
H 3C
NH
9
1
N
N
O
NH 2
CH 2
5'
9
CH 2
P
N
N
O
OH
N
N
(CHOH)3
OH
O
O
P
O
H2 C
O
O
FMN
FAD
2.2. Sources
2.3. Réactions catalysées par les coenzymes flaviniques
H
H
N
N
10
10
+2H
+
+2e
-
1
1
N
Ox
H
N
E' = - 0,20 V
°
Red
H
R'
21/22
2.2.1. Hydrogènes provenant d'un substrat réduit XH2
XH 2
X
FAD
H 2C
COOH
H 2C
COOH
FADH 2
HC
HOOC
Acide succinique
FAD
COOH
CH
Acide fumarique (trans)
FADH 2
2.2.2. Hydrogènes issus de coenzymes nicotiniques réduits
XH
NADH + H +
FADH
Cytochrome red
2
2
NAD +
X
FAD
e-
Cytochrome ox
3. COENZYMES QUINONIQUES
O
H 3 CO
CH 3
CH
H 3 CO
CH 2
H
avec
4 < n < 10
C
CH 2
n
CH 3
O
O
OH
+2H
Ox
+
+2e
−
E' = + 0,10 V
°
O
Red
OH
4. ACIDE LIPOIQUE
(CH2 )4— COOH
(CH2) 4— COOH
S
S
+ 2 H+ + 2 e -
Acide lipoïque
oxydé
HS
E' = - 0,29 V
°
SH
Acide lipoïque
réduit
22/22
5. ACIDE ASCORBIQUE
O
O
C
C
C
O
C
O
C
O
+2H
+
+2e
−
C
HC
HC
HO
C
OH
O
OH
HO
H
H
CH 2 OH
CH 2 OH
Acide
L déhydro ascorbique
C
E' = + 0,06 V
°
Acide L ascorbique
6. LE GLUTATHION
Acide glutamique
H2 N
HOOC
CH
(CH 2 )2
Cystéine O
H
N
C
N
C
CH
H
O
CH 2
Glycine
CH 2
COOH
SH
G—S—S—G + 2 H+ + 2 e-
2 G—SH