Résumé Introduction : Le complément C3 est un composant
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Résumé Introduction : Le complément C3 est un composant essentiel et le point commun de convergence des trois cascades d'activation du complément (voies classique, alternative et des lectines) qui représente une partie importante dans le système immunitaire. Objectifs : Analyser la fraction Bêta-2 globuline qui correspond au composant C3 du complément des fractions des deux systèmes d’électrophorèse : HELENA LABORATORIES et SEBIA HYDRAGEL β1-β2. Buts : Comparaison des concentrations du C3 sérique entre patients et témoins avec ces deux différentes méthodes d’électrophorèse (HELENA et SEBIA) suivie d’une autre comparaison entre les résultats de ces deux procédures. Matériels et méthodes : La fraction β2 qui correspond au composant C3 du complément d’électrophoregrammes obtenus par deux systèmes d’électrophorèse (HELENA et SEBIA HYDRAAGEL) de 4 patients immunodéficients et 3 témoins au total a été analysée par le logiciel imageJ. Résultats : les résultats de notre présente étude ont apporté qu’il y’a une différence statistiquement significative entre les taux du composant C3 du complément obtenus par électrophorèse Sebia et Helena et que les immunodifécients se caractérisent par une modeste augmentation du C3. Conclusion : Nos résultats préliminaires ne permettent pas de conclure qu’il y’a une différence significative entre ces deux système d’électrophorèse et lequel entre eux est meilleur que l’autre, mais cette étude permettra d'envisager de nouvelles perspectives de recherches. Mots clés : Système du complément - C3 – β2 globuline – électrophorèse – Helena Laboratories – Sebia hydragel. Abstract Introduction: The complement C3 is an essential component and the common point of convergence of three complement activation cascades (classical, alternative and lectin pathway) which is an important part in the immune system. Objectives: Analyze the fraction beta-2 globulin which is the complement component C3 fractions of two electrophoresis systems: HELENA LABORATORIES and SEBIA HYDRAGEL β1-β2. Aim: Comparison of serum C3 concentrations between patients and controls with two different electrophoresis methods (HELENA and SEBIA) followed by a comparison between the results of both procedures. Materials and Methods: The β2 fraction that corresponds to the complement component C3 electrophoregrams obtained by two electrophoresis systems (HELENA and SEBIA HYDRAGEL) of 4 immunodeficients patients and 3 control total was analyzed by ImageJ software. Results: The results of our present study provided that there's a significant difference between the component levels complement C3 obtained by Sebia electrophoresis and Helena, and that immunodifécients patients are characterized by a modest increase in C3. Conclusion: Our preliminary results do not suggest that there's a significant difference between these two electrophoresis systems and which of them is better than the other, but this study will consider new research perspectives. Keywords: complement system - C3 – β2 globulin - Electrophoresis - Helena Laboratories - Sebia HydraGel اﻟﮭدف. ﻋﻧﺻرا أﺳﺎﺳﯾﺎ وﻧﻘطﺔ ﻣﺷﺗرﻛﺔ ﺗﻠﺗﻘﻲ ﻋﻧدھﺎ ﺛﻼث ﺗدﻓﻘﺎت ﻟﺗﻔﻌﯾﻠﮫ )اﻟﻣﺳﺎرات اﻟﻛﻼﺳﯾﻛﯾﺔ واﻟﺑدﯾﻠﺔ واﻟﻼﻛﺗﯾن( ﺣﯾث ﯾﻣﺛل ﺟزءا ھﺎﻣﺎ ﻓﻲ اﻟﺟﮭﺎز اﻟﻣﻧﺎﻋﻲC3 ﯾﻌﺗﺑر اﻟﻣﻛﻣل: ﻣﻠﺧص وHELENA Laboratories : ﻟﻠﻣﻛﻣل ﻣن أﺟزاء طرﯾﻘﺗﯾن ﻣﺧﺗﻠﻔﺗﯾن ﻣن اﻟﮭﺟرة اﻟﻛﮭرﺑﺎﺋﯾﺔC3 ﺟﻠوﺑﯾﻠﯾن ﻓﻲ اﻟﻣﺻل اﻟذي ﯾﻣﺛل اﻟﻣﻛونβـ2 ﻣن ھدا اﻟﺑﺣث ﺗﺣﻠﯾل ﺗرﻛﯾز اﻟﺟزء . ﻟدى ﻣﺻل ﻛل ﻣن اﻟﻣرﺿﻰ و اﻟﺷﮭود اﻟﻣﺣﺻل ﻋﻠﯾﮭﺎ ﻣن اﻟطرﻗﺗﯾن اﻟﻣذﻛورﺗﯾن ﺳﺎﺑﻘﺎC3 و دﻟك ﻣن أﺟل اﻟﻣﻘﺎرﻧﺔ ﺑﯾن ﻧﺗﺎﺋﺞ ﺗرﻛﯾز اﻟﻌﻧﺻر.SEBIA Hydragel β1-β2 . Sebia ـHelena ﺟﻠوﺑﯾﻠﯾن ـ اﻟﮭﺟرة اﻟﻛﮭرﺑﺎﺋﯾﺔ ـ2β ـC3 ﻧظﺎم اﻟﻣﻛﻣل ـ:اﻟﻛﻠﻣﺎت اﻟﻣﻔﺗﺎﺣﯾﺔ TLEMCEN N° D’ORDRE UNIVERSITE DE TLEMECEN – ABOU-BEKR BELKAID FACULTE SNV/STU - DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Laboratoire de Biologie Moléculaire Appliquée et Immunologie Mémoire Présenté pour obtenir le grade DE MASTER ll EN IMMUNOLOGIE Par Mlle BAHBAH Ismahen Soutenu le : 30/06/2016 Intitulé : Analyse par ImageJ le complément C3 des fractions d’électrophorèse HELENA Laboratories et SEBIA Hydragel β1-β2 JURY : Mr ARIBI.M Professeur Président Mme TRIQUI.Ch MAA Promoteur Mme BRAHAMI.N MC B Examinatrice 30/06/2016 III Résumé Résumé Introduction : Le complément C3 est un composant essentiel et le point commun de convergence des trois cascades d'activation du complément (voies classique, alternative et des lectines) qui représente une partie importante dans le système immunitaire. Objectifs : Analyser la fraction Bêta-2 globuline qui correspond au composant C3 du complément des fractions des deux systèmes d’électrophorèse : HELENA LABORATORIES et SEBIA HYDRAGEL β1-β2. Buts : Comparaison des concentrations du C3 sérique entre patients et témoins avec ces deux différentes méthodes d’électrophorèse (HELENA et SEBIA) suivie d’une autre comparaison entre les résultats de ces deux procédures. Matériels et méthodes : La fraction β2 qui correspond au composant C3 du complément d’électrophoregrammes obtenus par deux systèmes d’électrophorèse (HELENA et SEBIA HYDRAAGEL) de 4 patients immunodéficients et 3 témoins au total a été analysée par le logiciel imageJ. Résultats : les résultats de notre présente étude ont apporté qu’il y’a une différence statistiquement significative entre les taux du composant C3 du complément obtenus par électrophorèse Sebia et Helena et que les immunodifécients se caractérisent par une modeste augmentation du C3. Conclusion : Nos résultats préliminaires ne permettent pas de conclure qu’il y’a une différence significative entre ces deux système d’électrophorèse et lequel entre eux est meilleur que l’autre, mais cette étude permettra d'envisager de nouvelles perspectives de recherches. Mots clés : Système du complément Laboratories – Sebia hydragel. - C3 – β2 globuline – électrophorèse – Helena IV Abstract Abstract Introduction: The complement C3 is an essential component and the common point of convergence of three complement activation cascades (classical, alternative and lectin pathway) which is an important part in the immune system. Objectives: Analyze the fraction beta-2 globulin which is the complement component C3 fractions of two electrophoresis systems: HELENA LABORATORIES and SEBIA HYDRAGEL β1-β2. Aim: Comparison of serum C3 concentrations between patients and controls with two different electrophoresis methods (HELENA and SEBIA) followed by a comparison between the results of both procedures. Materials and Methods: The β2 fraction that corresponds to the complement component C3 electrophoregrams obtained by two electrophoresis systems (HELENA and SEBIA HYDRAGEL) of 4 immunodeficients patients and 3 control total was analyzed by ImageJ software. Results: The results of our present study provided that there's a significant difference between the component levels complement C3 obtained by Sebia electrophoresis and Helena, and that immunodifécients patients are characterized by a modest increase in C3. Conclusion: Our preliminary results do not suggest that there's a significant difference between these two electrophoresis systems and which of them is better than the other, but this study will consider new research perspectives. Keywords: complement system - C3 – β2 globulin - Electrophoresis - Helena Laboratories Sebia HydraGel V Remerciement Remerciement En préambule de ce mémoire, je souhaite adresser ici tous mes remerciements aux personnes qui m’ont apporté leur aide et qui ont ainsi contribué à l’élaboration de ce mémoire. Tout d’abord, je tiens à exprimer mes vifs remerciements et ma profonde gratitude à Madame TRIQUI.Ch pour son implication dans mes recherches, son aide lors de l’élaboration de ma problématique et son suivi durant la finalisation de ce projet. Son soutien, ses compétences dans ce domaine m’ont orienté à bien mené ce mémoire. A Monsieur le professeur ARIBI.M le directeur du mémoire et du laboratoire BIOMOLIM, et son personnel pour m’avoir bien accueillit, pour leurs appréciables conseils, tant au niveau de la réalisation du mémoire que dans les recherches. Je souhaite aussi remercier la faculté (SNV/STU), mes enseignants spécifiquement Madame BRAHAMI. N, VI Remerciement Je tiens à exprimer ma gratitude envers mes parents, mes frères « Mohamed », « Yassine » et ma très chère et unique sœur « Ahlem » pour leur soutien aussi moral que financier et pour leurs sacrifices. Enfin, j’adresse mes plus sincères remerciements à tous mes proches et ami(e)s, notamment mon fiancé Nadhir.Gh, ma meilleure et mon âme sœur BENMATALLAH Abla, ma chère HADJILA Asma et ma cousine MEDJAHDI Lamia, qui m’ont toujours soutenu et encouragé et à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce mémoire. VII Dédicace Je dédie cet humble travail avec grand amour, sincérité et fierté : A mes chers parents, source de tendresse, de noblesse et d’affectation. A mes frères et ma sœur, en témoignage de la fraternité, avec mes souhaits de bonheur de santé et de succès. Et a tous les membres de Ma famille. A tous mes ami(e)s, tous mes enseignants et à tout qui compulse ce modeste travail. VIII Table des matière Table des matières Résumé ………………………………………………………………………………………… III Abstract ………………………………………………………………………………………… IV Remerciement …………………………………………………………………………………. V Dédicace ……………………………………………………………………………………….. VII Table des matières ……………………………………………………………………………. VIII Liste des figures ……………………………………………………………………………….. X Liste des abréviations ………………………………………………………………………… XI Introduction …………………………………………………………………………………….. 1 Chapitre1. Revue de la littérature ………………………………………………………… 3 1. Complément C3 …………………………………………………………………………….. 3 1.1. Le système du complément (Merle et al, 2015) : …………………………………….. 3 1.2. Structure du complément C3 …………………………………………………………… 6 1.3. Rôle du complément C3 dans l’immunité ……………………………………………... 7 2. Méthodes de quantification et de dosage du complément : …………………………… 8 2.1. analyses fonctionnelles ………………………………………………………………….. 8 2.1.1. Activité totale du complément (voie classique, alternative et des lectines) ……... 8 2.1.2. Activité des différents composants. ………………………………………………….. 9 2.2. Essais immunochimiques pour les composants individuels…………………………. 10 3. Electrophorèse des protéines sériques ………………………………………………….. 10 3.1. Description et principe …………………………………………………………………… 10 3.2. Electrophorèse Sebia Hydragel ………………………………………………………… 10 3.3. Electrophorèse Helena Laboratories …………………………………………………... 11 4. Problématique ………………………………………………………………………………. 11 4.1. Objectif de l’étude ………………………………………………………………………... 12 4.2. Buts 12 4.3. Intérêt de l’étude …………………………………………………………………………. 12 Chapitre 2. Matériels et méthodes ………………………………………………………... 13 IX Table des matière 1. Electrophorèse des protéines par - Kit SEBIA HYDRAGEL β1-β2 …………………… 13 1.1. Réactifs fournis dans le kit ……………………………………………………………… 13 1.2. Technique ………………………………………………………………………………… 13 a) Migration ……………………………………………………………………………………. 13 b) Fixation des protéines …………………………………………………………………….. 15 c) Coloration – Décoloration …………………………………………………………………. 15 d) Lecture ………………………………………………………………………………………. 15 2. Electrophorèse des protéines par HELENA Laboratories (polycopies P.ARIBI M) …. 15 2.1. Réactifs …………………………………………………………………………………… 15 2.2. Technique ………………………………………………………………………………… 16 2.3. Lecture ……………………………………………………………………………………. 16 3. Analyse statistique…………………………………………………………………………. 17 Chapitre3. Résultats et interprétation ……………………………………………………. 18 1.Analyse de l’électrophoregramme Sebia Hydragel B1-B2 par ImageJ ……………….. 18 2.Analyse de l’électrophogramme Helena laboratoires par ImageJ …………………….. 19 3.Taux du composant C3 du complément …………………………………………………. 20 4.Comparaison entre les deux systèmes d’électrophorèse ……………………………… 21 Chapitre4. Discussion ……………………………………………………………………… 22 Chapitre 5. Conclusion et perspectives …………………………………………………. 24 Chapitre 6. Bibliographie …………………………………………………………………… 25 X Liste des figures Liste des figures Figure 1 : Activation du complément (Merle et al, 2015) Figure 2: Classes des protéines fonctionnelles dans le système du complément (Janeway CA Jr et al, 2001) Figue 3.A: La structure primaire de C3 et de ses produits (Noritaka Nishida et al, 2006) Figue 3.B : Architecture du domaine C3 native et C3c (Noritaka Nishida et al, 2006) Figure 4: Porte-applicateur HYDRAGEL Sebia Figure 5 : Placement du gel à l’intérieur du cadre Figure 6 : Dépôt du sérum dans les puits de l’applicateur Figure 7 : Abaissement du chariot porte-applicateur Figure 8 : Electrophoregramme SEBIA Figure 9 : Electrophoregramme HELENA Figure 10 : Analyse quantitative de la fraction du complément C3 par électrophorèse Helena chez les malades avec déficit immunitaire primaire Figure 11 : Analyse quantitative de la fraction du complément C3 par électrophorèse Sebia chez les malades avec déficit immunitaire primaire XI Liste des abréviations Liste des abréviations C1 / C3 / C4 / C9 : composant 1/ 3/ 4 / 9 du complément CD59 : cluster de différenciation 59 CPA : cellule présentatrice d’antigène CR1 : récepteur 1 du complément DAF : Decay-accelerating factor DMLA: dégénérescence maculaire liée à l’age ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay FH : facteur H IDR : immuno-diffusion radiale IgG : immunoglobuline G IgM : immunoglobuline M LPS : Lipopolysaccharide MAC : complexe d'attaque membranaire MASP: Mannan-binding lectin serine protease MBL : Mannose-binding lectin MCP : Membrane cofactor protein MG : Macroglobuline TED : thioester domain VA : voie alternative VC : voie classique VL : voie des lectines 1 Introduction Introduction Le système du complément est un ensemble de protéines qui participe aux mécanismes de défense naturels de l’hôte contre l’infection, au maintien en solution et à l’élimination des complexes immuns. Compte tenu des fonctions du système du complément, une exploration de ces protéines est principalement indiquée pour le diagnostic et le suivi des maladies autoimmunes et pour rechercher des facteurs favorisants des infections (Frémeaux-Bacchiaet al, 2012). Le système du complément comprend des protéines plasmatiques et membranaires. Certaines protéines participent à l’activation du complément (par les voies classique, alterne ou des lectines) et la plupart d’entre elles acquièrent leurs activités biologiques séquentiellement en cascade (Walport., 2001). Le complément C3 est un composant essentiel des trois cascades d'activation du complément. Le foie est la principale source de C3 en circulation et d'expression (Denis A et al, 2013). Il a un rôle central dans l'activation du système du complément ; son activation est nécessaire pour les deux voies d'activation du complément classique et alternative (Sahu A et al, 2001). Les personnes présentant un déficit en C3 sont sensibles à l'infection bactérienne (Lachmann P, 1975 ; Matsuyama W et al, 2001). Ces carences peuvent conduire aux infections génétiques, habituellement fatales aux nouveaux nés (Abbas, Abul K et al, 2012). L’électrophorèse est la principale des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules. Elle a quelques applications en chimie, mais est principalement utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation des protéines ou des acides nucléiques. Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. C’est une technique connue depuis 1930. D'abord réalisée en veine liquide, selon le système de TISELIUS, dont la méthodologie pratique était particulièrement compliquée, elle a évolué vers des applications sur supports solides : c'est l'électrophorèse de zones. Les supports utilisés successivement furent : le papier, les membranes d'acétate de cellulose et les gels d'agarose. HELENA Laboratories et SEBIA Hydragel, acteurs majeurs dans le domaine de l’électrophorèse et des fabricants d'instruments de laboratoire et de réactifs cliniques qui mettent à la disposition des laboratoires des appareils et des réactifs performants et innovants. 2 Introduction La technique HYDRAGEL permet la séparation des protéines du sérum en six fractions majeures par électrophorèse sur gel d’agarose, en particulier la séparation des fractions β1 et β2. La fraction β1 correspond à la transferrine et aux béta lipoprotéines, la fraction β2 correspond au complément C3 (Fiche technique HYDRAGEL PROTEIN K20, 2008). Tandis que la procédure d’Helena des protéines du sérum permet la séparation de ces dernières en cinq fraction en fonction de leurs charges électriques respectives à un pH de 8,8 sur une plaque en acétate de cellulose en utilisant à la fois les forces électrophorétiques et électroendosmotiques présents dans le système (Fiche technique HELENA LABORATORIES, 2007). Dans ce contexte, nous allons faire une étude comparative de l’électrophorèse sur gel d’agarose suivant la technique de SEBIA HYDRAGEL β1-β2 et l’électrophorèse sur plaque d’acétate de cellulose suivant la technique d’HELENA LABORATORIES, en analysant le composant C3 du complément des fractions protéiques. 3 Chapitre 1.Revue de la littérature Chapitre1. Revue de la littérature 1. Complément C3 1.1. Le système du complément (Merle et al, 2015) : Le système du complément représente une partie importante de l'immunité innée. C’est une cascade de protéines solubles, des récepteurs membranaires et des régulateurs (figure 1), qui fonctionne dans le plasma, dans les tissus, sur la surface et même à l’intérieur des cellules. Il se compose de plus de 40 protéines (Figure 2), ceux qui sont solubles sont produits principalement par le foie. Le complément a été découvert à la fin du XIXe siècle et a été décrit comme un «facteur» ou «principe» capable d'induire la lyse bactérienne. Après cela, pendant une longue période, le système du complément a été considéré comme une partie de support de l'immunité innée et a reçu relativement peu d'attention de la part des immunologistes. Au cours des années, il est devenu clairement que le complément a des fonctions polyvalentes et que son action se prolonge bien au-delà de l'activité bactéricide simple. Dans un individu sain, il orchestre le dégagement immunologiquement silencieux des cellules hôtes après leur mort cellulaire programmée. La cascade du complément est activée immédiatement après avoir rencontré l'agent pathogène. Par conséquent, le complément participe à l’opsonisation de l’agent pathogène, le marquage pour la phagocytose par les cellules présentatrices d'antigènes (CPA); il joue un rôle central dans le processus inflammatoire et module l'activité des lymphocytes T et B. Après la génération d'anticorps spécifiques de l'agent pathogène, le complément contribue dans le dégagement des complexes immuns et l’élimination des pathogènes. Des études au cours des années ont démontré que le complément participe à presque toutes les étapes de la réaction immunitaire et qu'il mérite une place centrale dans la recherche immunologique. Malheureusement, le manque de cohérence dans la nomenclature des protéines du complément et la complexité de la cascade enzymatique rendent le complément une des parties les plus compliquées et incompréhensibles de l'immunologie et est souvent évité par les étudiants et les scientifiques. Parmi les composants de la cascade du complément, C3 joue un rôle unique, en raison de ses différentes caractéristiques: non seulement c’est la protéine du complément la plus abondante dans le sérum, mais aussi le point de rencontre des trois voies d'activation de la cascade du complément (Dodds et Law, 1988). 4 Chapitre 1.Revue de la littérature Figure 1 : Activation du complément (Merle et al, 2015) Le système du complément est composé de trois voies différentes. VC est activée par la formation des complexes immuns sur la surface de l’agent pathogène et par calréticuline exprimée sur les cellules apoptotiques, conduisant à l’association du complexe C1. La VL reconnaît glycane mannose-terminal sur les agents pathogènes conduisant à l’activation du complexe MBL-MASP ce qui va induire la formation de la C3 convertase classique C4b2a. la VA est activée en permanence à un niveau bas par hydrolyse spontanée de C3 en C3(H2O). L’absence d'inhibiteurs du complément sur les agents pathogènes induit l'activation alternative C3bBb de la C3 convertase . L'activation du complément entraîne l'opsonisation et la phagocytose par le dépôt de C3b, la lyse des bactéries par la formation du complexe C5b-9, l'inflammation par le recrutement des cellules immunitaires, l'activation des cellules endothéliales, épithéliales et l’activation des plaquettes. 5 Chapitre 1.Revue de la littérature Figure 2: classes des protéines fonctionnelles dans le système du complément (Janeway CA Jr et al, 2001) 6 Chapitre 1.Revue de la littérature 1.2. Structure du complément C3 Le composant C3 (1.641 résidus) (Bert J. C. Janssen et al, 2005) est une glycoprotéine sérique abondante (1,3 mg/ml) de 190 kDa (Fredslund F et al, 2006), codée par le gène C3 localisé sur le bras court du chromosome 19 (Lusis AJ et al, 1986), elle est constituée de deux chaînes polypeptidiques alpha et bêta ; α (110kDa) et β (75 kDa), reliées par un pont disulfure (De Bruijn, 1985) qui est positionné dans le domaine partagé de MG (MG 6) (Fredslund F et al, 2006) (voir figure 3.A) . La caractéristique sans doute la plus importante de cette protéine réside dans sa capacité transitoire de se lier de façon covalente à de nombreuses autres molécules. Cette liaison est par la suite stabilisée à l'intérieur de la structure tridimensionnelle du C3 natif (Figure 3.B). Au moment de la formation de C3b, c'est-à-dire lorsque C3 est clivé au cours de l'activation du complément ou par action d'autres protéases (trypsine, élastase, etc.), un changement de conformation dans la protéine provoque l'exposition du thioester aux attaques nucléophiles permettant, en théorie, une réaction avec les groupements -OH ou -NH2 (villier, 1995). Figue 3.A (Noritaka Nishida et al, 2006) : La structure primaire de C3 et de ses produits, Le groupe thioester dans le TED est présenté comme un cercle avant (rouge) ou après (cyan) addition nucléophile. 7 Chapitre 1.Revue de la littérature Figue 3.B (Noritaka Nishida et al, 2006) : Architecture du domaine C3 native et C3c révélée par cristallographie aux rayons X. Les couleurs sont les mêmes que dans (A). 1.3. Rôle du complément C3 dans l’immunité Le C3 joue un rôle central dans l'activation du système du complément ; son activation est nécessaire pour les deux voies d'activation du complément classique et alternative (Sahu A et al, 2001), et elle tient aussi, en se liant de façon covalente à l'antigène, une place très importante dans la réponse immune (Erdei et al., 1991). Les personnes présentant un déficit en C3 sont sensibles à l'infection bactérienne (Lachmann P, 1975 ; Matsuyama W et al, 2001). Ces carences peuvent conduire aux infections génétiques, habituellement fatales aux nouveaux nés (Abbas, Abul K et al, 2012). La pré-protéine codée est traitée par protéolyse pour générer les sous-unités alpha et bêta qui forment la protéine mature, qui est ensuite encore traitée pour produire de nombreux produits peptidiques. Son clivage protéolytique modifie la conformation de la molécule de manière qu'un pont thioester intramoléculaire se rompe, permettant l'établissement d'une liaison covalente avec des accepteurs tels que des bactéries, des complexes immuns et d'autres protéines. Le complexe fragment C3/antigène pénètre dans les CPA après liaison aux récepteurs de C3, et la présence de fragments du C3 modifie l'apprêtement des peptides antigéniques dans les endosomes (villier, 1995). Des modèles animaux déficients en C3 ont permis de montrer que ce dernier est impliqué dans la commutation IgM/IgG et à plusieurs niveaux de la réponse immune: opsonisation, prolifération cellulaire, cytotoxicité et établissement de la mémoire immunologique (Dierichet al.,1993). 8 Chapitre 1.Revue de la littérature Le peptide C3a, également connu sous l’anaphylatoxine C3a, module l'inflammation et possède une activité antimicrobienne et C3b sert d'agent d'opsonisation. Le Facteur I peut cliver C3b en C3c et C3d, ce dernier joue un rôle dans l'amélioration des réponses des lymphocytes B. Des mutations dans ce gène sont associées à un syndrome hémolytique et urémique atypique et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) chez les patients humains (NCBI protein RefSeq, 2015). Le composant C3 peut également être un marqueur de susceptibilité vis-à-vis de certaines pathologies (Thuman JM et al, 2006) 2. Méthodes de quantification et de dosage du complément : Au cours des dernières années, de grands progrès ont été réalisés dans l'analyse du complément afin de mieux définir la gravité des maladies, l'évolution et la réponse aux traitements. Les technologies de diagnostic moderne qui se concentrent sur la quantification des produits fractionnés dérivés du complément ou des complexes protéine-protéine fournissent maintenant une analyse complète de l'état d’activation du système. Pour plus de détails ; voir tableau 01 présent dans l’article de Michael Kirschfink, and Tom E. Mollnes (2003) portant des indications cliniques pour l'analyse de complément et donne un aperçu sur des méthodes actuelles dans des diagnostics courants et expérimentaux de complément (Michael Kirschfink, and Tom E. Mollnes, 2003). 2.1. Analyses fonctionnelles 2.1.1. Activité totale du complément (voie classique, alternative et des lectines) Des analyses hémolytiques ont été traditionnellement utilisées pour évaluer l'activité fonctionnelle du système complémentaire. Elles fournissent l'analyse dans l'intégrité de la réaction entière de cascade. Ces essais sont particulièrement très utiles dans les enquêtes sur des insuffisances de complément suspectées (Michael Kirschfink, and Tom E. Mollnes, 2003). Bien que décrit dans de nombreuses modifications, les analyses hémolytiques sont toujours basées sur des protocoles d'abord décrits par Mayer (Mayer, M, 1961) et Rapp et Borsos (Rapp, H. J., and T. Borsos, 1970). Des dilutions périodiques de l'échantillon à analyser sont incubées avec des érythrocytes de moutons sensibilisés avec des anticorps à une température définie. Des analyses hémolytiques sont exécutées dans des tubes ou dans des plats d'agarose. Les résultats sont souvent exprimés comme des dilutions réciproques de l'échantillon requis pour produire 50 ou 100% de lyses (CH50 ou CH100, respectivement). 9 Chapitre 1.Revue de la littérature L'activité de complément totale est un essai réalisé pour évaluer le niveau du fonctionnement du système complémentaire. Les termes « CH50 » ou « CH100 » peuvent se rapporter à cet essai. C'est une mesure de la capacité du sérum de lyser 50% ou 100% des globules rouges. Il identifie une réduction de la fonction, mais n’identifie pas l'élément spécifique impliqué (Michael T. Lotze; Angus W. Thomson, 2005). La quantité normale de complément à l'intérieur du sang (dosage variable selon la méthode utilisée) est comprise entre 70 et 110 unités par millilitres en ce qui concerne le CH50. La fonction du complément peut également être examinée en mesurant le dépôt des produits d'activation sur l'activation du sérum avec des substances immobilisées d’activation du complément (IgM [voie classique], LPS [voie alternative], ou mannose [voie des lectine]) sur un plat microtitre. La combinaison de la détection de C9 dans ELISA d’IgM, le dépôt de properdine dans l'ELISA de LPS, et C4 lié dans l'analyse de voie des lectines exclut l’insuffisance de complément suspectée (Fredrikson GN et al, 1993). 2.1.2. Activité des différents composants. La titration des différentes protéines du complément exige l'addition de ces composants qui sont nécessaires pour accomplir l'ordre de réaction. Une évaluation correcte de l'activité des composants est obtenue par le calcul des molécules fonctionnelles (Rapp, H. J and T. Borsos, 1970). La manière la plus commode de détecter l'activité fonctionnelle des différents composants de complément est de déterminer la capacité de l'échantillon pour reconstituer l'activité hémolytique d'un sérum qui est déficient pour la protéine. Avec la disponibilité du complément déficient ou sérum humain appauvri, le titrage des protéines du complément individuels sont devenus beaucoup plus facile à réaliser. Pour montrer finalement que seulement un seul composant est absent, un composant fonctionnellement actif purifié peut être ajouté au sérum pour rétablir l'activité hémolytique de la voie correspondante (Michael Kirschfink, and Tom E. Mollnes, 2003). Un dosage pondéral par immunodiffusion radiale peut être effectué pour chacune des fractions. C’est la méthode utilisée pour le dosage des fractions C1q, C3 et C4 (ARDTAN, 1992). On peut réaliser aussi un test pour déterminer les concentrations des composants du complément (C3, C4, inhibiteur de C1, etc.) qu’on appelle teste immunoturbidimétrique. Son principe se base sur la réaction de l’échantillon avec un tampon contenant des anticorps spécifiques pour le composant du complément. L’absorbance (340 nm) de la solution trouble est proportionnelle à la concentration de composant dans l’échantillon. En élaborant la courbe d’étalonnage à partir des absorbances des étalons, la concentration du composant peut être déterminée (Documents A. MENARINI Diagnostics, 2007). 2.2. Essais immunochimiques pour les composants individuels. Les composants du complément individuel, indépendamment de l'activité fonctionnelle, peuvent être mesurés par des tests d'immunoprécipitation (immunodiffusion radiale techniques [IDR] ou néphélomètre), ELISA ou Western blot. Dans le diagnostic de routine, C3 et C4 (et parfois le facteur B) sont le plus souvent mesurés, suivis par inhibiteur de la C1 (Michael Kirschfink, and Tom E. Mollnes, 2003). 3. Electrophorèse des protéines sériques 3.1. Description et principe Dès le début du XXème siècle, les chercheurs ont pensé à se servir du champ éléctrique pour séparer des molécules présentes dans une solution, en fonction de leurs charges électriques et leur volume. Et c’est en 1937 que Tiselius a mis en point la première électrophorèse en milieu liquide, puis en 1941 la technique a évolué vers des applications sur des supports solides : c’est l’électrophorèse sur zone (Daunizeau. A, 2000) Cette technique est fondée sur le déplacement d'ions (molécules chargées positivement ou négativement) sous l'effet d'un champ électrique. Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres. Des techniques d’électrophorèse de zone ont été développées sur différents supports, chacun donnant un fractionnement des protéines sériques en fonction de leur charge, dans un tampon de pH donné suivant le kit utilisé. On cite ceux d’HELENA LABORATORIES ; support plaque d’acétate de cellulose et SEBIA Hydragel. 3.2. Electrophorèse Sebia Hydragel SEBIA, acteur majeur dans le domaine de l’électrophorèse, met à la disposition des laboratoires d’analyses médicales des appareils et des réactifs performants et innovants. Le kit HYDRAGEL permet la séparation des protéines du sérum en six fractions majeures par électrophorèse sur gel d’agarose. Chaque gel d’agarose contenu dans le kit est prévu pour l’analyse de 7 échantillons. 10 Chapitre 1.Revue de la littérature L’agarose, d’utilisation très facile, a été choisi comme support. Il donne une séparation des 11 Chapitre 1.Revue de la littérature constituants sériques humains en six fractions majeures de mobilités différente : albumine, alpha-1 globulines, alpha-2 globuline, béta-1 globulines, béta-2 globulines et gamma globulines. La technique HYDRAGEL permet en particulier la séparation des fractions β1 et β2. La fraction β1 correspond à la transferrine et aux béta lipoprotéines, la fraction β2 correspond au complément C3. Chaque zone contient un ou plusieurs constituants sériques. 3.3. Electrophorèse Helena Laboratories Helena Laboratories est un fabricant d'instruments de laboratoire et de réactifs cliniques. Ses clients comprennent les grands centres médicaux, les petits hôpitaux, les grands laboratoires de référence et les petits laboratoires de médecin privé. Dans la procédure d’Helena des protéines du sérum, ces dernières sont séparées en fonction de leurs charges électriques respectives à un pH de 8,8 sur une plaque en acétate de cellulose en utilisant à la fois les forces électrophorétiques et électroendosmotiques présents dans le système. Une fois que les protéines sont séparées, la plaque est placée dans une solution d'acide sulfosalicylique et Ponceau S (pour colorer les bandes de protéine). L'intensité de coloration est liée à la protéine concentration. Après déshydratation dans le méthanol, le fond de la plaque est ensuite rendu transparent par un traitement avec une solution de compensation. 4. Problématique Le composant C3 joue un rôle central dans l'activation du système du complément ; son activation est nécessaire pour les deux voies d'activation du complément classique et alternative (Sahu A et al, 2001), et il tient aussi, en se liant de façon covalente à l'antigène, une place très importante dans la réponse immune (Erdei et al., 1991). Récemment, de grands progrès ont été réalisés dans l'analyse du complément afin de mieux définir la gravité des maladies, l'évolution et la réponse aux traitements. Les technologies de diagnostic moderne qui se concentrent sur la quantification des produits fractionnés dérivés du complément ou des complexes protéine-protéine fournissent maintenant une analyse complète de l'état d’activation du système (Michael Kirschfink, and Tom E. Mollnes, 2003). L’électrophorèse a pris sa place dans le domaine d’analyse de routine dans la pratique quotidienne des laboratoires de recherche et cliniques. Les cliniciens requièrent cette analyse principalement pour le dépistage des pathologies qui modifient les profils 12 Chapitre 1.Revue de la littérature électrophorétiques. Aujourd'hui cette technique, qui ne cesse de s'améliorer par la diversité des supports et des techniques de réalisation, est devenue un outil indispensable dans de nombreux laboratoires, tant au niveau de la recherche et de l'industrie que des sciences médicales au sens large. Les supports utilisés successivement furent : le papier, les membranes d’acétate de cellulose et les gels d’agarose. A cet égard, nous allons essayer de comparer la technique d’électrophorèse Helena laboratories utilisant la plaque d’acétate à l’électrophorèse en gel d’agarose Hydragel β1-β2 (Sebia) en analysant la fraction C3 des profils électrophorétiques obtenus. Les manipulations de notre étude auront lieu au niveau de notre laboratoire de recherche BIOMOLIM (laboratoire de biologie moléculaires appliquée et immunologie), Université de Tlemcen. 4.1. Objectif de l’étude Notre travail a pour objectif d’analyser par Ie logiciel ImageJ le composant du complément C3 des fractions d’électrophorèse Helena Laboratories et Sebia hydragel β1-β2. 4.2. Buts - Comparaison des concentrations du C3 sérique entre patients et témoins avec ces deux différentes méthodes citées ( HELENA et SEBIA). - Comparaison entre les résultats des deux différentes techniques d’éléctrophorèse. 4.3. Intérêt de l’étude Les données recueillis dans notre étude pourraient être utiles pour les cliniciens ainsi que pour les chercheurs pour un meilleur choix de techniques, en vue de montrer les différences des résultats des deux systèmes d’électrophorèse HELENA et SEBIA. Chapitre 5. Conclusion et perspectives 24 Chapitre 5. Conclusion et perspectives Le complément joue un rôle central dans l'homéostasie et l'installation de la réponse immunitaire innée adaptative. Par son rôle de soutien dans l’élimination des cellules apoptotiques et nécrotiques, et son importance dans la polarisation des lymphocytes T et la réponse humorale par coopération avec les lymphocytes B, le complément représente une véritable clé de voûte du système immunitaire. Ce rôle crucial pour le bon fonctionnement de l'organisme est illustré par le fait que les deux ; les déficiences et les sur-activations du complément sont associées à des maladies graves et potentiellement mortelles. L'amélioration de notre compréhension du rôle du complément dans la santé et la maladie ouvre la possibilité d'utiliser le complément de modulation des médicaments dans la pratique clinique. A partir de nos résultats, la fraction β-2 qui correspond au composant C3 du complément est diminuée chez les témoins par rapport aux patients immunodificients dans les deux différentes techniques SEBIA HYDRAGEL et HELENA. Comparant les deux procédures nous pouvons conclure que le dosage par électrophorèse « kit Sebia » est plus homogène et performant par rapport celui par électrophorèse à « Helena ». Malgré la différence qu’on a pu observer entre ces deux techniques, nous ne pouvons pas déduire laquelle est plus fiable que l’autre que par l’ajout d’un troisième système d’électrophorèse avec les 2 systèmes qu’on a étudié dans ce travail, et voire lequel ses résultats sont semblables ou plus proches à ceux d’une de ces deux procédures. En raison des différences dans les méthodes d'électrophorèse, les cliniciens doivent veiller à utiliser de manière cohérente notamment les laboratoires cliniques. Pour la meilleure application, les intervalles de référence doivent être établis en fonction des espèces et système d'électrophorèse. Chapitre 6. Bibliographie 25 Chapitre 6. Bibliographie A Abbas, Abul K.; Lichtman, Andrew H.; Pillai, Shiv. "Chapter 8: Effector Mechanisms of Humoral Immunity". Basic Immunology: Functions and Disorders of the Immune System (Fourth ed.). Philadelphia, PA: Elsevier Saunders, 2012. p. 162. ARDTAN, Nephrologie - Inp 15, INTERNAT-Nouveau programme, Heures de France, 1992 – page 21. A Szymanowicz, B Cartier, J-P Couaillac, C Gibaud, G Poulin, H Rivière, D Le Carrer, Proposition de commentaires interprétatifs prêts à l’emploi pour l’électrophorèse des protéines sériques, Annales de Biologie Clinique, Juillet-Août 2006, Volume 64, numéro 4, Pages : 367-80. Aucouturier P, Preud’homme JL. Diagnostic biologique des immunoglobulines monoclonales. Rev Prat 1993 ; 43 : 285-8 B Bert J. C. Janssen, Eric G. Huizinga, Hans C. A. Raaijmakers, Anja Roos, Mohamed R. 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