Axe 5 Modélisation moléculaire et interaction ligand/protéine

Axe 5 Modélisation moléculaire et interaction ligand/protéine I. Thioglycosyltransférases 74B1 et 74C1
Dans le cadre de ce projet qui est toujours en cours, nous étudions les thioglycosyltransférases
(74B1 et 74C1) de la plante modèle Arabidopsis Thaliana qui présente une activité rare Sglycosyltransférase à fort intérêt pour l’industrie pharmaceutique. Ces enzymes transfèrent le
sucre d’un donneur Uridine DiPhosphate Glucose (UDPG) sur un accepteur de type
thiohydroxamique. (Thèse de Sami Marroun ; Collaboration avec le groupe du professeur R.
Daniellou, ICOA, Orléans).
Au cours d’une première étape, la modélisation par homologie a permis de générer au niveau
atomique des modèles 3D des enzymes. Ces modèles théoriques ont ensuite été utilisés dans
des protocoles de docking afin de proposer un mécanisme enzymatique se basant sur la
prédiction des modes de liaison des donneurs et accepteurs, d’identifier des molécules d’eau
conservées du site actif et de mesurer les distances interatomiques entre les ligands et les
résidus du site actifs des enzymes étudiées.
1 Sur la base des résultats obtenus, nous avons proposé un mécanisme basé sur une relation
directe entre l’acidité du groupe accepteur et l’activité catalytique. Cette relation a été
clairement validée par des mesures précises de pKa par RMN sur différents ligands.
Les études par RMN de l’interaction ligand/protéine ont également permis de mettre en
évidence des interactions, au niveau atomique, entre l’enzyme 74B1 et ces deux ligands
l’UDPG et le PATH. De plus, la stéréochimie de la liaison formée au niveau du produit de la
réaction du PATH avec l’UDPG chez la S-UGT 74B1 a été clairement déterminée par RMN,
ce qui constitue à ce jour l’une des rares preuves expérimentales du mécanisme d’activité
d’une enzyme de ce type.
II. Le complexe Pyridoclax/protéine Mcl-1
Thèse de A. Bourafai (CRUNCh, 2015-2018)
Ce projet multidisciplinaire repose sur la collaboration de plusieurs équipes normandes
possédant un savoir-faire dans le domaine de la conception et la synthèse des foldamères
(CERMN, Caen), de la caractérisation des « hot-spots » par RMN et modélisation moléculaire
(UMR 6014 COBRA, Rouen et CERMN, Caen), de l’évaluation biologique in vivo
(BioTICLA, Caen et CURB-BRP, Caen).
Le cancer de l’ovaire est la septième cause de cancer chez la femme et la quatrième cause de
décès par cancer chez la femme. Son diagnostic est souvent tardif, ce qui explique leur
pronostic défavorable.
Les interactions protéine-protéine (IPPs) jouent un rôle crucial dans les voies de signalisation
régulant de nombreuses fonctions cellulaires. Parmi les IPPs, celles via l’hélice alpha,
structure secondaire la plus répandue dans les protéines, constituent une catégorie très
importante. De ce fait, la conception de molécules capables de perturber les interactions entre
hélices alpha est un enjeu pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques.
Les travaux de l’équipe de BioTICLA ont montré que les protéines anti-apoptotiques Bcl-xL
et Mcl-1 coopèrent pour protéger les cellules cancéreuses ovariennes contre l’apoptose, et que
leur inhibition concomitante conduit à la mort des cellules chimiorésistantes. Les protéines
anti-apoptotiques Bcl-xL et Mcl-1 constituent ainsi un «verrou moléculaire» essentiel
empêchant la survenue de l’apoptose. La levée de ce verrou suffit à elle seule à induire la
mort des cellules tumorales chimiorésistantes en réponse au stress oncogénique ou à la
chimiothérapie. L’inhibition de Bcl-xL peut être obtenue par l’utilisation de molécules BH3mimétiques, parmi elles, la molécule la plus prometteuse est ABT-737 (Abbvie) : elle est
sélective et actuellement elle est en phase II d’essais cliniques. En revanche, l’inhibition de
Mcl-1 reste problématique. Ce n’est que très récemment que quelques molécules, ligands de
Mcl-1, viennent d’être publiées. La recherche des inhibiteurs sélectifs de Mcl-1 est donc un
enjeu majeur, d’autant que cette protéine est désormais désignée comme une cible
thérapeutique prioritaire dans de nombreuses localisations tumorales, dont le cancer de
l’ovaire.
Dans ce cadre une famille de foldamères, a été synthétisée au CERMN (Caen). L’évaluation
biologique de cette famille de foldamères en tant que mimes d’hélice alpha a été réalisée dans
2 le domaine de la cancérologie, en particulier, dans le cadre de la recherche de nouvelles
stratégies pro-apoptotiques. Les résultats ont permis d’identifier des candidats prometteurs,
perturbateurs des interactions protéine-protéine (IPPs) impliquées dans le processus de mort
cellulaire programmée. Des données récentes ont apporté la preuve de concept avec
Pyridoclax (et son chlorhydrate) ; ce dernier est capable d’interagir directement et
sélectivement avec Mcl-1 impliquée dans les cancers des ovaires, avec une affinité de
l’ordre du nanomolaire (SPR, Biacore).
L’étude RMN du Pyridoclax, réalisée au laboratoire COBRA, basée principalement sur
l’analyse quantitative de spectres 2D NOESY, couplée à la modélisation moléculaire
(CERMN), a permis de caractériser finement sa structure et sa conformation en solution
(détermination des distances internucléaires et des angles entre les plans des cycles pyridine)
et a montré ce composé était un bon mime d’hélices alpha.
Afin de connaître le mécanisme d’interaction du Pyridoclax et de Mcl-1, une étude de
l’interaction entre ces deux entités a ensuite été réalisée par RMN au moyen de méthodes
récentes telles que le STD, le tr-NOE et le Chemical Shift Mapping (comparaison des
cartes 2D 1H-15N HSQC de 15NMcl-1 en absence et en présence de quantités variables de
ligand). L’expérience STD a confirmé l’interaction entre le Pyridoclax et Mcl-1, et a permis
d’identifier les protons du ligand les plus affectés par l’interaction. Les cartes tr-NOE ont
montré que la conformation du ligand était conservée lors de l’interaction. Enfin, le Chemical
Shift Mapping a permis l’identification des résidus de la protéine impliqués dans
l’interaction (« hot-spots »).
Les résultats expérimentaux sont actuellement en cours d’exploitation par la modélisation
moléculaire sous contrainte RMN pour optimiser le modèle des complexes ligands/Mcl-1, et
par la chimie médicinale pour concevoir de nouveaux perturbateurs des IPPs.
Superposition de la structure du
pyridoclax à une hélice alpha
Structure radiocristallographique de Mcl-1 (172-327) (PDB : 4HW4_A, A.
Friberg et al. J. Med. Chem. 2013, 56, 15-30) sur laquelle les hotspots
déterminés par RMN sont représentés selon le code couleur suivant :
cyan : acides aminés peu perturbés, orange : acides aminés perturbés,
rouge : acides aminés fortement perturbés/violet : résidus perturbés
présents dans la cavité (site actif de Mcl-1).
3