cours aa oct 2011

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Biochimie structurale des protéines Les acides aminés Licence Bio-­‐math 2011 Céline Ollivaux UMR-­‐CNRS 7150 "Mer et Santé" StaDon Biologique de Roscoff PLAN du cours • 
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Un peu d’histoire
Formule générale d’un acide aminé (aa)
Structure et classification des aa
Les modifications des aa
La chiralité des acides aminés (Les aa L & D) Propriétés spectroscopiques Propriétés acido-­‐basiques Méthodes d’étude des aa Un peu d’histoire…. •  1806 -­‐ L'asparagine : 1er acide aminé découvert en 1806 par deux chimistes français Pierre Jean Robiquet et Louis Nicolas Vauquelin (asperges). •  1827 -­‐ La taurine est un acide aminé (Red Bull) découvert en 1827 par les Japonais (bile de taureau). •  1950 -­‐ DéfiniDon des acides aminés essenDels ou indispensables Formule générale •  Un acide aminé est une molécule organique possédant un squele\e carboné et deux foncDons : une amine et un acide carboxylique. Formule générale •  Le carbone portant la foncDon carboxylique acide (COOH) est dit "0" •  Les atomes de carbone de la chaîne carbonée sont ordonnés et comparés au groupe carboxyle et appelés par une le\re grecque : l'atome de carbone directement lié au groupe carboxyle est le carbone α. Il porte la foncDon amine (NH2) •  Les aa diffèrent par leur chaîne latérale R (structures, tailles et charges électriques variables) α α •  A Dtre d'exemple, la lysine est un acide α-­‐aminé portant un deuxième groupe aminé en posiDon ε Formule générale •  unités structurales de base des pepDdes/protéines •  mesurent à peu près 100 picomètres (pm) •  Il existe plus de 100 acides α-­‐aminés présents dans la nature. •  20 aa naturels protéinogènes, dans le code généDque animal (+2 bactériens) •  Dérivés d’aa (modificaDons post traducDonnelles) IonisaDon des acides aminés dans l’eau ou soluDon phys. (pH 7) Ex : Lysine Les premiers acides aminés de la vie apportés par les météorites ? •  Météorite d’Orgueil, tombée en 1864 dans ce village français du Tarn-­‐et-­‐Garonne •  En 1969, une météorite est tombée sur le village australien de Murchison. Son analyse a révélé qu'elle contenait quelque 70 acides aminés dont 8 font parDe des 20 qui composent les protéines de tous les êtres vivants terrestres. Ces briques auraient donc pu servir à une chimie prébioDque. Différentes catégories d'acides aminés •  Certains aa sont retrouvés dans les protéines, et sont capables de parDciper in vivo à la synthèse de ces protéines. Ce sont par conséquent à la fois des consDtuants et des précurseurs des protéines •  Certains aa sont retrouvés dans les protéines seulement après la biosynthèse de ces dernières •  Certains aa n'existent qu'à l'état libre. Bien qu'il existe de nombreux acides aminés dans la nature, l'hydrolyse des protéines ou pepDdes naturels conduit à 20 acides aminés Importance des acides aminés à l’état libre, ex: la L-­‐glutamine •  La L-­‐glutamine joue un rôle important dans le bon foncDonnement du système nerveux. Dans notre cerveau la L-­‐glutamine se transforme en acide glutamique qui sert de carburant essenDel de toutes les cellules nerveuses. (Bassini-­‐Cameron A, Monteiro A, Gomes A, Werneck-­‐de-­‐Castro JP, Cameron L. Glutamine protects against increases in blood ammonia in football players in an exercise intensity-­‐dependent way. Br J Sports Med. 2008) •  La L-­‐glutamine absorbe efficacement l’ammoniac (NH3) en excès. L’accumulaDon de l’ammoniac par des cellules du système nerveux nuit, entre autres, gravement à la concentraDon, à la mémoire et aux capacités d’apprendre. (Lagranha CJ, Levada-­‐Pires AC, Selliu DF, Procopio J, Curi R, Pithon-­‐Curi TC. The effect of glutamine supplementaDon and physical exercise on neutrophil funcDon. Amino Acids. 2008) ClassificaDon des acides aminés •  Le complexe ci-­‐contre sans R est nommé chaîne principale, il est commun à l'ensemble des acides aminés. •  R représente une chaîne latérale spécifique de chaque acide aminé. •  Les acides aminés sont généralement classés selon les propriétés de la chaîne latérale (polarité) en cinq groupes : hydrophiles (polaires) : acides, basiques, neutres (polaires non chargés) hydrophobes (apolaires) : aliphaDques et aromaDques Les 20 aa naturels protéinogènes, dans le code généDque animal Code 3 lettres
Les 2 peDts derniers •  La pyrrolysine (Pyl, O) rencontrée chez certaines archées méthanogènes dans les enzymes faisant parDe du métabolisme responsable de la producDon de méthane •  La sélénocystéine (Sec, U) rare, entre dans la consDtuDon de certaines protéines comme la glutathion peroxydase ou la formate déshydrogénase (sélénoprotéines). On dénombre actuellement trois gènes codant des sélénoprotéines chez la bactérie E. coli (non formée par traducDon de l'ARNm, mais incorporée directement lors de la synthèse de la chaîne polypepDdique par le ribosome.) - Possède un goût sucré, utilisée pour améliorer le goût d'édulcorant (E640)
- Entre dans la composition des acides biliaires
- Rôle de neuromédiateur inhibiteur au niveau de la moëlle épinière
(polaires) Très hydrophiles
Acides aminés
non polaires aliphatiques * *Composé carboné acyclique ou cyclique, saturé ou insaturé (sauf composés aromatiques)
Acides aminés
non polaires aromatiques
Principe de Spectrophotométrie (UV-­‐visible monofaisceau)
(2) Monochromateur (4) SoluGon à doser I lum incidente et I0 lum transmise (3) Fente (1) Source Lumineuse (6) Détecteur I0 I (5) Cellule photoélectrique UV : λ entre celle de la lumière visible et celle des rayons X (400-­‐10 nm). (1) 
(2) 
(3) 
(4) 
(5) 
(6) 
Lum blanche polychromaGque (halogène, xénon) et /ou lum UV (deutérium) Formé d’un réseau diffractant la lum (sélecGon d’une λ) Largeur fixe ou variable pour régler la bande passante Cuve transparente de différentes composiGons -­‐ solvant +/-­‐ transparent (témoin de compensaGon) converGsseur photons-­‐électrons (détecteur de type photodiode ou photomulGplicateur) Détecteur électronique (affichage de la mesure relaGve de I proporGonnelle à ce courant électrique)
Principe de Spectrophotométrie Faisceau incident d’intensité l (cm) Faisceau transmis d’intensité Io I E0 Et Ea Trajet opGque Er Substance en soluGon A(λ)=log I0(λ) /I(λ) Loi de Beer-­‐Lambert (19è s) Absorbance : A =ε(λ)cl Courbe d’étalonnage A(λ)=log I0(λ) /I(λ) =ε(λ)cl A(λ) A connue Longueur de la cuve (cm) C inconnue Absorbance à λ donnée C(mol.L-­‐1) ConcentraGon (mol. L-­‐1) (1) Coefficient d’exGncGon molaire à λ donnée (mol-­‐1.L.cm-­‐1) (1)  Traduit la capacité d’absorpGon de la molécule donnée à ce^e longueur d’onde Acides aminés polaires non chargés
Asn et Gln dérivent de Asp et Glu par amidation
2 Cyst forment des
pontsdisulfure
disulfure
un pont
cystine
Exemple de diagramme des acides aminés Les acides aminés essenDels Acide aminé essenDel ou indispensable : ne peut pas être synthéGsé de novo par l'organisme (généralement humain) ou qui est synthé:sé à une vitesse insuffisante. doit être apporté par l'alimenta1on (bon fonc1onnement de l'organisme) Chez l’homme, huit acides aminés essenDels : le tryptophane, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine. Chez le nourrisson, l'hisDdine et l'arginine : semi-­‐essenDels (besoin d'un apport exogène, par ex le lait maternel). La cystéine, la glycine et la tyrosine sont parfois nécessaires à certaines populaDons qui ne sont pas capables de les synthéDser en quanDté suffisante. Ex : les personnes a\eintes de phénylcétonurie doivent réduire au max l'absorpDon de phénylalanine, or cet acide aminé est précurseur de la tyrosine : ce\e dernière ne peut alors plus être synthéDsée et devient essenDelle. Le concept d'essenDalité doit toutefois être relaDvisé : en effet, certains acides aminés classés non essenDels peuvent être considérés essenDels lorsque le corps ne les synthéDse pas suffisamment, en raison d'une condiDon physiologique et/ou d'un dérèglement organique ou foncDonnel. Les acides aminés non consDtuant des protéines 20 (+2) aa naturels protéinogènes, dans le code généDque animal Il existe plus de 100 acides α-­‐aminés présents dans la nature Ex : la citrulline Cet acide aminé est trouvé principalement dans la pastèque (faible quanDté : 1 g pour 800 g) Métabolisme de l’azote (cycle de l’urée) Métabolisme de l’azote (cycle de l’urée) Dérivés d’acides aminés (dérivaDon) •  DétecDon des acides aminés par fluorescence λex=390 nm et λem=465 nm E=hν=hc/λ
λ = c.T = c/υ
h=constante de Planck 6,626.10-­‐34 J.s-­‐1 c= vitesse de la lumière 300 000 km.s-­‐1 État excité
État fondamental
Dans les atomes ou molécules, les énergies (E) ne peuvent prendre que certaines valeurs discrètes, quanDfiées. Quand l’E varie, on observe l’Em ou l’Ab d’un quantum d’E ou photon. •  AbsorpDon – Energie transférée à la molécule absorbante (transiDon de l’état de basse energie à un état de haute énergie) •  Emission -­‐ Energie transférée à la molécule éme\rice (transiDon de l’état de haute énergie à un état de basse énergie) •  DiffracDon – Changement de direcDon des photons sans échange d’énergie E + faible ! Fluorescence Dérivés d’acides aminés (dérivaDon) RéacDon d’Edman (séquençage des protéines) MODIFICATIONS DES RESIDUS INTERNES DE CERTAINS ACIDES AMINES ModificaDon post traducDonnelle enzymaDque de la chaîne latérale MéthylaDon (prot contracDles), carboxylaDon (prot fixant le Ca2+), phosphorylaDon (caséine)…. Ex : HydroxylaDon (hydroxyproline dans le collagène) Déficit en Vitamine C : scorbut HydroxylaDon de la lysine FormaDon de l’hydroxylysine dans le collagène Lysyl hydroxylase (protocollagen-­‐
lysine 2-­‐oxoglutarate 5-­‐dioxygenase, E.C. 1.14.11.4) catalyzes the hydroxylaDon of lysine residues in X-­‐
Lys-­‐Gly triplets in collagens and other proteins with collagenous domains (Kivirikko et al. 1992 , Kivirikko & Pihlajaniemi, 1998). La chiralité des acides aminés : isomérie Isomères : Deux molécules qui possèdent la même formule brute mais ont des formules semi-­‐développées ou des formules développées différentes Propriétés physiques, chimiques et biologiques différentes La chiralité des acides aminés : Les énanDomères (isomères opDques) Ces deux acides aminés sont l'image l'une de l'autre dans un miroir et ne sont pas semblables car non superposables (ils présentent une chiralité) Par convenDon (Fischer) : l’aa lévogyre (L) présente le -­‐NH3 à gauche Pouvoir rotatoire Les acides aminés D sont partout !! Les acides aminés D sont partout !! FormaDon des aa D •  SynthéDsés sous forme L puis isomérisaDon (ex: D serine racemase) •  SynthéDsés directement sous forme D (non ribosomal) •  IsomérisaDon avec l’âge (racémisaDon non enzymaDque) •  DégradaDon des pepDdes (D amino acid containing pepDdes = DAACPs) Propriétés spectroscopiques des aa •  DétecDon UV aa aromaDques (280 & 260 nm) •  DétecDon après dérivaDon ex : RéacDon avec la fluorescamine •  RMN (1H ou 13C) : spectre caractérisDque de chaque aa Structure 3D des protéines Propriétés acido-­‐basiques -­‐ Les acides aminés ont des foncDons acido-­‐basiques (cf cours sur l’eau de J .Mary) -­‐  En soluDon dans l’eau (ou pH physiol. 7), les aa sont des ions dipolaires (zwi\erions). -­‐  Les substances ayant ce\e capacité sont dites amphotères (ampholytes) R La charge + de NH3+ rend l’ionisaDon de COOH + probable acide R n’est pas pris en compte dans le calcul de la charge ne\e Force des acides et bases
Rappel
La force d’un acide va se définir par rapport à celle de l’eau. A l’équilibre:
AH + H2O
Ka =
A- H3O+ AH . aH2O Ka =
A- H3O+ AH A - + H 3O +
Ka constante d’acidité du couple AH/ADéfinie par rapport à l’eau,
Dépend de la température (298K)
Varie de 10-10 à 10-20
La force de l’acide est caractérisée par la valeur de Ka
Par commodité, Ka peut-être remplacé par pKa avec
pKa= -log Ka
Un acide est d’autant plus fort que son Ka est grand ou son pKa petit
Exemple Acide acétique/acétate Ka = 1,8.10-5 pKa = 4,74
Acide formique/formate Ka = 1,6.10-4 pKa = 3,8 Jean Mary
Rappel
Relation d’Henderson-Hasselbalch
Pour tout couple AH/A- dans l’eau
Log Ka = log H3
pKa = pH - log
pH = pKa + log
O+
pH < pKa
HCOOH > HCOO-
AH Accepteur de H+
AH Donneur de H+
A- AH AH A- A- Exemple du couple
pH = 0
+ log
Ka =
A- H3O+ Lorsque pH = pKa alors A- = AH
HCOOH / HCOO-
pH = pKa
HCOOH = HCOO-
pKa = 3,8
pH > pKa
pH = 14
HCOOH < HCOOJean Mary
Pour un acide aminé, il y a deux constantes de dissociaDon K1 et K2 pKC ou pK2 pKN ou pK1 K1 = [forme neutre][H3O+] K2 = [forme caDonique] pH = -­‐ log[H3O+]
pH = pK1 + log [forme anionique][H3O+] [forme neutre] et pK = -­‐ logK [forme neutre] [forme caDonique] = pK2 + log [forme anionique] [forme neutre] Point isoélectrique (pI) •  pH pour lequel la charge ne\e = 0 •  pI = ½ somme des pK qui encadrent la forme isoionique pI = ½ (pK1 + pK2) glycine (R=H) : pI=0.5 (2.34 + 9.60) =5.97 Rappel
Un équivalent = nombre de moles de OH-­‐ (ou de H+) libérés quand on dissout 1 mole d’une molécule donnée. Exemples: 1 mole de Ca(OH)2 = 2 équivalents Ca(OH)2 1 mole de Al(OH)3 = 3 équivalents Al(OH)3 1 mole de H2SO4 = 2 équivalents H2SO4 1 mole de HCl = 1 équivalent HCl Courbe de DtraDon caractérisDque acide-­‐base (addiDon ou retrait graduels de H+) pK1 pI pK2 TitraDon de l’HisDdine +2 +1 pI= pHeq2 pHeq1 À 1 OH-­‐eq. : pHeq1 = 0.5 (pK1 +pKr) = 3.91 À 2 OH-­‐eq. : pHeq2 = 0.5 (pK2 +pKr) = 7.59 0 -­‐1 Résumé
pK1≈ 2 pK2 ≈ 9 pKR Si pH < pK1 la forme caDonique est majoritaire Si pH = pK1 les formes [caDons] = [neutres] Si pH = (pK1 + pK2)/2 la forme neutre est majoritaire, on parle de pHi Si pH = pK2 les formes [neutres] = [anions] Si pH > pK2 la forme anionique est majoritaire Méthode d’étude des acides aminés Chromatographie Taille Polarité Spectrométrie de masse Charge Électrophorèse Etude par chromatographie •  La chromatographie est une technique de séparaDon des consDtuants d’un mélange qui repose sur des différences de leurs interacDons avec une phase staDonnaire et une phase mobile (ou éluant) •  Le terme a été proposé par Tswe\ en 1906 Techniques Chromatographiques
ClassificaGon selon le phénomène chromatographique : Ce dernier dépend de la nature (et de la structure) de la phase staDonnaire uDlisée. On disDnguera donc en parDculier : • la chromatographie d'adsorpDon (LSC, GSC) : Van der waals • la chromatographie de partage (LLC, GLC) : polarité • la chromatographie d'échange d'ions (IEC) : charge • la chromatographie d'exclusion (cf cours protéines) • la chromatographie d’affinité (cf cours protéines) Techniques Chromatographiques
+ AdsorpDon + Echange d’ions Affinité Partage Exclusion A ne pas confondre !! Techniques Chromatographiques
ClassificaGons selon les procédés uGlisés : Selon le condi:onnement de la phase staDonnaire, on disDnguera : • la chromatographie sur colonne • la chromatographie sur papier • la chromatographie sur couche mince. Selon les modalités de migra:on de la phase mobile, on disDnguera : • la chromatographie par développement (les consDtuants de l'échanDllon restent sur la phase staDonnaire) • la chromatographie d'éluGon (les substances sont entraînées hors de la phase staDonnaire). Chromatographie par développement Chromatographie sur couche mince (CCM) ou sur papier Chromatographie
d’élution
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Solvant EchanDllon phase solide ou liquide
Colonne Bille microporeuse Détecteur Collecteur Chromatographie liquide à haute performance
(/pression) ou HPLC
La chromatographie de partage : phase
normale et phase inverse
phase normale
phase inverse
Phase stationnaire : polaire
(silice, alumine)
Phase stationnaire : non
polaire (silice greffée, résine)
Phase mobile : non polaire
(solvants organiques)
Phase mobile : polaire (eau +
alcool)
L’ordre d’élution des composés est globalement
inversé entre les deux modes
Analyse par HPLC des acides aminés
DérivaDon des acides aminés par la fluorescamine DétecDon en fluorescence Limite de DétecDon UV < 5 pmol FL < 100 fmol
La chromatographie chirale (HPLC ou CPG)
Le domaine médical uDlise la chromatographie chirale pour séparer deux énanDomères dont les propriétés peuvent être radicalement différentes, notamment lorsque l’une est curaDve et l’autre dangereuse (aa L et aa D). Certaines agro-­‐industries l’uDlisent pour sélecDonner un composé naturel associé à une odeur/un arôme. La chromatographie chirale peut être aussi uDlisée pour détecter des polluDons, (fiouls et pétroles issus de dégazage), les composés cancérigènes (les aromaDques), et les résines En écologie, ce\e technique de chromatographie peut servir à discriminer deux espèces par simple détecDon de molécules présentes ou non dans l’organisme étudié (ex : la différenciaDon des poissons sauvages et des poissons d’élevage, grâce, entre autres, à l’étude de l’astaxanthine, détectée par HPLC chirale, pigment caroténoïde issu des crustacés et algues ingérés par l’animal in natura). La chromatographie d’échange d’ions
liaison covalente G support macromoléculaire – H + ion échangeable (+ ou -­‐) groupement foncDonnel ionisé(+ ou -­‐) Chromatographie par échange d’ions
Résine échangeuse de caDons (condiDonnée dans un tampon à pH 5) AugmentaDon progressive du pH de la soluDon d’éluDon (lavage) pI Glu = 3.2 pI His=7.6 pI Arg=10.7 •  FixaDon à pH 5 éluDon de Glu •  Lavage à pH 9 éluDon de His •  Lavage à pH 12 éluDon de Arg Chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse (GC MS) ÉchanDllon à l’état gazeux (He, N2) Gas Chromatography SéparaDon des acides aminés (GC) et idenDficaDon par déterminaDon de la masse (MS) Masse moyenne d’un aa = 110 Da Etude par électrophorèse Support : papier (cellulose) silice (CCM), tamis (gel agarose, amidon, polyacrilamide…) + + + -­‐ -­‐ -­‐ Etude par électrophorèse Cas des protéines : migraDon dans un champ électrique (voltage), en foncDon de la charge (ou pas en condiDon dénaturante), du coeff de fricDon (selon taille et masse) Électrophorèse bidimensionnelle DIGE( DIfference Gel Electrophoresis) électrophorèse à pH fixe (pI) Dépôt CCM (polarité) Suite dans 15 jours les protéines 
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