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Procédure : Protocole national ammonium,
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Version : 2014 Date de création : 3 décembre 2007
Date de dernière modification : 1er décembre 2012
Les produits et marques commerciales mentionnés appartiennent à leurs propriétaires respectifs.
Dosage de l'azote ammoniacal
Rédigé par :
Thierry Cariou
Eric Macé
Visé par :
Nicole Garcia, responsable
qualité national
Le 06 janvier 2015

Procédure : Protocole national ammonium,
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I- Introduction :
L’azote minéral dissous dans l’eau de mer existe sous forme d’azote gazeux et d’ions ammonium, nitrite
et nitrate. Dans le cycle de l’azote, l’ammoniac dissous (sous forme d’ion ammonium) occupe une place
particulière. D’une part, le phytoplancton utilise l’ammonium préférentiellement comme source nutritive
azotée, d’autre part, la dégradation de l’azote particulaire et de l’azote dissous par l’activité
hétérotrophique donne lieu à la formation d’ammoniac oxydé ensuite en nitrite puis en nitrate. Enfin, le
zooplancton contribue à enrichir l’eau de mer en ammoniac par excrétion directe. Les teneurs en
ammoniac dissous dans l’eau de mer sont comprises généralement entre 0 et 3 µmoles.l-1.
Le dosage est basé sur la réaction de Berthelot (1859). En milieu alcalin (8 < pH < 11.5), l’ammoniac
dissous réagit sur l’hypochlorite pour former une monochloramine. Ce composé, en présence de phénol
et en milieu oxydant, donne lieu à la formation d’un bleu d’indophénol. A 20 °C, la réaction catalysée par
l’ion nitroprussiate demande 6 heures pour se développer. L’absorption est mesurée par
spectrophotométrie à 630 nm.
La méthode a été appliquée à l’eau de mer, en particulier par L. Solorzano et F. Koroleff en 1969.
L’analyse par fluorimétrie développée par Holmes commence à se répandre dans la communauté des
analystes de l’eau de mer. Cette méthode apporte des avantages (par exemple le non-emploi de
phénol). Cette méthode ne sera pas décrite dans ce protocole car la majorité des laboratoires utilisent
encore la méthode de Koroleff.
Précision et limite de détection :
Etant donné l’influence de la turbidité à la longueur d’onde de mesure (630 nm), ainsi que les
nombreuses sources de contaminations potentielles de ce paramètre, les écarts-types relatifs obtenus
sur des triplicats peuvent être très variables. S’ils se situent généralement entre 1 et 5 % au delà de 1
µmole.l-1, ils peuvent atteindre facilement 20 à 50 % en dessous de 0.5 µmole.l-1.
La limite de détection se situe aux alentours de 0.02 µmole.l-1 (= 3xs0, écart type sur le blanc
analytique) pour un trajet optique de 10 cm avec une limite de détection de 0.001 unité DO.
La loi de Beer-Lambert est respectée dans la gamme de concentration allant de 0 à 70 µmoles.l-1. Au
delà de cette concentration il est possible de diluer l’échantillon. Pour les faibles concentrations (0 à 5
µmoles.l-1) il est conseillé d’utiliser des cuves de 10 cm. Au delà, à moins de diluer, des cuves de 5 cm ou
1 cm seront nécessaires.
II – Précautions particulières
Le risque de contamination est un des paramètres déterminant dans la réussite ou non de la mesure.
Les réactifs utilisés sont à conserver à l’obscurité et au réfrigérateur jusqu’à utilisation.
Une attention particulière sera apportée lors du prélèvement, mais également au niveau de la
manipulation et du stockage du matériel et des échantillons.
Le risque majeur est lié à la pollution atmosphérique du laboratoire aussi bien que du lieu de
prélèvement (vapeurs azotées, proximité de produits chimiques, présence de fumeurs ou rejets du
bateau …) mais également à la manipulation (contact avec la peau de l’échantillon, du flaconnage,
bouchons…) ainsi qu’au matériel de pré-filtration (lorsque celui-ci est indispensable). Le port de gants à
usage unique peut être une bonne solution à condition d’être bien ajustés et d’être changés
régulièrement. Certains caoutchoucs sont également des sources de contaminations notables
d’ammonium et il convient donc de les éviter au niveau du bouchage des flacons aussi bien qu’au niveau
des tendeurs des bouteilles Niskin.

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III – Matériel et appareillage utilisé :
Prélèvement :
- Bouteilles de prélèvement à clapet Niskin.
- Flacons ronds gradués en verre de 100ml (type fisherbrand grande ouverture, sans bague
anti-goutte) : généralement gradués jusqu’à 80 ml, les 100 ml correspondent souvent au
rétrécissement du goulot qui assure alors une précision satisfaisante sur le volume d’échantillon
analysé. Dans les milieux très turbides (e.g. estuaires de la Gironde) un flacon de 30 ml peut
être utilisé.
- 1 système de préfiltration (de type Swinnex Millipore en PP) équipé d’une soie de 50 µm
décontaminée, par niveau de prélèvement, pour les milieux turbides ou système de filtration
(« cocotte » de filtration avec filtre en fibre de verre) dans les systèmes très turbides.
- Bac de transport et conservation opaque (pendant la réaction).
- 2 dispensettes pour l’addition des réactifs (3ml réactif/100 ml ; 1ml réactif/30 ml).
Préparation des réactifs :
- Balance au centième de gramme.
- Hotte aspirante.
- 1 spatule.
- Agitateur magnétique avec barreaux et tige aimantés.
- 2 béchers de 500 ml + béchers de 250, 50 ml.
- 2 fioles jaugées de 500 ml à bouchon rodé.
- 1 éprouvette graduée.
- 1 pissette.
- 2 dispensettes à volume fixe de 3 ml.
Préparation des standards :
- Balance de précision au centième de milligramme et spatule.
- Etuve réglée à 105 °C.
- Dessicateur et silicagel.
- Petit bécher.
- 1 fiole jaugée d’un litre (classe A+) à bouchon rodé.
- 4 fioles jaugées de classe A à bouchons rodés de 500 ou 1000ml.
- Pipettes automatiques et embouts correspondants.
- Pissette.
Mesure :
- Spectrophotomètre (630nm) acceptant des cuves de 10 cm de trajet optique, situé sous extracteur.
- 1 cuve de 10 cm en verre optique spécialisé (2 cuves appariées si possible en cas de double faisceau).
- Papier absorbant et papier optique.
Contrôle qualité :
Filtre Holmium pour vérification des longueurs d’onde. Référence : filtre Holmium Hellma, 666-F1.
Filtres de vérification des densités optiques. Référence : filtre gris Hellma, 666-F2.
Elimination des déchets :
Recueillir les effluents contenant les réactifs dans un bidon qui sera ensuite retraité avec les déchets
chimiques aromatiques.
IV – Produits chimiques et réactifs utilisés
Produits chimiques :
Eau déminéralisée de très bonne qualité de type Milli-Q fraîchement soutirée.

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Acide chlorhydrique 32%, d=1.16 (HCl) : Prolabo RP (ref. 20 252 290).
Sulfate d’ammonium ((NH4)2SO4) : Merck PA (ref. : 1.01217. xxxx).
Citrate trisodique dihydraté (Na3C6H5O7, 2H2O) : Merck PA (ref. 1.06448.xxxx).
Hydroxyde de sodium ( NaOH) : Merck PA (ref. 1.06495.xxxx).
Solution aqueuse d’hypochlorite de sodium à 3.5% env. de chlore actif (NaClO) : Prolabo GPR Rectapur
(ref. 27896.291).
Nitroprussiate de sodium dihydraté (Na2[Fe(CN)5NO],2H2O) : Merck PA (ref. 1.06541.xxxx).
Thiosulfate de sodium pentahydraté (Na2S2O3, 5H2O) : Merck PA (ref. 1.06516.xxxx).
Phénol (C6H5OH) : Merck PA (ref. 1.00206.xxxx) ou phénol liquide 85 %.
Iodure de sodium (NaI) : Merck PA (ref. 1.06523.xxxx).
Silicagel.
NaCl : Merck PA.
Pour les fiches de sécurité, consulter le site de l’Institut National de Recherche et de Sécurité :
http://www.inrs.fr
Conservation des réactifs :
Chacun des réactifs préparés est transvasé dans un flacon brun de 500ml et surmonté d’un
distributeur automatique réglé sur 3 ou 1ml (ou de préférence à volume fixe), spécifique et identifié
(R1 NH4+et R2 NH4+). Ils sont conservés au froid (4°C) et à l’obscurité.
Dans ces conditions, le réactif 1 est stable un mois, mais le réactif 2 sera préparé tous les quinze
jours.
Lors des manipulations sur le terrain, les réactifs R1 et R2 sont transportés, si possible, dans une
glacière équipée de blocs de froid et sont replacés au réfrigérateur dès le retour au laboratoire.
V – Préparation du matériel
Vérifier que les tendeurs de rappel des clapets des bouteilles « Niskin » n’ont pas été remplacés par un
caoutchouc ordinaire (source de contamination importante en ammonium).
Flaconnage :
Les flacons neufs seront systématiquement remplis d’acide chlorhydrique 1N et laissés à tremper une
nuit avant d’être vidés puis parfaitement rincés à l’eau déminéralisée de qualité Milli-Q (entre 5 et 10
fois). Un blanc de contrôle sera alors effectué.
Entretien courant : Entre 2 sorties de prélèvement peu espacées dans le temps, on peut conserver le
mélange du dernier prélèvement avec les réactifs. Cela évite les éventuelles contaminations.
En cas de blanc trop fort, les flacons seront à nouveau lavés à l’acide puis à l’eau déminéralisée.
Un soin tout particulier sera apporté à la manipulation des bouchons et tout contact manuel avec le
goulot des flacons sera évité.
Le stockage des flacons devra alors se faire dans un endroit exempt de toute contamination
potentielle.
Prévoir un bac de transport opaque avec couvercle et correctement équipé pour le transport en toute
sécurité de ces flacons.
Distributeurs de réactifs :
Ils seront régulièrement vidés et rincés afin d’éviter une détérioration du piston et d’en maintenir le
bon fonctionnement. Une vérification des volumes distribués sera également effectuée par pesée et
reportée sur la fiche de contrôle correspondante.(Annexe 1).

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VI - Préparation des réactifs
Ils seront préparés à partir d’eau déminéralisée de haute qualité fraîchement soutirée : eau Milli Q
par exemple, et essentiellement de produits pro analysis. Les conserver au réfrigérateur et à l’abri
de la lumière.
Réactif 1 (R1) : solution de phénol nitroprussiate, à préparer sous hotte aspirante.
Dissoudre successivement 17,5g de phénol et 200 mg de nitroprussiate de sodium, dans 400 ml d’eau
déminéralisée. Compléter à 500ml en fiole jaugée avec l’eau et homogénéiser.
Dans le cas de l’utilisation de phénol liquide, remplacer les 17.5 g de phénol en cristaux par 20 ml de
phénol liquide.
Réactif2 (R2) : solution alcaline complexante au chlore.
Dissoudre 11g de soude et 140g d’acide trisodique dans 400ml d’eau. Ajouter la quantité d’hypochlorite
nécessaire pour réaliser une solution contenant 0,14% de chlore, soit 22 ml de solution fraîche
d’hypochlorite. Compléter à 500 ml par de l’eau déminéralisée.
La solution d’hypochlorite peut être remplacée par un autre réactif : le dichloroisocyanurate de sodium
dihydraté. La préparation de ce réactif ne sera pas décrite (se reporter au manuel Aminot-Kerouel
pour plus de détails).
Quantité de solution d’hypochlorite commerciale à ajouter :
Le titre de la solution commerciale est contrôlé périodiquement de la façon suivante :
A 1ml de la solution commerciale, on ajoute 50ml de KI à 1% et 0,25ml HCL concentré. L’iode libéré est
titré par une solution de thiosulfate de sodium 0,1N. A 1ml de thiosulfate 0,1N correspond 3,54mg de
chlore.
VII – Prélèvement et conditionnement
Le prélèvement des échantillons se fera aussitôt après ceux effectués pour l’analyse de l’oxygène et du
pH.
Tout contact manuel avec l’eau de prélèvement aussi bien qu’avec toute partie du matériel entrant en
contact avec cette eau sera soigneusement évité tout au long de la procédure (voir chapitre II).
Après avoir vérifié l’absence de toute contamination potentielle (fumée) sur le lieu de prélèvement,
vider dans la poubelle de déchets 1 à 3 flacons identifiés de leur mélange réactifs-échantillons
précédents (ou eau déminéralisée) avant d’en effectuer un triple rinçage avec l’eau de prélèvement.
Veiller au rinçage correct des bouchons et utiliser le système de pré-filtration ou de filtration prévu à
cet effet, si nécessaire selon le site étudié (le changer pour chaque niveau de prélèvement).
Remplir les flacons (+ 1 flacon « turbidité ») avec pré-filtration ou filtration (si nécessaire) en
ajustant le volume prélevé à (100 +- 5) ml et ajouter successivement les réactifs 1 puis 2 (3 ml) au
moyen des distributeurs correspondants, en prenant soin d’homogénéiser énergiquement après chaque
ajout.
Réaliser le blanc de réactifs de la même manière au laboratoire avec de l’eau milliQ.
VIII – Conservation et stockage
Aussitôt après le dernier ajout, placer les flacons à l’obscurité dans le bac de transport correspondant.
Conserver ce dernier à température ambiante mais à l’abri du soleil et de toute contamination
potentielle jusqu’au moment de l’analyse.
Le temps de réaction, dépendant de la température, est de 6 heures minimum à environ 20°C.