les microparticules - Journées de Biologie Clinique
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Journées de biologie clinique Necker-Pasteur Paris, le 17 Janvier 2011 Les « nouveaux marqueurs » d’activation de l’hémostase : les microparticules Dominique Helley, MCU-PH Service d’Hématologie biologique Hôpital Européen Georges Pompidou Université Paris Descartes [email protected] Définitions Microparticules : Vésicules de taille < 1 µm, émises par les cellules lors de leur activation ou de l’apoptose exposant à leur surface : des protéines membranaires caractéristiques de leur origine cellulaire qui permettent d’identifier de cette origine et peuvent être vectrices de propriétés spécifiques des aminophospholipides qui confèrent aux microparticules la capacité de favoriser la cascade de la coagulation Maladies où l’activation de la coagulation participe à la physiopathologie (syndromes coronariens aigus, HTA, diabète, drépanocytose, HPN, prééclampsie, PTT,…) 50 Feuillet externe PC Sph PE PS Feuillet interne 50 Cellules au repos Cellule au repos: maintien de l'asymétrie - - - - Transport spécifique (flippase active) (floppase inactive) (ATPase Mg2+-dépendante) - Scramblase inactive Internalisation de la Phosphatidylsérine Cellule stimulée: perte de l'asymétrie - - - - - Transport spécifique (flippase inactive) (floppase active) (ATPase Mg2+-dépendante) [Ca2+]i 50 Scramblase active Externalisation de la Phosphatidylsérine 50 PC - Feuillet externe Sph PE PS Feuillet interne Cellules activées, cellules apoptotiques Formation des microparticules + ++ - - - - + + + + + - - - - - - - - + - + + + + Flippase Scramblase Floppase Ca2+ Gelsoline Calpaïne Rho Kinases Caspases Perte de capacité à former des microparticules exposant de la PS Syndrome hémorragique (syndrome de Scott) Role des phospholipides dans la coagulation Cascade de la coagulation X IX VIIa IXa TF Ca2+ - Ca2+ - - VIIIa VIII - X PHOSPHOLIPIDES Ca2+ - Ca2+ - - - PHOSPHOLIPIDES pC Système anticoagulant de la protéine C activée Va VIIIa pCa pS Xa II Ca2+ Va V Ca2+ - PHOSPHOLIPIDES Ca2+ PHOSPHOLIPIDES Fibrinogène Ca2+ - - Thrombine Fibrine - - Composition des microparticules Cellule Cellule activée Phospatidylsérine Protéine constitutive Protéine inductible Microparticules Fonctions attribuées aux microparticules Inflammation Production de cytokines Exposition de molécules d’adhésion Exposition de molécules d’adhésion Interactions Leucocytes Cellules endothéliales Microparticules Microparticules plaquettaires Surexpression de Mac-1 et LFA-1 sur les monocytes et d’ICAM-1 sur les cellules endothéliales Augmentation de l’interaction cellulaire Surexpression de CD11b sur les leucocytes Augmentation de l’activité phagocytaire et des liaisons cellules-cellules Production par les leucocytes d’IL-1β, d’IL-8 et de TNFα Production par les cellules endothéliales d’IL-1β, d’IL-6 et d’IL-8 Fonctions attribuées aux microparticules Microparticules plaquettaires Microparticules monocytaires Transfert d’acide arachidonique aux cellules endothéliales, aux monocytes Expression de Cox-2 et synthèse de prostacycline Vasodilatation et diminution de la réactivité vasculaire Plaques d’athérome: Exposition de FT Activité procoagulante des plaques Microparticules Cellules endothéliales Production de prostacycline Diminution de la relaxation endothéliale Fonction vasculaire Contrôle IDM: Hte conc Micropart IDM: Faible conc Micropart Tm: Hte conc Micropart Boulanger et al., Circulation, 2001;104:26490 Fonctions attribuées aux microparticules Microparticules quelque soit l’origine Phosphatidylsérine à la face externe Cascade de la coagulation Microparticules plaquettaires Expression de FT sur les monocytes via interaction de la P-sélectine Microparticules endothéliales Expression de FT sur les monocytes via interaction ICAM-1 / intégrine β2 Microparticules FT+ sur plaquette (x 25000) Microparticules Surface procoagulante Exposition de facteur tissulaire Monocytes Exposition de facteur tissulaire Giesen et al, PNAS, 1999;96:2311-2315 Coagulation Fonctions attribuées aux microparticules Microparticules Interactions cellulaires Transfert d’antigène Activité protéolytique Facteurs de croissance Prolifération Différenciation Angiogenèse Croissance tumorale Propriétés biologiques des microparticules (endothéliales) Copyright ©2011 American Heart Association Dignat-George & Boulanger, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011;31:27-33 Méthodes de détection et de mesure des microparticules Points critiques de la phase pré-analytique 1 - Prélèvement sanguin - Anticoagulant (citrate, EDTA,…) - A jeun But : 2 - Transport 3 – Traitement et conservation de l’échantillon - Délai - Température * Eviter l’activation cellulaire (plaquettes surtout) * Préserver les proportions de MP et leur intégrité (fonction) in vascular biology J.M. Feyssinet and F. Dignat-George http://www.isth2009.com/ Conditions pré-analytiques : Recommandations Sang sur citrate Conservation à TA < 4 heures 15 min à 1500 g à TA Plasma pauvre en plaquettes (PPP) Culot cellulaire 2 min à 13000 g à TA Plasma déplaquetté Congélation à - 80°C 45 min à 15000 g à TA Détermination des microparticules Microparticules Lavages Microparticules purifiées Etudes fonctionnelles, protéomiques… Mesure des microparticules : différentes méthodologies Cytométrie en flux Taille < 1 µm Antigènes spécifiques par anticorps Phosphatidylsérine par Annexine V Numération et origine cellulaire Tests fonctionnels Phosphatidylsérine par activité prothrombinase Facteur tissulaire par génération de thrombine Potentiel procoagulant Tests de capture Phosphatidylsérine ou antigène Test fonctionnel procoagulant Potentiel procoagulant et origine cellulaire Détection des microparticules par cytométrie en flux Taille < 1 µm Antigènes spécifiques par anticorps Phosphatidylsérine par Annexine V Numération et origine cellulaire Macey et al., Cytometry B Clin Cytom. 2011;80:57-63 Détection des microparticules par cytométrie en flux Taille < 1 µm Antigènes spécifiques par anticorps Phosphatidylsérine par Annexine V Numération et origine cellulaire Boulanger et al., Hypertension, 2006;48:180-186 Détection des microparticules par cytométrie en flux Taille < 1 µm Antigènes spécifiques par anticorps Phosphatidylsérine par Annexine V Numération et origine cellulaire Boulanger et al., Hypertension, 2006;48:180-186 Marqueurs utilisés pour l’identification des microparticules Microparticules totales Pan MP Annexine V ? Microparticules dérivées des différentes sous-populations cellulaires Antigènes spécifiques de l’origine cellulaire Plaquettes CD41, CD42b, CD62P, CD61... Antigènes reliés à un potentiel fonctionnel Erythrocytes Leucocytes Endothélium CD45, CD31, CD51, CD235 PSGL-1, CD66b, CD54, CD62E, (Glycophorine A) CD16, CD14, CD105, CD106, CD11a, CD11b, CD144, CD146… CD3, CD4, CD20… E-sélectine P-sélectine PSGL-1 Facteur tissulaire Détection des microparticules par tests fonctionnels Phosphatidylsérine par activité prothrombinase Facteur tissulaire par génération de thrombine Potentiel procoagulant Sur des micropraticules purifiées: mesure de l’activité prothrombinase et facteur tissulaire Tests de coagulation d’un plasma contenant des microparticules Méthode automatisée : STA-Procoag-PPL (Diagnostica Stago) Essai combinant capture des microparticules exprimant la phosphatidylsérine et détermination de l’activité procoagulante Kit ZYMUPHEN MP Activity (HYPHEN BioMed/Biogenic) Détection des microparticules par tests fonctionnels : Capture suivi d’activité procoagulante Phosphatidylsérine ou antigène Test fonctionnel procoagulant Potentiel procoagulant et origine cellulaire II Xa Détection de la phosphatidylsérine mesure de la thrombine générée Va Ca2+ Ca2+ - - - - PHOSPHOLIPIDES VIIa X Détection du facteur tissulaire mesure du Xa généré FT Annexine V couplée à la biotine Ca2+ - - Ca2+ - - PHOSPHOLIPIDES Détection des microparticules par capture suivi d’activité procoagulante Phosphatidylsérine ou antigène Test fonctionnel procoagulant Potentiel procoagulant et origine cellulaire II Xa Détection de la phosphatidylsérine mesure de la thrombine générée Va Ca2+ Ca2+ - - - - PHOSPHOLIPIDES VIIa X Détection du facteur tissulaire mesure du Xa généré FT Anticorps spécifique d’origine cellulaire couplée à la biotine Ca2+ - - Ca2+ - - PHOSPHOLIPIDES Intérêt en pathologie de la détection des microparticules Pathologies cardiovasculaires Hypertension Plaquette, monocyte, cellule endothéliale Hyperlipidémie Cellule endothéliale Athérosclérose Monocyte, plaquette, cellule endothéliale Syndrome coronarien aigü Plaquette, cellule endothéliale Diabète Plaquette, cellule endothéliale Maladie de Buerger Plaquette Pathologies hémorragiques ou thrombotiques Thrombopénie induite par l’héparine Plaquette Syndrome des antiphospholipides Plaquette, cellule endothéliale Purpura thrombotique thrombocytopénique Plaquette, cellule endothéliale Hémoglobinurie paroxystique nocturne Plaquette, érythrocyte, cellule endothéliale Drépanocytose Plaquette, érythrocyte, cellule endothéliale Pathologies infectieuses Sepsis Plaquette, cellule endothéliale Infection à HIV Lymphocyte Pathologie de la grossesse Prééclampsie Lymphocyte, granulocyte Pathologies néoplasiques Néoplasie pulmonaire Monocyte Néoplasie gastrique Plaquette Nombre de microparticules/µL Monocytaire FT+ Endothéliale FT+ Totale FT+ Témoins A/A Sujets S/S Sujets S/S à l'état stable en crise Temps de coagulation plasmatique (sec) Drépanocytose Avec AC anti-FT Avec AC CTRL p=0,002 p=0,001 Témoins A/A Sujets S/S Corrélation entre microparticules FT+(monocytaires) et activation de la coagulation Rôle physiopathologique des MP FT+ dans les complications thrombotiques associées à la drépanocytose Shet et al., Blood, 2003;102:2678-2683 Lupus Microparticules endothéliales CD51+/µL 400 P=0,001 300 P=0,0074 200 100 0 Témoins (n=30) Lupus anticagulant avec thrombose sans thrombose (n=15) (n= 15) Combes et al., J Clin Invest, 1999;104:93-102 Microparticules FT+ et activation de la coagulation lors du sepsis R = 0.78, P < 0.01, n = 16 Corrélation entre microparticules FT+ et activation de la coagulation lors du sepsis Wang et al., J Thromb Haemost, 2009;7:1092-1098 Les microparticules favorisent la formation du thrombus : rôle du facteur tissulaire Ligature de la veine cave inf au dessous de la veine rénale Injection IV des MP (100 µL) 10 min Poids du thrombus dans la veine cave ● MP après chir. cardiaque MP péricardiques + AC anti-FT MP péricardiques + AC contrôle ○ MP de donneurs sains Biró et al., J Thromb Haemost, 2003;1:2561-2568 Microparticules et cancer : marqueur de l’évolution tumorale ? prédicteur de la thrombose ? VEGF (pg/mL) « Prédiction » des métastases Stade I Stade II/III Stade IV Cancer gastrique (n=29) (n=28) (n=40) (n=41) Stade I Stade II/III Stade IV Cancer gastrique (n=29) (n=28) (n=40) (n=41) Normal Stade I Stade II/III Stade IV Cancer gastrique (n=29) (n=28) (n=40) (n=41) Sensibilité (%) Spécificité (%) Normal RANTES (pg/mL) Normal IL-6 (pg/mL) Microparticules plaquettaires x 106/µL Cancer gastrique Micropart. plaquettes 93,3 91,1 VEGF 56,7 64,6 IL-6 70,0 79,7 RANTES 81,8 50,0 Normal Stade I Stade II/III Stade IV Cancer gastrique (n=29) (n=28) (n=40) (n=41) Microparticules plaquettaires = meilleur marqueur pour identifier les cancers gastriques métastatiques Kim et al., Eur J Cancer, 2003;39:184-191 Relation microparticules plaquettaires et survie dans le cancer de la prostate métastatique hormonorésistant Survie et nombre de microparticules plaquettaires 1,0 Microparticules plaquettaires ≤ 6800/ µL > 6800/µL 0,8 43 patients inclus p = 0,034 Survie globale 0,6 Médiane 26,4 mois Survie à 2 ans : 51% 0,4 Médiane 16,7 mois 0,2 Survie à 2 ans : 34% 0 0 12 24 36 Mois 48 60 Helley et al., Eur Urol, 2009;56:479-485 Taux plasmatiques FT+ et survie dans le cancer du pancréas Courbe de survie (Kaplan-Meyer) selon l’activité du FT dans le K du pancréas Activité du FT sur les microparticules 273 Sujets normaux N = 37 VTE K sein K sein K pancréas avant après chir métastatique N=7 N = 10 N = 17 N = 23 Tesselaar et al., J Thromb Haemost, 2007;5:520-527 Expression du FT par les cellules tumorales dans le cancer du pancréas P = 0,04 Khorana et al., Clin Cancer Res, 2007;13:2870-2875 Microparticules FT+ et incidence des TV 60 patients cancéreux n’ayant jamais thrombosé au moment du dosage des microparticules P < 0,001 P = 0,03 Taux augmenté de MP FT+, n=16 Taux Nx de MP FT+, n=44 Zwicker et al., Clin Canc Res, 2009;15:6830-6840 Conclusions • Marqueurs de l’activation cellulaire et de la coagulation (patients à risque vasculaire ou thrombotique) • Vecteurs de molécules biologiquement actives • Cibles pharmacologiques éventuelles • Besoin d’une standardisation des méthodes de dosage pour une signification en pratique clinique Conclusions Les microparticules = Marqueur de l’activation de la coagulation et support, voire initiateur, de l’activation de la coagulation
