Des microparticules cellulaires dévoilent leur fonction fibrinolytique

M/S n° 1, vol. 25, janvier 2009
MEDECINE/SCIENCES 2009 ; 25 : 37-44
37
SYNTHÈSE REVUES
Des
microparticules
cellulaires
dévoilent
leur fonction
fibrinolytique
et protéolytique
Loïc Doeuvre, Eduardo Angles-Cano
Origine et formation des microparticules
Les microparticules cellulaires (MP) sont des vésicu-
les membranaires de petite taille (entre 0,1 et 1 μm)
émises par des cellules activées ou en apoptose. Leur
formation puis leur expulsion ont lieu à la suite d’un
stimulus entraînant un influx calcique important [1,
2]. Cet influx calcique modifie l’activité des transpor-
teurs transmembranaires des phospholipides (flippase,
floppase et scramblase) qui, dans la cellule au repos,
assurent le maintien de la phosphatidylsérine (PS) dans
le feuillet cytoplasmique de la membrane [3]. La modi-
fication de l’activité de ces protéines conduit à l’expo-
sition de la PS sur le feuillet membranaire externe, ce
qui constitue une manifestation précoce de l’activation
cellulaire et de l’apoptose [4]. L’augmentation de Ca2+
intracellulaire favorise également l’activation des cal-
païnes intervenant dans la dissociation de structures
membranaires du cytosquelette et favorisant le bour-
geonnement de la membrane plasmique. L’ensemble de
ces phénomènes conduit à la formation et à l’émission
de MP portant à leur surface la PS (Figure 1), véritable
stigmate reconnu par l’annexine V. Cette interaction
entre la PS et l’annexine V est utilisée pour détecter et
mesurer, principalement par cytométrie en flux, le nom-
bre et la taille des MP présentes dans le sang circulant
[5, 6]. Il est important de noter que la cytométrie en
flux ne permet pas de détecter les MP dont la taille est
inférieure à 300 nm, le nombre de MP obtenu par cette
méthode reste donc sous-évalué.
La plupart des MP circulantes sont d’origine plaquet-
taire, mais le sang contient également des MP issues
de leucocytes, de globules rouges et de cellules endo-
théliales [7-9]. Toute cellule vivante étant suscep-
tible de produire des MP, la présence dans les fluides
biologiques (sang, larmes, liquide céphalo-rachi-
dien…) de MP d’origines cellulaires diverses serait la
signature détectable d’un processus d’activation ou
d’apoptose de cellules qui, séquestrées dans les tis-
sus, sont inaccessibles à la détection par des moyens
non invasifs.
> Des microparticules cellulaires dont la taille
varie entre 0,1 et 1 μm sont émises par des cellu-
les activées ou en apoptose. Elles portent, asso-
ciées à leur membrane, des protéines indiquant
leur origine cellulaire et de la phosphatidylsérine
qui transforme le feuillet membranaire externe en
surface d’assemblage des facteurs de la coagu-
lation. Cette propriété procoagulante est accen-
tuée par la présence de facteur tissulaire (FT) sur
certaines microparticules. Une nouvelle fonction
pro-fibrinolytique et protéolytique est mainte-
nant décrite pour des microparticules d’origine
tumorale ou endothéliale portant des métallo-
protéinases matricielles et/ou des composants
du système d’activation du plasminogène. Ces
microparticules concentrent le plasminogène à
leur surface où il est transformé en plasmine par
l’urokinase (uPA, urokinase plasminogen activa-
tor) liée à son récepteur uPAR. La fibrinolyse, la
migration cellulaire, l’angiogenèse, la dissémi-
nation tumorale, ainsi que l’apoptose induite par
le détachement cellulaire pourraient ainsi être
modifiées par la présence de ces microparticules
chargées en plasmine. <
Inserm U919, Sérine Protéases
et Physiopathologie
de l’Unité neurovasculaire,
CiNaps, UMR CNRS 6232,
GIP Cyceron,
boulevard Henri Becquerel,
14074 Caen Cedex, France.
[email protected]
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extracellulaire après fusion d’endosomes multivésicu-
laires avec la membrane plasmique. En raison de leur
petite taille et de leur surface lipidique, les exoso-
mes sont isolés par des centrifugations séquentielles
suivies d’une centrifugation à très haute vitesse
(100 000 g). La purification des MP suit également
un protocole très précis comportant une succession
de différentes centrifugations. Un consensus sur
L’exposition de la PS, le bourgeonnement membranaire et l’émission
de MP précèdent généralement la fragmentation de l’ADN. Les MP
émises après activation cellulaire se distinguent donc des corps
apoptotiques qui sont en général de plus grande taille (> 1,5 μm)
et englobent des fragments d’ADN. Les MP doivent également être
distinguées des exosomes [10-12]. Ces petites vésicules d’origine
endosomique, de taille (< 100 nm) inférieure à celle des MP, ont une
composition protéique différente et sont sécrétées dans le milieu
Redistribution des phospholipides
Membrane d’une cellule CHO
1 mm
500 nm
Bourgeonnement de la membrane
d’une cellule CHO
Microparticule émise
par une cellule CHO
Réorganisation du cytosquelette
Émission de MP
Phosphatidyl-
sérine
(feuillet externe)
Activation cellulaire
Apoptose
Flippase Floppase
Scramblase
Cytosquelette
Ca++
Dysfonctionnement
de l’activité
Calpaïnes Phosphatidyl-
sérine
(feuillet interne)
1
A B
2
3200 nm
Figure 1. Formation d’une microparticule. A. Un stimulus
induit un influx calcique important, entraînant une modifi-
cation de l’activité des transporteurs (flippase, floppase et
scramblase) gouvernant la répartition des phospholipides
entre les deux feuillets membranaires. Ce même influx calcique entraîne une réorganisation
du cytosquelette via l’activité protéolytique des calpaïnes. L’ensemble de ces événements
conduit à un bourgeonnement de la membrane, puis à l’émission d’une microparticule
exposant la phosphatidylsérine sur son feuillet externe. B. Aspect de la membrane plas-
mique d’une cellule CHO observée par microscopie électronique à transmission (1) au
repos, (2), après stimulation par du plasminogène : vésiculation, et émission d’une micro-
particule (3). CHO : cellules ovariennes de hamster.
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SYNTHÈSE REVUES
une méthode d’isolement n’a pas encore été obtenu
(Tableau I), mais il paraît clair que la force gravita-
tionnelle relative nécessaire pour sédimenter les MP
(20 000 g, 45 à 90 min) est très différente de celle
utilisée pour isoler les exosomes.
Molécules bioactives
exprimées par les microparticules
Activité procoagulante des microparticules
Deux observations clés ont conduit à la découverte de
MP procoagulantes dans le plasma frais dépourvu de
plaquettes. Premièrement, l’identification par Char-
gaff (1946) d’une activité procoagulante dans le pré-
cipité obtenu par centrifugation de ce plasma à haute
vitesse (30 000 g, 120 min) [13]. Puis, la confirmation
par Wolf (1967) de ce phénomène et
l’identification dans ces précipités, par
microscopie électronique, de très peti-
tes particules d’origine plaquettaire
[14]. Cette activité procoagulante des
MP est associée à la présence de la PS
dans le feuillet externe de la membrane
et de facteur tissulaire (FT), une pro-
téine transmembranaire synthétisée
par les fibroblastes, les leucocytes et
les cellules endothéliales. La PS joue
un rôle pivot dans l’assemblage mem-
branaire de facteurs de la coagulation
et le FT est le principal initiateur de la
séquence d’activation aboutissant à la
formation de thrombine et, in fine, au
caillot fibrino-plaquettaire. La des-
cription d’un défaut dans la transloca-
tion de phospholipides membranaires et
dans la libération de MP plaquettaires,
érythrocytaires et lymphocytaires chez
des patients ayant un syndrome hémor-
ragique (syndrome de Scott) a confirmé
le rôle physiologique de ces MP dans la
réponse hémostatique [15].
Ces caractéristiques, présence de PS
et/ou de FT, ont orienté les travaux
sur les MP dérivées de plaquettes ou
de leucocytes vers l’étude de leur rôle
dans la coagulation [7, 8]. Ainsi, leur
activité procoagulante est actuelle-
ment considérée comme un détermi-
nant du risque de thrombose au cours
de plusieurs situations pathologiques
[16, 17].
Reconnaître l’identité cellulaire des microparticules
L’activation cellulaire provoquée par différents types de stimulus
(inflammatoires, physiques, chimiques, infectieux) se manifeste par
l’expression de médiateurs cellulaires et de facteurs protéolytiques.
Les MP émises expriment également ces molécules (Tableau II) et
reflètent directement l’état d’activation cellulaire.
La présence de glycoprotéines membranaires spécifiques de la
cellule parentale [16, 17] a permis d’identifier l’origine des MP
(plaquettaire, endothéliale, leucocytaire et érythrocytaire), mais
aussi de considérer leur présence dans la circulation comme un
indicateur soit de lésion endothéliale [18-20] soit d’activation
plaquettaire [7]. Hormis ces glycoprotéines identitaires et les
composants procoagulants, des études in vitro montrent que les MP
transportent également d’autres composants bioactifs dérivés de la
cellule parentale (récepteurs membranaires, cytokines, facteurs de
transcription, ARNm) [21, 22] (Tableau II). Récemment, une analyse
Source Type
cellulaire Stimulus Méthode de purification Référence
Surnageant de culture
Cellules CABA 1
(cancéreuses)
600 g/15 min
1 500 g/15 min
100 000 g / 1 h
[27]*
U937 et cellules
Jurkatt
LPS 10 μg/mL,
TNFα 1 nM
1 500 g/5 min
100 000 g / 20 min [44]*
HMEC-1 TNFα 100 ng/mL 4 300 g/5 min
20 000 g / 2 h [25]
Liquide d’ascite
Carcinome ovarien
600 g/15 min
1 500 g/ 15 min
100 000 g / 1 h
[27]*
Carcinome ovarien
500 g/15 min
800 g / 10 min
100 000 g / 1 h
[29]*
Plasma
Cellules circulantes
sanguines
1 900 g/20 min
31 000 g/150 min [13]
Cellules circulantes
sanguines
600 g/15 min
1 500 g/ 15 min
100 000 g / 1 h
[27]*
Cellules circulantes
sanguines
2 000 g/ 15 min
2 000 g / 15 min
24 000 g / 1 h
[25]
Tableau I. Différentes méthodes d’isolement des microparticules. CABA 1 : cellules issues de car-
cinome ovarien. U937 : lignées cellulaires issues de lymphomes monocytaires. HMEC-1 : cellules
endothéliales microvasculaires. *Les MP obtenues par cette procédure contiendraient également
des exosomes. LPS : lipopolysaccaride. TNF : tumor necrosis factor.
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pro-MMP sont activées par un changement de confor-
mation ou par une protéolyse limitée due à la plas-
mine ou à d’autres pro-MMP (Figure 2). La fonction
des MMP activées est régulée par 4 types d’inhibiteurs
de type tissulaire (TIMP-1 à TIMP-4, tissue inhibitor of
metalloprotease).
Le système d’activation du plasminogène
Il est étroitement lié à la fibrinolyse et à la protéolyse
péricellulaires [32]. La réaction centrale de ce sys-
tème est la conversion du plasminogène en plasmine
à la surface de la fibrine ou de la membrane cellulaire
par l’activateur de type tissulaire (tPA) ou par l’ac-
tivateur de type urokinase (uPA) lié à son récepteur
spécifique l’uPAR. L’activation du plasminogène est
conditionnée par une interaction entre ses sites de
liaison et les résidus lysine en position carboxy-termi-
nale présents dans des glycoprotéines de la membrane
cellulaire, mais aussi de la matrice extracellulaire
[33] ou de la fibrine (Figure 2). La plasmine générée in
situ est capable de cliver des glycoprotéines membra-
naires, de dégrader directement certaines protéines
de la matrice extracellulaire et la fibrine, mais aussi
d’activer des précurseurs inactifs dont la pro-uroki-
nase, des facteurs de croissance, ainsi que des MMP.
Ce phénomène peut être inhibé tant au niveau des
activateurs du plasminogène (par le plasminogen
activator inhibitor, PAI-1) qu’au niveau de la plasmine
(par l’α2-antiplasmine).
Le système d’activation du plasminogène, en étroite
interaction avec le système des MMP, constitue la
protéomique a permis de détecter un nombre important de protéines
dans des MP de plusieurs origines [23, 24].
Systèmes protéolytiques des microparticules
Des études récentes indiquent qu’à l’activité procoagulante carac-
téristique des MP circulantes, nous devons maintenant ajouter une
fonction pro-fibrinolytique complémentaire. Dans cet article, nous
faisons une analyse des travaux récents rapportant l’existence
d’une activité fibrinolytique et protéolytique sur des MP cellulaires
(Tableau III).
En effet, en 2007, Lacroix et al. [25] ont attribué aux MP d’origine
endothéliale la capacité de générer de la plasmine et de développer
une activité fibrinolytique et protéolytique péricellulaire. D’autres
études indiquent que des métalloprotéinases matricielles (MMP)
présentes sur des MP issues de cellules cancéreuses pourraient éga-
lement induire une activité protéolytique [26-29]. Cette nouvelle
fonction des MP résulte de la présence, sur la cellule parentale, de
ces deux systèmes protéolytiques : le système des MMP et le système
d’activation du plasminogène (Figure 2).
Les MMP
Ce sont des endopeptidases sécrétées sous la forme de pro-enzymes
(pro-MMP), dont l’activité dépend de leur activation et de l’incorpo-
ration du zinc dans le site catalytique [30]. Les 23 MMP actuellement
décrites chez l’homme ont été initialement classifiées en fonction
de leur spécificité pour un substrat (collagénase, gélatinase, stro-
melysine, matrilysine, métallo-élastase) et de leur localisation sur
la membrane cellulaire (les membrane-type MMP, MT-MMP) [31].
Cependant, la multiplicité des substrats pour un même type de MMP
a conduit à leur classification numérique (MMP-1, MMP-2 etc.). Les
Type cellulaire Stimulus Éléments présents dans
les MP Fonction Référence
Cellules WEHI 274.1 Calcimycine Facteur Tissulaire Coagulation [48]
THP1 LPS 1 μg/mL Raft Fusion membranaire [49]*
Ascite/culture de cellules
épithéliales cancéreuses Fas Ligand Induction de l’apoptose [50]
HUVEC CPT 5 μm Forme normale de la protéine prion Transmission du prion [51]*
Cellules progénitrices
endothéliales circulantes Sevrage en sérum ARNm Transfert d’ARNm [22]*
CHO Sevrage en sérum
CCR5 Infection tissulaire [52]
Monocytes isolés du sang
de patients VIH
Tableau II. Composants cellulaires portés par les microparticules. Selon leur origine cellulaire, les MP portent des éléments variés avec des fonc-
tions ou des effets pathologiques pouvant être transmis à d’autres cellules. *Les MP obtenues par cette procédure contiendraient également des
exosomes. WEHI 274.1 : cellules monocytaires tumorales de souris. THP1 : lignées monocytaires. HUVEC : cellules endothéliales isolées de cordon
ombilical. CHO : cellules ovariennes de hamster. CPT : Camptothécine. CCR5 : chemokine (C-C motif) receptor 5. LPS : lipopolysaccharide.
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plus importante source d’activité pro-
téolytique péricellulaire (dégradation
de protéines matricielles, libération de
facteurs de croissance de la cellule ou
de la matrice extracellulaire, généra-
tion de molécules bioactives) au cours
de l’inflammation, de l’angiogenèse
[34] et de processus pathologiques
comme les cancers [35] et l’athéro-
sclérose [36]. Une défaillance de ce
système peut conduire à des accidents
ischémiques vasculaires. À l’opposé,
différentes études montrent les consé-
quences dramatiques d’une protéolyse
péricellulaire exacerbée sur l’adhé-
rence, l’organisation et la survie cellu-
laires, pouvant aboutir au détachement
de cellules de la matrice extracellulaire
et à la mort cellulaire par apoptose
[37].
Les métalloprotéinases
matricielles (MMP)
Les cellules tumorales malignes possè-
dent un potentiel protéolytique impor-
tant, caractérisé par la production
de MMP et d’uPA, nécessaires à leur
dissémination et à l’invasion tissu-
laire. Dans une série d’études publiées
depuis 1994, la présence de ces enzy-
mes protéolytiques a été identifiée,
in vitro et in vivo [26, 27, 38-42], sur
la membrane de vésicules tumorales
Type cellulaire Stimulus Éléments présents
sur les MP Référence
Composants du système d’activation du plasminogène
Liquide d’ascite
HMEC-1
Cellules CABA 1
(cancéreuses)
TNFα 100 ng/ml uPA
[29]*
[25]
[27]*
Liquide d’ascite
HMEC-1
HUVEC
TNFα 100 ng/ml
PAI-1 1 à 10 ng/ml
uPAR
[29]*
[25]
[47]
Liaison du plasminogène et surface d’activation [25]
HMEC-1
HMEC-1
TNFα 100 ng/ml
TNFα 100 ng/ml
α-énolase
Plasmine
[25]
[25]
Métalloprotéinases
Liquide d’ascite
Cellules CABA 1
(cancéreuses)
MMP-2 et MMP-9 [29]*
[27]*
Cellules PCR3 Surnageant
d’ostéoblastes TIMP-1 et TIMP-2 [43]*
Cellules de fibro-
sarcome Sevrage en sérum Complexe MMP-9 - TIMP-1 [41]*
Tableau III. Éléments protéolytiques présents sur les microparticules. Deux grands systèmes pro-
téolytiques sont présents dans les MP: le système d’activation du plasminogène et/ou les métal-
loprotéinases. *Les MP obtenues par cette procédure contiendraient également des exosomes.
Lacroix et al. [23] ont montré que le plasminogène peut se lier à la surface de MP, notamment
via des récepteurs de type α-énolase, et ainsi permettre la formation de plasmine à la surface
des MP. HMEC-1 : cellules endothéliales microvasculaires. CABA 1 : cellules issues de carcinome
ovarien. HUVEC : cellules endothéliales isolées de cordon ombilical. PCR3 : cellules cancéreuses
prostatiques. MMP : metalloprotéases matricielles. TNF : tumor necrosis factor. uPAR : urokinase
plasminogen activator receptor. PAI : plasminogen activator inhibitor.
Figure 2. Interaction entre le système
d’activation du plasminogène et les métallo-
protéinases. Le plasminogène (Pg) circulant
est concentré sur la membrane des micro-
particules (MP) par liaison aux résidus lysine
de glycoprotéines membranaires via des sites
de liaisons spécifiques. Il est transformé en
plasmine (Pn) in situ par l’un des activateurs
du plasminogène : l’uPA. La plasmine peut agir
directement sur la fibrine (fibrinolyse) ou sur
des protéines matricielles, ou encore en acti-
vant des pro-métalloprotéinases (pro-MMP)
en MMP actives.
Fibrinolyse
Protéolyse
Péricellulaire
Pn
Pro-MMP
MMP actives
Pg
Circulant
Pg
Membrane
d’une MP
uPA
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