PROJET DE RECHERCHE Etude des mécanismes de
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2014 PROJET DE RECHERCHE Etude des mécanismes de chimiorésistance dans le cancer du sein Docteur Charlotte Ngô Praticien Hospitalo-universitaire Chirurgie cancérologique gynécologique et du sein Hôpital Européen Georges Pompidou FSF 91 boulevard de Sébastopol 75002 Paris Étude des mécanismes de chimiorésistance : Étude de la régulation par les adipocytes de l'expression tumorale des pompes d'efflux dans le cancer du sein Prise en compte du rôle de l'obésité 1 - RESUME DU PROJET Le cancer du sein est le premier cancer féminin dans le monde. En France, on compte près de 50 000 nouveaux cas chaque année avec 11 000 décès (chiffres de l'Institut National du Cancer 2012). Par ailleurs, la prévalence globale du surpoids et de l'obésité augmente. Aujourd'hui, plus de 30% de la population mondiale est concernée par un surpoids et un adulte sur 10 est obèse (Indice de Masse Corporelle IMC > 30 kg/m²) [1]. En France, le taux d'obésité moyen est de 14.5% en 2012, il est de 18.7% chez les adultes de plus de 65 ans [2]. Il est aujourd'hui démontré que l'obésité est un facteur de risque de cancer du sein et un facteur de mauvais pronostic [3]. Environ 10% des cancers du sein sont directement attribuables à l'obésité. Il est prouvé qu'une femme obèse atteinte d'un cancer du sein a un risque de mortalité majoré de 30% par rapport à une femme non obèse, ceci serait en partie lié à une moins bonne réponse à la chimiothérapie. Au vu de ces constats, il est essentiel de décrypter les mécanismes par lesquels l'obésité altère le pronostic des femmes atteintes de cancer du sein, afin de proposer des stratégies différentes à ces patientes. 1-1 JUSTIFICATION SCIENTIFIQUE Valider in vivo l'hypothèse selon laquelle les cellules graisseuses pourraient contribuer à la chimiorésistance des cancers du sein chez les patientes obèses. 1-2 INDICATION Cancer du sein opéré. Patientes obèses et non obèses. 1-3 MÉTHODOLOGIE RETENUE Il s’agit d’une étude rétrospective sur des échantillons de tumeurs mammaires provenant de patientes opérées d'un cancer du sein. L'étude de l'expression des pompes d'efflux se fera par immunohistochimie (étude de la morphologie des cellules destinée à mettre en évidence certains constituants cellulaires et tissulaires sur des coupes de tissus). Docteur Charlotte Ngô Chirurgie cancérologique gynécologique et du sein - Hôpital Européen Georges Pompidou FSF - 91 boulevard de Sébastopol - 75002 Paris Contact : Marie DELANOË [email protected] 2 1-4 OBJECTIFS Objectif principal : comparer la quantité des pompes d'efflux présentes à la surface des cellules cancéreuses mammaires chez des patientes obèses et non obèses. Objectifs secondaires : corréler les niveaux d'expression des pompes d'efflux aux caractéristiques des patientes et des tumeurs. 1-5 CRITÈRES DE JUGEMENT Critère de jugement principal : mesure semi-quantitative de l'immunomarquage pour les protéines impliquées dans l'efflux (mesure de la quantité de transporteurs présents à la surface des cellules par la quantification du nombre de cellules marquées et de l'intensité du marquage). Critères de jugement secondaires: caractéristiques cliniques des patientes, caractéristiques biologiques des tumeurs. 1-6 PRINCIPAUX CRITÈRES D’INCLUSION Patientes âgées de plus de 18 ans, ayant donné leur consentement pour l'utilisation de leurs échantillons. Cancer du sein opéré avec échantillons tissulaires conservés en paraffine. 1-7 PRINCIPAUX CRITÈRES DE NON INCLUSION Patiente enceinte Patiente ayant eu de la chimiothérapie avant d'être opérée 1-8 COHORTE CONCERNÉE patientes (20 femmes non obèses et 20 femmes obèses) 2 - JUSTIFICATION DE L’ETUDE L'augmentation du risque de cancer observée chez les personnes obèses est liée à des modifications conséquentes à l'expansion du tissu graisseux et qui sont favorables au développement et à la croissance des tumeurs [4-8]. Il a été montré que les cellules composant la glande mammaire de patientes obèses proliféraient plus que les cellules de patientes de poids normal [9-11]. La progression tumorale est le produit d'un dialogue entre les cellules tumorales et leur environnement [12]. Les adipocytes (cellules graisseuses) représentent le composant majoritaire du microenvironnement du cancer du sein. Docteur Charlotte Ngô Chirurgie cancérologique gynécologique et du sein - Hôpital Européen Georges Pompidou FSF - 91 boulevard de Sébastopol - 75002 Paris Contact : Marie DELANOË [email protected] 3 L'équipe du Pr Catherine Muller de l'Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale a montré l'existence d'un dialogue entre les cellules graisseuses et les cellules tumorales donnant lieu à des modifications des deux types cellulaires [13-17]. Ces modifications stimulent les propriétés invasives des cellules tumorales [18]. Il a été montré chez la souris et chez l'humain que l'obésité induisait une résistance à la chimiothérapie de certains types de cancers du sein [9-11, 19]. En effet, les cellules tumorales mises en culture avec des cellules graisseuses deviennent résistantes à la chimiothérapie par augmentation de l'efflux des drogues (efflux: mécanisme par lequel les drogues sont expulsées hors de la cellule), ce mécanisme est augmenté si les cellules graisseuses proviennent de sujets obèses. L'expulsion des drogues hors de la cellule se fait grâce à des transporteurs, également appelés pompes d'efflux, situés à la surface de la cellule. Parmi ces transporteurs, on distingue entre autres: la glycoprotéine P, la BCRP (breast cancer resistance protein) et la LRP (Lung resistance protein). Des études cliniques ont clairement établi un lien entre la surexpression de ces pompes et une résistance à la chimiothérapie avec un pronostic altéré dans le cancer du sein et dans le cancer du poumon [20-22]. Les travaux récents montrent que l'expression de ces transporteurs est augmentée in vitro dans les cellules tumorales cultivées avec les cellules graisseuses provenant de souris obèses. Ces données doivent être confirmées in vivo sur des échantillons tumoraux humains. L'objectif de notre étude est de confirmer ces hypothèses en étudiant l'expression des pompes d'efflux par les cellules tumorales au front invasif, site de contact avec les adipocytes péri-tumoraux, et leur régulation dans l'obésité. 3 - OBJECTIFS DE L’ÉTUDE Objectif principal L’objectif principal est de comparer l'expression par les cellules tumorales des pompes d'efflux LRP, BCRP et PgP chez des patientes obèses et non obèses opérées d'un cancer du sein. Objectifs secondaires Les objectifs secondaires sont de corréler le taux d'expression de ces pompes aux caractéristiques cliniques et biologiques dans les deux groupes de patientes. 4 - MÉTHODOLOGIE a) Plan experimental Etude préliminaire rétrospective sur des patientes ayant donné leur consentement pour la conservation de leurs échantillons biologiques et l'utilisation de leurs données personnelles. L'étude consiste à évaluer l'expression des protéines LRP, BCRP et PgP par immunohistochimie sur des Docteur Charlotte Ngô Chirurgie cancérologique gynécologique et du sein - Hôpital Européen Georges Pompidou FSF - 91 boulevard de Sébastopol - 75002 Paris Contact : Marie DELANOË [email protected] 4 échantillons tumoraux conservés en paraffine. b) Population Critères d’inclusion : Patientes âgées de plus de 18 ans ; Ayant été opérée d'un cancer du sein infiltrant entre le 01/01/2013 et le 31/12/2014 Patientes ayant donné leur consentement pour la conservation et l'utilisation de leurs échantillons biologiques et de leurs données personnelles. Traitement chirurgical premier Groupe de patientes non obèses: BMI < 25 Groupe de patientes obèses: BMI > 30 Critères de non inclusion : Chimiothérapie ou hormonothérapie précédent l'intervention ; Grossesse en cours c) Durée de l’étude Sélection des patientes et recueil des données Réalisation des techniques d'immunohistochimie Interprétation et exploitation des résultats Durée totale Durée en mois 2 mois (en cours) 2 mois 2 mois 6 mois d) Techniques Les immunomarquages seront réalisés sur des échantillons tumoraux inclus en paraffine, sur des coupes montrant le front invasif, c'est-à dire montrant la limite entre les cellules tumorales et le tissu adipeux péritumoral. e) Critères d’évaluation Critère d’évaluation principal Evaluation semi-quantitative de l'immunomarquage pour les protéines LRP, BCRP et PgP par le score suivant, prenant en compte à la fois l'intensité du marquage et la proportion de cellules marquées: -, absent; +, faible; ++, modéré; +++, fort. Docteur Charlotte Ngô Chirurgie cancérologique gynécologique et du sein - Hôpital Européen Georges Pompidou FSF - 91 boulevard de Sébastopol - 75002 Paris Contact : Marie DELANOË [email protected] 5 Critères d’évaluation secondaires Les critères d’évaluation secondaires sont les caractéristiques cliniques (âge, poids, taille, ménopause, traitements, taille de la tumeur…) et biologiques (caractéristiques biologiques de la tumeur) qui seront corrélées à l'expression des pompes. 5 - GESTION DE DONNÉES Modalités pratiques de recueil des données Identification des patientes : les patientes qui se prêtent à cette recherche se verront attribuer un numéro de code associé à leurs initiales. Ce code sera présent sur tous les documents nécessaires à la recherche. Toutes les informations requises par le protocole seront recueillies de manière anonyme sous la responsabilité de l’investigateur qui veillera à l’exactitude des données renseignées. Analyse statistique Nous utiliserons les tests de Fisher pour tester l'association entre les niveaux d'expression des protéines P-gp, LRP et BCRP et la variable "obésité", mais également l'association avec d'autres variables (types histologiques, stade..). Les caractéristiques des 2 groupes de patientes feront l'objet de statistiques descriptives, les variables catégoriques seront analysées par le test du chi2 ou par le test de Fisher. Les analyses seront menées à l'aide du logiciel R (http://cran.r-project.org). 6 - RÉALISATION PRATIQUE DE L’ÉTUDE Cette étude sera coordonnée par le Dr Charlotte Ngô de l'équipe de chirurgie cancérologique gynécologique et mammaire du Pr Lecuru, Hôpital Européen Georges Pompidou. La sélection des patientes et le recueil des données seront effectués par l'équipe. La réalisation des techniques d'immunohistochimie sera effectuée au sein du service d'anatomopathologie de l'HEGP. La lecture des lames sera effectuée par l'équipe du Dr Catherine Muller de l'Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, l'interprétation et l'exploitation des résultats seront effectués conjointement par les deux équipes. 7 - RÉSULTATS ATTENDUS ET RETOMBÉES SCIENTIFIQUES Une surexpression des pompes d'efflux au front invasif, zone de dialogue entre les cellules tumorales et les adipocytes péritumoraux, chez les patientes obèses par rapport aux patientes non obèses confirmerait in vivo l'implication des adipocytes dans les mécanismes de la chimiorésistance observée chez les patientes obèses. Cette étude préliminaire permettrait la mise en place d'une étude prospective à plus large échelle évaluant la réponse à la chimiothérapie des patientes obèses atteintes de cancer du sein, en fonction Docteur Charlotte Ngô Chirurgie cancérologique gynécologique et du sein - Hôpital Européen Georges Pompidou FSF - 91 boulevard de Sébastopol - 75002 Paris Contact : Marie DELANOË [email protected] 6 de la caractérisation moléculaire des cellules graisseuses péritumorales. 8- ÉTHIQUE ET RESPONSABILITÉ Les soumissions aux différents comités sont en cours (CPP Ile de France 2). 9-BUDGET PREVISIONNEL Poste de dépense Sélection des échantillons Mise au point IHC Réactifs IHC Anticorps spécifiques Temps technicien temps plein 2 mois Sous-total (en €) Frais de fonctionnement (10%) TOTAL (en €) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Prix unitaire 30 68 68 419 2800 Nombre d'unités 120 20 120 3 2 Coût total 3 600 1 360 8 160 1 257 5 600 19 977 1 997,70 21 974,70 BIBLIOGRAPHIE Ng, M., T. Fleming, M. 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