Les cellules tumorales circulantes

anatomie et cytologie pathologiques
Revue FRancophone des LaboRatoiRes - JanvieR 2013 - n° 448 // 55
article reçu le 5 octobre, accepté le 10 octobre 2012.
© 2012 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.
Summary
Circulating tumour cells
Methods for detection and usefulness in oncology
For several decades, there is a strong and permanent
effort in translational research for the discovery of new
oncology biomarker for diagnosis (in particular for an
early screening of cancer), prognosis or prediction of
treatment efcacy. These biomarkers are analyzed
from tissues, cells or biological fluid samples. In
this context, there is a growing enthusiasm around
the detection of circulating tumor cells (CTC) in the
blood of cancer patients since this detection may
have a strong diagnostic, prognostic and/or thera-
nostic interest. Numerous direct and indirect methods
were developed to detect and characterize the CTC.
However, there is a great variability in the sensitivity
and the specicity of these methods. Each available
method shows certain advantages, but also some
disadvantages. The advent of targeted therapies in
oncology has suddenly intensied the interest in the
CTC eld. The detection of genomic alterations in CTC
could be associated with a personalized medicine
according to the identied mutations. The purpose
of this review is to describe the main methods for
CTC detection and characterization, and the potential
clinical utility of CTC in oncology.
Circulating tumour cells – targeted therapy – prognosis –
diagnosis – cancer screening.
réSumé
L’intérêt pour les biomarqueurs en oncologie fait l’objet depuis plusieurs
décennies d’une recherche permanente an de pouvoir établir des tests
diagnostiques (en particulier pour un dépistage précoce de cancer), pro-
nostiques ou prédictifs de la réponse aux traitements. Ces biomarqueurs
sont étudiés à partir des tissus, des cellules ou dans les uides biologiques.
Dans ce contexte, un engouement croissant se fait actuellement autour
de la détection des cellules tumorales circulantes (CTC) dans le sang des
patients, cette détection pouvant avoir un intérêt diagnostique, pronostique
et/ou théranostique. De nombreuses méthodes directes ou indirectes ont
été ainsi développées pour détecter les CTC. Cependant, la sensibilité et
la spécicité de ces méthodes sont variables, et les technologies propo-
sées à ce jour présentent un certain nombre d’avantages mais aussi des
inconvénients. L’avènement des thérapies ciblées a brutalement intensié
ce domaine d’application en oncologie, avec la recherche d’altérations
génomiques dans les CTC pouvant conduire à développer une médecine
personnalisée à partir de prélèvements non invasifs. Nous décrivons les
principales méthodes de détection des CTC et l’utilité potentielle de la
mise en évidence des CTC en oncologie.
Cellules tumorales circulantes – thérapie ciblée –
pronostic – diagnostic – dépistage.
Véronique Hofmana, b, Élodie Longa, b, Marius Iliea, b, Eric Selvab, Paul Hofmana, b,*
Les cellules tumorales circulantes :
méthodes de détection et intérêt en oncologie
des cellules tumorales circulantes (CTC) font l’objet de
nombreux travaux de recherche clinique et translationnelle
depuis plusieurs décennies. Récemment, le nombre de
publications relatives aux CTC, et particulièrement de
revues générales, s’est considérablement accru, témoi-
gnant ainsi d’un engouement de plus en plus fort des
chercheurs et des oncologues dans ce domaine [1-10].
Il existe toutefois un profond contraste entre l’énergie
déployée pour développer les outils visant à identier
les CTC et l’application que l’on peut en faire à ce jour
an d’améliorer l’offre de soins aux patients atteints d’un
cancer, en particulier en France. Ceci tient certainement
à plusieurs points : 1) à l’absence de consensus commun
sur une technique idéale permettant la détection des
CTC, 2) à des incertitudes sur la spécicité et la sensi-
bilité des méthodes utilisées, 3) à la difculté actuelle de
développer ce domaine d’activité dans les établissements
1. Introduction
Le développement croissant des thérapies ciblées en
oncologie associé au concept de médecine personnali-
sée impose une adaptation rapide des biologistes et des
pathologistes an d’optimiser la mise en évidence de
certains biomarqueurs déjà établis ou bien de découvrir
de nouveaux biomarqueurs susceptibles d’améliorer le
diagnostic des cancers, d’apprécier le pronostic et surtout
de mieux prédire la réponse aux traitements. Au sein de
ces biomarqueurs, la mise en évidence et la caractérisation
a Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale
b Biobanque/CRB CHUN
Hôpital Pasteur
B.P. 69 – 30, avenue de la Voie-Romaine
06002 Nice cedex 01
Université de Nice Sophia
* Correspondance
[email protected]

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de soins, en particulier en France, et ceci en partie faute
de moyen, 4) au faible nombre d’études multicentriques
en France dans ce domaine. Cependant, quelques pro-
grammes hospitaliers de recherche clinique (PHRC) ou
de programmes de soutien aux techniques innovantes et
coûteuse (STIC) ont plus récemment permis d’entreprendre
dans notre pays des projets structurés dans le domaine
des CTC. Les résultats obtenus ou en cours pourraient
permettre le déploiement de certaines méthodes dans
les laboratoires d’analyse et de faire discuter à moyen
terme le remboursement de ces actes médicaux par la
sécurité sociale.
Après avoir brièvement abordé la terminologie et quelques
dénitions, nous décrivons dans cet article les données
actuelles concernant la physiopathologie des CTC, les
principales méthodes de détection des CTC en insistant
sur leurs avantages et leurs inconvénients, et les applica-
tions potentielles de ce champ d’activité dans le domaine
de l’oncologie clinique.
2. Terminologie et définitions
De nombreux biomarqueurs pouvant être isolés dans le
sang des patients atteints d’un cancer sont actuellement
à l’étude et ne rentre pas à proprement parler dans le
champ thématique des cellules tumorales circulantes. Il
s’agit en particulier de biomarqueurs identiés à partir
de l’ADN libre circulant, de l’ARN libre circulant, des
microARN plasmatiques, et des cellules endothéliales
circulantes. Le terme de « cellule tumorale circulante »
(CTC) est le plus fréquemment utilisé dans la littérature
bien que le caractère tumoral reste souvent hypothétique
à établir selon la méthode d’isolement employée, et ceci
en l’absence de marqueur spécique associé permettant
de les identier comme tel. La grande majorité des tech-
niques de détection met en fait en évidence ces cellules
épithéliales circulantes, souvent assimilées par abus de
langage à des cellules tumorales circulantes chez des
patients atteints d’un cancer. Ainsi, par exemple, lorsque
l’on utilise l’une des méthodes les plus employées pour
détecter les CTC, la méthode Cell Search, les cellules
isolées correspondent à des cellules étrangères aux
éléments gurés du sang périphérique (cellules épi-
théliales), sans que leur caractère néoplasique puisse
être afrmé [9]. Il conviendrait mieux ainsi d’appeler
ces cellules, des « cellules épithéliales circulantes ». En
effet, des cellules épithéliales non néoplasiques peuvent
circuler dans le sang et donc être détectées par beau-
coup de méthodes [9] et le caractère malin des CTC est
impossible à déterminer avec la plupart des méthodes
dites indirectes [11, 12]. Par ailleurs, le terme de cellule
métastatique circulante devrait être banni du vocabu-
laire, puisque le potentiel invasif et de dissémination
tissulaire des cellules tumorales détectées dans le sang
ne peut pas être actuellement afrmé [9]. La viabilité
des cellules tumorales circulantes est difcile à mettre
en évidence et leur potentiel prolifératif est donc quasi
impossible à apprécier. Les CTC peuvent être détectées
de façon isolée ou bien sous forme d’amas cellulaire,
appelé microembol tumoral [7, 13]. Dans ce cas là, le
terme de micro métastase sanguine n’est pas approprié
car le potentiel métastatique n’est pas connu. Ainsi, le
terme de « cellule non hématologique circulante » (CNHC)
pourrait être utilisé d’une façon plus générale pour dési-
gner toute cellule détectée dans le sang périphérique
ne correspondant pas à des éléments gurés présents
dans le sang ou dans la moelle osseuse [14]. En pratique,
un amalgame se fait pour assimiler ces « CNHC » à des
« CTC ». Nous utiliserons toutefois par simplication le
terme de CTC dans la suite de cet article.
3. Physiopathologie des cellules
tumorales circulantes :
quoi de neuf ?
La mise en évidence et la caractérisation phénotypique
et génotypique des CTC a permis de mieux comprendre
l’histoire naturelle des cancers [10, 15-17]. Certains tra-
vaux récents sur les CTC ont identifiés de nouveaux
mécanismes liés à la progression tumorale [10, 18]. Les
CTC peuvent être détectées dans la plupart des cancers
solides en phase métastatique, mais peuvent être asso-
ciées à des cancers primitifs de petite taille et avant toute
intervention chirurgicale [3, 19-23]. Ainsi, le passage dans
le sang de cellules tumorales est certainement un événe-
ment très précoce de la carcinogenèse [9]. Le passage
transendothélial des cellules tumorales et leur circula-
tion sanguine est facilité par le phénomène de transition
épithélio-mésenchymateuse (TEM) [9, 10]. Les cellules
tumorales perdent de façon plus ou moins complète leur
phénotype épithélial et acquièrent un phénotype de cel-
lule mésenchymateuse, ce qui augmente certainement
leur plasticité dans le ux sanguin. Inversement, la colo-
nisation tissulaire d’un site métastatique s’accompagne
d’un phénomène de transition mésenchymo-épithéliale,
les cellules tumorales ainsi extravasées retrouvant leur
phénotype épithélial [9, 10]. Il est possible que certaines
CTC résistent au phénomène d’anoïkis grâce à ces modi-
cations phénotypiques et aux interactions pouvant se
produire entre elles (phénomène de migration « collec-
tive ») ou bien avec les cellules sanguines, en particulier
les plaquettes [24, 25]. Ainsi des interactions cellulaires
sont tout à fait possible entre les CTC et les différents
éléments gurés du sang périphérique, soit par contact
direct, soit via une production de cytokines, soit via des
exosomes pouvant transférer entre les différentes cel-
lules. Un nouveau mécanisme impliquant les CTC a été
récemment établi : le phénomène de « tumor-self seeding ».
Ce mécanisme décrit le rôle de certaines CTC dans la
progression et/ou la récidive de la tumeur primitive grâce
une « re colonisation » du site primitif après leur circulation
sanguine [18, 26]. Les CTC peuvent en outre coloniser des
tissus et rester quiescentes pendant une longue période,
avant d’entrer à nouveau en activité, et de proliférer an de
développer une tumeur ou bien « re circuler » dans le sang.
Ces cellules dormantes (phénomène de « dormancy »)
peuvent ainsi être à l’origine d’une récidive de la maladie
cancéreuse après une période de rémission de plusieurs
années [27].

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4. Méthodes de détection des
cellules tumorales circulantes
Les méthodes permettant de détecter les CTC sont nom-
breuses [2, 4, 6, 8-10]. Elles reposent sur différentes approches
et présentent toutes un certain nombre d’avantages et d’incon-
vénients [8, 9]. Certaines de ces méthodes sont relativement
simples et peu coûteuses, alors que d’autres sont complexes
et onéreuses tant pour l’équipement nécessaire à leur mise en
œuvre, que pour les consommables utiles à leur réalisation.
Les techniques développées sont le plus souvent commer-
cialisées et largement répandues, alors qu’un certain nombre
d’entre elles sont « condentielles », non commercialisées, et
peu disponibles. La caractérisation cellulaire et moléculaire
des CTC est une étape actuellement incontournable pour
l’optimisation de ce domaine d’exploration en oncologie.
En effet, cette caractérisation doit permettre selon le cas, de
conrmer le diagnostic, de participer à l’appréciation du pro-
nostic, et enn et surtout, d’envisager
une approche théranostique [8, 9, 10,
22, 28]. Nous décrivons brièvement les
principales techniques de détection
des CTC avec leurs avantages et leurs
inconvénients.
4.1. Principes généraux
pour la détection des CTC
Il existe trois grands principes pour
la détection des CTC selon la tech-
nique employée. Le premier principe
est basé sur la capture des CTC grâce
à l’expression de certains antigènes.
Ces méthodes que l’on peut ainsi qua-
lier de façon simpliée, « méthode
immunologique » sont les plus répan-
dues et les plus nombreuses [6, 8, 9,
29]. Elles reposent sur le fait que les
CTC, éléments cellulaires étrangers au
sang périphérique, possèdent des anti-
gènes qui ne sont pas présents dans
les cellules sanguines. Le deuxième
grand principe est un isolement des
CTC par leur densité. Les techniques
ont été développées en s’appuyant
sur le fait qu’une cellule tumorale dans
le sang a une densité plus importante
que n’importe quel élément guré du
sang périphérique [6, 8, 9, 29]. Enn, le
dernier principe repose sur l’isolement
des CTC par leur taille et leur morpho-
logie [6, 8, 9, 29, 30]. Ces approches
cytomorphologiques sont basées sur
le fait que les CTC sont plus grandes
(en général) que les éléments gurés du
sang, et que les critères cytologiques
permettent de les différencier des cel-
lules sanguines. Globalement on peut
aussi séparer les techniques en deux
grandes approches, les approches
directes qui visualisent la morphologie
des CTC et les approches indirectes qui reposent sur des
réactions immunologiques ou biochimiques [9].
Après leur isolement, différentes méthodes complémentaires
peuvent être réalisées : extraction des acides nucléiques (ADN
ou ARN ou microARN) et techniques de biologie moléculaire
(PCR, RT-PCR, analyse à haut débit sur différentes puces),
analyse immunocytochimique, et hybridation in situ [10, 28,
30-36]. De façon plus exceptionnelle, des techniques per-
mettent de recueillir des CTC non xées et de les mettre en
culture, ce qui permet ainsi d’apprécier leur potentiel tumoral.
4.2. Isolement des CTC
par des méthodes « directes »
4.2.1. Méthode ISET (isolation by size of epithelial
tumor cell) (figure 1)
Cette méthode consiste à détecter les CNHC sur des cri-
tères de taille (les cellules tumorales ayant généralement
Figure 1 – La méthode ISET (isolation by size of epithelial tumor cells)
et principales étapes de la technique.
Automate « ISET » (Rarecells, Paris, France) pour détecter les cellules tumorales circulantes (A). Étape de ltration :
positionnement du bloc de ltration sur l’automate (B). Remplissage des puits de ltration par du sang mélangé à un
tampon (C). Filtration sanguine à travers le ltre (D). Désinsertion du ltre du bloc de ltration (E) (encart : étape de
rinçage du ltre avant coloration). Filtre non coloré (F). Filtre contenant 10 « spots » colorés au MGG (G).
A
D
G
E F
B C

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un diamètre supérieur à plus de 20 microns) et à les
caractériser ensuite morphologiquement [30]. Briève-
ment, 10 ml de sang total fraîchement prélevé sont
ltrés sur des ltres contenant des pores réguliers de 8
microns de diamètre. Les CNHC sont alors « trappées »
à la surface du ltre et seules les cellules du sang guré
passent à travers le ltre [30]. Les avantages de cette
technique sont donc la possibilité d’analyser après
coloration cytochimique les critères morphologiques des
cellules ainsi isolées [14, 30]. Trois grands groupes de
cellules ont été ainsi caractérisés : 1) un groupe présen-
tant des critères cytologiques de malignité (irrégularité
nucléaire, anisocytose, augmentation du rapport nucléo-
cytoplasmique, nucléoles volumi-
neux, chevauchement nucléaire
et amas tridimensionnels), 2) des
cellules cytologiquement bénignes
(ne présentant pas les critères sus
cités) et 3) des cellules dont la
malignité de peut pas être afrmée
de façon certaine sur les critères
cytologiques [11, 14]. Ainsi les cri-
tères dénis sont ceux utilisés en
cytologie conventionnelle (cytoponc-
tion d’organe profond, aspiration à
l’aiguille ne ou produit d’étalement
cytologique). Cette technique pré-
sente plusieurs avantages. Elle per-
met de caractériser sur des critères
cytologiques de malignité les cellules
tumorales circulantes [14, 30]. Des
méthodes complémentaires peuvent
être appliquées sur les cellules ainsi
isolées pour mieux les caractériser :
une analyse par immunocytochimie
ou par hybridation in situ permet
de corréler l’étude morphologique
à l’expression moléculaire permet-
tant de caractériser leur origine pri-
mitive, leur potentiel de malignité
ou la présence de certaines alté-
rations génomiques susceptibles
d’être associées à une thérapie
ciblée [28, 30, 33]. Une sélection
des cellules isolées sur les ltres,
en particulier par microdissection
par capture laser, peut permettre
une extraction d’ADN et une ana-
lyse de mutation [30]. La méthode
ISET présente toutefois un certain
nombre d’inconvénients. Le sang
doit être ltré rapidement après la
ponction veineuse (au mieux dans
les deux heures) [30]. Le diamètre
des pores peut laisser passer cer-
tainement des cellules tumorales
de petite taille, ce qui peut rendre
cette approche moins sensible que
d’autres techniques (Pantel 2008).
Cette méthode a été à ce jour utilisée
essentiellement chez des patients atteint d’un cancer
du foie, du pancréas, du poumon ou d’un mélanome
[22, 37-39] (figure 2).
4.2.2. Méthode FAST
(fiber-optic array scanning technology)
Cette méthode ne nécessite pas d’enrichissement pré-
alable pour la détection des CTC [9]. Les cellules sont
détectées à l’aide d’un scanner muni d’un laser dont
la vitesse est environ mille fois supérieure à celle d’un
microscope digital [9]. La visualisation se fait par immu-
noorescence et après analyse morphologique en utili-
sant des anticorps anti-cytokératines et un marquage
nucléaire au DAPI [40].
Figure 2 – Analyse des cellules non hématologiques circulantes (CNHC)
isolées sur les filtres par la méthode ISET.
CNHC isolée (A) (MGG x 1 200). Amas de CNHC ou microembole tumoral (B) (MGG x 1 000). CNHC avec aspect
cytologique de malignité (C). CNHC avec aspect cytologique de malignité incertaine (D). CNHC avec aspect
cytologique de bénignité (E) (C-D, MGG x 1 000). CNHC exprimant la cytokératine 19 (F) (immunoperoydase x 1 000).
CNHC experimant la vimentine (G) (immunoperoxydase x 1 000). CNHC exprimant ALK (H) (immunoperoxydase x
1 000). CNHC montrant un réarrangement du gène EML4-ALK (I) (FISH x 1 000).
A
C D E
GF
H I
B

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4.3. Isolement des CTC
par des méthodes
« indirectes »
Ces méthodes indirectes peuvent
correspondre à des méthodes
faisant intervenir des techniques
immunologiques ou moléculaires.
4.3.1. Méthode CellSearch
(figure 3)
Cette méthode est basée sur une
approche immunologique [9]. Des
ferrouides recouverts d’un anticorps
dirigé contre un antigène épithélial
(epithelial cell adhesion molecule
ou EpCam) sont dirigés contre des
CTC isolées par un enrichissement
immunomagnétique. Les cellules
sont perméabilisées, préfixées et
détectées de façon simultanée par
un uorochrome nucléaire, le DAPI,
un anticorps anti-CD45 (dirigés
contre les leucocytes) uorescent
et des anticorps uorescents dirigés
contre des cytokératines intracyto-
plasmiques (CK8, CK18, CK19) [9].
Cette technique est largement déve-
loppée à travers le monde, notam-
ment aux USA, et est approuvée par
le Food Drug Association (FDA) aux
USA dans le cadre de certaines mala-
dies métastatiques (cancers métas-
tatiques du sein, du colon et de la
prostate). Elle présente comme avan-
tages de pouvoir garder l’échantillon
à analyser à température ambiante
jusqu’à 90 heures après la ponction
veineuse, grâce à l’utilisation d’un
tampon de conservation (tampon
« Cell Save »). La quantication est
possible par l’analyse visuelle d’une
galerie d’images et le test développé
est ainsi sensible. Certains inconvé-
nients sont toutefois décrits. L’incon-
vénient majeur est de faire reposer la détection des « CTC »
sur l’expression de la molécule EpCam et des cytokéra-
tines. En effet des faux positifs et des faux négatifs sont
alors possibles. Un certain nombre de cellules épithéliales
de nature bénigne peuvent circuler [11, 12]. Ces cellules
épithéliales peuvent provenir de tumeurs bénignes ou être
plus exceptionnellement être associées à des pathologies
non tumorales (par exemple en cas de pneumothorax, un
certain nombre de cellules parenchymateuses pulmonaires
peuvent pénétrer dans le ux veineux après effraction).
Parmi les éléments gurés du sang, des cellules de la lignée
monocytaire expriment les cytokératines et peuvent être
alors comptabilisées à tord comme des CTC. À l’inverse,
compte tenu du phénomène de transition épithélio-mésen-
chymateuse, des cellules tumorales malignes peuvent ne
pas être détectées car exprimant faiblement ou n’exprimant
pas de cytokératines [9, 13, 31, 32, 33]. Enn, il existe un
problème de coût non négligeable, tant pour l’acquisition
de l’équipement que pour le fonctionnement et le dévelop-
pement en pratique hospitalière.
4.3.2. Méthodes de RT-PCR
Le principal avantage de cette technique est sa sensibi-
lité, considérée comme étant plus élevée que celle des
méthodes d’immunodétection [9]. La technique impose
les étapes suivantes : la collecte de sang périphérique,
l’enrichissement en cellules nucléées par un gradient de
densité et/ou par une technique immunomagnétique ou
immunologique, l’extraction d’ARN, la synthèse d’ADN
complémentaire, l’amplication par PCR de l’ADN com-
plémentaire, et l’analyse des produits de PCR. Une des
limites importantes de la technique est que l’ensemble des
CTC est détruit par cette méthode, ce qui ne permet plus
de les compter ou de les analyser individuellement par la
Figure 3 – La méthode Cellsearch (Veridex, LLC, USA).
Automate permettant l’isolement et la détection des cellules tumorales circulantes (Celltracks Autoprep System)
(A). Automate permettant l’analyse des cellules tumorales circulantes (Celltracks Analyzeur) (B). Galerie d’images
observées sur le Celltracks Analyzeur détectant des cellules tumorales circulantes avec un anticorps pancytokératine
(C). Galerie d’images observées sur le Celltracks Analyzeur détectant des cellules endothéliales circulantes (D).
A
C
D
B