UE13 – Parcours n°3 – Signalisation cellulaire – cours n°2 02/03/2016 Marc LOMBES [email protected] RT : CHIQUET Charlotte Marc-Anthony CHOUILLARD RL : MAFI Donia Structure/Fonction des récepteurs stéroïdiens Plan : I. La superfamille des récepteurs nucléaires A- Historique B- Mécanisme d’action des hormones stéroïdes C- Homologie des récepteurs stéroïdiens, organisation fonctionnelle D- Classification des récepteurs nucléaires : arbre phylogénétique E- Structure et domaines fonctionnels des récepteurs stéroïdiens (organisation génomique) II. Approche méthodologique A- Mise en évidence des régions cibles à la régulation hormonale B- Autres techniques III. Les récepteurs nucléaires A- Les domaines fonctionnels d’un récepteur nucléaire 1) 2) 3) Le domaine central ou DNA Binding Domain (DBD) Le domaine C-Ter ou Ligand Binding Domain, (LBD) Le domaine N-Ter (NTD) B- Les localisations subcellulaires C- Les modifications post-traductionnelles des RN 1) Phosphorylation 2) Ubiquitinylation et sumoylation 3) Acétylation, méthylation, palmitoylation IV. Régulation hormono-dépendante de la transcription A- La machinerie transcriptionnelle basale 1) La structure chromatinienne 2) Les mécanismes de régulation de la transcription B- Complexe de corégulateurs; coactivateurs, corépresseurs et régulation de la transcription 1 I. La superfamille des récepteurs nucléaires La superfamille des récepteurs nucléaires est une famille très importante car c’est la plus grande famille de facteurs de transcription chez les Eucaryotes. A- Historique A partir des années 80 a lieu la première purification des récepteurs nucléaires aux hormones stéroïdes. Le premier récepteur purifié par des techniques biochimiques classiques est le récepteur aux œstrogènes, suivi de la purification d'autres récepteurs aux hormones stéroïdiennes, notamment ceux de la progestérone et des glucocorticoïdes à partir de tissus cibles comme l’utérus pour les œstrogènes ou la progestérone et le foie pour les glucocorticoïdes. En 1985, l’avènement de la technique de clonage moléculaire a permis le clonage de l’ensemble des récepteurs nucléaires et la découverte de la super famille des récepteurs nucléaires. Le premier récepteur à avoir été cloné est celui des glucocorticoïdes, puis ceux de la progestérone, de l’œstradiol puis un peu plus tard, ceux des hormones thyroïdiennes, de la vitamine D, de l’acide rétinoïque… Enfin, des récepteurs dits orphelins ont été identifiés récemment, récepteurs pour lesquels on ne connaissait pas à l’époque le ligand naturel. Aujourd’hui on a trouvé pour certains d’entre eux, des ligands : les récepteurs PPAR sont, par exemple, activés par des dérivés lipidiques. Il existe en particulier des « vrais » récepteurs orphelins pour lesquels aucun ligand endogène n’a encore été identifié à ce jour (Nurr1). Enfin, c’est dans les années 2000 qu’on utilise pour la première fois le concept de corégulateur, suivi de leur caractérisation. B- Mécanisme d’action des hormones stéroïdes La régulation transcriptionnelle est induite par des récepteurs nucléaires. L’hormone stéroïdienne circule dans le sang, elle entre ensuite dans la cellule cible, généralement par diffusion passive. Elle interagit ensuite avec un COMPLEXE MACROMOLECULAIRE qui comporte une sous-unité capable de lier l’hormone, il s’agit du récepteur stéroïdien (SR), ainsi que plusieurs protéines partenaires. Le complexe hormone-récepteur subit des 2 modifications conformationelles : des protéines interactantes vont être libérées, ce qui va permettre au complexe hormone-récepteur de migrer dans le noyau. Les récepteurs nucléaires ont donc un tropisme et une action nucléaire. Puis, le complexe hormone-récepteur subit des modifications post-traductionnelles (phosphorylation, sumoylation…), cela va permettre au récepteur de se dimériser et d’aller interagir avec des séquences particulières de l’ADN. Il va alors recruter des partenaires moléculaires spécifiquement nucléaires appelés cofacteurs (activateurs ou répresseurs selon la situation), à l’origine du recrutement de la RNA polymérase de type II qui permet la néosynthèse des ARNm. Cela conduit à la synthèse ou à la répression de protéines spécifiques et donc au déclenchement d’effets physiologiques spécifiques. Il est important de noter qu’une hormone particulière agit sur une cellule cible particulière et va être responsable d’un effet physiologique spécifique. C- Homologie des fonctionnelle récepteurs stéroïdiens, organisation L’homologie entre les différents types de récepteurs stéroïdiens est très importante mais varie en fonction du domaine protéique du récepteur impliqué : la partie centrale de la molécule, qui est le domaine d’interaction avec l’ADN, le DBD (DNA Binding Domain), est très bien conservée (>90%). Il s’agit de la signature de ces récepteurs censés lier l’ADN. De même, le domaine C-Ter ou LBD (Ligand Binding Domain), qui est le domaine de liaison à l'hormone, a une forte homologie mais est plus divergent que le DBD. Enfin le domaine N-ter ou NTD est en revanche très divergent (<15%), avec une grande variabilité en longueur et en séquence. L’ensemble de ces récepteurs nucléaires est regroupé sous le nom de superfamille des récepteurs nucléaires et forme l’arbre phylogénétique des récepteurs nucléaires. C’est la plus grande famille de facteurs transcriptionnels chez les eucaryotes (+++). Cette superfamille est classée en 6 groupes, désignés par un chiffre. A l’intérieur de ces groupes, il existe des sousgroupes nommés par une lettre qui eux même contiennent des membres. Cette classification permet de nommer individuellement chaque récepteur (par exemple NR3C1 pour le récepteur des glucocorticoïdes). Il existe 48 membres de cette superfamille chez l’homme, 21 chez la drosophile et presque 300 chez C.Elegans. D- Classification des récepteurs nucléaires Elle peut se faire : > En fonction de leur capacité à lier un ligand naturel ou synthétique - Récepteurs endocriniens : le ligand est un lipide hormonal (dérivé du cholestérol), c’est le cas des récepteurs stéroïdiens. Ces récepteurs sont de haute affinité pour les stéroïdes (ex : récepteur à l’acide rétinoïque, aux hormones thyroïdes, à la vitamine D, aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes, aux œstrogènes…) - Récepteurs orphelins adoptés : RXR (pour le récepteur de l’acide rétinoïque), PPAR, LXR, dont les ligands sont souvent des dérivés lipidiques. Ces récepteurs sont de basse affinité pour les lipides. - Récepteurs orphelins, de type SF1, ERR (des perturbateurs endocriniens comme le bisphénol A peuvent s’y lier)… Remarque : cette classification évolue car on connaît de plus en plus de ligands capables de se lier à ces récepteurs dits, au départ, orphelins. 3 > En fonction de leur capacité à lier l’ADN - Les récepteurs stéroïdiens homodimères : ils se lient sous forme dimérique à l’ADN (récepteurs aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes, à la progestérone, aux androgènes, à l’œstrogène…) - Les hétérodimères : ils ont un monomère spécifique (comme celui à vitamine D ou de l’hormone thyroïdienne par exemple) qui va s’hétérodimériser avec un partenaire privilégié : le récepteur RXR (c’est un récepteur de l’acide 9 Cis rétinoïque), - Les récepteurs orphelins dimériques : GCNF, RXR… - Les récepteurs se liant sous forme de monomère : SF1 , ERR, ROR… E- Structure et domaines fonctionnels des récepteurs stéroïdiens Il existe 3 grands domaines fonctionnels : le domaine N-Ter qui a un rôle très important dans les fonctions de transactivation (-répression) et de corégulation ; le domaine central, qui se lie à l’ADN ; le domaine C-Ter, qui lie le ligand. Chaque domaine a des fonctions spécifiques. Les récepteurs nucléaires ont aussi une organisation génomique très conservée. Généralement, l’exon 1 est non traduit, le codon ATG d’initiation de la traduction est généralement situé au tout début de l’exon 2, celui-ci code le domaine N-ter du récepteur stéroïdien. Les 2 petits exons 3 et 4 codent la partie centrale (le DBD). Enfin, les exons 5 à 9 codent la partie C-ter (LBD). La composition des gènes des différents récepteurs stéroïdiens ont une organisation exon/intron très similaire, comme par exemple les récepteurs aux glucocorticoïdes et aux minéralocorticoïdes. Cependant, pour le récepteur des minéralocorticoïdes, en 5’, deux premiers exons ne sont pas traduits alors que pour le récepteur des glucocorticoïdes, on a surtout un exon 9 épissé de manière alternative, qui donne donc des isoformes. De même, les récepteurs aux androgènes et à la progestérone sont similaires d’un point de vue organisationnel. C’est donc l’organisation structurale des gènes des récepteurs nucléaires qui est très conservée. / !\ ATTENTION : Cependant (avec comme exemple le récepteur humain des minéralocorticoïdes) le gène peut conduire à différents isoformes de messagers et à des variants protéiques. Le gène du récepteur des minéralocorticoïdes comporte deux exons non traduits qui sont 1alpha et 1béta, générés par deux promoteurs alternatifs (P1 et P2). En fonction de l’utilisation de l’un ou l’autre promoteur, on aura l’un ou l’autre exon 1 et donc deux isoformes d’ARNm, mais comme l’exon 1 n’est pas traduit, ils conduiront à la même protéine. Il 4 existe d’autres isoformes, dépendant de mécanismes excision/épissage alternatifs qui conduisent à des variants, dont certaines parties peuvent être délétées (ex :hMRΔ5,6). Il existe enfin des variants protéiques issus de l'utilisation alternative du codon d’initiation de la traduction, qui conduit à deux protéines dont l’activité transcriptionnelle n’est pas identique. Ainsi, un même gène peut conduire à différentes isoformes d’ARNm et donc à différentes protéines aux structures et fonctions distinctes. II. Approches méthodologiques Ce chapitre doit faciliter la lecture d’articles, l’analyse de résultats… On étudie ici des techniques utilisées en endocrinologie moléculaire : le séquençage, la méthode Sanger, ChIP, PCR, RT-PCR… A- Mise en évidence des régions cibles de la régulation hormonale On cherche dans les parties 5’ flanquantes d’un gène, des séquences susceptibles d’être régulées par un type d’hormone et de récepteur. La méthode est systématique : 0- Clonage des parties régulatrices du gène, c'est à dire des parties 5'-flanquantes 1- Couplage de la partie 5'-flanquante à un gène rapporteur par substitution du gène par un gène rapporteur (luciférase +++, CAT, β-galactosidase…) 2- Création de mutants de délétion : On crée des mutants de délétion de la région 5'flanquante pour étudier la capacité des séquences flanquantes à induire l’expression du gène rapporteur dont on suit l’activité ; et on identifie une région indispensable pour l'expression du gène et sa régulation. 3- Couplage avec un promoteur hétérologue : (généralement la thymidine Kinase). Pour confirmer que la région trouvée est importante, on couple cette région avec un promoteur (et le gène rapporteur) dans une autre construction plasmidique et on regarde si ce plasmide répond ou non à une hormone particulière. 4- Études plus fines : le retard sur gel, précipitation de la chromatine (ChIP), transgenèse, … ces études permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation et d’identifier dans les séquences régulatrices le fragment d’ADN d'intérêt. B- Les autres techniques 5 - La technique d’empreintes à la DNAse ou Footprint ne se fait plus, elle permettait de déterminer les séquences d’ADN sur lesquelles se fixe un récepteur nucléaire. La DNAse coupe l’ADN. La présence d'un récepteur nucléaire va protéger l’ADN contre l’attaque de la DNAse alors que l’ADN nu est attaqué. Ainsi, en présence de facteurs de transcription, on a une protection de certaines zones, ce qui sous-entend que ce facteur de transcription peut protéger l’ADN ciblé de la digestion par les DNAses. - Le retardement sur gel est utilisé pour déterminer une interaction entre une séquence d'ADN et un récepteur nucléaire. On utilise un oligonucléotide double brin marqué au phosphore 32 qui va interagir avec un récepteur nucléaire. On fait migrer le tout sur un gel d’électrophorèse : la sonde libre migre très rapidement car sa masse moléculaire est très faible alors que la migration du complexe récepteur-sonde d’une masse moléculaire plus importante est retardée. Aujourd’hui, on pratique : - La transfection cis-trans (utilisée ++) : On utilise un modèle cellulaire dans lequel on transfecte un plasmide qui permet l’expression d’un récepteur donné, ainsi qu’un gène rapporteur qui contient un élément de réponse et un gène rapporteur (la luciférase), puis des hormones/antagoniste/antihormones ... pour étudier l’activité transactivatrice du récepteur nucléaire. On peut mesurer l’activité de l’enzyme du gène rapporteur, proportionnelle à la capacité du récepteur nucléaire à se fixer sur l’ADN, et générer ainsi des courbes dose /réponse afin de caractériser l’efficacité relative des ligands de ce récepteur nucléaire. On définit alors l’ED50, c’est-à-dire la concentration qui entraîne 50% de la transactivation maximale. 6 - La technique ChIP (= Chromatin Immunoprecipitation) permet d’identifier l’interaction potentielle d’un facteur de transcription avec l’ADN, de comprendre comment ils interagissent et où. Dans un premier temps, on réalise un couplage covalent par le formaldéhyde qui va permettre de faire un pontage covalent entre les protéines et l’ADN. Puis on fragmente l’ADN par une technique de sonication. Ensuite, on utilise un anticorps spécifique de la protéine d’intérêt et on réalise l’immunoprécipitation de la chromatine avec l’anticorps. On isole alors les morceaux d’ADN, on élue le complexe protéine/ADN, on casse les pontages covalents et on obtient de l’ADN cible que l’on peut amplifier par PCR ou séquencer par séquençage haut débit. L’ensemble des cibles de la protéine d’intérêt est alors identifié. III. Les récepteurs nucléaires Les récepteurs nucléaires sont associés à un nombre considérable de protéines partenaires dans le cytoplasme. Par exemple, les protéines de choc thermique HSP 90 ou 70 sont très largement conservées. Elles sont associées aux récepteurs des hormones stéroïdes. La HSP90 (90 kD de PM) dont il existe deux isoformes, est très importante, très conservée, très abondante, ubiquitaire, elle est phosphorylée, capable de lier l'ATP et a une fonction de chaperon moléculaire, c’est-à-dire qu’elle facilite l’activité fonctionnelle du récepteur et le protège d’une protéolyse intra cellulaire. Elle est généralement présente dans le complexe hétéro-oligomérique sous forme dimérique associée à la HSP 70. Ce complexe est fait de plusieurs types de protéines. C’est un complexe très régulé et très mobile en composition et en interaction. Il existe aussi dans ce complexe macromoléculaire des immunophilines (P59 ou CYP40), qui sont capables de lier des immunosuppresseurs (tels que la rapamycine ou la cyclosporine A) utilisés dans le traitement des rejets de greffe. Chose importante, le complexe multi-protéique macromoléculaire est très DYNAMIQUE, finement régulé. Il faut qu’il y ait absolument TOUTES les liaisons entre les protéines du complexe afin que le récepteur soit compétent à lier le ligand. Chaque interaction avec les protéines du complexe est indispensable. Ex: Si on inactive HSP90, le récepteur sera mal formé et ne pourra lier ni l'hormone, ni l'ADN. 7 A- Les domaines fonctionnels d’un récepteur nucléaire (3 distincts) 1) Le domaine central ou DNA Binding Domain, le DBD > Il est extrêmement structuré, relativement petit (entre 60 et 70 AA), très hydrophile et est composé de 2 structures en doigts de Zinc où 4 cystéines sont tétra-coordonnées autour d’un atome de Zn2+. Cela permet de rigidifier la structure. De plus, les deux structures en doigt de zinc sont perpendiculaires, ce qui permet l’interaction avec l’ADN. > On définit 2 boîtes spécifiques: - La P box en C-Ter du 1er doigt de zinc est définie par un certain nombre d’acides aminés indispensables à une interaction spécifique avec un hémi-site de la séquence d’ADN (exemple : la P box du récepteur aux glucocorticoïdes interagit avec un hémi-site sur l'ADN et reconnait la séquence AGAACA) Selon les acides aminés formant la P box, ce ne sont pas les mêmes séquences d'ADN qui seront reconnues. Importance de la sélectivité d'interaction de la P-Box - La D box en N-Ter du 2ème doigt de zinc, est un domaine de dimérisation en position latérale du domaine du DBD. Il permet à deux monomères de récepteur d’interagir l'un avec l'autre et de faire une unité fonctionnelle dimérique. Comment les récepteurs nucléaires sont capables d’interagir avec l’ADN ? On sait que les récepteurs stéroïdes sont capables de se lier de façon dimérique (homodimère principalement mais il existe aussi des hétérodimères) à des séquences d’ADN et on définit des éléments de réponse. Par exemple pour le récepteur aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes, aux androgènes, à la progestérone, ce sont deux hémi-sites palindromiques en position inverse avec une symétrie axiale, séparés par trois nucléotides et sur lesquels un premier et un deuxième monomère de ce récepteur vont être capables de se fixer. Un monomère est donc capable de lier un hémi-site et l’autre monomère, l’autre hémi-site. De plus, on sait exactement quel acide aminé du DBD du récepteur interagit avec quel nucléotide de la séquence d’ADN. /!\Une mutation dans ces domaines fonctionnels peut altérer la liaison du récepteur avec la séquence d’ADN et donc empêcher son rôle de facteur de transcription. Pour les hétérodimères RXR avec un autre récepteur nucléaire, ce sont des séquences nucléotidiques légèrement différentes : elles sont direct repeat au lieu d’inverse repeat, séparées par des nucléotides plus ou moins longs qui fixent de façon préférentielle tel ou tel hétérodimère. Les récepteurs stéroïdes sont donc capables de lier l’ADN sous forme homodimérique et hétérodimérique. 8 Le positionnement et la localisation des éléments de réponse, où se fixent les facteurs de transcription, ne sont pas fixes : ils peuvent être isolés ou multiples, proximaux ou distaux par rapport au site d’initiation de la transcription du gène correspondant. Souvent, on retrouve des éléments associés dans lesquels il y a une multiplicité d’éléments de réponse qui permettent de potentialiser la réponse transcriptionnelle d’un gène par rapport à un récepteur donné. Ces éléments peuvent être, là encore, très proximaux ou très distaux, groupés ou non, parfois ils sont même complètement dissociés et peuvent même se trouver en intra-génique et non dans les parties classiques de régulation type 5’ flanquante. Ainsi, la plupart des sites de liaison ne sont pas situés dans une partie proche du site d’initiation de la transcription puisque la majorité d’entre eux sont situés à plus de 10kb de part et d’autre du site d’initiation de la transcription. Certains peuvent même se trouver jusqu’à 2000 kb très en amont ou très en aval. Ainsi, les éléments de réponse ne sont pas forcément situés à proximité immédiate des sites d'initiation de la transcription des gènes. Certaines régulations ne font pas intervenir une interaction directe entre le facteur de transcription et l’ADN mais des mécanismes d’interaction indirecte par liaison du facteur de transcription sur d'autres facteurs de transcription. Par exemple pour le récepteur des minéralocorticoïdes, on a identifié des facteurs de transcription comme FOX, AP1, PAX1 qui indiquent que le récepteur interagit de manière indirecte avec l’ADN. 2) Le domaine C-Ter, ou Ligand Binding Domain, le LBD Ce domaine est beaucoup plus grand que le DBD, il fait à peu près 250 acides aminés. A l’inverse du DBD qui est très hydrophile, ce domaine est très hydrophobe car la plupart des ligands des récepteurs nucléaires sont des dérivés lipidiques très hydrophobes. Ce domaine peut être étudié par des techniques biochimiques classiques, on peut ainsi déterminer les constantes d’affinité, les vitesses de dissociation et d’association de ce domaine avec le ligand. D’un point de vue structurel, le LBD est formé: > Sans hormone, le LBD est une poche hydrophobe constituée de 11 à 12 hélices alpha (H1 à H12) et de deux feuillets beta anti-parallèles. Le fond de la poche est tapissé par ces deux feuillets béta antiparallèles où se positionnera le ligand du récepteur. L’hélice H12 est en position latérale. > Avec hormone, il y a un changement majeur : une compaction +++ de la poche hydrophobe, et l’hélice H12 précédemment latérale, se repositionne en position centrale pour fermer la poche hydrophobe. Cela créé une interface AF2 qui va permettre de créer une interface de liaison avec des cofacteurs. > Quand le ligand est antagoniste il existe un repositionnement antagoniste de l’hélice H12. Elle est en position intermédiaire, entre la position latérale et centrale, ce qui n’est pas compatible avec une interaction fonctionnelle appropriée avec les cofacteurs. 9 Remarque : Quand le ligand est dans la poche hydrophobe, on peut déterminer les interactions spécifiques entre les groupements réactifs du ligand et les AA du récepteur. Ces informations sont obtenues par cristallographie/ modélisation et peuvent permettre de développer de nouveaux ligands avec encore d'avantage de spécificité et d’affinité (drug design). 3) Le domaine N-ter, ou NTD ou domaine « immunologique » Il est plus divergent en structure primaire et en longueur par rapport aux autres domaines, il est en effet très grand et très mal structuré. Il est aussi beaucoup moins étudié, aucune cristallisation de ce domaine n’a été réalisée jusqu’à présent. Il était appelé « immunologique » car, lorsque l’on purifiait les récepteurs lors des études, la plupart des anticorps étaient dirigés contre cette partie, plus longue et plus hydrophile donc plus susceptible de déclencher une réponse immunitaire. Il joue néanmoins un rôle très important (+++) car il contient des fonctions de transactivation bien caractérisées via les domaines d’activation fonctionnelle (AF). Il en existe deux grands types : - AF1 (Activation Function) en N-Ter, constitutivement actif, il interagit avec des corégulateurs, il est peu structuré et est indépendant de la présence du ligand, - AF2 en C-Ter, activé uniquement quand le ligand se lie au récepteur, cela entraîne une modification conformationnelle majeure et définit ce domaine AF2. Il interagit avec des corégulateurs qui présentent un motif LXXLL et qui forment une petite hélice. AF2 est très structuré et est en rapport avec le repositionnement des hélices alpha du LBD. Remarque : Le domaine Hinge ou domaine charnière sépare le DBD du LBD et permet une flexibilité entre ces deux domaines. B- Les localisations subcellulaires On peut facilement mettre en évidence des mouvements de redistribution nucléocytoplasmiques à l’aide de protéines chimériques fluorescentes. Par exemple, avec un réceptur chimérique associée à la GFP au temps 0 il n’y a pas de marquage dans le noyau. Après traitement par l’hormone, on peut alors voir au temps t une translocation nucléaire du RN. /!\ Certains RS en l’absence d’hormone sont déjà dans le compartiment nucléaire. Pour d’autres, la présence de l’hormone est indispensable au transfert du RN du cytoplasme vers le noyau. La translocation du cytoplasme vers le noyau (import) est régulée par la présence de signaux de localisation nucléaire, ou NLS dont il existe deux grands types, NLS1 et NLS2, aux fonctions et aux activités différentes. 10 - NLS1 dans le DBD est constitutif (il n'a pas besoin d'hormone pour être actif, contrairement au NLS2) et dont l’activité est prépondérante par rapport à NLS2 dans les RS à localisation nucléaire - NLS2 se situe en C-ter (dans le LBD) et nécessite la présence de l’hormone pour s’activer. La translocation du noyau vers le cytoplasme (export) se fait sous l’action de NES (Nuclear Export signal). Ces RS et RN subissent une navette nucléocytoplasmique permanente. En fonction de l’environnement et des stimuli extérieurs, cette localisation se voit modifiée. L’import est énergie dépendant et nécessite de l’ATP. L’export en revanche est un mécanisme énergie indépendant. Il existe des inhibiteurs spécifiques de ces mécanismes. C- Les modifications post-traductionnelles des RN Après néo-synthèse des protéines, comment sont modifiées l’activité ou la localisation des RN ? 1) Phosphorylation Il existe au moins 3 niveaux de phosphorylation : Phosphorylation basale : 1er niveau de phosphorylation. Elle a lieu la plupart du temps sur des résidus Sérine ou Thréonine. Phosphorylation ligand dépendant : 2ème niveau de phosphorylation. Quand le récepteur lie le ligand, il voit sa conformation se modifier. Ceci est finement régulé par des kinases pour la phosphorylation sur des résidus particuliers ou des phosphatases pour la déphosphorylation Phosphorylation ADN dépendant : 3ème niveau de phosphorylation. Le récepteur se dimérise et interagit avec l’ADN. L’activation RS conduit à 3 grands états de phosphorylation. Ces derniers conditionnent les propriétés fonctionnelles de ces récepteurs. L’hyper phosphorylation des récepteurs conduit (en général) à une forme hyperactive du récepteur. Dans les cellules cancéreuses par exemple, certains facteurs de croissance peuvent modifier l’état de phosphorylation du FT, indépendamment du ligand et ainsi d’activer la transcription. La transcription dépend de l’état de phosphorylation du récepteur et peut se faire INDEPENDAMMENT de la présence du ligand (dans certaines situations physiopathologiques). 2) Ubiquitinylation et Sumoylation L’ubiquitinylation et la sumoylation sont des processus de conjugaison très comparables qui consistent en un greffage covalent sur les protéines cibles de groupement ubiquitine ou Sumo. Les différentes étapes de ces modifications post-traductionnelles sont très proches et sont constituées d’une étape de maturation du groupement suivie d’une hydrolyse puis de leur conjugaison, trois étapes catalysées par des enzymes E1, E2 et E3 ; ces enzymes catalysent respectivement les étapes activation, de conjugaison et enfin de ligation. La différence entre ces 2 modifications post-traductionnelles tient du fait que l’ubiquitinylation est un processus irréversible, au contraire de la sumoylation. Remarque : L’ubiquitine et les groupements SUMO n’ont pas d’homologie de séquence primaire, mais des structures tridimensionnelles comparables (SUMO a une extension n-ter) 11 => L’ubiquitinylation correspond à un greffage covalent de groupements ubiquitine sur la lysine d’une protéine cible. Elle correspond en un signal conduisant la protéine ubiquitinylée vers le protéasome. Il y a alors dégradation de la protéine cible et recyclage possible des groupements ubiquitine et de certains AA. Ce processus est énergie dépendant et est irréversible. Il existe d’autre part des inhibiteurs spécifiques de ce processus (MG132, epoxomycine). => La sumoylation est le greffage covalent d’un groupe SUMO (Small Ubiquitin-like related Modifier), dont il existe 3 types différents (Sumo 1, 2 et 3). Ce greffage se fait préférentiellement sur le site consensus de sumoylation : YKXE où la Lysine K est la cible privilégiée. 30% des protéines cellulaires sont soumises à ce mécanisme et se sont essentiellement des protéines à tropisme nucléaire (FT et RN). Ce processus est réversible. Globalement, une protéine sumoylée est moins efficace et moins active. Ces modifications post traductionnelles par sumoylation ont différentes conséquences fonctionnelles : - La modification du trafic nucléo cytoplasmique - Impact sur la structure chromatinienne et la dynamique nucléaire (histones...) - La compétition avec d’autres modifications post traductionnelles (ubiquitinylation, sumoylation et acétylation) - La régulation de la transcription Elles permettent globalement le contrôle des interactions protéines/protéines et conduisent à inhiber la transcription. Une protéine hyper-sumoylée est (en général) hypo-active. 3) Acétylation, méthylation, palmitoylation… (Ne sont pas détaillées en cours) IV. Régulation hormono-dépendante de la transcription A- La machinerie transcriptionnelle basale 1) La structure chromatinienne Le nucléosome est un enroulement de 2,5 tours d’ADN autour d’un octamère d’histones : 2 H2A, 2 H2B, 2 H3, 2 H4 et une histone H1 verrouillant le tout. Les queues des histones sont soumises à des modifications post-traductionnelles (acétylation) permettant de rendre la séquence d’ADN plus ou moins disponible aux facteurs de transcription. 2) Les mécanismes de régulation de la transcription +++ > La régulation de la transcription se fait par 4 grands mécanismes : 1- Remodelage chromatinien : Méthylation, acétylation, désacétylation, réorganisation des nucléosomes 2- Eléments régulateurs en cis : promoteurs, enhancers, MAR, insulateurs 3- Eléments régulateurs en trans : les facteurs de transcription 4- Machinerie transcriptionnelle basale > Les étapes de l’assemblage du complexe de pré initiation de la transcription : - TFIID est un complexe multi-protéique avec un positionnement particulier sur un gène qui se compose de : • TATA box Binding protein (TBP) se fixant sur la boite TATA du gène • TAF (TATA binding protein Associated Factors) nommées selon leur PM 12 - Cela conduit au complexe d’initiation de la transcription qui se compose de : TFIID + association progressive d’autres FT + RNA polymérase de type II (permet la néosynthèse d’ARN messagers). Ce complexe est une cible très importante de l’action des récepteurs nucléaires. Cet assemblage est séquentiel, dynamique, combinatoire et spécifique d’une cellule. Régulation de la transcription par les hormones stéroïdes : Agoniste : Sur le gène il existe un élément de réponse hormonal sur lequel se lie un dimère de récepteurs associé à un agoniste. Après cette interaction, le RS permet le recrutement de coactivateurs (tels que SRC1) par l’intermédiaire du motif AF2 en C-ter (sur l’hélice H12) du RS et du motif LXXLL du coactivateur. Le Coactivateur sert de plateforme sur laquelle est alors recruter des Co-intégrateurs (tels que P/Caf, CBP/p300) doués de propriétés enzymatiques d’histone acétylase. Cela permet une acétylation des queues des histones qui induit un repositionnement des nucléosomes et une décompaction de la chromatine. Cette décompaction permet de façon dynamique et contrôlée le recrutement, de manière directe ou indirecte (interaction protéine/protéine), de la machinerie transcriptionnelle ce qui conduit à une activation de la transcription du gène et son initiation. Antagoniste : Quand il se fixe au récepteur, le dimère adopte une conformation dite « antagoniste », le positionnement de l’hélice H12 n’est pas compatible donc le recrutement des coactivateurs mais à l’inverse cette conformation facilite le recrutement de corépresseurs qui eux même recrutent des protéines histone désacétylases (HDAC) qui désacétylent les histones et entraînent une compaction de la chromatine. Ceci empêche le recrutement de la machinerie transcriptionnelle de base et donc une répression de la transcription. On a donc une relation très importante entre la compaction de la chromatine, l’acétylation des histones et l’activation de la transcription. 13 B- Complexe de corégulateurs: coactivateurs, corépresseur et régulation de la transcription Beaucoup de protéines contrôlent l’activation ou la répression de la transcription grâce à leur interaction avec les RN. Les RN jouent donc un rôle central car ils peuvent interagir en fonction du contexte cellulaire avec un nombre considérable de protéines qui peuvent réguler la transcription. Les coactivateurs (nombre > 100) les plus connus font partie de la famille des P160 (car leur PM > 160 kD, approximativement 1500 AA) et ce sont les SRC1/2/3). Ils contiennent des NR boxes (nuclear receptor box) avec le motif LXXLL (Lys-X-X-Lys-Lys) qui interagissent directement avec le domaine AF2 des parties C-ter des RN et par cette interaction ils permettent le recrutement de co-intégrateurs et ainsi entrainer la décompaction de la chromatine. Les corépresseurs sont des protéines encore plus grandes de plus de 2500 AA (N-coR et SMRT), et ne présentent pas dans leurs structures de motifs LXXLL, mais des motifs équivalents très hydrophobes qui pourraient interagir avec AF2. Ils sont impliqués dans des mécanismes de désacétylation des histones et de compaction de la chromatine, en se fixant de la même manière sur le domaine C-ter des RN. > On constate que le positionnement du RN et le recrutement de ses partenaires moléculaires se fait de façon cyclique = horloge transcriptionnelle. Le RN se positionne sur le promoteur ou l’élément de réponse ce qui conduit au recrutement du complexe d’initiation de la transcription On a ensuite le décrochage de ce complexe et le complexe arrive de nouveau, se redécroche et arrive, se redécroche et ainsi de suite. Tout ceci est nécessaire à une transcription optimale ; S’il n’y a pas cette cyclicité de recrutement de ces complexes alors il n’y a pas de transcription. > Une autre notion très importante est celle de dégradation par le protéasome : cette cyclicité de cette horloge transcriptionnelle dépend étroitement de l’activité du protéasome. Quand on inhibe la dégradation de certains facteurs par des inhibiteurs du protéasome on bloque totalement la régulation de la transcription. 14 POINTS IMPORTANTS Les RN sont au centre de la régulation de la transcription. Il existe également des modifications post traductionnelle qui modifient leur fonctionnalité. Ces RN n’agissent jamais seuls, il existe un environnement cellulaire spécifique d’un tissu à l’autre, d’autres voies de signalisation peuvent modifier cet environnement comme par exemple le taux d’AMPC et modifier les cascades de phosphorylation ou déphosphorylation qui conditionnent l’action de ces récepteurs. Dans ces situations, la notion de dialogue croisé entre plusieurs voies de signalisation prend tout son sens. Cette diversité et la complexité du mécanisme d’action des récepteurs nucléaires existent à différents niveaux : > Celui du Ligand qui peut être agoniste, antagoniste, agoniste partiel, orphelins, modulateurs sélectifs (exemple du tamoxifène, utilisé dans le cancer du sein, qui est un antagoniste des récepteurs aux œstrogènes au niveau mammaire mais qui est un agoniste partiel au niveau endométrial et qui conduit à une hypertrophie de l’utérus). > Celui du Tissu cible : Puisque l’on a : - Une expression tissu-spécifique du RN et des cofacteurs, - Des enzymes qui peuvent être activateurs ou inhibiteurs selon les tissus - Des protéines de liaison (plasmatique ou intracellulaire) > Celui du Récepteur : - Dans leur localisation subcellulaire ils peuvent être cytoplasmique ou nucléaire - Isoformes quand ils viennent d’un même gène ou des isotypes quand ils proviennent de gènes distincts (exemple : R-alpha ou béta des œstrogènes) ou des variants protéiques - Ces récepteurs peuvent de dimériser ou s’homo/ hétérodimériser - Ils subissent de multiples MPT > Celui des Eléments de réponse qui peuvent différer selon : - Qu’ils soient consensus vs non-consensus - Qu’ils soient simple, complexe, négatif - Leur nombre de copie, leur positionnement, leur proximité d’autres éléments de réponse - Leur coopérativité, interaction avec d’autres FT > Celui de l’Activité transcriptionnelle qui dépend de : - La transactivation ou transrépression - L’activité promoteur-spécifique, cellule-spécifique, avec des aspects cinétique (cyclicité) - Cross-talk (dialogue croisé) avec la phosphorylation L’Intérêt de la compréhension de RN est multiple : - Fait appel à des mécanismes fondamentaux comme l’étude structure fonction et l’étude de grands mécanismes moléculaires - Clinique : Les mutations (gain ou perte de fonction) de ces récepteurs peuvent être comprises et détectées grâce à cette bonne compréhension des RN - Implications physiopathologiques (cancer, développement ...) : Ils sont responsables de régulations fines de grandes fonctions biologiques et moléculaires. - Thérapeutique : Avec la découverte et la modélisation de nouveaux ligands agonistes ou antagonistes spécifiques qui sont de nouveaux outils thérapeutiques qui permettent de réguler les dysfonctions ou hyperfonction relayées par ces RN. Cette pharmacopée est très importante pour le contrôle des processus pathologiques. 15 FICHE RECAPITULATIVE La superfamille des récepteurs nucléaires (RN) est une famille très importante car c’est la plus grande famille de facteurs de transcription chez les Eucaryotes. Elle a été découverte vers 1985 grâce à la technique de clonage moléculaire. Mécanisme d'action des récepteurs nucléaires La régulation transcriptionnelle est induite par des récepteurs nucléaires. -Entrée de l'hormone stéroïdienne dans une cellule cible -Interaction un complexe macro-moléculaire comportant une sous unité capable de lier l'hormone : le récepteur stéroïdien, ainsi qu'avec plusieurs protéines partenaires. -Migration du complexe hormone récepteur dans le noyau (par modif conformationnelles) -Modification post-traductionnelles du complexe hormone-récepteur -Dimérisation du récepteur interaction avec des séquences spé de l'ADN + recrutement de cofacteurs -Recrutement le RNA polymérase synthèse ARNm synthèse ou répression de protéines spé effets physio spé Les RN sont associés à un nombre considérable de protéines partenaires dans le cytoplasme (ex: prot de choc thermique HSP90 - 70, immunophilines P59 ou CYP40) /!\ Le complexe multi-protéique macromoléculaire est très DYNAMIQUE, finement régulé. Il faut qu’il y ait absolument TOUTES les liaisons entre les protéines du complexe afin que le récepteur soit compétent. Chaque interaction avec les protéines du complexe est indispensable. Homologie des RN et organisation fonctionnelle Homologie impt ++ entre les différents type de récepteurs stéroïdiens - domaine d’interaction avec l’ADN = DBD (DNA Binding Domain), partie centrale: très bien conservé (>90%). Marque de fabrique des récepteurs liant l'ADN. - domaine C-Ter= domaine de liaison à l'hormone = LBD (Ligand Binding Domain): bien conservé mais + divergent que le DBD. - domaine N-ter = NTD: très divergent (<15% d'homologie), grande variabilité en longueur et en séquence. Organisation génomique des RN très conservée : en général l’exon 1 est non traduit et le codon ATG d’initiation de la traduction est situé au début de l’exon 2, et code le domaine N-ter du récepteur stéroïdien. Les 2 petits exons 3 et 4 codent la partie centrale (le DBD) et les exons 5 à 9 codent la partie C-ter (LBD). / !\ Le gène d'un RN peut conduire à différents isoformes de messagers et à des variants protéiques (mécanismes: promoteurs alternatifs, utilisation alternative du codon d'initiation de la traduction, excision/épissage alternatifs) Classification des RN > En fonction de leur capacité à lier un ligand naturel ou synthétique - Récepteurs endocriniens : le ligand est un lipide hormonal (dérivé du cholestérol), Haute affinité pour les stéroïdes (ex : R de l’acide rétinoïque, aux hormones thyroïdes, à la vitamine D, aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes, aux œstrogènes…) - Récepteurs orphelins adoptés : RXR (R de l’acide rétinoïque), PPAR, LXR, dont les ligands sont souvent des dérivés lipidiques. Basse affinité pour les lipides. - Récepteurs orphelins = récepteur dont on ne connait pas le ligand naturel de type SF1, ERR > En fonction de leur capacité à lier l’ADN 16 - Les récepteurs stéroïdiens homodimères : ils se lient sous forme dimérique à l’ADN (R aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes, à la progestérone etc - Les hétérodimères : un monomère spécifique (ex: celui à la vit D ou de l’hormone thyroïdienne) va s’hétérodimériser avec un partenaire privilégié : le récepteur RXR. - Les récepteurs orphelins dimériques : GCNF, RXR… - Les récepteurs se liant sous forme de monomère : SF1 , ERR, ROR… Approche méthodologique >Mise en évidence de la région cible de la régulation hormonale: on cherche dans les parties 5’ flanquantes du gêne, des séquences susceptibles d’être régulées par un type d’hormone et de récepteur. 0- Clonage des parties régulatrices du gène= parties 5'-flanquantes 1- Couplage de la partie 5'-flanquante à un gène (luciférase+++) 2- Création de mutants de délétion : délétion de la région 5'-flanquante pour étudier la capacité des séquences flanquantes à induire l’expression du gène rapporteur dont on suit l’activité . 3- Couplage avec un promoteur hétérologue : (généralement la thymidine Kinase). Pour confirmer que la région trouvée est importante, on couple cette région avec un promoteur (et le gène rapporteur) dans une autre construction plasmidique et on regarde si ce plasmide répond ou non à une hormone particulière. 4- Études plus fines : le retard sur gel, précipitation de la chromatine (ChIP), transgenèse, … >Autres techniques -Technique d’empreintes à la DNAse ou Footprint (abandonnée aujd): permet de déterminer les séquences d’ADN sur lesquelles se fixe un récepteur nucléaire en repérant les zones protégées de la digestion contre la DNAse. - Retardement sur gel: permet de déterminer une interaction entre une séquence d'ADN et un récepteur nucléaire. Oligonucléotide double brin marqué au phosphore 32 interagit interagir avec un récepteur nucléaire. Migration sur gel d’électrophorèse retardée lorsqu’elle interagit avec le récepteur. - Transfection cis-trans (utilisée ++) : Plasmide exprimant un récepteur donné + un gène rapporteur (luciférase) +/- hormones. Etude de l’activité transactivatrice du RN en mesurant l’activité de l’enzyme du gène rapporteur, proportionnelle à la capacité du RN à se fixer sur l’ADN. - Technique ChIP (= Chromatin Immunoprecipitation) permet d’identifier l’interaction potentielle d’un facteur de transcription avec l’ADN, de comprendre comment ils interagissent et où. -fixation covalente par le formaldéhyde pontage covalent entre protéines d’intérêt et l’ADN. -fragmentation de l’ADN par sonication. -utilisation d'un anticorps spécifique de la protéine d’intérêt -immunoprécipitation de la chromatine avec l’anticorps. -élution du complexe protéine/ADN, on casse les pontages covalents et on obtient de l’ADN cible que l’on peut amplifier par PCR ou séquencer par séquençage haut débit. Les domaines fonctionnels d'un RN >Domaine DBD Très extrêmement structuré: composé de 2 structures en doigts de Zinc où 4 cystéines sont tétra-coordonnées autours d’un atome de Zn2+. Doigt de zinc perpendiculaires interaction avec l’ADN. On définit 2 boîtes spécifiques: 17 - La P box en C-Ter du 1er doigt de zinc est définie par un certain nb d'AA indispensables à une interaction spécifique avec un hémi-site de la séquence d’ADN. Importance de la sélectivité d'interaction de la P box. - La D box en N-Ter du 2ème doigt de zinc, est un domaine de dimérisation en position latérale du domaine du DBD. Interaction de 2 monomères unité fonctionnelle dimérique. Les RN se lient de façon dimérique (homodimères ou hétérodimères) à des séquences d’ADN en se fixant à des éléments de réponses. Ceux si sont isolés ou multiples, proximaux ou distaux par rapport au site d’initiation de la transcription du gène sur lequel ils agissent. /!\ Les éléments de réponse ne sont pas forcément situés à proximité immédiate des sites d'initiation de la transcription. Il existe des mécanismes de régulation par des interactions directes entre le facteur de transcription et l’ADN mais aussi des mécanismes d’interaction indirecte par liaison du facteur de transcription sur d'autres facteurs de transcription. >Domaine C-ter: LBD Bcp + grand que le DBD, très hydrophobe car la plupart des ligands des RN sont des dérivés lipidiques. > Sans hormone: LBD = poche hydrophobe constituée de 12 hélices alpha (H1 à H12) +2 feuillets beta anti-//dont le fond est tapissé par les feuillets beta où se positionne le ligand. H12 est en position latérale. > Avec hormone: compaction +++ de la poche hydrophobe et l'hélice H12 devient centrale création interface AF2 = interface de liaison avec des cofacteurs. >Ligand antagoniste: H12 en position intermédiaire pas compatible avec 1 interaction fonctionnelle appropriée avec les cofacteurs. >Domaine N-ter + divergent, très grand, très mal structuré, - étudié. Autrefois appelé domaine immuno car bcp d'Ac dirigés contre cette partie. Rôle très important (+++) car il contient des fonctions de transactivation bien caractérisées via les domaines d’activation fonctionnelle (AF). Il en existe deux grands types : - AF1 en N-Ter : constitutif car ligand indépendant. Interaction avec des corégulateurs. Peu structuré. -AF2 en C-Ter: activé uniquement par liaison ligand-récepteur. Très structuré, du au repositionnement de H12 du LBD. Interaction avec des corégulateurs qui présentent un motif LXXLL. Localisation subcellulaires /!\ Certains RN sont déjà dans le compartiment nucléaire en l’absence d’hormone.7Pour d’autres, la présence de l’hormone est indispensable au transfert du RN du cytoplasme vers le noyau. -translocation cyto noyau (import): régulée par les NLS (signaux de localisation nucléaire): NLS1(constitutif) et NLS2(activation hormono-dépendante). Processus ATP dépendant. -translocation noyau cyto (export): sous l'action de NES (Nuclear export signal). RN font en permanence la navette nucléo-cytoplasmique. Localisation sous influence de stimuli extérieurs. Les modifications post-traductionnelle des RN >Phosphorylation: 3 niveaux de phospho: basale/ ligand dépendant/ ADN dépendant Conditionne propriétés fonctionnelles des RN 1 hyper phosphorylation conduit (en général) à une forme hyperactive du récepteur. /!\ Cellules cancéreuses: certains facteurs de croissance peuvent modifier l’état de phosphorylation du FT, indépendamment du ligand et ainsi d’activer la TRANSCRIPTION. 18 >Ubiquitinylation et sumoylation : greffage sur les protéines cibles de groupement ubiquitine ou Sumo. Processus de conjugaison très comparables mais : -ubiquitinylation; protéine ubiquitinylée est adressée au protéasome où elle sera dégradée. Processus énergie dépendant et IRREVERSIBLE. -sumoylation: greffage d'un groupe SUMO sur le site consensus YKXE: lysine K=cible privilégiée. Processus REVERSIBLE. Une protéine hyper-sumoylée est (en général) hypoactive. Nombreuses conséquences fonctionnelles : modif trafic nucléocyto/ impact sur structure chromatinienne + dynamique nucléaire/ impact sur régulation de la transcription Régulation hormono dépendante de la transcription >La machinerie transcpritonnelle basale -Nucléosome = enroulement 2,5 tours d’ADN autours d’un octamère d’histones. Queues d'histone soumises à des modif post trad (acétylation) modifiant l'accessibilité de l'ADN aux FT. -4 grands mécanismes de régulation de la transcription. 1- Remodelage chromatinien : Méthylation, acétylation, désacétylation, réorganisation des nucléosomes 2- Eléments régulateurs en cis : promoteurs, enhancers, MAR, insulateurs 3- Eléments régulateurs en trans : les facteurs de transcription 4- Machinerie transcriptionnelle basale -Complexe d'initiation de la transcpription = PIC, composé de: TFIID = TBP (TATA box Binding Protein) + TAF (TATA binding protein Associated Factors) Facteurs de transcription RNA polymérase de type II Cet assemblage est séquentiel, dynamique, combinatoire et spécifique d’une cellule. >Régulation de la transcription par les hormones stéroîdes -Agoniste: RN associé à un agoniste se lie à un élément de réponse hormonal situé sur le gène. Interaction recrutement de coactivateur (famille P160) via le motif AF2 du RN (Cter) et motif LXXLL du coactivateur, qui recrutent à son tour des cointégrateurs ayant des prop d'acétylation. Acétylation queues d'histone repositionnement du nucléosome + décompaction de la chromatine Recrutement (direct ou indirect) de la machinerie transcptionnelle iniatiation de la transcription. -Antagoniste: RN associé à un antagoniste adopte une position "antagoniste": position de l'hélice H12 recrutement coréprésseurs (Ncor, SMRT) recrutement des HDAC (protéines histone désacétylase) Désacétylation des histones compaction de la chromatine recrutement machinerie transcriptionnelle IMPOSSIBLE répression de la transcription. /!\ Positionnement du RN + recrutement des ses partenaires se fait de façon cyclique= HORLOGE TRANSCRIPTIONNELLE. RN se positionne sur le promoteur ou l'élément de réponse recrutement du complexe d'initiation de la transcription. RN se détache puis se repositionne ainsi de suite. Cette cyclicité est liée à la dégradation par le protéasome. Les inhibiteurs du protéasome bloquent la régulation de la transcription. Absence de cyclicité PAS de transcription. 19