la resistance du biofilm au peroxyde d`hydrogene

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LA RESISTANCE DU BIOFILM
AU PEROXYDE D’HYDROGENE
De nombreux produits chimiques sont utilisés quotidiennement en industrie
agroalimentaire: produits de nettoyage, désinfectants, savons antimicrobiens, antiseptiques,
antibiotiques, etc. Cependant qu’en est-il de l’usage de ces biocides sur la résistance des
bactéries ? Cette préoccupation s’est fortement amplifiée ces dernières années due au nombre
croissant de souches résistantes mais aussi à leur capacité à survivre en industrie alimentaire.1
En effet, il a été démontré que les bactéries sont capables de résister aux biocides lorsqu’elles
vivent dans un biofilm.2
La résistance des bactéries
La résistance bactérienne aux biocides est étudiée depuis les années 1950.3 La capacité
des microorganismes à s'adapter de façon très rapide à leur environnement, en développant
une résistance aux éléments extérieurs agressifs, est aujourd'hui bien connue. Les bactéries
deviennent de plus en plus résistantes face aux biocides qui ne détruisent que partiellement la
flore bactérienne.4 En effet, dans une étude récente5, il a été démontré que certains biocides
sont inefficaces contre les bactéries d’un biofilm bien qu’efficaces contre la même population
de bactéries sous forme planctonique.
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en#développant#des#mécanismes#de#défense#très#efficaces,#dont#le#biofilm.#Le#biofilm#
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La flore bactérienne a mis en place différents mécanismes de défense contre les biocides:6
1. La réduction de la perméabilité membranaire : La bactérie empêche l’entrée du
biocide en modifiant la perméabilité de sa membrane cytoplasmique. La modification
de la perméabilité limite la quantité de biocides dans la cellule, ce qui diminue la
concentration effective du biocide. Le biocide devient alors inefficace car la dose
létale n’est pas atteinte.
2. L’efflux des biocides : La bactérie utilise des pompes à efflux ayant le pouvoir
d’expulser certaines substances actives. La pompe à efflux est une pompe localisée
dans la membrane cytoplasmique qui va empêcher le biocide d’atteindre sa cible en
effectuant son efflux actif hors de la bactérie. Le biocide n’accède alors plus à la cible
en quantité suffisante pour détruire la bactérie.
3. La transformation enzymatique des biocides : La bactérie produit de nouvelles
enzymes capables d’inactiver le biocide (comme par exemple la catalase qui dégrade
le peroxyde d’hydrogène). Le biocide devient alors inactif.
4. La mutation de la cible du biocide : Chaque biocide agit en ciblant une partie précise
de la cellule : paroi, ribosome... La présence d'une modification consécutive à une
mutation modifie le site de fixation et empêche ainsi la liaison du biocide. Le biocide
devient alors inutile.
En complément de ces quatre mécanismes de défense, il existe un autre mécanisme de
défense très efficace appelé biofilm, qui lui en plus de pouvoir concentrer tous les
mécanismes de résistance décrits jusqu’à présent présente la caractéristique suivante , à savoir
que les bactéries se protègent grâce à une couche de polysaccharides qu’elles secrètent et se
développent sous forme de colonies.
Le biofilm
La couche de polysaccharides qui entoure les bactéries d’un biofilm est très difficile à
détruire, voir impossible, avec les moyens classiques de désinfection.7 Cependant, les biofilms
représentent le mode de vie majoritaire des microorganismes.8 En effet, 1.000 à 10.000 fois
plus de bactéries grandissent dans un biofilm plutôt que comme cellules planctoniques.9 Le
biofilm bactérien peut être 1.000 fois plus résistant aux biocides que les cellules
planctoniques.10 Cela est surtout du à la matrice d’exopolymères qui entoure les bactéries du
biofilm.11
Vu la difficulté d’éliminer complètement le biofilm, très peu de laboratoires effectuent des
tests pour évaluer l’efficacité des biocides sur son élimination. Il n’y a actuellement pas de
standards européens pour les tests des désinfectants contre les biofilms en agroalimentaire.12
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Cependant les quelques tests réalisés montrent des taux de résistance aux désinfectants et aux
antibiotiques alarmants. La matrice du biofilm est vue comme une barrière à la diffusion.13
Photo : Les 5 étapes du développement d'un biofilm sur une surface dure; attachement initial, attachement
irréversible, apparition et « maturation I » du biofilm, maturation II, érosion et dispersion/Détachement
autogène. Les photomicrographies (toutes à même échelle) sont celles d'un biofilm de Pseudomonas aeruginosa
en développement.
La résistance des biofilms au peroxyde d’hydrogène
Plusieurs études (Journal of Bacteriology14, Applied and Environmental
Microbiology15 et Journal of Hospital Infection16) ont démontré que le biofilm pouvait résister
au peroxyde d’hydrogène. L’étude publiée dans Applied and Environmental Microbiology17 a
analysé le rôle de deux catalases dans la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans la protection
des cellules du biofilm contre le peroxyde d’hydrogène. En effet, en présence du peroxyde
d’hydrogène, les bactéries libèrent deux enzymes : KatA et KatB qui ont comme rôle de
neutraliser ce biocide. Cette étude a été réalisée après une heure d’exposition à une dose
continue de 50mM de peroxyde d’hydrogène et a montré que l’intégrité du biofilm reste
largement intacte et presque 80% des cellules survivent. Même en l’absence d’une activité
catalase, les biofilms restent relativement résistants au peroxyde d’hydrogène.
FIG. 1: Les barres non pleines représentent le pourcentage de viabilité des cellules restantes;
les barres pleines, le pourcentage de biofilm supprimé.18
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Une autre étude publiée dans Journal of Hospital Infection19 a également montré
qu’après 5 minutes d’exposition à des concentrations recommandées en peroxyde
d’hydrogène (0.017% à 8.75%) dans la désinfection clinique, les cellules microbiennes restent
intactes et vivantes.
FIG. 220: Numérisation d’images par laser d’un microscope confocal
Le traitement enzymatique
Du à l’inefficacité des désinfectants et en particulier du peroxyde d’hydrogène face au
biofilm, d’autres méthodes ont été investiguées.21 Le traitement enzymatique semble être une
solution efficace dans l’élimination du biofilm.22 Cependant, seul un cocktail d’enzymes
complexe et très spécifique sera capable de dégrader la matrice protectrice du biofilm. Une
phase de désinfection est ensuite appliquée afin de détruire les bactéries devenues
planctoniques et donc sensibles aux biocides.
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Validation pratique : l’inefficacité des biocides (peroxyde d’hydrogène dans ce cas) sur
l’élimination d’un biofilm23
Pour ce cas pratique, nous utilisons des produits Sterilex à base de peroxyde
d’hydrogène pour évaluer l’efficacité d’un biocide sur l’élimination du biofilm.
Protocole
1) Préparation du biofilm
La formation de biofilm en laboratoire se fait de manière dynamique sur des tubes en
PTFE (polytétrafluoroéthylène) à 30°C avec des Pseudomonas fluorescens. Après 7 jours
de circulation, nous pouvons considérer que le biofilm est formé dans le tube. Le tube en
PTFE est ensuite coupé en plusieurs morceaux de tubes de 7 cm de long. Pour chaque
produit trois morceaux de tubes non-consécutifs sont sélectionnés, connectés ensuite à la
pompe péristaltique afin de réaliser les tests de nettoyage en circulation.
2) Elimination du biofilm
• Rinçage à l’eau : 5 minutes à température ambiante
• Application de Sterilex Ultra Disinfectant Cleaner Solution 1 à 10% + Sterilex
Ultra Activator 10%
• Temps de lavage en circulation testé à 10, 15 et 20 minutes
• Température de l’eau au départ : 50°C
3) Détection du biofilm:
• Les tubes en PTFE sont coupés longitudinalement pour une meilleure vision à
l’intérieur du tube. Le biofilm résiduel est ensuite coloré à l’aide du « Biofilm
Detection Kit »*, utilisé pour rendre visible les biofilms présents.
• 5 minutes de trempage dans le REACTIVE 1 (produit du Biofilm Detection Kit)
• 5 minutes de trempage dans le REACTIVE 2 (produit du Biofilm Detection Kit)
Résultats
1) Témoin
Photo 1. Coloration du biofilm avant le nettoyage
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Recherche&Agronomique&en&France)&et&le&laboratoire&BiotechQ!"#$%&'"()*+,-.%/.01"('"(/2345.6&"("&($./."7(380+.1%/."#9:!!
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