la resistance du biofilm au peroxyde d`hydrogene
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8/09/14 LA RESISTANCE DU BIOFILM AU PEROXYDE D’HYDROGENE Au fil des années, les bactéries sont devenues de plus en plus résistantes aux biocides en développant des mécanismes de défense très efficaces, dont le biofilm. Le biofilm est pourtant le mode de vie majoritaire des microorganismes. En effet, il existe 1.000 à 10.000 fois plus de bactéries grandissant dans un biofilm plutôt que comme cellules planctoniques. Dans le cas d’un biofilm, les bactéries se protègent grâce à une couche de polysaccharides. A cause de cette matrice d’exopolymères, le biofilm peut être 1.000 fois plus résistant aux biocides que les cellules planctoniques. Plusieurs études et une validation expérimentale ont confirmé l’inefficacité des biocides, y compris le peroxyde d’hydrogène, sur l’élimination complète du biofilm. En effet après une dose continue de 50mM de peroxyde d’hydrogène pendant une heure, l’intégrité du biofilm reste largement intacte et presque 80% des cellules survivent. Le cas pratique a également révelé l’efficacité du traitement enzymatique de Realco suivie d’une phase de désinfection à l’élimination intégrale du biofilm. De nombreux produits chimiques sont utilisés quotidiennement en industrie agroalimentaire: produits de nettoyage, désinfectants, savons antimicrobiens, antiseptiques, antibiotiques, etc. Cependant qu’en est-il de l’usage de ces biocides sur la résistance des bactéries ? Cette préoccupation s’est fortement amplifiée ces dernières années due au nombre croissant de souches résistantes mais aussi à leur capacité à survivre en industrie alimentaire.1 En effet, il a été démontré que les bactéries sont capables de résister aux biocides lorsqu’elles vivent dans un biofilm.2 La résistance des bactéries La résistance bactérienne aux biocides est étudiée depuis les années 1950.3 La capacité des microorganismes à s'adapter de façon très rapide à leur environnement, en développant une résistance aux éléments extérieurs agressifs, est aujourd'hui bien connue. Les bactéries deviennent de plus en plus résistantes face aux biocides qui ne détruisent que partiellement la flore bactérienne.4 En effet, dans une étude récente5, il a été démontré que certains biocides sont inefficaces contre les bactéries d’un biofilm bien qu’efficaces contre la même population de bactéries sous forme planctonique. 1 J.M., La résistance face aux biocides, in Microbiologie, Services n°0214, Mars 2011 LEUNG CY, CHAN YC, SAMARANAYAKE LP, SENEVIRATNE CJ, Biocide resistance of Candida and Escherichia coli biofilms is associated with higher antioxidative capacities, in J Hosp Infect., 81(2):79-­‐86, Mai 2012 3 EUROPEAN COMMISSION, Directorate-­‐General for Health&Consumers, Assessment of the Antibiotic Resistance Effects of Biocides, Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks SCENIHR, Janvier 2009 4 BRIANDET R, FECHNER L, NAITALI M, DREANNO C, Biofilms, quand les microbes s’organisent, Carnets de Sciences, Editions Quae, 2012 5 SMITH K, HUNTER IS.,Efficacy of common hospital biocides with biofilms of multi-­‐drug resistant clinical isolates, in J Med Microbiol 2008; 57:966-­‐73. 2 1 8/09/14 La flore bactérienne a mis en place différents mécanismes de défense contre les biocides:6 1. La réduction de la perméabilité membranaire : La bactérie empêche l’entrée du biocide en modifiant la perméabilité de sa membrane cytoplasmique. La modification de la perméabilité limite la quantité de biocides dans la cellule, ce qui diminue la concentration effective du biocide. Le biocide devient alors inefficace car la dose létale n’est pas atteinte. 2. L’efflux des biocides : La bactérie utilise des pompes à efflux ayant le pouvoir d’expulser certaines substances actives. La pompe à efflux est une pompe localisée dans la membrane cytoplasmique qui va empêcher le biocide d’atteindre sa cible en effectuant son efflux actif hors de la bactérie. Le biocide n’accède alors plus à la cible en quantité suffisante pour détruire la bactérie. 3. La transformation enzymatique des biocides : La bactérie produit de nouvelles enzymes capables d’inactiver le biocide (comme par exemple la catalase qui dégrade le peroxyde d’hydrogène). Le biocide devient alors inactif. 4. La mutation de la cible du biocide : Chaque biocide agit en ciblant une partie précise de la cellule : paroi, ribosome... La présence d'une modification consécutive à une mutation modifie le site de fixation et empêche ainsi la liaison du biocide. Le biocide devient alors inutile. En complément de ces quatre mécanismes de défense, il existe un autre mécanisme de défense très efficace appelé biofilm, qui lui en plus de pouvoir concentrer tous les mécanismes de résistance décrits jusqu’à présent présente la caractéristique suivante , à savoir que les bactéries se protègent grâce à une couche de polysaccharides qu’elles secrètent et se développent sous forme de colonies. Le biofilm La couche de polysaccharides qui entoure les bactéries d’un biofilm est très difficile à détruire, voir impossible, avec les moyens classiques de désinfection.7 Cependant, les biofilms représentent le mode de vie majoritaire des microorganismes.8 En effet, 1.000 à 10.000 fois plus de bactéries grandissent dans un biofilm plutôt que comme cellules planctoniques.9 Le biofilm bactérien peut être 1.000 fois plus résistant aux biocides que les cellules planctoniques.10 Cela est surtout du à la matrice d’exopolymères qui entoure les bactéries du biofilm.11 Vu la difficulté d’éliminer complètement le biofilm, très peu de laboratoires effectuent des tests pour évaluer l’efficacité des biocides sur son élimination. Il n’y a actuellement pas de standards européens pour les tests des désinfectants contre les biofilms en agroalimentaire.12 6 EUROPEAN COMMISSION, Directorate-­‐General for Health&Consumers, Assessment of the Antibiotic Resistance Effects of Biocides, Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks SCENIHR, Janvier 2009 7 BRIANDET R, FECHNER L, NAITALI M, DREANNO C, Biofilms, quand les microbes s’organisent, Carnets de Sciences, Editions Quae, 2012 8 BRIANDET R, FECHNER L, NAITALI M, DREANNO C, Biofilms, quand les microbes s’organisent, Carnets de Sciences, Editions Quae, 2012 9 COSTERTON JW, GEESEY GG, CHENG Cheng K-­‐J, How bacteria stick, in Sci.Amer, 238:86-­‐95, 1978 10 ROUX A, GHIGO JM, Les biofilms bactériens, in Bull. Acad. Vét. France, Tome 159, n°3, 2006 11 BRIANDET R, FECHNER L, NAITALI M, DREANNO C, Biofilms, quand les microbes s’organisent, Carnets de Sciences, Editions Quae, 2012 12 EUROPEAN COMMISSION, Directorate-­‐General for Health&Consumers, Assessment of the Antibiotic Resistance Effects of Biocides, Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks SCENIHR, Janvier 2009 2 8/09/14 Cependant les quelques tests réalisés montrent des taux de résistance aux désinfectants et aux antibiotiques alarmants. La matrice du biofilm est vue comme une barrière à la diffusion.13 Photo : Les 5 étapes du développement d'un biofilm sur une surface dure; attachement initial, attachement irréversible, apparition et « maturation I » du biofilm, maturation II, érosion et dispersion/Détachement autogène. Les photomicrographies (toutes à même échelle) sont celles d'un biofilm de Pseudomonas aeruginosa en développement. La résistance des biofilms au peroxyde d’hydrogène Plusieurs études (Journal of Bacteriology14, Applied and Environmental Microbiology15 et Journal of Hospital Infection16) ont démontré que le biofilm pouvait résister au peroxyde d’hydrogène. L’étude publiée dans Applied and Environmental Microbiology17 a analysé le rôle de deux catalases dans la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans la protection des cellules du biofilm contre le peroxyde d’hydrogène. En effet, en présence du peroxyde d’hydrogène, les bactéries libèrent deux enzymes : KatA et KatB qui ont comme rôle de neutraliser ce biocide. Cette étude a été réalisée après une heure d’exposition à une dose continue de 50mM de peroxyde d’hydrogène et a montré que l’intégrité du biofilm reste largement intacte et presque 80% des cellules survivent. Même en l’absence d’une activité catalase, les biofilms restent relativement résistants au peroxyde d’hydrogène. FIG. 1: Les barres non pleines représentent le pourcentage de viabilité des cellules restantes; les barres pleines, le pourcentage de biofilm supprimé.18 BRIANDET R, FECHNER L, NAITALI M, DREANNO C, Biofilms, quand les microbes s’organisent, Carnets de Sciences, Editions Quae, 2012 KHAKIMOVA M, AHLGREN HG, HARRISON JJ, ENGLISH AM, NGUYEN D, The stringent response controls catalases in Pseudomonas aeruginosa and is required for hydrogen peroxide and antibiotic tolerance, in J. Bacteriol., 195(9):2011, March 2013 15 ELKINS JG, HASSETT DJ, STEWART PS, SCHWEIZER HP, MCDERMOTT TR, Protective role of catalase in Pseudomonas aeruginosa biofilm resistance to hydrogen peroxide, in Appl Environ Microbiol., 65(10):4594-­‐600, Oct 1999 16 LEUNG CY, CHAN YC, SAMARANAYAKE LP, SENEVIRATNE CJ, Biocide resistance of Candida and Escherichia coli biofilms is associated with higher antioxidative capacities, in J Hosp Infect., 81(2):79-­‐86, May 2012 17 ELKINS JG, HASSETT DJ, STEWART PS, SCHWEIZER HP, MCDERMOTT TR, Protective role of catalase in Pseudomonas aeruginosa biofilm resistance to hydrogen peroxide, in Appl Environ Microbiol., 65(10):4594-­‐600, Oct 1999 18 ELKINS JG, HASSETT DJ, STEWART PS, SCHWEIZER HP, MCDERMOTT TR, Protective role of catalase in Pseudomonas aeruginosa biofilm resistance to hydrogen peroxide, in Appl Environ Microbiol., 65(10):4594-­‐600, Oct 1999 13 14 3 8/09/14 Une autre étude publiée dans Journal of Hospital Infection19 a également montré qu’après 5 minutes d’exposition à des concentrations recommandées en peroxyde d’hydrogène (0.017% à 8.75%) dans la désinfection clinique, les cellules microbiennes restent intactes et vivantes. FIG. 220: Numérisation d’images par laser d’un microscope confocal Le traitement enzymatique Du à l’inefficacité des désinfectants et en particulier du peroxyde d’hydrogène face au biofilm, d’autres méthodes ont été investiguées.21 Le traitement enzymatique semble être une solution efficace dans l’élimination du biofilm.22 Cependant, seul un cocktail d’enzymes complexe et très spécifique sera capable de dégrader la matrice protectrice du biofilm. Une phase de désinfection est ensuite appliquée afin de détruire les bactéries devenues planctoniques et donc sensibles aux biocides. 19 LEUNG CY, CHAN YC, SAMARANAYAKE LP, SENEVIRATNE CJ, Biocide resistance of Candida and Escherichia coli biofilms is associated with higher antioxidative capacities, in J Hosp Infect., 81(2):79-­‐86, May 2012 20 LEUNG CY, CHAN YC, SAMARANAYAKE LP, SENEVIRATNE CJ, Biocide resistance of Candida and Escherichia coli biofilms is associated with higher antioxidative capacities, in J Hosp Infect., 81(2):79-­‐86, May 2012 21 LEQUETTE Y., BOELS G, CLARISSE M, FAILLE C. , Using enzymes to remove biofilms of bacterial isolates sampled in the food-­‐industry, in Biofouling, 26(4):421-­‐31., 2010 May 22 BRIANDET R, FECHNER L, NAITALI M, DREANNO C, Biofilms, quand les microbes s’organisent, Carnets de Sciences, Editions Quae, 2012 4 8/09/14 Validation pratique : l’inefficacité des biocides (peroxyde d’hydrogène dans ce cas) sur l’élimination d’un biofilm23 Pour ce cas pratique, nous utilisons des produits Sterilex à base de peroxyde d’hydrogène pour évaluer l’efficacité d’un biocide sur l’élimination du biofilm. Protocole 1) Préparation du biofilm La formation de biofilm en laboratoire se fait de manière dynamique sur des tubes en PTFE (polytétrafluoroéthylène) à 30°C avec des Pseudomonas fluorescens. Après 7 jours de circulation, nous pouvons considérer que le biofilm est formé dans le tube. Le tube en PTFE est ensuite coupé en plusieurs morceaux de tubes de 7 cm de long. Pour chaque produit trois morceaux de tubes non-consécutifs sont sélectionnés, connectés ensuite à la pompe péristaltique afin de réaliser les tests de nettoyage en circulation. 2) Elimination du biofilm • Rinçage à l’eau : 5 minutes à température ambiante • Application de Sterilex Ultra Disinfectant Cleaner Solution 1 à 10% + Sterilex Ultra Activator 10% • Temps de lavage en circulation testé à 10, 15 et 20 minutes • Température de l’eau au départ : 50°C 3) Détection du biofilm: • Les tubes en PTFE sont coupés longitudinalement pour une meilleure vision à l’intérieur du tube. Le biofilm résiduel est ensuite coloré à l’aide du « Biofilm Detection Kit »*, utilisé pour rendre visible les biofilms présents. • 5 minutes de trempage dans le REACTIVE 1 (produit du Biofilm Detection Kit) • 5 minutes de trempage dans le REACTIVE 2 (produit du Biofilm Detection Kit) Résultats 1) Témoin Photo 1. Coloration du biofilm avant le nettoyage 23 Rapport de laboratoire réalisé par Realco, Biofilm-­‐comparaison Sterilex vs Enzyfoam, 27/05/2014 Le Kit de Détection Biofilm colore instantanément la matrice protectrice du biofilm. Il a été validé par l’INRA (Institut National de la Recherche Agronomique en France) et le laboratoire Biotech-­‐Germande (Spécialiste de l’hygiène en milieu hospitalier). * 5 8/09/14 2) Rinçage à l’eau à 50°C Photo 2. Coloration du biofilm résiduel après le rinçage à l’eau à 50°C. De gauche à droite : 10, 15 et 20 minutes de circulation 3) Application du Sterilex Ultra Disinfectant Cleaner Solution 1 à 10% + Sterilex Ultra Activator à 10% Photo 3. Coloration du biofilm résiduel après le nettoyage avec les produits Sterilex. De gauche à droite : 10, 15 et 20 minutes de circulation Les tubes nettoyés avec le mélange de produits Sterilex laisse une quantité assez importante de biofilm (coloration bleue) même après 20 minutes de nettoyage. Il n’y a pas de différence marquée entre les temps de nettoyage 10, 15 et 20 minutes. Parallèlement le cocktail enzymatique de Realco a été testé selon le même protocole et dans les mêmes conditions. La seule différence est dans le dosage utilisé (plus faible) : l’Enzyfoam a été dilué à 1 % et le Biorem 20 à 0,2%. 6 8/09/14 4) Application de l’Enzyfoam à 1% + Biorem 20 à 0,2% Photo 4. Coloration du biofilm résiduel après le nettoyage avec les produits Realco. De gauche à droite : 10, 15 et 20 minutes de circulation Le traitement enzymatique complexe et très spécifique de Realco a éliminé la matrice EPS en 10 minutes. Après une phase de désinfection ciblée et maitrisée, le biofilm sera alors complètement éliminé. Conclusion de l’expérience En circulation, le mélange des produits enzymatiques est nettement plus efficace à l’élimination d’un biofilm que le mélange à base de peroxyde d’hydrogène. Conclusion générale Comme étudié dans cet article, le biofilm représente le mode de vie majoritaire des microorganismes. Il existe 1.000 à 10.000 fois plus de bactéries grandissant dans un biofilm plutôt que comme cellules planctoniques. Il est donc extrêmement important de pouvoir l’éliminer car il peut avoir de graves conséquences dans l’industrie alimentaire et entrainer des pertes économiques importantes. Cependant les nombreuses études de la littérature et un cas pratique en laboratoire ont montré l’inefficacité des biocides et plus particulièrement du peroxyde d’hydrogène sur l’élimination intégrale du biofilm. En effet, dans le cas d’un biofilm, les bactéries se protègent grâce à une couche de polysaccharides, barrière extrêmement difficile à détruire. L’expérience en laboratoire a montré que le traitement enzymatique de Realco était le seul capable d’éliminer cette barrière. Une fois la matrice détruite, une phase de désinfection est nécessaire afin d’éliminer les bactéries libérées. 7
