Biochimie du 7 octobre 2003

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Biochimie du 7 octobre 2003.
Les protéines.
 Structure primaire des protéines.
2- séquençage des protéines.
Il faut déjà avoir purifié la protéine, il faut couper cette protéine en petits morceaux par
différents produits chimiques ou enzymatiques (exopeptidase ou des endopeptidase). Une fois
que la protéine est coupé en petits fragments (peptides), on doit analyser chacun de ces
peptides dans les AA qui les composent et pour faire ça on purifie, on sépare les peptides les
uns des autres par électrochromatographie ou CLHP. On analyse ensuite chacun des peptides
par
c-enlèvement récurrent de l’AA N terminal.
Pour ça on utilise le PITC qui va se fixer sur l’AA qui possède un NH2 terminal (en position
1) et en se fixant il va détacher cet AA du reste du peptide. Par chromatographie on va
individualiser la place de cet AA : identifier cet AA. C’est la réaction d’Edman qui utilise le
PITC pour cliver le peptide N terminal pour donner un phényl tio identoide + AA (ici
l’alanine). On peut recommencer l’analyse avec le peptide restant pour cliver de nouveau le
AA N terminal et ainsi de suite jusqu’au bout. Le coloration jaune verdâtre du PITC permet
de visualiser par chromatographie l’AA. Cette technique a remplacé les premières techniques
qui utilisait le fluoronitrobenzène et le chlorure de danse qui avaient l’intérêt de couper l’AA
N terminal mais on pouvait pas réutiliser plusieurs fois sur le même peptide parce qu’ils
dégradaient le reste du peptide à concentration trop grande.
d- étape finale – détermination de la séquence par chevauchement.
Ca commence par l’analyse des deux AA N et C terminaux et on les mets à chaque bout de la
protéine. Parmi tous les peptides clivés, analysés on retrouve les fragments obtenu à partir
d’un clivage chimique puis à partir d’un clivage enzymatique pour une protéine donnée. Pour
trouver le milieu on chevauche. Il se peut qu’il y ait plusieurs possibilités de séquence d’AA.
e- détermination indirecte de la séquence protéique.
Il existe au niveau de l’Adn de l’information qui est traduite dans l’ARNm qui code pour
chacune des protéines et cette lecture est faite au niveau des ribosomes des cellules qui en
fonction des triplets de nucléotides rajoutent les AA les uns derrières les autres pour fabriquer
la chaîne polypeptidique. A partir de différentes étapes de la biologie moléculaire (ADN et
ARN) déduire la structure en AA d’une protéine. Dans ce schéma on explique une voie : la
plus simple et facile à faire lorsque l’on a une protéine fabriquée par une cellule – par
exemple l’albumine fabriqué par les cellules hépatiques – cette albumine humaine a une
spécificité d’espèce. Si on injecte à une autre espèce une protéine donnée, cette autre espèce
fabrique des molécules de reconnaissances : des anticorps (immunoglobuline). Si on fait des
Ac anti albumine humaine, on utilise ces Ac pour réaliser une interaction entre l’anticorps et
l’albumine qu’on avait injecté donc il se produit un complexe antigène (albumine) / anticorps
antialbumine (complexe qui est éliminé par les cellules phagocytaires ensuite). Cet Ac est
utilisé in vitro pour purifié l’ARNm qui code pour l’albumine. On a des cellules hépatiques
qui fabriquent l’albumine : on fait un broyat de cellules hépatiques et dans ce broyat il y a des
ribosomes qui étaient en train de fabriquer de l’albumine. Ils étaient en train de lié l’ARNm
pour l’albumine et associé à ce ribosome à la sortie il y avait la chaîne polypeptidique de
l’albumine. Donc si je pêche à l’intérieur par le biais d’un Ac l’albumine, je vais attiré en

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même temps tout ce qui est attaché c’est à dire le ribosome et l’ARN messager. Donc cette
technique de précipitation par un anticorps de la protéine spécifique cellulaire me permets de
récupérer de façon simple l’ARNm spécifique de cette protéine. Cet ARNm est analysé donc
pour remonter à l’ADN il existe la réverse transcriptase qui est une enzyme qui permet de
transformer l’information qui existe sur l’ARN en codon de nucléotide d’ADN qui sont la
base du gène qui code pour l’albumine. Ici on obtient donc de l’ADNcomplèmentaire
spécifique de l’albumine et par une technique de séquençage identique à celle qu’on a vu pour
les AA, on va pouvoir identifié les différents codons de nucléotides qui sont présents au
niveau de l’ADN donc qui sont le support de cette structure primaire de la protéine. Si on fait
le séquençage de l’ADN on obtient comment est codé l’information génétique au niveau de
l’ADN.
APPLICATIONS.
-Ceci permets de comparer les deux informations : celle obtenue par les voies biochimiques
classiques du séquençage d’amino acides et celle obtenue par le biais de l’information qui est
porté par les gènes et on s’aperçoit qu’il existe des petites différences car le code génétique
codant pour la protéine au niveau de l’ADNc est sur une séquence codante. Toute la séquence
de l’ADN ne correspond pas à des AA mis les uns derrières les autres mais il y a aussi des
morceaux de régulations.
-On va s’apercevoir que les protéines excrétés dans les milieux extra cellulaires perdent
quelques AA du fait que la protéine pour être excrété des cellules doit passer par différentes
barrières, différents organites et pour cela elle a besoin de s’accrocher par des structures d’AA
qui disparaissent ensuite quand la protéine est complètement excrété.
Donc différence entre protéine circulante et information génétique au niveau de l’ADN.
- Ca permets aussi de visualiser des anomalies qui peuvent être pathologique. Le simple fait
d’un AA remplacé par un autre dans le codage du patrimoine génétique va se traduire par des
différences dans la structure de la protéine. Anomalies qui peuvent être grave et altérer la
fonction de la protéine et par exemple il y a une maladie qui touche l’hémoglobine présente
sur le globule rouge et qui fait donc respirer les tissus en transportant l’O2. La simple
anomalie d’un AA d’un acide glutamique changé par une valine va entraîner une hémoglobine
anormale qui se polymérise dans le globule rouge qui va devenir ovalaire au lieu être rond
donc il y a défaut d’oxygénation et c’est le Drépanocytose ou anémie falciforme.
- On s’aperçoit que la plupart de l’information génétique a été conservé pour les protéines qui
sont les plus indispensables à la vie, qui permettent de médier de grandes fonctions et ça
permet de voir l’évolutivité de ces espèces. Les protéines ont pratiquement la même fonction
au fur et à mesure de l’évolution de la vie.
 Organisation tridimensionnelle des protéines.
Réalisé par différents types de structurations.
STRUCTURE SECONDAIRE :
C’est l’organisation, le repliement de la chaîne polypeptidique dans l’espace sur quelques
portions de la chaîne sous forme de 2 modèles. Ces structurations sont maintenues par des
liaisons non covalentes et pour l’hélice alpha ce sont des liaisons de type hydrogène.

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1- hélice alpha : structuration en hélice, spiral et la chaîne est maintenu par des liaisons
non covalentes réalisés entre des AA situés à des distances toujours identiques : le tour
de spire est toujours de la même dimension donc c’est entre un groupement CO et un
NH d’un autre AA qui va y avoir des liaisons qui maintiennent la cohésion de cette
structure. C’est généralement une liaison établie entre un AA à position n et un autre
AA à une position n + 4. Le pas de l’hélice est toujours de la même dimension :
0,54nm et le diamètre du cylindre est toujours identique : de 0,5nm. En vue de dessus
on voit que vers l’extérieur il y a toutes les chaînes latérales des AA et ce sont elles
qui vont interagir avec d’autres AA et ça a un rôle important dans un autre niveau de
structuration.
2- Feuillets bêta plissé : Une sorte de feuille de papier plissé en accordéon. Donc la
chaîne est replié sur elle même de façon plus lâche que sur l’hélice alpha et il faut que
deux portions de la chaîne viennent en contact l’une avec l’autre. On voit une partie de
la chaîne et la deuxième partie qui vient en face pour qu’il y ait des liaisons de type
non covalentes qui se fassent entre CO et NH. Ici ça s’effectue entre deux portions de
la chaîne qui viennent en contact l’une de l’autre. Il y a 2 possibilités pour que les
deux portions soient en face de l’autre :
-on parle de feuillets bêta plissés parallèles (cas le moins fréquent) quand les deux
portions sont dans le même sens (N term vers C term)
-feuillets bête plissés anti parallèles : quand un seul repliement et dans sens opposés de la
chaîne
3-Boucles : Il faut entre les différentes portions de la chaîne des points de jonction qui
sont des boucles qui réalisent l’association entre toutes ces structures. Que ce soit
n’importe quelle protéine il faut des boucles pour maintenir la structure globale de tout
l’ensemble : ça donne la forme de la protéine pour qu’elle joue son rôle fonctionnel. Ce
sont ces boucles qui entrent en interaction
Exemple de l’Ac : Qui représente un moyen de se fixer de manière spécifique sur
l’antigène et c’est une réaction de stéréo spécificité. La partie qui vient se fixer sur l’Ag
est organisé en feuillet bêta plissé et surtout il y a des boucles longues qui représentent les
doigts de la main qui se fixent sur l’antigène.
STRUCTURE TERTIAIRE.
C’est le niveau ultime de structuration pour certaines protéines quand il y a qu’une seule
polypeptidique. Ca donne la forme de la protéine, pour voir la structure de la protéine il
existe des techniques pour analyser les protéines donc d’en déduire une forme de la
protéine (allongée ou fibrillaire). Ces techniques physiques sont basées sur différents
propriétés que peuvent avoir des atomes à l’intérieur de ces protéines. Il y en a de
nombreuses mais on voit que 2 :
- Cristallographie aux rayons x : on bombarde une protéine avec des rayons X et il
faut l’avoir purifier et l’avoir sous forme d’un cristal (soluble). Quand on bombarde la
protéine les rayons X interagissent au niveau des atomes de carbone et on obtient sur
une plaque photographique le trajet des rayons x qui a étés déviés par les atomes de
carbone et on obtient une série de cercles concentriques mélangés les uns avec les
autres et l’important c’est les points de jonctions entre tous ces cercles et d’une
protéines à une autre ces distances interatomiques sont différentes et il y a des
logiciels qui rapporte les distances à une structure tridimensionnelle de la protéine. Ici
on voit que la protéine est une enzyme donc possède un site de réactivité vis à vis d’un
substrat et ce site réactif est glissé au centre de la protéine.

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- Spectroscopie RMN : Consiste à étudier le rayonnement magnétique d’un certain
nombre d’atome d’Hydrogène. En bombardant d’un rayonnement magnétique on peut
matérialisé le positionnement de ces H les uns par rapport aux autres. L’intéressant ici
c’est qu’on peut reconstitué la présence des chaînes latérales sur la protéine.
-Maintient de la structure tertiaire : par des liaisons non covalentes : H, ionique entre
deux groupements chargé COO- et NH3+, liaison hydrophobe entre AA à site aromatique,
entre noyaux atomique il peut y avoir des liaisons de Van de Waal. A l’intérieur de ces
AA il peut y avoir des métaux qui viennent s’ajouter. Dans l’hémoglobine il y a une
structure qui contient du fer indispensable à la fixation d’oxygène. Ces liaisons entre
atome métallique et AA sont des liaisons de coordinence métallique. Il y a aussi des ponts
dissulfures qui sont de type covalentes qui s’établissent par les groupements SH des
cystéines donc S-S pont dissulfure.
L’ensemble de ces liaisons donne la structure tertiaire. Quand on parle de ponts dissulfure
c’est pour l’organisation de la structure tertiaire mais dans la secondaire il peut y avoir
aussi des ponts dissulfures qui maintiennent la structure secondaire.
ACQUISITION de la structure tertiaire :
Comment on peut matérialiser sa formation et comment associer cette notion à la fonction
de la protéine ? On peut essayé de détruire la structure tertiaire par 2 types de produits :
les produits qui détruisent les liaisons non covalentes (faibles affinités) sont les détergents
(Suldate de dodécyle de sodium = SOD), les acides ou bases faibles en faible quantité, les
agents chaotropiques (urée, guanidine).
Pour détruire les ponts dissulfures on utilise un réducteur qui est le Bêta mercaptoéthanol.
Donc si on utilise le réducteur et un des produits détruisant les liaisons non covalentes, on
déroule la chaîne de la protéine.
Pour les grosses protéines elle est irréversible sauf pour certaines petites protéines
comme :
La ribonucléase qui est composé d’une seule chaîne polypeptidique repliée sur elle même
et qui est maintenu par 4 ponts dissulfure et de nombreuses liaisons non covalente. La
ribonucléase détruit l’ARN (acide ribonucléique) et si on lui fait subir la dénaturation on
va couper les ponts dissulfures et détruire les liaisons, on déroule la protéine donc perte de
la fonction enzymatique lié à la structure tertiaire. Pour la ribonucléase si on enlève les
réducteur la chaîne a des AA assez proches pour que les ponts dissulfures se reconstituent,
pour que les liaisons non covalentes se rétablissent et on va régénérer une protéine native
avec ses fonctionnalités. Mais pour la plupart des protéines complexes la dénaturation
entraîne une irréversibilité de régénérer la structure de la protéine parce que de
nombreuses protéines ont des chaînes grandes associées entre elles et si on régénère le
milieu la régénération de la protéine est aléatoire.