Número 4 2004 Les allergies au latex provoquées par les gants à usage médical, diagnostic et dosage des protéines Pour les gants à usage médical, le problème des allergies au latex reste d’une actualité brûlante. Selon la norme européene EN 1441, les fabricants sont tenus d’effectuer une analyse de risques qui, comme le précise la norme EN 455-3, concerne aussi le potentiel allergénique des gants. Cette dernière norme décrit les méthodes classiques de détermination quantitative des protéines contenues dans les gants en latex. De nouvelles techniques commencent aussi à entrer dans la pratique courante, mais l’utilisateur en ignore souvent la pertinence. Plus d’information avec SEMPERMED. S ous le terme d’allergie au latex, on désigne souvent présents dans les gants en latex et dans les gants non aussi bien les réactions pseudo- allergiques latex. Les réactions de type IV peuvent par conséquent (irritations) que les réactions allergiques véritables. Alors survenir aussi bien avec des gants en latex artificiel que les réactions d’irritation sont imputables à l’effet qu’avec des gants en latex naturel. cutané de facteurs physiques (particules pulvérulentes) ou chimiques (pH, occlusion), les Immunglobuline (Ig E) Antigéne allergies véritables s’expliquent par des réactions immunitaires excessives vis-àAntigène vis des constituants du gant. Parmi les réactions allergiques aux gants à usage médical, on distingue les allergies de Ig E À type I et les allergies de type IV. L L Les allergies de type IV (à médiation E R cellulaire) sont en principe imputables à G I des produits chimiques utilisés lors de la E Cellule immunitaire Mastocyte Mastocyte fabrication des gants. Ces allergies Réserve Histamine d’histamine impliquent essentiellement les accéléraLorsque des antigènes pénètrent dans l’organisme, le cellules du système immunitaire produisent des anticorps spécifiteurs de vulcanisation, et notamment les ques (immunoglobulines). Ces derniers s’accumulent sur les mastocytes et les sensibilisent. Lors d’un contact ultérieur, thiurames. les mastocytes seront capables de capturer «leurs» antigènes et il se produira une libèration d’histamine, totalement De nombreux composés chimiques sont incontrôlée chez le sujet allergique. 1 In-vivo Type IV Type I Test épicutané Test-prick Cuti-réaction Intradermoréaction Test par frottement Test de provocation à tester sont laissées pendant 48 heures au contact de la peau, et les réactions sont contrôlées 24 ou 48 heures plus tard, ainsi que 72, voire 96 heures après l’application. L’interprétation est effectuée conformément aux recommandations de l’ICDRG (Groupe de recherche international sur les dermatites de contact). La persistance des manifestations cutanées pendant au moins 48 heures est le signe d’une réaction allergique. Lorsqu’on soupçonne qu’une allergie peut être imputable à des gants à usage médical, on teste, outre les substances habituelles (principaux allergènes de type IV), les constituants essentiels du caoutchouc ainsi qu’un échantillon du gant en latex. test cutané – essai de port du gant test de provocation bronique – avec gant poudré In-vitro Test de transformation lymphocytaire Dosage des IgE spécifiques Examples: -RAST -CAP FEIA Test de simulationExamples: Example: -test de libération d’histamine Tableau 1 (cette liste ne prétend pas être exhaustive) Les allergies de type I (médiées par les lgE) sont imputables aux protéines contenues dans le latex. À l’heure actuelle, il est possible de réduire la concentration de ces protéines dans les gants produits mais il reste impossible de supprimer totalement ces molécules. Nous présenterons ici les méthodes de diagnostic les plus couramment utilisées pour déceler une allergie au latex, puis les principales techniques appliquées pour déterminer le potentiel allergénique des gants en latex. Diagnostic En présence de réactions allergiques à des gants en latex, le diagnostic fait appel à des tests in vivo et in vitro. Diagnostic d’une allergie de type IV Tableau clinique Une allergie de type IV se traduit par un eczéma de contact apparaissant 24 à 48 heures après le contact avec l’allergène et s’aggravant progressivement. Outre l’érythème prurigineux, les papules, les vésicules et la desquamation, l’eczéma de contact allergique se caractérise aussi par des phénomènes de dissémination, c’est-à-dire des manifestations cutanées s’étendant sur toute la zone de contact avec l’allergène (gants en latex par exemple). Ces caractéristiques permettent de distinguer clairement ces phénomènes des manifestations d’irritation. Test épicutané: les substances à tester sont dèposées à l’aide d’une bande adhésive à réservoirs, prévue à cet effet Test in vitro Dans les allergies de type IV, on utilise le test de transformation lymphocytaire qui repose sur la stimulation, par l’allergène, de la croissance lymphocytaire dans le sang du patient. Ce test très coûteux et difficile à mettre en oeuvre n’est utilisé qu’exceptionnellement pour le diagnostic. Diagnostic d’une allergie de type I Tableau clinique Contrairement aux allergies de type IV, la symptomatologie clinique des allergies de type I apparaît le plus souvent dans les 5 à 30 minutes suivant le contact avec l’allergène. C’est pourquoi ce type de réaction est également appelé „ allergie immédiate “. Selon von Krogh et Maibach, l’allergie de type I comporte quatre stades qui sont tous présents dans les allergies au latex. Test in-vivo Test épicutané ou patch-test Ce test est pratiqué sur une zone normale non enflammée du dos. Les substances à tester sont placées dans de petits réservoirs en aluminium (chambre de Finn, par exemple) fixés sur la peau à l’aide de bandes adhésives commercialisées à cet usage. Les substances 2 Stade I Urticaire de contact localisée Stade II Urticaire généralisée avec oedème péri-orbitaire Stade III Uriticaire et signes muqueux (asthme bronchique allergique, rhinoconjunctivite oedème laryngé et manifestations digestives) Stade IV Choc anaphylactique Intradermoréaction Cuti-réaction Tableau 2 Ce test consiste à effectuer une injection intradermique de 0,02 à 0,05 ml d’une solution d’allergène fortement diluée (selon la substance à tester).Les réactions sont lues au bout de 20 à 40 minutes, de la même manière que dans le prick-test. Ce test est cependant rarement utilisé pour le diagnostic des allergies au latex. Test in vivo Parmi les tests in vivo, on compte avant tout les tests cutanés dans lesquels l’allergène est introduit dans le tissu conjonctif du derme, qui est riche en mastocytes. L’allergène déclenche alors une réaction de type immédiat, mediée par les lgE. La standardisation des différentes méthodes est délicate car les résultats du test dépendent de plusieurs facteurs, entre autres de la quantité d’allergène contenue dans l’extrait déposé sur la peau ou introduit dans l’organisme, ainsi que du type de protéine par lequel le patient a été sensibilisé. Prick-test Dans le prick-test, l’allergène est déposé sur la peau de la face interne de l’avant-bras. Une aiguille fine, ou une lancette, est utilisée pour piquer et relever la couche superficielle de la peau au centre de la goutte déposée, sachant qu’aucun saignement ne doit se produire. La réaction est lue au bout de 20 à 40 minutes, en respectant des règles bien définies. Test par frottement Intradermoréaction En cas de risque de réaction allergique majeure (choc anaphylactique), l’allergène à tester est appliqué par frottement léger sur la peau. La lecture se fait comme dans le prick-test mais, en cas de résultat négatif, un prick-test est effectué à la suite. Test prick Test de provocation Le test de provocation consiste à mettre le patient en contact avec le matériel allergénique, dans des conditions aussi proches que possible de la réalité. En cas d’allergie à des gants, on peut faire appel à un essai de port du gant et à un test de provocation bronchique. Cuti-réaction Evaluation Quaddel-size (mm) Erythem-size (mm) 0 + ++ +++ ++++ 0 2– 3 3 4–6 > 6 (pseudopodia) <3 3–5 6 – 10 11 – 20 > 20 Essai de port du gant Ce test consiste à enfiler le gant (ou uniquement un doigt) après avoir humidifié la main à l’eau. Le gant est laissé en place pendant 30 minutes. Les réactions sont ensuite évaluées comme dans le prick-test. Cette méthode est surtout utilisée lorsque les antécédents du Tableau 3: évaluation des réactions au test prick selon Ring (1988) Dans ce test, la peau est scarifiée (sans saignement) à l’aide d’une lancette d’environ 5 mm de long, avant l’application de la substance contenant l’allergène. La lecture des résultats s’effectue comme dans le prick-test . 3 patient indiquent clairement une allergie au latex mais que les lgE spécifiques ne sont pas décelables dans le sang. humains chez des animaux de laboratoire. Lorsque ces anticorps de détection portent un marquage radioactif, la quantité d’lgE fixées peut être déterminée par un compteur gamma.Lorsque les anticorps de détection sont marqués par une enzyme, la méthode comporte également une réaction enzymatique (immuno-enzymo essai). Après addition des anti-IgE marqués par une enzyme, on ajoute une solution qui provoque la formation d’une substance colorante ou fluorescente. La concentration du colorant est quantifiée à l’aide d’un photomètre. Test de provocation bronchique Ce test comporte une exploration fonctionnelle des voies respiratoires supérieures et inférieures, en présence d’un allergène administré par un nébulisateur. Pour les gants, on utilise généralement la poudre des gants incriminés dont on sait qu’elle véhicule les protéines allergènes du latex. Les réactions bronchopulmonaires sont enregistrées en continu (spirométrie, pléthysmographie du corps entier, rhinomanométrie). MISE EN GARDE: Tous les tests in vivo portant sur des allergènes de type I doivent être pratiqués exclusivement par des médecins expérimentés, et à proximité du matériel nécessaire en cas d’urgence car, même si elles sont rares, les réactions anaphylactiques ne peuvent être exclues. Le patient et le personnel des services effectuant ce type de tests doivent être correctement informés des risques possibles. Prélèvment du patient contenant des IgE spécifiques Allergène fixé sur un disque en papier Complexe allergène-IgEanti-IgE-sur disque en papier Anti-IgE à marquage radioactif Test-in-vitro Parmi ces tests, il faut citer le dosage des lgE (immunoglobulines ou anticorps de classe E) spécifiques des allergènes ainsi que différents tests de stimulation. Complexe allergène-IgE sur disque en papier RAST (Radio-Allergo-Sorbent-Test) Photométrie Le principe de base de la détermination photométrique de la concentration consiste à utiliser: un rayon lumineux d’intensité donnée qui frappe le liquide à tester, provoquant ainsi une atténuation de la lumière qui peut être alors mesurée. Une courbe d’étalonnage permet de déterminer la concentration de la substance à doser. Dosage des lgE spécifiques des allergènes RAST Le RAST (Radio Allergo Sorbent Test) mis au point par la société Pharmacia (Uppsala) a été la première méthode de dosage des lgE spécifiques des allergènes. Par la suite, lorsque ce test est tombé dans le domaine public, toute une série d’autres méthodes équivalentes reposant sur le même principe ont été développées. On a cependant pris l’habitude d’utiliser le terme „RAST“ comme synonyme de dosage des lgE spécifiques des allergènes, même si ajourd’hui les anticorps ne sont plus dosés en utilisant un marquage radioactif. Dans toutes ces techniques, l’allergène est avant tout fixé à une phase solide (disque en papier, récipient ou billes en polystyrène). Lorsque le sérum du patient y est ajouté, les lgE correspondantes se lient à l’allergène fixé. Après lavage du sérum, les molécules d’lgE qui se sont ainsi également fixées peuvent être décelées à l’aide d’anticorps dirigés contre les IgE humaines (anti-IgE). Ces anti-IgE sont obtenues par injection d’anticorps Rayon lumineux Absorption Liquide à tester Signal de mesure Concentration Test de stimulation (test de libération d’histamine, par exemple) Ce test consiste à faire incuber des cellules sanguines (sang total ou lymphocytes isolés) en présence de différentes concentrations de l’allergène. Cette procédure 4 stimule les lymphocytes B qui présentent à leur surface la molécule d’lgE correspondante, ce qui déclenche la réaction caractéristique d’une allergie de type I. Il se produit, entre autres, une libération d’histamine ainsi qu’une nouvelle synthèse et une libération de prostaglandines. Ces substances (médiateurs) peuvent être mesurées, ce qui renseigne sur l’intensité de la réaction allergique. Ces techniques sont cependant coûteuses et très difficiles à mettre en oeuvre; elles sont par conséquent réservées à certains cas particuliers. matière première, toutes les protéines du latex contenues dans les gants ont une signification allergologique. Certains allergènes ont depuis lors été identifiés et leur structure primaire a pu être analysée. Potentiel allergénique des gants en latex Il existe différentes méthodes dont les unes permettent de déterminer la teneur totale en protéines des gants en latex et les autres la teneur en allergènes. Les méthodes décrites ci-après utilisent les différentes propriétés des protéines pour connaître le potentiel allergénique des gants en latex. Les méthodes de dosage des protéines totales prennent en compte l’ensemble des protéines solubles contenues dans un gant en latex, y compris celles qui ne proviennent pas du latex mais sont ajoutées par certains fabricants (caséine par exemple). Table 4 Allergéne Nb d’acides aminés Prohévéine 20 187 Hévéine (N-terminale)* 4,7 43 Hévéine (C-terminale)* 14 138 REF** 14,6 137 Hévamine 29,6 273 Préntyltransférase 38 * Issue de la prohévéine ** Rubber Elongation Factor, Facteur d’élongation du caoutchouc Allergène important dans le spina bifida kD: kiloDalton – unité de masse moléculaire On connaît également en partie la structure primaire de trois protéines dont le poids moléculaire est respectivement de 27, 36 et 100-110 kD. Difficultés de dosage des protéines contenues dans un gant en latex Protéines antigèniques IgG Teneur totale en protéines Masse moléculaire (kD) Protéines allergéniques IgE Techniques Unités analytique -Lowry µg/g** (teneur totale en protéines) -HPLC µg/g Méthodes de chimie -Bradford Tous les allergénes sont des antigénes mais la réciproque n’est pasnécessairement vraie Méthodes immunologiques (teneur en allergènes) Dans le latex utilisé pour la fabrication des gants, 240 protéines différentes ont été identifiées à ce jour. Ces protéines se distinguent essentiellement par leur poids moléculaire qui varie entre 2 et 200 kilodaltons (kD). Elles n’ont cependant été mises en évidence que dans le latex sous forme de matière première et non dans les extraits préparés à partir de gants en latex. Ces extraits ne contiennent en effet que quelques-unes des protéines initiales mais renferment en revanche un grand nombre de peptides dont la masse moléculaire est inférieure à 10 kD. Dans la mesure où il s’agit de produits de dégradation des protéines initiales, on peut partir du principe que, contrairement au latex sous forme de -Inhibition du RAST UA*/ml -Inhibiton ELISA UA/ml -LEAP µg/g ** Mikrogramme de protéines par gramme de latex * UA = unité arbitraire (non standardisée) Tableau 5 (cette liste ne prétend aucunement être exhaustive) Les méthodes usuelles de dosage des protéines sont prévues pour caractériser les protéines en tant que constituants principaux d’un échantillon biochimique. Dans un gant en latex, les protéines ne sont présentes qu’à l’état de traces (concentrations mesurées en ppm, c’est-à-dire en parties par million) et celles-ci doivent être dosées en présence de toute une série de substances 5 chimiques qui perturbent de nombreuses techniques colorimétriques. C’est pourquoi l’Union Européenne a financé un projet de recherche sur la détermination des protéines et des accélérateurs de vulcanisation contenus dans les gants en latex et sur la signification allergologique des résultats obtenus. Ce projet a été conduit dans des services de dermatologie d’Erlangen, de Copenhague ainsi qu’à l’ÖIBW de Vienne. Ces travaux ont montré que la méthode de Lowry modifiée débouche sur des résultats acceptables, en bonne corrélation avec les données cliniques (prick-test). Avantages: Ce procédé est intéressant car seule la surface des gants est soumise à l’extraction et le volume de liquide d’extraction est minime. Cette approche simule aussi très bien les conditions réelles de port des gants. Étant donné que le gant intérieur est rempli d’une solution colorée (pour détecter les perforations), un contact optimal est garanti entre le produit d’extraction et l’ensemble de la surface. ASTM D 5712 Aux États-Unis, les gants sont préalablement fragmentés et l’extraction s’effectue en solution aqueuse, dans certaines conditions bien déterminées. Procédé d’extraction Le procédé d’extraction qui consiste à extraire les protéines du gant est au moins aussi important que la technique de mesure. Une méthode développée à cet effet dans le cadre du projet européen mentionné cidessus a été reprise dans la norme européenne EN 455-3. Il est essentiel d’utiliser un tampon car, avec les gants poudrés, l’addition d’oxyde de magnésium donne lieu à des pH très élevés (jusqu’à 10,5) dans les extraits non tamponnés. Les directives internationales (CEN, ASTM, ISO) se sont accordées sur un tampon de pH 7,4. Méthodes de chimie analytique Ces méthodes permettent de déterminer la teneur totale en protéines dans les extraits préparés à partir de gants en latex naturel. Méthode de Lowry modifiée Cette méthode colorimétrique repose sur une réaction des ions cuivre avec les protéines et utilise le réactif de Folins pour obtenir une coloration bleue caractéristique dont l’absorption est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre, à une longueur d’onde de 600-750 nm (voir le descriptif de la photométrie). EN 455-3 Le liquide d’extraction est versé entre deux gants enfilés l’un sur l’autre puis le gant intérieur est rempli par un colorant. En l’espace de deux heures, à température donnée, toutes les protéines hydrosolubles sont extraites de la face interne du gant extérieur et de la face externe du gant intérieur. Le colorant est alors éliminé et l’extrait se trouvant entre les deux gants est analysé à l’aide de l’une des méthodes décrites ci-après. Dosage des protéines sur des plaques de microtitrage selon la méthode modifée de Lowry Afin de pouvoir doser les protéines présentes seulement à l’état de traces, celles-ci doivent être préalablement précipitées par addition d’acides, pour être ensuite rediluées sous un faible volume puis enfin concentrées. Cette étape de précipitation permet aussi d’éliminer partiellement les autres substances qui perturbent les résultats de la méthode de Lowry. 1 gant extérieur, 2 gant intérieur, 3 liquide d’extrction tamponné, 4 solution colorante, 5 pince 6 Avantages: Cette méthode est recommandée, aussi bien par la norme européenne que par les normes ASTM et ISO, pour doser les protéines des gants. Il s’agit d’une technique relativement simple à mettre en oeuvre, et utilisée régulièrement dans de nombreux laboratoires. Elle se prête également aux contrôles de routine réalisés en cours de fabrication. Elle présente enfin une corrélation acceptable avec les résultats cliniques du prick-test. Invonvénients: Cette méthode complexe est malheureusement coûteuse et très difficile à mettre en oeuvre et ne peut donc pas être utilisée en routine. Méthodes immunologiques Il existe aussi toute une série de méthodes immunologiques pour doser les protéines du latex. Ces techniques sont plus spécifiques des protéines allergéniques que le dosage des protéines totales. Plus de 50 protéines différentes présentant des propriétés allergéniques ont été caractérisées à ce jour dans le latex. Dans les extraits préparés à partir de gants en latex, on trouve surtout, à côté de certaines protéines, une grande quantité de fragments protéiniques qui contiennent les épitopes allergéniques (parties des molécules qui se lient aux lgE). Compte tenu de la multitude de protéines et de peptides allergéniques, il reste impossible à ce jour de standardiser et d’affiner les méthodes immunologiques de telle manière que tous les laboratoires du monde puissent caractériser les mêmes allergènes en concentrations comparables. Inconvénients: Toute une série de composés chimiques risquent malheureusement de perturber la réaction colorée. Au cours de ces deux dernières années, il est cependant apparu que ces substances se raréfiaient. Analyse des acides aminés par HPLC (chromatographie liquide à haute pression) Ces méthodes utilisent l’acide chlorhydrique pour décomposer les protéines en acides aminés. Ces derniers sont alors séparés par HPLC puis dosés. La somme des différents acides aminés donne la teneur en protéines. Technique d’inhibition du RAST Technique d’inhibition ELISA (Enzym Linked Immuno Sorbend Assay = dosage immunoenzymatique) Ces approches utilisent les méthodes de dosage des lgE spécifiques d’allergènes, décrites plus haut, pour doser les protéines du latex. Un échantillon contenant de nombreux prélèvements sériques de patients allergiques au latex est mis à incuber avec des extraits de latex (pour la préparation des extraits de latex, voir le paragraphe consacrée au procédé d’extraction). Les allergènes du latex contenus dans l’extrait se fixent aux lgE correspondantes du sérum. Lors du dosage des lgE spécifiques du latex par l’une des méthodes décrites ci-dessus (RAST par exemple), les anticorps déjà fixés ne sont plus reconnus et ne peuvent plus être détectés. La diminution de concentration des lgE spécifiques par rapport à la teneur d’un échantillon non traité par l’extrait permet de calculer la concentration d’allergène dans l’extrait, grâce à des courbes d’étalonnage. On utilise comme solution de référence une solution d’allergène préparée à partir du latex et/ou d’extraits de gants. Ces procédés permettent de doser les protéines allergéniques dans des extraits de gants. Les résultats sont cependant fonction de trois facteurs non encore standardisés et ne sont donc pas comparables: Chaque pic correspond à un acide aminé. Les concentrations peuvent être déterminées d’aprés la surface des pics. Avantages: Cette méthode a l’avantage d’être totalement indépendante de la structure des protéines et de ne pas être perturbée par d’autres substances chimiques. Dans le projet de recherche mentionné plus haut, c’est le dosage des acides aminés qui s’est révélé le mieux corrélé au prick-test. 7 - L’allergène couplé à la phase solide Il faut s’assurer que toutes les protéines et tous les peptides actifs sur le plan allergologique, et contenus dans le gant, sont effectivement fixés à la phase solide. Les allergènes commercialisés varient d’un fabricant à l’autre. - La substance de référence utilisée pour préparer les courbes d’étalonnage La substance de référence doit contenir toutes les protéines et tous les peptides importants sur le plan allergologique. - Le mélange de sérums Le mélange de sérums doit contenir suffisamment de molécules d’lgE dirigées contre toutes les protéines et tous les peptides importants sur le plan allergologique. évidence par l’addition d’un second anticorps (lgG antilapin de caprin) qui réagit avec les anticorps de lapin. Ce second anticorps est marqué par une enzyme qui présente une réaction colorée lors de l’addition d’un substrat adapté. Cette coloration est mesurée par spectrophotométrie. Avantages: Il s’agit d’une technique très sensible. L’utilisation exclusive de sérums animaux permet de s’affranchir de toute dépendance vis-à-vis du sérum humain. Inconvénients: Ce test ne dose pas les protéines allergéniques du latex mais uniquement les protéines qui provoquent une réaction immunitaire chez le lapin (protéines antigéniques). Un autre inconvénient est que les protéines et les peptides dont la masse moléculaire est inférieure à 10 000 daltons ne se fixent pas complètement à la surface du polystyrène. Cette approche n’identifie donc que partiellement les protéines dans les extraits de gant, dans lesquels ces petites molécules représentent la majeure partie des protéines allergéniques. Avantage: Les techniques d’inhibition du RAST et d’inhibition ELISA sont extrêmement sensibles pour doser les protéines allergéniques du latex. Inconvénients: Les deux méthodes sont actuellement dépendantes de l’utilisation de sérum humain comme source d’lgE. Elles sont également onéreuses et longues à mettre en oeuvre et s’avèrent par conséquent inadaptées aux contrôles de routine en cours de fabrication. Glossaire Allergène Substance qui provoque une allergie chez des sujets prédisposés. Anticorps Substance immunitaire formée dans le sérum sanguin en réaction à l’introduction LEAP (Latex ELISA for Antigenic Protein) Ce procédé mis au point par Beezhold est une technique immunoenzymatique pour doser les protéines du latex. Il consiste à fixer par des liaisons non covalentes les protéines du latex contenues dans l’extrait de gant à la surface de plaques de microtitrage en polystyrène, puis à les incuber avec des anticorps anti-latex de lapin. Ces anticorps sont obtenus chez des lapins ayant reçu des protéines de latex purifiées qui ont provoqué la formation d’lgG. La quantité fixée d’anticorps de lapin dirigés contre les protéines du latex est mise en d’un antigène. Antigène Substance étrangère (bactérie par exemple) qui provoque la formation d’anticorps dans l’organisme. Caséine FEIA Protéine du lait de vache. Dosage immunoenzymatique à fluorescence. Inhibition Limitation ou suppression d’une réaction chimique sous l’effet d’une substance inhibitrice. Protéine à courte chaîne moléculaire. Impressum Édition et fabrication : Semperit Technische Produkte Ges.m.b.H. & Co KG, Editeur : Sempermed, Modecenterstrasse 22, A-1031 Vienne, Tel. +43-1-79 777-621, Fax: +43-1-79 777-630, E-Mail : [email protected], Rédaction : Martina Büchele 8 08/2004 DM1500843 Peptide