Comparaison de la composition chimique des cires épicuticulaires

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Comparaison de la composition chimique
des cires épicuticulaires des feuilles
et des fruits de l’arganier et Impact
sur la conservation et la valorisation
de cette espèce
Bouzoubaâ Z.1, F. Domergue D.2, René L.2
1 - INRA/CRRA Agadir. Boîte Postale 124 Inezgane.
2 - Laboratoire de Biogénèse Membranaire, Bordeaux, France
Résumé Les cires jouent un rôle important dans le maintien d’un statut hydrique fonctionnel chez la
plante. Ils ont un grand intérêt dans la conservation de la surface des organes en général et les
fruits en particulier, cet essai est conduit dans le but de caractériser et de comparer la composition
chimique des cires epicuticulaires des feuilles et des graines de l’arganier, un travail qui s’est fait pour
la première fois chez l’arganier.
L’analyse des constituants des cires epicuticulaires des feuilles et des fruits (épicarpe du fruit)
de 15 génotypes d’arganier collectés dans trois sites du sud ouest marocain, a été réalisée par
chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse CPG/MS. Les résultats ont
montré que les cires epicuticulaires avaient des compositions similaires sauf pour certains constituants.
Les alcanes, les acides gras, les aldéhydes, les alcools primaires, le squalène et les triterpènes sont
les principaux composés déterminés. Ces analyses ont également montré qu’il y a des constituants
qui sont présents dans les deux organes mais à des quantités variables. d’autres qui sont présents
chez l’un et non pas chez l’autre. Dans les feuilles, on n’a pas noté la présence d’alcane C21, d’acides
gras, d’aldéhyde C22 ni de squalène comme ce qui a été le cas pour les fruits. Chez ces dernières, on
n’a pas noté la présence d’alcanes C32 ni celle de C33 et ceci pour tous les génotypes étudiés, ce qui
est probablement du au milieu environnant. Les analyses statistiques concernant la composition et la
quantité relative des différents constituants, ont montré que les différences sont significatives entre
les arbres, qu’elles sont peu significatives entre les sites mais qu’elles sont hautement significatives
entre les organes (feuilles et fruits).
La composition chimique des cires varie selon l’arbre est l’organe (feuilles ou fruit) mais elle conserve
toujours son rôle principal qui est l’imperméabilité. Cette variation suggère des fonctions secondaires
de la cuticule (matrice des cires), impliquant des interactions chimiques avec l’environnement immédiat
de la plante comme la défense ou le camouflage contre les pathogènes ou les insectes phytophages.
Les cires epicuticulaires pourraient relâcher lentement des substances volatiles en favorisant la
saturation de la couche d’air limite qui se trouve à la surface des feuilles. L’intérêt de ce travail sur la
composition des cires qui sont des métabolites secondaires, pourrait amener à une sélection clonale
pour la tolérance à la sécheresse vue la relation étroite des cires avec la préservation de l’eau dans les
tissus. Il peut également servir à l’investigation dans une meilleure valorisation des sous produits de
l’arganier (épicarpe du fruit) vu les grandes teneurs de ces tissus en triterpènes et particulièrement en
squalène (produits largement utilisés en Industrie pharmaceutique).
Mots clès : Cires épicuticulaires ; Feuilles et fruits d’argan ; Composition Chimique ; CPG/MS ;
Valorisation.
Actes du Premier Congrès International de l’ Arganier, Agadir 15 - 17 Décembre 2011
sélection clonale pour la tolérance à la sécheresse vue la relation étroite des cires avec la préservation de l’eau
dans les tissus. Il peut également servir à l’investigation dans une meilleure valorisation des sous produits351
de
l’arganier (épicarpe du fruit) vu les grandes teneurs de ces tissus en triterpènes et particulièrement en squalène
(produits largement utilisés en Industrie pharmaceutique).
Mots clès : Cires épicuticulaires ; Feuilles et fruits d’argan ; Composition Chimique ; CPG/MS ; Valorisation.
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Summary
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Waxes play an important role in maintaining a functional water status in the plant. in general
it’s have a great interest in the conservation of the surface of organs as leaves and fruits in particular,
this experiment was conducted in order to characterize and to compare the chemical composition of
epicuticular waxes of leaves and fruits of argan tree; a work that was done for the first time for argan.
Analysis of constituents of epicuticular wax on leaves and fruits (epicarp of the fruit) of 15 genotypes
of argan tree collected at three sites in south west Morocco; Ademine, Argana and Taroudant. The
material was performed by gas chromatography coupled with mass spectrometry GC/MS for analyses.
The results showed that epicuticular waxes had similar compositions except for certain constituents.
Alkanes, fatty acids, aldehydes, primary alcohols, squalene and triterpenes were the main determined
compounds. The results also showed, that some constituents were present in both organs but in
varying amounts. others were present in one organ but not in the other. In leaves, we did not note
the presence of C21 alkane, fatty acid, aldehyde C22 or squalene as had been the case for fruits. In
the fruits, we didn’t note the presence of alkanes C32 and C33 for all studied genotypes, which is
probably due to the environment climate conditions. Statistical analyzes concerning the composition
and the relative amount of different constituents, showed that the differences are significant between
the trees, they are not significant between sites but they are highly significant between the organs
(leaves and fruit).
The chemical composition of waxes varied among trees and organes (leaf or fruit) but it still
retains its primary role that was waterproofing. This variation suggests secondary functions of the
cuticle (wax matrix), involving chemical interactions with the immediate environment of the plant as
defense or camouflage against pathogens or herbivores. Epicuticular waxes could slowly release volatile
substances promoting the saturation of the boundary layer of air which is at the leaf surface.
The interest of this work on the chemical composition of waxes which are secondary
metabolites, could result in a clonal selection for drought tolerance to the close relationship waxes
with the preservation of water in tissues. It can also be used for the investigation in a better an
efficient use of the argan tree products .The fruit epicarp showed large concentrations of triterpenes
and especially squalene (products widely used in industry).
Key words: Epicuticular waxes; Leaves and fruits of argan, Chemical Composition, GC / MS;
Valorization
Actes du Premier Congrès International de l’ Arganier, Agadir 15 - 17 Décembre 2011
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Introduction La cuticule des plantes supérieure est écologiquement très importante, elle constitue une
interface entre la plante et son environnement. Son rôle est de prévenir la dessiccation des plantes
dans les environnement à ressources en eau limitées (Chatterton et al., Schonher, 1976 ; Rîeder et
Markstadter, 1996 ; Rieder et Schreiber, 2001 ; Feakins & Sessions 2010). La cuticule joue un rôle
essentiel dans le contrôle des échanges hydriques entre la plante et son milieu extérieur autre que
celui régulé par l’intermédiaire des stomates (Schreiber et al., 1996). Elle agit comme une barrière
contre les pertes d’eau à travers la plante (Kerstiens, 1996a). Elle peut aussi protèger les tissus des
dommages mécaniques qui peuvent être causés par chocs divers (Baker & Hunt 1986), ou bien des
insectes (Eigenbrode, 1996).la cuticule peut aussi protéger les tissus photosynthétiques contre le trop
de lumière.
La fonction hydrophobe de la cuticule est essentiellement assurée par les cires qui rentrent
dans la composition chimique de la cuticule. Les cires sont de longues chaînes aliphatiques qui
jouent un grand rôle dans la préservation de l’eau de la plante. Elles sont impliquées dans plusieurs
paramètres adaptatifs de la plante à son environnement et sont considérées par plusieurs auteurs
dont (Bouzoubaâ et al., 2006 ;) comme un critère de sélection des plantes tolérantes à la sécheresse.
Leur quantité et leur composition sont très influencées par l’environnement.
Vue l’intérêt des cires dans le maintien d’un statut hydrique fonctionnel chez la plante et vu
l’intérêt que revêt les cires dans la conservation de la surface des organes en général et les fruits en
particulier, cet expérimentation a été conduite dans le but de visualiser et d’étudier la morphologie des
feuilles de l’arganier, de caractériser et de comparer la composition chimique des cires epicuticulaires
des feuilles et des fruits, un travail qui n’a jamais été réalisé auparavant sur l’arganier.
Nos objectifs sont donc :
- Déterminer, caractériser, et comparer la composition chimique des cires epicuticulaires
des feuilles et des fruits de l’arganier.
- Injecter
quelques réflexions pour la valorisation de l’espèce via la détermination de la
composition chimique de ces organes
Matériel et méthodes :
- Morphologie et répartition des cires épicuticulaires des feuilles de l’arganier
Matériel végétal : surface de la face supérieure et inférieure de feuilles d’arganier
Méthode : Observation au microscope électronique à balayage
Six feuilles d’un arganier d’Ademine, ont été délicatement essuyées, déshydratées puis leurs
surfaces (abaxiale et adaxiale) ont été métallisées avec une couche très fine de poudre d’or pour
l’observation des cires epicuticulaires au microscope électronique à balayage.
- Extraction et Analyses des cires épicuticulaires des feuilles et des fruits
- Matériel végétal : Feuilles et graines de l’arganier prises séparément sur 5 arbres par
site
- Sites de prélèvement : Ademine ; Argana ; Taroudant - Extraction et détermination de la quantité des cires : extraction au chloroforme et
détermination de la quantité par la méthode gravimétrique
Actes du Premier Congrès International de l’ Arganier, Agadir 15 - 17 Décembre 2011
détermination de la quantité par la méthode gravimétrique
-
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Analyses statistiques : les différents effets testés avec des analyses hiérarchisés.
Comparaison des moyennes par le test de Newman et Keuls à 5%
- Analyses statistiques : les différents effets testés avec des analyses hiérarchisés.
-Comparaison
Identification
des composés
par
en Couche Minces (CCM),
des moyennes
par le test
de Chromatographie
Newman et Keuls à 5%
révélation des
au réactif
de Macala
et détermination
à 366nm
(Figure
composés
- Identification
par Chromatographie
en Couche
Minces
(CCM), 1.).
révélation au réactif de Macala et détermination à 366nm (Figure 1.).
-
Analyses des constituants : par Chromatographie en Phase Gazeuse couplée à la
Spectrométrie
de Masse
CPG/MS
Spectrométrie
de Masse
CPG/MS
- Analyses des constituants : par Chromatographie en Phase Gazeuse couplée à la
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-
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56.)#2#%+.#)!
Figure 1. Séparation et
identification des const
des cires de l’arganier p
Chromatographie en co
mince. AG : Acides gra
Alc1 : Alcool primaires
Alcanes . 1, 2, 3, ……,
constituants de cires.
!!!
!
Figure 1. Séparation et identification des constituants des cires de l’arganier par Chromatographie
en couche mince. AG : Acides gras ; Alc1 : Alcool primaires ; Alc : Alcanes . 1, 2, 3,
……,13, : constituants de cires.
Principaux Résultats et discussions :
Principaux Résultats et discussions :
Morphologie
et répartition
des
cires épicuticulaires
des
de l’arganier!
--Morphologie
et répartition
des cires
épicuticulaires
des feuilles
de feuilles
l’arganier
Les observations réalisées au microscope électronique à balayage, ont permis de visualiser
Les observations réalisées au microscope électronique à balayage, ont permis de visualiser
la morphologie des cires, ainsi que la constitution de la surface foliaire aussi bien face
morphologie
des cires, ainsi que la constitution de la surface foliaire aussi bien face supérie
supérieur que inférieur, elle a également donné une idée sur la forme et la fréquence
que des
inférieur,
elleéléments
a également
donné
une
idée de
surla plante
la forme
fréquence des stomate
stomates ;
stratégiques
de la
relation
avecet
sonlaenvironnement
éléments
stratégiques
de la relation de la plante avec son environnement (figures.2 et 3).
(figures.2
et 3).
- Extraction et Analyses de la composition chimique des cires épicuticulaires des
feuilles et des fruits de l’arganier
L’analyse des cires epicuticulaires des feuilles et des graines (épicarpe de la graine) (figure 4), a
montré que les cires épicuticulaires des 15 génotypes avaient des compositions similaires sauf pour
certains constituants (figure 5 et 6). Les alcanes, les acides gras, les aldéhydes, les alcools primaires,
le squalène et les triterpènes sont les principaux composés déterminés. Ils sont à des teneurs et à des
pourcentages variables aussi bien dans la feuille que dans le fruit.
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L’analyse des cires epicuticulaires des feuilles et des graines (épicarpe de la graine) (figure 4),
354 a montré que les cires épicuticulaires des 15 génotypes avaient des compositions similaires
sauf pour certains constituants (figure 5 et 6). Les alcanes, les acides gras, les aldéhydes, les
alcools primaires, le squalène et les triterpènes sont les principaux composés déterminés. Ils
sont à des teneurs et à des pourcentages variables aussi bien dans la feuille que dans le fruit.
200!m!
500!
m!
500!m!
1000!m!
50!m!
200!m!
20!m!
10!m!
5!m!
2!m!
10!m!
20!m!
Figure 2. Observation au microscope électronique
! à balayage de la surface adaxiale d’une
feuille
âgée 2.
à différents
grossissements.
Les
Figure
Observation
au microscope
flèches indiquent les amas de cires.
!
Figure3. Observation au microscope électronique à balayage de la surface abaxiale d’une
Figure3.
au microscope Les
feuille
âgée àObservation
différents grossissements.
électronique
à les
balayage
de la
flèches
indiquent
stomates.
électronique à balayage de la surface
surface abaxiale d'une feuille âgée à
adaxiale d'une feuille âgée à différents
Ces analyses ont également montré qu’il y a des constituants
qui sont présents
différents grossissements.
Lesdans les deux
grossissements. Les flèches indiquent
flèches
indiquent
les
stomates.
organes
mais
à
des
quantités
variables
(Figure
7
A,
C
et
D).
d’autres
qui
sont
présents
chez l’un et
! les amas de cires.!
non pas chez l’autre (figure 7 B). Dans les feuilles, on n’a pas noté la présence d’alcane C21, d’acides
gras, d’aldéhyde C22 et de squalène (figure 7 C) ; comme ce qui a été le cas pour les graines. Chez ces
!
dernières, on n’a pas noté la présence d’alcanes C32 ni C33 et ceci pour tous les génotypes étudiés, ce
qui est probablement du au milieu environnant. Les analyses statistiques concernant la composition et
Ces analyses ont également montré qu’il y a des constituants qui sont présents dans les deux
la quantité relative des différents constituants, ont montré que les différences sont significatives entre
organes mais à des quantités variables (Figure 7 A, C et D). d’autres qui sont présents chez
les arbres, qu’elles sont peu significatives entre les sites mais qu’elles sont hautement significatives
l’un et non pas chez l’autre (figure 7 B). Dans les feuilles, on n’a pas noté la présence
entre les organes (feuilles et fruits).
!
d’alcane C21, d’acides gras, d’aldéhyde C22 et de squalène (figure 7 C) ; comme ce qui a été
le cas pour les graines. Chez ces dernières, on n’a pas noté la présence d’alcanes C32 ni C33
et ceci pour tous les génotypes étudiés, ce qui est probablement du au milieu environnant. Les
analyses statistiques concernant la composition et la quantité relative des différents
constituants, ont montré que les différences sont significatives entre les arbres, qu’elles sont
peu significatives entre les sites mais qu’elles sont hautement significatives entre les organes
(feuilles et fruits).
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Figure 4.Chromatogrammes
des principaux constituants des cires épicuticulaires des feuilles et
des graines de l’arganier
Actes du Premier Congrès International de l’ Arganier, Agadir 15 - 17 Décembre 2011
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Figure 5. Teneur en µg /g de poids sec des constituants des différents composés des cires
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épicuticulaires des feuilles de l’arganier
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Figure
6. Teneur en % des différents constituants des composés des cires épicuticulaires des
(')!>?!+$@$')!&6$$')/6.(+.#)!+%<!#$62)!)2#')!('!/$0,-A':'.#!
graines des 15 arbres correspondants aux trois sites de prélèvement
La composition
chimique
desdes
cires
varie
selon
elle
La composition
chimique
cires
varie
selonl’arbre
l’arbreest
estl’organe
l’organe(feuilles
(feuillesou
ou fruit)
fruit) mais
mais elle
conserveconserve
toujourstoujours
son rôleson
principal
qui
est
l’imperméabilité
(Médina
et
al.,
2006).
Cette
variation
rôle principal qui est l’imperméabilité (Médina et al., 2006). Cette
suggère variation
des fonctions
secondaires
de la
cuticule (matrice
des cires),
impliquant
interactions
suggère des fonctions
secondaires
de la cuticule
(matrice
des cires),des
impliquant
des
chimiques avec l’environnement immédiat de la plante comme la défense ou le camouflage contre
interactions chimiques avec l’environnement immédiat de la plante comme la défense ou le
les pathogènes ou les insectes phytophages (Eigenbrode & Esplie., 1995). Les cires epicuticulaires
camouflage contre les pathogènes ou les insectes phytophages (Eigenbrode & Esplie., 1995).
pourraient relâcher lentement des substances volatiles en favorisant la saturation de la couche d’air
Les cires epicuticulaires pourraient relâcher lentement des substances volatiles en favorisant
limite qui se trouve à la surface des feuilles (Stadler, 1986).
la saturation de la couche d’air limite qui se trouve à la surface des feuilles (Stadler, 1986).
Actes du Premier Congrès International de l’ Arganier, Agadir 15 - 17 Décembre 2011
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variation suggère des fonctions secondaires de la cuticule (matrice des cires), impliquant des
interactions chimiques avec l’environnement immédiat de la plante comme la défense ou le
camouflage contre les pathogènes ou les insectes phytophages (Eigenbrode & Esplie., 1995).
Les cires epicuticulaires pourraient relâcher lentement des substances volatiles en favorisant
la saturation de la couche d’air limite qui se trouve à la surface des feuilles (Stadler, 1986).
Figure 8. Structure chimique du squalène de ses précurseurs et dérivé
Figure 8. Structure chimique du squalène de ses précurseurs et dérivé
Le squalène (figure 8), un des constituants des cires épicuticulaires de l’epicarpe du fruit de
l’arganier,
présent
dans
les
cires
lavalorisation
feuille, des
est des
le précurseur
biochimique
de toute
famille
Lenon
squalène
(figure
un
des de
constituants
cires
épicuticulaires
de l’epicarpe
du la
fruit
de
nanotechnologie,
d’où8),
une
meilleure
biomolécules
des sous
produits
de
des stéroïdes.
Pyrophosphate
isopentényl
(PIP),
pyrophosphate
dimethylallyle
(DMAPP),
Géranyl
l’arganier.
l’arganier, non présent dans les cires de la feuille, est le précurseur biochimique de toute la
pyrophosphate
Il est largement
utilisé en
cosmétique
et enpyrophosphate
nanotechnologie,
d’où une meilleure
famille(GPP).
des stéroïdes.
Pyrophosphate
isopentényl
(PIP),
dimethylallyle
valorisation des biomolécules des sous produits de l’arganier.
(DMAPP), Géranyl pyrophosphate (GPP). Il est largement utilisé en cosmétique et en
/!
.!
!
0!
-!
Figure
7. Comparaison
des quantités
moyennes
par sites
certains
constituants
des différents
Figure
7. Comparaison
des quantités
moyennes
par de
sites
de certains
constituants
des
composés
de
cires
des
feuilles
et
des
graines
de
l’arganier ;
A :
Triterpènes ;
B :
le
Squalène ;
différents composés de cires des feuilles et des graines de l’arganier ; A : Triterpènes
; B : le C
Aldéhyde C26 ; et D : Alcool primaire C30 dans les trois sites d’études.
Squalène ; C Aldéhyde C26 ; et D : Alcool primaire C30 dans les trois sites d’études.
Conclusions et Recommandations
L’intérêt Actes
de ce dutravail
la composition
quiAgadir
sont 15
des- 17
métabolites
secondaires,
Premiersur
Congrès
Internationaldes
de l’cires
Arganier,
Décembre 2011
pourraient amener à une sélection clônale pour la tolérance à la sécheresse comme ça été
montré par Bouzoubaâ et al 2006 sur la quantité des cires sur les feuilles d’arbres de différents
357
Conclusions et Recommandations
L’intérêt de ce travail sur la composition des cires qui sont des métabolites secondaires, pourraient
amener à une sélection clônale pour la tolérance à la sécheresse comme ça été montré par Bouzoubaâ
et al 2006 sur la quantité des cires sur les feuilles d’arbres de différents sites de l’arganeraie. Il peut
également servir à l’investigation dans une meilleure valorisation des sous produits de l’arganier
(épicarpe des graines) vu les grandes teneurs en triterpènes et en squalène ; produits largement
utilisés en cosmétique et en nanotechnologie.
Références bibliographiques
Baker, E. A. & Hunt, M (1986). Erosion of waxes from leaf surfaces by simulated rain. New phytologist.
Vol 102. 161p.
Bouzoubaâ. Z., El Mousadik. A et Benlahcen Y. (2006). Variation in amounts of epicuticular waxes
on leaves of argania spinosa (L). Skeels. Acta Bot. Gallica 153(2), 167-177.
Chatterton N,J., Hanna, W. W., Powel J. B and D. R. Lee (1975). Photosynthesis and Transpiration
in bloom and bloomless . Can. J. Plant Sc., (55) : 641-643.
Eigenbrode. S. D. & Esplie.K, E.(1995). Effect of plant epicuticular lipids on insect herbivores.
Annuel Review of Entomology, (40), 171-194.
Feakins S.J. &Sessions A.L (2010). Controls on the D/H ratios of plant leaf waxes in arid ecosystem.
Geichimica et Cosmochimica Acta 74 (2010) 2128-2141.
Kerstiens, G. (1996a).Cuticular waterpermeability an dits physiological significance. J. Exper. Bot
(47) : 1813-1832
Médina, E. G.Aguiar, M. Gomez, J. Aranda, J. D. Medina and K. Winter.( 2006). Taxonomic
significance of the epicuticular wax composition in species of the genus Clusia from Panama.
Biochemical Systematics and ecology. Volume 34, Issue. (4).319-326.
Rîeder, M ; et Markstadter, C. (1996 ). Cuticular waxes : a critical assassement of current knowlede :
In : Plant Cuticles, an Integrated funcytional approach, Kersteins G (ed), BIOS Scientific Publishers.
Ltd., Oxford. 189-200.
Rieder, M. et Schreiber, L. (2001). Protecting against water loss : analysis of the barrer properties
of plant cutucles : J. Exp. Bot. (52) : 2023-2032.
Schonher,J. ( 1976) . Water permeability of isolated cuticular membranes : The effect of cutucular
waxeson diffusion of water : Planta(131) : 159-164.
Schreiber. L, Rieder M, Schorn K. (1996). Mobilities of organic compounds in reconstituted cuticular
wax of barley leaves : effects of monodispearse alcohol ethoxylates on diffusion of pentachlorophenoland
tetracosanoic acid. Pesticide science (48), 117-124.
Stadler, E. (1986).Oviposition and feeding stimuli in leaf surface waxes. In Insect and the plant
surface. B Juniper and R. Southwood Ed. 105-121. Edward Arnold. London U.K.
Actes du Premier Congrès International de l’ Arganier, Agadir 15 - 17 Décembre 2011