Neurofibromatose de type 1 - GER-NF
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Neurofibromatose de type 1 L’ expérience française Dominique VIDAUD UMR_S745 Inserm – Université Paris Descartes Service de Biochimie et Génétique moléculaire – Hôpital Cochin Genève 25 mars2013 1 centre de Référence : Hôpital Henri Mondor, APHP, Pr P. Wolkenstein La NF1 en France 1 centre de Référence : Hôpital Henri Mondor, APHP, Pr P. Wolkenstein # 10 centres de compétence répartis sur le territoire 2 laboratoires de diagnostic à Paris et à Lyon (Dr. S. Pinson) Laboratoires de recherche : - Orléans, CNRS UPR_4301, H. Bénédetti - Pr M. Peschanski, ISTEM, Généthon - INSERM UMRS_745, Pr M. Vidaud 2 associations de patients Activité de diagnostic Laboratoire de Biochimie et Génétique Moléculaire Chef de Service : Pr Marc Delpech Activité de recherche INSERM, UMR_S745 « Génétique, physiopathologie et approches thérapeutiques des maladies héréditaires du système nerveux » Directeur : Pr Michel Vidaud Organigramme Unité de Recherche Michel VIDAUD PUPH Ivan BIECHE MCUPH Chérif BELDJORD PUPH Catherine DODE MCUPH Marc JEANPIERRE MCUPH Béatrice PARFAIT MCUPH Michel VIDAUD PUPH Dominique VIDAUD MCUPH Chérif BELDJORD AHU PUPH Eric PASMANT Catherine DODE Post-doctorante MCUPH Séverine MARCOS Marc JEANPIERRE MCUPH Armelle LUSCAN Doctorante Béatrice PARFAIT Ingénieur MCUPHd’Etudes Ingrid LAURENDEAU Dominique VIDAUDIngénieur MCUPHAPHP Audrey BRIAND AudreyVARIN BRIAND Technicienne Ingénieur APHP Jennifer Eric PASMANT AHU technique Hassina HAFROZ Adjoint Service de Génétique Moléculaire Activité de diagnostic Laboratoire de Biochimie et Génétique Moléculaire Chef de Service : Pr Marc Delpech Environ 400 prélèvements par an : correspondants cliniciens dans toute la France, quelques correspondants étrangers En 2012 : 21 diagnostics prénatals (seul laboratoire en France ) Financements du diagnostic Dotation APHP du laboratoire : financement sur activité et sur publications Financements fléchés INCa pour les syndromes de prédisposition aux cancers (consommable et personnel) Financements sur Programmes Hospitaliers de Recherche Clinique (PHRC) Analyse moléculaire du gène NF1 : double approche ADN/ARN Genomic DNA extracted from blood leucocytes RNA extracted from blood leucocytes (PAXgene) 2 Four intragenic microsatellites genotyping pre-screening 1 Homozygosity Real-Time PCR-Based gene dosage Heterozygosity Deletion - cDNA sequencing Mutation - Mutation + Deletion + Custom high resolution Array CGH MLPA P081/P082 Mutation - 4,3% NF1 total deletion 0,5% NF1 large partial deletion Mutation - Dr. Dominique Vidaud Confirmation with genomic DNA + familial segregation Mutation + Custom high resolution Array CGH Coding exons sequencing Mutation + 89,4% 3,7% No NF1 mutation identification Confirmation with cDNA + familial segregation 3,4% 0,3% 3 Extrait de : Parfait B. et al. Human Mutation, en révision Bilan de l’étude moléculaire du gène NF1 en mars 2012 Diagnostic moléculaire efficace (95% des mutations identifiées) mais long et coûteux Problème des mosaïques responsables de NF1 segmentaires voire de formes paucisymptomatiques - mutation non identifiée sur l’ADN des cellules circulantes - accès à d’autres types cellulaires pas toujours simple File active très importante : environ 400 patients et 20 DPN par an Plateforme NGS Next Generation Sequencing • Grands gènes → NF1 • Etude simultanée de plusieurs gènes NF1 et SPRED1 NGS ciblé : Ion Workflow UMR_S 745 Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 149 Amplicons de 200 pb 2 pools de primers Cible : NF1 : région codante et UTRs : ~12 kb → couverture >98% Ion PGM™ Sequencer Mars 2012 Plateforme NGS Next Generation Sequencing DGOS/PNMR2 APHP - Associations Région Ile de France Inserm Franck Letourneur U1016 Ion PGM™ Sequencer Ion Proton™ System 5500 SOLiD™ System Analyse moléculaire des gènes NF1 et SPRED1 nouvelle approche ADN/ARN Genomic DNA extracted from blood leucocytes Four intragenic microsatellites genotyping pre-screening Homozygosity Real-Time PCR-Based gene dosage Heterozygosity Deletion - Deletion + NGS Custom high resolution Array CGH 4,3% NF1 total deletion 0,5% NF1 large partial deletion RNA extracted from blood leucocytes (PAXgene) Genomic DNA extracted from blood leucocytesd Dr. Dominique Vidaud Mutation - Mutation + Confirmation with DNA and cDNA Sanger sequencing + familial segregation No NF1 mutation identification cDNA sequencing MLPA P081/P082 + Custom high resolution Array CGH Conclusion : NF1, approche NGS Le NGS fonctionne ! Trois jours, < 100 € / patient 22 patients par puce 314 : profondeur de 150X 44 patients par puce 316 : profondeur de 100X Objectifs : • Passage en haut débit : 200 patients en prospectif • Développer un pipeline bioinfo efficace • Etude des formes au diagnostic difficile • Analyse d’exomes voire de génomes pour les familles NF1 négatives Génétique, physiopathologie et approches thérapeutiques des maladies héréditaires du système nerveux Directeur : Michel Vidaud Dotation Université Paris Descartes / INSERM Association Neurofibromatoses et Recklinghausen Ligue contre les Neurofibromatoses Ligue Nationale Contre le Cancer Fondation ARC pour la recherche sur le Cancer Vague D : Campagne d’évaluation 2012 - 2013 Unité de recherche Demande de création Génétique, physiopathologie et approches thérapeutiques des maladies héréditaires du système nerveux Directeur : Michel Vidaud Evaluation : janvier 2013 Réponse : # juin 2013 Voies de signalisation et neurofibromatose de type 1 Neurofibromatose de type 1 RASOPATHIES : SYNDROMES NCFC Syndrome Syndrome Syndrome Syndrome de LEOPARD de Noonan CFC Costello HAMARTOMATOSES Hémimégal encéphalie Syndrome Syndrome de de Cowden McCune-Albrigh GPCR X NF1 PY PY PY PY PY PY NRAS KRAS HRAS PIP2 PIP3 Gs PI3K AC PTEN ARAF SHP2 Gab1 BRAF PDK CRAF AMPc Grb2 SOS1 Spred1 MEK1 PKA MEK2 AKT3 Syndrome de Legius ERK1 ERK2 RSK Substrats cytoplasmiques Prolifération AKT1 TSC1/2 Rheb mTOR Complexe de Carney STK11 Survie cellulaire Syndrome de Peutz-Jeghers vHL HIF1α Apoptose Sclérose Maladie de tubéreuse de BournevilleVon-Hippel Lindau Syndrome de Protée PHENOTYPE Centre de référence Maladies Rares Neurofibromatoses Pr. Wolkenstein, CHU Henri Mondor GENOTYPE Base de données Service de Génétique Moléculaire Pr. Vidaud, CHU Cochin 561 familles NF1 1083 individus Mutations du gène NF1 ~90% Larges délétions du locus NF1 ~5% ~5% Recherche Négative Cahier d’observation clinique standardisé NF1 : projets de l’Unité de recherche • Corrélations phénotype / génotype • Identification de gènes de modification : ANRIL et SUZ12 • Etude de l’implication des gènes SUZ12 et ANRIL dans la tumorigenèse associée à la neurofibromatose de type 1 • Etude de la physiopathologie des tumeurs des gaines nerveuses des patients atteints de neurofibromatose de type 1 et évaluation de nouvelles approches thérapeutiques Etude de la variabilité phénotypique de la NF1 ? ? Facteurs environnementaux Facteurs génétiques Gène NF1 Modificateurs génétiques Mutation du gène NF1 Polymorphismes Pas d’implication du gène NF1 - pas d’influence de la nature de la mutation intragénique du gène NF1 - pas d’influence des polymorphismes du locus NF1 Implication de modificateurs génétiques Easton D.F. et al. An analysis of variation in expression of NF1 : evidence for modifying genes. Am J Hum Genet 1993, 53:305-313. Szudek J. et al. Analysis of intrafamilial phenotypic variation in NF1. Genet Epidemiol, 2002, 23:150-164. Sabbagh A. et al. Hum Mol Genet. 2009, 18:2768-78. Pasmant E. et al. J Med Genet. 2012, 49:483-9. NF1 : projets de l’Unité de recherche • Corrélations phénotype / génotype • Identification de gènes de modification impliqués dans la tumorigenèse associée à la neurofibromatose de type 1 • Etude de l’implication des gènes SUZ12 et ANRIL dans la tumorigenèse associée à la neurofibromatose de type 1 • Etude de la physiopathologie des tumeurs des gaines nerveuses des patients atteints de neurofibromatose de type 1 et évaluation de nouvelles approches thérapeutiques Neurofibromes Tumeurs bénignes des gaines nerveuses périphériques Classification par localisation : - Neurofibromes cutanés - Neurofibromes sous cutanés / nodulaires - Neurofibromes profonds Classification anatomopathologique : - Neurofibromes diffus - Neurofibromes plexiformes SNC Nf Plexi Nf cut MPNST Fascicule nerveux NF1+/- NF1-/- Neurofibrome Mastocyte Cellule périneurale Cellules de Schwann Gaine de myéline Fibroblaste Axone Tumeurs des gaines nerveuses • Neurofibrome • MPNST Cultures de cellules de Schwann Approches génomiques Validation fonctionnelle Gènes candidats Base de données génotype/phénotype NF France Pr. Wolkenstein Validation génétique Neurofibromes L’allèle T du SNP rs2151280 plexiformes d’ANRIL est associé à un risque d’un plus grand nombre de neurofibromes plexiformes CGH-array Gène candidat : ANRIL Base de données génotype/phénotype NF France Pr. Wolkenstein Validation génétique Gène modificateur Etude d’association sur données familiales Pasmant E, Sabbagh A, Masliah-Planchon J, Ortonne N, Laurendeau I, Melin L, Ferkal S, Hernandez L, Leroy K, Valeyrie-Allanore L, Parfait B, Vidaud D, Bièche I, Lantieri L, Wolkenstein P, Vidaud M. J Natl Cancer Inst. 2011;103:1713-22 SUZ12 Aguilo F. et al. Cancer Res 2011, 71:5365-9 p14/ARF tel E3 E2 α E1 ANRIL βE1 E1 E2 E1 ~300 pb p16/CDKN2A p15/CDKN2B E2 E3 E4 E5 cen chr.9p21 SUZ12 et tumorigenèse associée à la NF1 Cohorte d’étude Tumorothèque Hôpital Henri Mondor Pr. Karen Leroy Nf plexiformes MPNST CGH-array 400K Agilent Délétions homozygotes de SUZ12 Collaboration européenne Department of Human Genetics, Catholic University, Leuven, Pr. Eric Legius Institut de Génétique Médicale de Cardiff, Pr. Meena Upadhyaya MPNST MPNST Séquençage SUZ12 c.961G>T, p.Glu321* Mutations perte de fonction homozygotes SUZ12 et tumorigenèse associée à la NF1 Cohorte d’étude Tumorothèque Hôpital Henri Mondor Pr. Karen Leroy Nf plexiformes MPNST CGH-array 400K Agilent Délétions homozygotes de SUZ12 Collaboration européenne Department of Human Genetics, Catholic University, Leuven, Pr. Eric Legius Institut de Génétique Médicale de Cardiff, Pr. Meena Upadhyaya MPNST MPNST Séquençage SUZ12 c.961G>T, p.Glu321* Mutations perte de fonction homozygotes NF1 : projets de l’Unité de recherche • Corrélations phénotype / génotype • Identification de gènes de modification • Etude de l’implication des gènes SUZ12 et ANRIL dans la tumorigenèse associée à la neurofibromatose de type 1 • Etude de la physiopathologie des tumeurs des gaines nerveuses des patients atteints de neurofibromatose de type 1 et évaluation de nouvelles approches thérapeutiques Valider les modificateurs génétiques de la tumorigenèse NF1 par étude d’association génome entier Tumeurs NF1 Base de données génotype/phénotype NF France PHRC nationaux Approches génomiques HumanOmni5-Quad BeadChip Etude d’association génome entier Gènes modificateurs de la tumorigenèse NF1 Illumina 4,300,000 SNP + 500,000 custom markers Analyse des données : Dr. Audrey Sabbagh Gènes candidats PRC2, ANRIL et gènes cibles • PHRC National 2010 - Etude de l’expressivité de la NF1 : identification de gènes modificateurs (483 k€) • 5th joint call for European research projects on rare diseases : Collaboration : Pr. Eric Legius (Leuven), Pr. Ali Varan (Ankara) Inactivation des orthologues de SUZ12 et NF1 Double KO en cis murin de Suz12 et Nf1 Dr. Marcel Tawk Pr. Legius Pr. Cichowski Dr. de Raedt Department of Medicine, Harvard Medical School Gènes candidats SUZ12 et ANRIL Zebrafish → Cellules de Schwann WT Etudes fonctionnelles in vivo Projet modèles animaux Morpholino suz12a Double KO en cis murin de Suz12 et Nf1 Inactivation des orthologues de SUZ12 et NF1 Dr. Marcel Tawk Pr. Legius Pr. Cichowski Dr. de Raedt Department of Medicine, Harvard Medical School Gènes candidats SUZ12 et ANRIL Zebrafish Foxd3::GFP → Cellules de Schwann WT Etudes fonctionnelles in vivo Projet modèles animaux Morpholino suz12a chr4∆70kb/∆70kb Nf1flox/flox;Dhh-Cre (délétion ANRIL) (KO conditionnel Nf1 / Schwann) NF1 : projets de l’Unité de recherche • Corrélations phénotype / génotype • Identification de gènes de modification • Etude de l’implication des gènes SUZ12 et ANRIL dans la tumorigenèse associée à la neurofibromatose de type 1 • Etude de la physiopathologie des tumeurs des gaines nerveuses des patients atteints de neurofibromatose de type 1 et évaluation de nouvelles approches thérapeutiques http://www.ctf.org/CTF-Awards-Grants-and-Contracts/NF-Preclinical-Consortium.html 4 centres : Harvard Medical School/Brigham & Women’s Hospital Director: Karen Cichowski, Ph.D, chair of NFPC Tumor Focus: NF1 malignant peripheral nerve sheath tumors. University of California, San Francisco Director: Kevin Shannon, MD Tumor Focus: NF1 myeloid leukemia Cincinnati Children’s Hospital Medical Center Director: Timothy Cripe, MD, Ph.D. Deputy Director: Nancy Ratner, Ph.D. Tumor Focus: NF1 plexiform tumors & dermal neurofibromas Indiana University Director: D. Wade Clapp, MD, Ph.D. Assistant Director: Luis Parada, Ph.D. Tumor Focus: NF1 plexiform neurofibromas, dermal neurofibromas, astrocytomas NF1 : Thérapeutiques ciblées actuelles • Ranibizumab • Bevacizumab PY PY PY PY PY PY NF1 • Salirasib • TLN-4601 • Lonafarnib RAS • Tipifarnib • Imatinib • Sunitinib • Nilotinib • Cediranib • PLX108-01 • Sorafenib • ARRY-300 • ARRY-438162 • AS703026 • Selumetinib • AZD8330 • E6201 • GDC-0973 • GSK1120212 • RDEA119 • RO4987655 • TAK-733 • PD0325901 RAF MEK ERK http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=nf1 • GSK2118436 • PLX4032 • RAF265 • RO5126766 PI3K • Sorafenib • XL281 AKT • BGT226 • BEZ235 • GDC-0980 • SF1126 • XL765 mTOR • BKM120 • BYL719 • CAL101 • GDC-0941 • GSK2126458 • PF-04691502 • PX-866 • XL147 • GSK2141795 • MK-2206 • Perifosine • SR13668 • AZD2014 • AZD8055 • Everolimus • OSI-027 • Sirolimus • Temsirolimus • CC-223 • Ridaforolimus Nos outils In vitro - Lignées de cellules de Schwann dérivées de MPNST NF1 -/- : 88-13, 88-14, 90-8, 96-2, 94-3 NF1 wt : STS26T STS26T, x200 - Cultures primaires de cellules de Schwann issues de neurofibromes plexiformes Chirurgie plastique, reconstructrice et esthétique Pr Lantieri, Dr Hivelin Schwann primoculture, x200 In vivo - Xénogreffes orthotopiques de lignées MPNST sur souris nude Pr. Conxi Lazaro, Institut Català d'Oncologia, Barcelone - Poisson zèbre invalidé le gène NF1 Dr. Tawk, UMR 788, Inserm, université Paris-Sud 11 Nos outils • Analyses de transcrits : transcriptome, RT-qPCR • Analyse protéiques : western blot, Bio-Plex, NanoPro 1000 • Analyses cellulaires : -Cytotoxicité : MTT/WST-1 Sels de tétrazolium Réduction déshydrogénases mitochondiales Formazan (spectrophotométrie) - Prolifération : incorporation BrdU - xCELLigence, Plateforme de Cytométrie et d'Immuno-Biologie (CYBIO), Institut Cochin Mesure de l’activité cellulaire en temps réel Lignée 88-14 1000, 2000, 4000, 6000 cells/puits - Migration cellulaire (matrigel BD, XCelligence module migration) - Apoptose/nécrose (Annexin V - Iodure de propidium) actuellement évaluées sur les lignées Plateforme de Cytométrie et d'Immuno-Biologie (CYBIO), Institut Cochin UMR_S 745 "Génétique, physiopathologie et approches thérapeutiques des maadies hérédiaires du Système Nerveux" Principales Publications 2012 Principales Publications 2012 Principales Publications 2012 5 autres publications sont actuellement soumises , en révision 2013 : Projets - Collaborations Gènes de modification - Poursuite du travail : confirmation du rôle du gène ANRIL - Identification de nouveaux gènes : GWAS nécessité de doubler le nombre d’individus à analyser : PHRC 3, coordonateur Pr. P. Wolkenstein, équipe de Mondor et réseau NF France Physiopathologie des neurofibromes - Etudes in vitro : culture de cellules de Schwann nécessité de travailler sur tissu « frais » ; Pr. L. Lantieri, Dr. M. Hivelin physiopathologie des cellules de Schwann : C. Massaad, UMR 8194, UFR des Saints-Pères - Etudes in vivo : développement d’un poisson zèbre NF1 , M. Tawk, Université Paris 7 - Gènes impliqués dans la tumorigenèse : analyse exomique à grande échelle, Pr. M. Upadhyaya, Cardiff Projets - Collaborations « Agence de la Biomédecine » Appel d’offres Recherche 2013 Mise en place du diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques rares et sévères Coordinateur : Juliette NECTOUX (PH) Service de Biochimie et Génétique Moléculaire, GH Cochin-Broca-Hôtel Dieu Diagnostic prénatal « conventionnel » Contexte Risque génétique connu dans la famille Découverte d’une anomalie à l’échographie Dépistage (screening) de la trisomie 21 (âge maternel+marqueurs biochimique+clarté nucale) Quels prélèvements? Biopsie de trophoblaste (11SA) Amniocentèse (15SA) Sang fœtal Quels risques? Fausse-couche 0.5-1% Prématurité Hémorragie Infection JM COSTA Laboratoire CERBA, Pontoise-France Diagnostic prénatal : analyse sur cellules foetales Obtention de cellules foetales • Prélèvement endo-cervical (ou de lavage intra-utérin) • Sang maternel DPNI ADN fœtal plasmatique Physiopathologie • Origine cellulaire: les cellules cytotrophoblastiques • Apparition (détection) précoce dans la circulation maternelle ≈ 5-6SA • Augmentation de la concentration tout au long de la grossesse • Disparition rapide (< 48 h) après accouchement (1/2 vie 16 min) • Pas de persistance après grossesse Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel Y X Détermination du sexe fœtal : Recherche de séquences dérivées du chromosome Y (gèneSRY) – Maladies génétiques liées à l’X – – Hyperplasie congénitales des surrénales (déficit en 21-hydroxylase) – – Eviter un geste invasif (CVS) chez les patientes conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque) Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile) Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences différentes du génome maternel + Achondroplasie Maladie de Huntington Neurofibromatose de type 1 ou + + Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences présentes dans le génome maternel - Maladies autosomiques récessives Drépanocytose, thalassémies, mucoviscidose…. - Maladies autosomiques dominantes Neurofibromatose de type 1, Maladie de Huntington… Analyse de l’ADN fœtal plasmatique: le background maternel ADN foetal ADN foetal Analyse qualitative Analyse quantitative (Recherche de marqueurs fœtaux absents du génome maternel ) (Marqueurs fœtaux spécifiques ou non) Détermination du sexe foetal Aneuploïdies Génotypage RHD, Ce et Kell Maladies monogéniques AR et AD maternelle Achondroplasie (de novo), Maladie AD sporadique ou paternelle Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Diagnostic des maladies monogéniques autosomiques dominantes Analyse qualitative mutation + ou - > Analyse quantitative mutation > ou = ++ Analyse qualitative mutation + ou - Dosage génique foetal Analyse quantitative non spécifique: « single molecule counting » ADN foetal ADN foetal 95 maternal copies 95 maternal copies 5 fetal copies 7.5 fetal copies 100 copies 10.000.000 copies 102,5 copies 10.250.000 copies Plus le nombre de molécules analysées sera important, meilleur sera le résultat (sensibilité, fiabilité,…) Dosage chromosomique foetal Quantification par « massively parallel sequencing (MPS) » 18 patientes (terme médian: 18 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés 14 patientes (terme médian: 14 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés Réseau Français NF-France INSERM UMR_S745 Michel Vidaud Dominique Vidaud Ivan Bièche Béatrice Parfait Eric Pasmant Ingrid Laurendeau Coordinateur : Pr. Pierre Wolkenstein Hôpital Henri-Mondor, Créteil Dr. Salah Ferkal (Créteil) Pr. Pierre Vabres (Dijon) Pr. Dominique Gaillard (Reims) Pr. Philippe Bernard (Reims) Pr. JM Bonnetblanc (Limoges) Pr. Héléne Dollfus (Strasbourg) Pr. Bernard Guillot (Montpellier) Pr. Philippe Berbis (Marseille) Pr. Josette Mallan Mancini (Marseille) Dr. Véronique Laithie(Besançon) Dr. JF Cuny (Nancy) Pr. Jacqueline Chevrant-Breton (Rennes) Pr. M D’Incan (Clermont-Ferrand) Dr. Christine Francannet (Clermont-Ferrand) Dr. Christian Derancourt (Fort de France) Pr. Pierre Castelnau (Tours) Dr. Gérard Lorette (Tours) Dr. MN Loiseau (Poitiers) Dr. Valérie Viseux (Amiens) Dr. JC Léonard (Berck) Dr. Benoît Catteau (Lille) Pr. Yves Chaix (Toulouse) Dr. Patrick Combemale (Lyon) Dr. Stéphane Pinson (Lyon) Dr Jacques Guyotat (Lyon) Pr. JP Lacour (Nice) Pr. JF Stalder (Nantes) Dr. Xavier Balguerie (Rouen) Dr. Diana Rodriguez (Paris) Dr. JS Guillamo (Caen) Dr. Anne Dompmartin (Caen) • Hôpital Cochin Hôpital Mondor, Hôpital Trousseau, Hôpital Necker HEGP Association Neurofibromatose et Recklinghausen Ligue contre les Neurofibromatoses Ligue Nationale Contre le Cancer Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer
