le muscle
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La jonction neuro-musculaire : paradigme de la synaptogénèse Neurobiologie du développement Master 1 a fichard carroll Agnes Fichard-Carroll Université Montpellier [email protected] 2010 To build a synapse: signaling pathways in neuromuscular junction assembly Haitao Wu, Wen C. Xiong and Lin Mei* Development 137, 1017-1033 (2010) 2012: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC330298 3/pdf/13539_2011_Article_41.pdf 2014 a fichard carroll * Synaptogénèse syn = ensemble; haptein = toucher, saisir; La jonction neuro-musculaire Les synapses inter-neurones a fichard carroll Sujet du cours : * La formation de la jonction neuro-musculaire (NMJ) au cours du développement est le fruit d’interactions entre trois partenaires: l’élément pré-synaptique (le nerf), l’élément postsynaptique (le muscle) et la cellule de Schwann. Un haut degré d’organisation est nécessaire pour obtenir une synapse fonctionnelle. Les éléments pré et post-synaptiques acquièrent des caractéristiques structurales, ils doivent être correctement apposés l’un par rapport à l’autre, le nombre de synapses fait l’objet d’une régulation, etc… Les signaux qui permettent la coordination spatiale et temporelle nécessaire à la formation d’une NMJ fonctionnelle font l’objet de ce cours. a fichard carroll Plan a fichard carroll I) le muscle II) Innervation du muscle III) Les trois cellules de la NMJ IV) La membrane basale V) Biographie des acteurs de la NMJ VI) Le contact nerf muscle VII) La différentiation post-synaptique Les signaux positifs et négatifs participant au regroupement des AchR A) Qui contrôle la différentiation, le nerf ou le muscle? B) Remise en cause du paradigme Topoisomérase, Souris agrin -/-, Souris HB9 -/-, étude sur le zebrafish C) Voies Wnt D) Localisation et activité des noyaux sous-synaptiques E) Ce n’est pas fini: laminine, dystroglycan…and co! VIII) La différentiation pré-synaptique IX) La maturation de la NMJ, l’élimination synaptique, la maintenance synaptique. X) La reeline est-elle impliquée dans la maturation et l’élimination synaptique ? * Petite histoire de la jonction neuro-musculaire * 1928 Caractéristiques de synaptogénèse neuromusculaire microscopie optique (Tello et Cajal) 1936 Première démonstration de la transmission synaptique chimique au niveau de la NMJ de vertébré (Dale et al.) Années 50, la NMJ au M. Elec 1966 La libération du neurotransmetteur est quantique et vésiculaire (Katz et al.) Année 70, la synaptogénèse (SG) dépend de signaux entre le nerf et le muscle a fichard carroll 1970 Use of a snake venom toxin to characterize the cholinergic receptor protein. (Changeux, Kasai, Lee) 1987 Agrine et jonction neuro-musculaire , (McMahan) 1996 Defective neuromuscular synaptogenesis in agrin-deficient mutant mice, (Sanes JR ) Développement de la jonction neuro-musculaire: 2009, 140 publis Nat Neurosc J Cell Biol Neuron PNAS a fichard carroll I) le muscle a fichard carroll Le muscle squelettique est constitué de cellules musculaires cylindriques. Chaque cellule musculaire contient de nombreuses myofibrilles disposées parallèlement les unes aux autres dans le sarcoplasme. a fichard carroll Les contrôles nerveux de la motricité sont attribués à différentes structures nerveuses La posture est contrôlée pour l’essentiel au niveau du tronc cérébral Les mouvements volontaires sont contrôlés par le cortex cérébral La programmation du mouvement est assuré par les noyaux gris de la base (caudé putamen pallidum) a fichard carroll * * II) Innervation du muscle Le fonctionnement des muscles striées est tributaire du système nerveux Le système nerveux peut graduer la force, la durée, la vitesse de contraction du muscle Le système nerveux est sans cesse informé sur l’état du muscle (variations de longueur, de force etc) par des structures tels que les fuseaux neuromusculaires, les organes tendineux, et d’autres récepteurs a fichard carroll * Les muscles sont innervés par des neurones dont le soma se situe dans la partie ventrale de la substance grise de la moelle épinière ou dans le tronc cérébral, pour les noyaux moteurs des nerfs crâniens Les axones des motoneurones forment les racines ventrales et se joignent aux racines dorsales pour former un nerf mixte. a fichard carroll La composition de la membrane basale de la NMJ est proche de celle présente dans le reste du corps, à savoir collagen IV laminin nidogène hsPG a fichard carroll Un muscle (plusieurs fibres musculaires) est innervé par plusieurs motoneurones. Un motoneurone peut innerver plusieurs fibres C’est l’unité motrice : ensemble constitué par un motoneurone et les fibres musculaires qu'il innerve (entre 10 et 2000). Mais chaque fibre musculaire n’est innervée que par un seul axone C’est la plaque motrice : –synapse entre le neurone et la fibre musculaire; –une seule par fibre musculaire. La plaque motrice se compose de plusieurs boutons synaptiques Le motoneurone forment des branches a fichard carroll * Un muscle est innervé par plusieurs motoneurones a fichard carroll * Un motoneurone innerve plusieurs fibres: Unité motrice a fichard carroll * Chaque fibre musculaire n’est innervée que par un seul axone a fichard carroll * La plaque motrice se compose de plusieurs boutons synaptiques Le motoneurone forme des branches a fichard carroll * a fichard carroll * Vésicule de NT Zone active a fichard carroll La transmission synaptique neuro-musculaire a fichard carroll * Le potentiel d’action atteint l’extrémité pré-synaptique Dépolarisation de la membrane Ouverture des canaux calciques, influx de Ca++ dans le nerf Fusion des vésicules synaptiques à la membrane Libération d’Ach Fixation d’Ach sur son récepteur nicotinique sur le sarcolemme Influx d’ions sodium, petit efflux d’ions potassium dépolarisation du sarcolemme Propagation de la dépolarisation le long du sarcolemme et des tubules T Des protéines du sarcolemme (récepteurs DHP dihydropyridine) changent leur conformation, ce changement provoque l’ouverture de canaux calciques du réticulum sarcoplastique Le calcium pénètre dans le cytoplasme. Il se lie à la troponine-C Ceci modifie les interactions du complexe troponin-tropomyosin Ce complexe change de conformation ce qui permet l’interaction actine-myosine C’est bien plus compliqué que ça !!! a fichard carroll * * III) Trois cellules de la NMJ Le neurone La cellule de Schwann La cellule musculaire © Eric Krejci a fichard carroll A ce niveau, ces cellules sont très spécialisées et arborent des composés (organelles, molécules) qui ne se retrouvent pas nécessairement aux mêmes concentrations ailleurs dans la cellule a fichard carroll Le neurone Il y a par exemple peu de cytosquelette contrairement à l’extrémité de l’axone Mais - Des vésicules de neurotransmetteurs de 50nm de diamètre contenant de l’Ach - De nombreuses mitochondries (énergie pour la synthèse et la libération du NT) a fichard carroll * Le neurone Les vésicules de neurotransmetteurs et les mitochondries sont répartis spécifiquement dans la cellule. Les mitochondries sont rassemblées à proximité de la cellules de Schwann Les vésicules sont rassemblées dans la partie faisant face au muscle Thomas H Gillingwater a fichard carroll De plus les vésicules sont regroupées sous forme de petites plages denses sur la membrane pré-synaptique à l’endroit où les vésicules fusionnent avec la membrane plasmique Ces endroits sont appelés zone active. Ces structures sont associées à des canaux potassiques et calciques voltage dépendant qui favorisent la sécrétion calcium dépendante a fichard carroll Acétylcholine * a fichard carroll Active zone a fichard carroll La cellule musculaire (élément post-synaptique) * La membrane est spécialisée pour répondre rapidement et efficacement à la libération de neurotransmetteur. Elle comporte un taux faramineux de récepteurs à l’Ach (nbre d’AchRs > 10 000/um2) a fichard carroll * Récepteurs nicotiniques Nicotinic responses are of fast onset, short duration and excitatory in nature www.fotosearch.com/comp Receptor Skeletal muscle Autonomic ganglion CNS CNS Subunits α1,β1,δ,γ(ε) α3,α5,α7,β2,β4 α3,α4,β2,β4 α7,α8,α9 + +/- - + α-Bungarotoxin Hexamethonium Dihydro-βerythroidine Mecamylamine α-Bungarotoxin Mecamylamine Epibatidine Epibatidine Epibatidine ABT-418 αBungarotoxin Antagonists Agonists a fichard carroll Bungarus (Bungarotoxine) a fichard carroll * Récepteurs muscariniques Muscarinic responses are slower, may produce excitation or inhibition and involve second messenger systems, Antagoniste atropine a fichard carroll M1 M2 M3 M4 M5 Distribution Cortex, hippocampus Heart Exocrine glands, GI tract Neostriatum Substantia nigra Antagonists Pirenzepine AF-DX 116 pF-HHSiD Agonists Xanomeline, CDD-0097 G protein Gαq/11 Gαi/o Gαq/11 Gαi/o Gαq/11 Phospholipase Cβ Adenylyl cyclase inhibition Phospholipase Cβ Adenylyl cyclase inhibition Phospholipa se Cβ Intracellular response * La caractéristique la plus étonnante de la membrane plasmique musculaire concerne les dépressions qu’elle présente, dépressions qui s’invaginent directement à l’opposé des zones actives a fichard carroll Fig. 5: Basic shape of motor end plate: infoldings with wider longitudinal crests and narrow lower interfold parts. Widely opened axon terminal in green, synaptic vesicles in purple, basal lamina omitted. a fichard carroll * Les cellules de Schwann Il existe deux types de cellules de Schwann, myélinisante ou non Les c de Schwann non myélinisantes coiffent de leurs prolongements les terminaisons nerveuses, les isolant de l’environnement et leur apportant des substances trophiques. Les c de Schwann myélinisantes sont au contact pré-terminal de l’axone a fichard carroll * a fichard carroll * IV) La membrane basale recouvre la fibre musculaire s’invaginant dans chaque gouttière. MB © Eric Krejci a fichard carroll * Qu’est ce qu’une membrane basale? C’est une matrice extracellulaire particulière par sa composition chimique par son très haut degré d'organisation spatiale par sa structure stratifiée a fichard carroll Les constituants des membranes basales * Les collagènes sont de protéines homo ou hétérotrimériques, extracellulaires, comportant un ou plusieurs domaines en triple hélice. La structure en triple hélice est permise par la séquence primaire de la protéine qui présente une répétition de triplets Gly-X-Y. Il existe une trentaine de collagènes différents. Le collagène IV est le collagène présent dans les membranes basales a fichard carroll * a fichard carroll * Les laminines sont des grosses glycoprotéines (900 kDa). Il en existe au moins douze isoformes Elles sont principalement trouvées au niveau des membranes basales Elles sont formées de trois chaînes αβγ, liées par des ponts SS. La laminine 4 est présente au niveau de la jonction neuromusculaire a fichard carroll a fichard carroll * Le nidogène est une petite protéine se liant aux collagènes et à la laminine a fichard carroll Laminine, collagène, nidogène forment l’échafaudage de la membrane basale: La laminine peut interagir avec elle même Le collagène IV peut interagir avec lui même Le nidogène interagit avec les deux a fichard carroll * Des protéoglycannes sont aussi présents dans les membranes basales: Les protéoglycannes sont composés d’une partie protéique, la protéine coeur sur laquelle est attachée de façon covalente une à plusieurs chaines de polymères charges négativement: les glycosaminoglycannes a fichard carroll * Les glycosaminoglycannes sont formés d’une unité disacccharidique répétées n fois: HA, CS, HS, DS, KS Les PG peuvent être sécrétés, liés aux membranes intracellulaires (le perlecan) Ils permettent hydratation, résistance aux forces compressives, biodisponibilité de molécules... a fichard carroll * a fichard carroll * L’agrine est un HS-PG fondamental pour la NMJ a fichard carroll B = Z form * Chick agrin, Scotton et al., 2006 a fichard carroll a fichard carroll * Dans le muscle, il y a deux formes de membranes basales La mb basale extrasynaptique et la mb basale synaptique La mb basale extrasynaptique recouvre chaque myofibre Elle interagit avec les protéines membranaires associées à la dystrophine et supporte la cellule contre le stress des contractions. Des mutations dans le complexe dystrophine et au niveau des protéines qui structurent la membrane basale (laminine α2) conduisent à des myopathies, (la NJM est peu affectée). a fichard carroll * * Membrane basale extrasynaptique a fichard carroll * a fichard carroll Extrasynaptique a fichard carroll Synapse Laminine * La membrane basale synaptique a fichard carroll * Au niveau de la membrane basale de la NMJ, sont présentes d’autres molécules - acétylcholinestérase - neuréguline -N-CAM Etc…. a fichard carroll * V) Biographie des acteurs de la NMJ Les acteurs voyagent sur de longues distances avant de se retrouver à la synapse. a fichard carroll * Les fibres musculaires proviennent de cellules mésodermiques qui acquièrent leur identité myogénique dans le dermatomyotome des somites. Ces cellules engagées dans la différenciation musculaire migrent vers les sites où les muscles se forment a fichard carroll * a fichard carroll Les motoneurones prennent leur origine dans la portion ventrale du tube neural à partir de progéniteurs qui donnent aussi naissance aux interneurones et à la glie Les axones des motoneurones sortent du système nerveux central par les racines dorsales ou par les nerfs crâniens, cheminent jusqu’au muscle. Ils forment rarement des embranchements et le plus souvent innervent un seul muscle. Par contre intramusculairement, ils se ramifient pour innerver entre 10 et 100 fibres a fichard carroll * a fichard carroll Patterning the nervous system with BMP, PZ Myers Les cellules de Schwann dérivent des cellules des crêtes neurales a fichard carroll * Les cellules de Schwann et les axones moteurs traversent la partie rostrale des somites, ce qui leur donne leur arrangement en segment C’est sans doute à ce niveau que les cellules de Schwann s’associent aux axones moteurs qu’elles suivent jusqu’à la périphérie. Les axones moteurs durant ce voyage fourniraient les signaux de guidage et les stimulations mitogéniques aux cellules de Schwann (ce serait l’inverse durant la régénération, les c de Schwann en premier, axones ensuite). a fichard carroll * Les motoneurones, les cellules musculaires et les cellules de Schwann sont tous différenciés au moment de la synaptogénèse. Ils expriment des composants synaptiques même lorsqu’ils sont cultivés seuls. La synaptogénèse est donc plus une étape organisatrice qu’une étape inductionnelle a fichard carroll * Avant la synaptogénèse, les motoneurones présentent entre eux une certaine hétérogénéité moléculaire. Idem pour les muscles. Ceci pourrait favoriser des formations préférentielles entre partenaires appropriés.. a fichard carroll * Plusieurs étapes dans la SG L’approche et le contact La différenciation post-synaptique La différenciation pré-synaptique La maturation synaptique L’élimination des synapses La maintenance synaptique a fichard carroll VI) Le contact nerf muscle Les MN depuis la moelle épinière émettent des axones. Ils atteignent les muscles au moment où les myoblastes fusionnent. Dès qu’un MN contacte un muscle, la transmission synaptique s’enclenche mais n’est pas performante. Il n’y a pas encore de lame basale a fichard carroll * a fichard carroll * a fichard carroll Pendant l’étape suivante (1 semaine chez la souris), une synapse fonctionnelle se forme. Accumulation de vésicules synaptiques La fente synaptique augmente La membrane basale apparaît Augmentation du nombre de vésicules, apparition de zones actives, apparition de l’activité électrique a fichard carroll * VII) La différentiation post-synaptique Le problème: la clusterisation (regroupement) des récepteurs à l’acétylcholine (AchR) est une étape clé dans la formation de la NMJ. Comment et qui régule cette clusterisation spatialement (sous la terminaison nerveuse) et temporellement? a fichard carroll Les AchR sont présents à faible taux dans le myoblaste mais sont up-regulés durant la fusion. Ils atteignent alors une densité d’environ 1000/um2 répartie uniformément sur la surface cellulaire. Dans la fibre mature, la densité est de 10 000/um2 au niveau de la synapse et tombe à 10/um2 en s’éloignant de quelques dizaines de micron de la terminaison nerveuse a fichard carroll Comment s’ effectue cette redistribution? -Regroupement (clustering) des AchRs distribués à la surface. Ce regroupement serait « passif», les récepteurs seraient piégés alors qu’ils diffusaient librement dans la membrane -La stabilité des AchR après clustering augmente passant d’environ l j à 14 jours chez l’adulte -Activation des gènes codant pour les s-u d’AchR dans les ny sous-synaptiques -Répression transcriptionnelle des gènes AchR dans les ny non synaptiques a fichard carroll * A) Qui contrôle la clusterisation des récepteurs le nerf ou le muscle? L’agrine un régulateur positif de la clusterisation a fichard carroll Il existe une voie: Agrin—MuSK-rapsyne-AchR Elle constituerait le programme coeur de la différenciation post-synaptique. D’autres molécules viendraient moduler le programme. a fichard carroll a fichard carroll * Analyse de la taille des clusters dans les souris agrine -/- a fichard carroll Une isoforme de l’agrine dérivée des neurones est synthétisée à partir de la terminaison nerveuse et est déposée dans la lame basale. L’agrine en interagissant avec son récepteur favoriserait alors le regroupement des AchR a fichard carroll L’activité de l’agrine requiert l’activation postsynaptique de MuSK (phosphorylation) qui induirait le clustering des AchRs. Le lien entre l’agrine et Musk, qui est longtemps resté inconnu, serait la protéine: LRP4 (low density lipoprotein receptor-related protein 4) a fichard carroll a fichard carroll Musk semble être un organisateur maître du développement synaptique LRP4: le lien entre l’agrine et Musk? * Lrp4 mutant mice lacked AChR clusters, had aberrant presynaptic branching and a reduction in presynaptic sites — a phenotype remarkably similar to that of Musk mutants The extracellular domain of LRP4 binds to neural Agrin and forms a complex with MUSK, which was shown to be required for MUSK activation by Agrin and for AChR clustering in myotubes LRP4 co-localizes with MUSK at the NMJ and in cultured muscle cells LRP4 interact directly with both Agrin and MUSK, and the interaction between LRP4 and MUSK is enhanced by Agrin Although LRP4 alone could bind Agrin, the MUSK–LRP4 complex had higher binding affinity at high Agrin concentrations, such as those predicted in the synaptic cleft a fichard carroll Two papers reported identification of a long-sought agrin coreceptor, Lrp4 (Kim et al. in Cell and Zhang et al. in Neuron). In Neuron, Linnoila et al. report the identification of a new player in the agrinMuSK pathway, Tid1, which directly interacts with MuSK and is responsible for transducing signals from MuSK activation to AChR clustering, culminating in cross-linking to the subsynaptic cytoskeleton. (Nov 2008) New dogs in the dogma a fichard carroll L’activité électrique , un régulateur négatif de la clusterisation Sans agrine, differentiation post-synaptique aberrante Mais formation d’AchR cluster dans les souris mutantes sans agrine Possibilité de faire des souris sans choline acetyl transferase chAT -/Enzyme de synthèse de l’Ach Pas de neurotransmission Défaut dans la différentiation précoce post-synaptique (myotube avec plus d’une innervation, endplate bande élargie…) a fichard carroll * Double knock-out (DKO) agrin -/-, chAT -/-: La NMJ se forme , la différentiation pre-post synaptique est présente et persiste jusqu’à la naissance (mort des animaux à la naissance) a fichard carroll Agrin -/- : pb de différentiation synaptique ChAT -/-: défaut dans la différentiation post-synaptique Agrin -/- et ChAT -/-: moins de problème de différentiation synaptique Sans neurotransmission, le phénotype agrine -/- est sauvé = Pas besoin d’agrine en l’absence de neurotransmission = Une des fonctions de l’agrine serait de contrecarrer un effet local de dispersion dû à la neurotransmission au site synaptique a fichard carroll Jonction neuro-musculaire Nerf muscle cellule gliale Post-synaptique Nerf synthétise de la Z-agrine voie Agrine Musk LRP4 Regroupement des AchR * B) Remise en cause du paradigme: Le nerf est-il indispensable à la clusterisation Topoisomérase, Wang, top2b J.C. Wang travaille sur la topoisomérase 2β. Les topoisomérases sont les magiciennes du DNA. Elles permettent de changer la topologie du DNA le faisant passer sous ses différentes formes brins, super-enroulés etc permettant donc réplication, transcription Il existe une famille de topoisomérase 1α (enzyme bridging), 1β (rotation) 2α et 2β. a fichard carroll Top2β est impliquée dans la ségrégation des chromosomes mais son rôle est mal défini car certaines cellules ne possèdent pas de Top2β souris K.O. pour comprendre sa fonction Top2β +/-: pas de problème Top 2β -/-: mort à la naissance Jusqu’à E 15,5, les souris WT et mutées semblent identiques La mort semble provenir de problèmes respiratoires a fichard carroll Marquage à E 18,5 Sur le diaphragme Axones: anticorps anti - synaptophysine Muscle α-bungarotoxine : les axones ne connectent pas le muscle soit ils n’arrivent pas jusqu’à la cible soit ils ne synapsent pas a fichard carroll Marquage chronologique de E 13,5 à. E 18,5 Les axones atteignent le muscle mais ne se connectent pas Cependant sur la cellule musculaire, des clusters d’AchR correctement positionnés sont formés . - Soit le muscle n’a pas besoin du nerf pour organiser le regroupement. - Soit le nerf libère un signal diffusible . a fichard carroll De plus, les NMJ sont absentes du diaphragme et du muscle des membres mais présentes sur les muscles intercostaux . Tous ces muscles dérivent du dermatomyotome Mais seuls les muscles du diaphragme et du membre expriment un gène homeobox Lbx 1. NB: le développement des neurones sensoriels est aussi aberrant a fichard carroll Quel rapport avec la topoisomérase? Les problèmes surviennent tard dans le développement donc peu de chances pour que ce soit un problème de réplication ou transcriptionnel Des défauts dans la neurogénèse sont observés chez des souris mutées sur XRCC4 et la DNAligase IV qui contrôlent la réparation de l’ADN. TopIIbeta in activation/repression of developmentally regulated genes at late stages of neuronal differentiation. a fichard carroll Souris agrin -/-, Lin et al. Analyse fine des souris agrine -/-: E18,5 agrin-/- : synaptogénèse déficiente Par contre: E14,5 nombre de clusters identique dans les souris AGZ-/- et WT Après E 14,5 dans les souris AGZ -/-, le nombre de clusters diminue et se renforce dans les souris +/+ De plus, les clusters rapsyne se comportent comme les clusters AchR a fichard carroll Donc le muscle sans Z-agrin est capable de faire ses propres clusters * Analyse de la taille des clusters dans les souris agrine -/- a fichard carroll Confirmation: Souris HB9 -/-, HB9 est un facteur de transcription motoneurone spécifique Dans les souris null, le diaphragme se forme sans innervation Or présence de clusters d’AChR qui se positionnent correctement au milieu de la fibre musculaire. Donc sans nerf, clusterisation assez efficace a fichard carroll * Souris contrôle A E14,5 Présence de cluster aneural (flèches blanches) A E18,5 Les clusters sont apposés a fichard carroll * Remise en cause du paradigme Topoisomérase, Wang, top2b Souris agrin -/-, Souris HB9 -/-, a fichard carroll Etude sur le zebrafish Possible de voir le développement (transparent) a fichard carroll * * Cluster d’ACHr Neurone Le neurone ne prend pas la direction de la bande centrale Il rétablit la direction vers les clusters aneuraux a fichard carroll Marquage motoneurone : zebrafish transgénique motoneurones GFP (HB9-GFP) Cluster d’Achr : marquage BTX ( bungarotoxin) Thus, pre-formed postsynaptic specializations can participate in normal synaptogenesis, although their maintenance requires innervation a fichard carroll * Assembly of the postsynaptic membrane at the neuromuscular junction: paradigm lost Terrance T Kummer, Thomas Misgeld and Joshua R Sanes Current Opinion in Neurobiology 2006, 16:74–82 J. Sanes a fichard carroll Previous and new views of neuromuscular synaptogenesis a fichard carroll * Encore un effort….. a fichard carroll C) Voie Wnt et jonction neuro-musculaire a fichard carroll Morphogènes de la famille des WNTs impliqués dans le DEVELOPPEMENT des organismes en fournissant des informations positionnelles Régulation anormale de la voie WNT» est impliquée dans la Maladie d’Alzheimer, la maladie de Huntington , les schizophrénies - Rôle dans les neurones post-mitotiques Famille WNT -19 membres de la famille chez les souris et les hommes - 11 récepteurs conventionnels appelés Frizzled chez les mammifères Ainsi que des récepteurs non conventionnels (DRL, ROR2) a fichard carroll a fichard carroll Les WNTs sont sécrétés aussi bien par le nerf que par le muscle et pourraient être synthétisés par les cellules gliales Régulation autocrine possible (chez la drosophile) a fichard carroll WNT3 induit le pre-clustering des récepteurs AchR avant l’innervation (Wbt11r:zebrafish) a fichard carroll WNT3 est impliqué dans le clustering après innervation a fichard carroll WNT3a et la libération d’acetylcholine disperse les AchR Un signal rétrograde induit par les B-catenin régule le développement de l’ élément pré-synaptique a fichard carroll Henriquez JP et Salinas PC 2012 Acta Physiol a fichard carroll Les WNTs pourraient avoir à la fois des fonctions synaptogéniques et anti-synaptogéniques Le rôle antagoniste des WNTs permettrait d’affiner l’architecture synaptique et interviendrait dans l’élimination synaptique a fichard carroll * D) Localisation et activité des noyaux sous-synaptiques Le problème: Les noyaux des cellules musculaires situés près de la synapse n’ont pas la même activité transcriptionnelle (transcription des AchR par exemple) que les noyaux situés à distance de la synapse. Comment s’effectue la régulation de la transcription des AchR ? a fichard carroll * Activité électique Ach Répression transcription Endocytose récepteur a fichard carroll E) Rôle de la laminine et du dystroglycan Autres protéines impliquées dans la formation de la NMJ LAMININES Laminine 1, présente tôt au cours du développement, et au moment de la synaptogénèse - Laminine 2 tout au long du développement - Laminine 4, expression commence au moment de la synaptogénèse a fichard carroll Forte expression de la laminine 2/4 au moment des premières synapses Laminine 1 et Laminine 2/4 peuvent induire le clustering des AchRs Ce clustering a une cinétique plus lente, est plus grand, et de densité plus forte rapport à l’agrine. * * a fichard carroll La chaîne β2 de la laminine est cruciale pour la différenciation pré et post-synaptique. K.O: Différenciation Post-Synaptique: moins de plis. Les souris ont des terminaisons nerveuses aberrantes: les cellules de Schwann envahissent la synapse La transmission synaptique est altérée (moins de libération spontanée de NT) a fichard carroll * a fichard carroll Laminine * Properly formed but improperly localized synaptic specializations in the absence of laminin 4 Patton BI et al., Nat Neurosci. 2001 Jun;4(6):597-604. Nerve terminal branches were thinner and more varicose a fichard carroll . At P6, NMJs from wild-type (e) and lama4-/- (f) mice appeared similar. * Figure 2. Subtle morphological defects in NMJs of lama4-/- mice. Muscles from adult (9 months; a−d) or young (P6; e, f) mice were double-stained with antibodies to axonal and nerve terminal proteins (green), and with rBTX to label postsynaptic AChRs (red). (a) In wild-type adults, motor axons form branched terminal arbors that precisely appose branches of the AChR-rich postsynaptic membrane. (b, c) Most ( 90%) lama4-/- NMJs were qualitatively similar to controls, except that nerve terminal branches were thinner and more varicose. (d) At 10% of lama4-/- NMJs, terminal arbors consisted of fewer and thicker branches. (e, f) During the first postnatal week, the AChR-rich postsynaptic site is plaque-like, and nerve terminals are slender and intertwined. At this age, NMJs from wild-type (e) and lama4-/- (f) mice appeared similar. a fichard carroll Il faut moins d’agrine pour obtenir un c1ustering parfait sur des myotubes traités au préalable par de la laminine a fichard carroll L’agrine et la laminine pourrait agir en synergie La laminine pourrait en activant une signalisation cellulaire proche de l’agrine, même à distance de la synapse, pourrait préparer les myotubes à 1’action de 1’agrine, Comment le démontrer? a fichard carroll Les clusters des protéines qui co-clusterisent avec les AchR sont différents quand ils sont induits par l’agrine ou par la laminine La laminine ne semble pas activer MuSK a fichard carroll Mais le pathway agrin et le pathway laminine ont des similitudes. L’agrine se lie aux laminines 1, 2 et 4 Les clusters induit par l’agrine et la laminine nécéssitent 1’ α-dystroglycan L’ intégrine α7β1est un récepteur de 1’agrine et de la laminine (son inactivation conduit à une pertubation du clustering) Le clustering par la laminine comme pour l’agrine requiert la rapsyne a fichard carroll * a fichard carroll a fichard carroll * Dystroglycan Les protéines associées à la dystrophine (DAP complex) sont responsables de dystrophies musculaires. Elles interviennent aussi à la NMJ. Le dystroglycan: Le gène Dag1 code pour a et b-dystroglycan Les souris K.O. meurent à E 6.5 Pourtant, on a pu montrer que des souris sans Dg présentent des pathologies musculaires ressemblant à des dystrophies. Comment? a fichard carroll Chimaeric mice deficient in dystroglycans develop muscular dystrophy and have disrupted myoneural synapses. Côté PD et al., Nat Genet. 1999 Nov;23(3):338-42. Contribution des cellules ES à la souris chimère Les souris 129 utilisées pour faire le K.O Glucose phosphate isomerase = Gpi Souris 129 et C57BL16 ont des isoformes de la Gpi qui sont différentes: GpiA=129 GPiB= C57BL16 Les Gpi forment des dimères Souris 129 Gpi AA: rouge C57BL16 Gpi BB: blue Souris chimère mixte GpiAB: bleu a fichard carroll Le degré de chimérisme varie d’une souris à l’autre Contrairement aux tissus cardiaques, certains tissus musculaires des membres peuvent dériver uniquement des cellules 129 Analyse de la jonction neuro-musculaire a fichard carroll * a fichard carroll 129 K.O. rouge Biceps Gastrocnemulus a fichard carroll SOURIS DIFFERENTES * Adducteur Coeur a fichard carroll * a fichard carroll a fichard carroll Le dystroglycan intervient donc dans la formation de la NMJ a fichard carroll * Conclusion (Sanes, Current Opinion in Neurobiology 2006 First, concentration of NMJs in a central end-plate band does not merely result from the central entry point of the motor nerve; Instead, muscles possess a nerve-independent pre-pattern that targets postsynaptic sites to their centers. Second, ingrowing axons do not necessarily ignore prepatterned AChR clusters; some are recognized and incorporated into synapses. Third, neurotransmitters play multiple roles in early synaptogenesis, including provoking the dispersal of prepatterned AChR clusters. a fichard carroll * Fourth, nerve-derived agrin counteracts activity induced dispersal, functioning at least in part as an ‘antideclustering’ factor to stabilize nerve-contacted AChR aggregates. (Fifth, neuregulin is crucial for NMJ formation as a Schwann cell trophic factor, but its direct effects on the postsynaptic membrane are subtle.) Sixth, subsynaptic nuclei are dispensable for synaptogenesis. Seventh, nerve-independent machinery can pattern the mature, branched postsynaptic array. a fichard carroll Pour garder les idées claires Des signaux positifs et négatifs participent à la clusterisation des récepteurs à l’acétylcholine: -Les ACHr pourraient se redistribuer plus particulièrement à la synapse à partir de clusters primitifs soit par mouvements latéraux, par diffusion membranaire ou endo et excocytose - Les noyaux sous-synaptiques ont une activité transcriptionnelle spécifique - Le turnover des AChR est réduit quand ils sont clusterisés. Les fibres motrices activent les fibres musculaires en libérant l’Acétylcholine . L’activation du muscle inhibe le clustering des AchR, supprime l’expression des AchR et déstabilise les clusters dans toute la fibre musculaire (signal négatif) - Les nerfs libèrent des signaux positifs comme l’agrine qui favorise la clusterisation - D’autres signaux (Wnt, dystroglycan etc…) participent à la différenciation Ppost-synaptiques a fichard carroll Agrine Ach Diffusion AchR Act Transcr Noyaux a fichard carroll + Wnt, LN Dystroglycan … Image claire Idées claires !!!! VIII) La différentiation pré-synaptique (nerf) Les cônes de croissance peuvent libérer des neurotransmetteurs en réponse à une stimulation électrique avant même d’avoir contacté le muscle La transmission synaptique se met en place quelques minutes après le contact nerf muscle Cependant, les synapses sont faibles la densité en AchR est pauvre et peu de transmetteurs sont libérés a fichard carroll * * a fichard carroll www.scorcher.ru/neuro/science/memory/mem1.php. * Les terminaisons nerveuses ressemblent à des élargissements en forme de bulles, elles ne proviennent pas nécessairement du cône de croissance Elles ne présentent que peu de vésicules synaptiques, pas de zone active Les vésicules synaptiques augmentent se regroupent, les éléments cytosquelettiques de l’axone disparaissent. Le volume synaptique augmente. a fichard carroll Les spécialisations pré-synaptiques ne se forment qu’ au site de contact avec les muscles, aussi bien en situation normale, qu’après ré-mnervation ou même en co-culture nerf muscle Donc, Des facteurs dérivés de la cible organisent la différenciation pré-synaptique a fichard carroll * Plusieurs molécules interviennent dans la différentiation pré-synaptique. Parmi elles, la laminine b2, FGF2, collagène IV Fox M.A et al., Cell, 2007, 129, 179-193 a fichard carroll Collagène IV 6 gènes 3 isoformes [α1]2α2, (α3)(α4)(α5), [α5)]2(α6) a fichard carroll * * Collagène IV 6 gènes 3 isoformes [α1]2α2, (α3)(α4)(α5), [α5)]2(α6) a fichard carroll Collagène IV * α2, α3, α6 cluster neurotransmitter vesicles in motoneurons (in vitro) In vivo, les chaînes de collagène IV n’apparaissent pas toutes en même temps α1 et α2 présentes partout dans la MB embryonnaire et dans la MB synaptique et extrasynaptique tout au long de la vie Les chaînes α3-6 ne sont pas détectées dans la MB embr apparaissent aux sites synaptiques vers la troisième semaine post-natale a fichard carroll * Les chaînes s’assemblent par 3, Règle des isoformes ex: Si COL4A3 est muté, la sous unité α4 ne sera pas présente puisqu’elle n’existe que dans l’isoforme (α3)(α4)(α5). Par contre la sous unité α5 sera présente puisqu’elle est incorporée dans l’isoforme [α5)]2(α6) a fichard carroll P21 A P21, pas de défauts visibles dans les souris Col4A5 -/Y P56 A P56, récepteurs fragmentés plutôt que branchés, clusters non apposés a fichard carroll * * Axones pré-terminaux distendus dans les mutants Syt: synaptogamin, NF, neurofilament a fichard carroll * Effets séquentiels Organisateurs multiples a fichard carroll
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