Le projet INDIRA

PROJET INDIRA
Rapid assays to evaluate the INDIvidual RAdiosensitivity
Tests rapides pour l’évaluation de la
radiosensibilité individuelle :
application à une cohorte de volontaires sains
PROJET INDIRA
Buts:
1. établir une cohorte représentative de la population générale
2. déterminer les sous-populations radiosensibles
à l’aide de tests fonctionnels
Fonctions biologiques ciblées:
signalisation et réparation des cassures double brin de l’ADN
la quasi-totalité des maladies génétiques associées à une radiosensibilité sont également
associées à une déficience de réparation ou de signalisation des CDB
CONSORTIUM INDIRA
N FORAY
INSERM
UMR1052 - Lyon
M MARTIN
CEA/INSERM
DSV/UMR987- Evry
C TELION
AP-HP
SAMU - Paris
N UGOLIN
CEA
DSV – Fontenay-aux-Roses
COHORTE INDIRA
Responsable de l’établissement de la cohorte:
Dr. Caroline TELION, SAMU de Paris
Base:
volontaire et anonyme
personnel susceptible d’intervenir dans des conditions d’urgence nucléaires
définition des critères d’inclusion/exclusion
cadre légal et éthique: déclaration à la CNIL, dossier déposé auprès du CCP
de Necker
questionnaire administratif et médical
recrutement de 500 hommes sains du SAMU–SMUR de Paris
prélèvements au SAMU
envoi aux 3 laboratoires
QUELS TISSUS ?
Sang
cancers RI, accès facile, lymphocytes sanguins
Peau:
dommages et cancers RI, accès facile
fibroblastes: données de radiosensibilité majoritairement acquises sur
fibroblastes cutanés
kératinocytes: représentatifs des cellules épithéliales, cibles majeures de
cancers RI
PRELEVEMENTS CUTANES
follicule pileux
derme
épiderme
kératinocytes
fibroblastes
kératinocytes
tests
rapides
cellules primaires
banques
banques
tests
secondaires
reproductibles
PRELEVEMENTS SANGUINS
lymphocytes du sang périphérique à partir d’une goutte prélevée par piqûre
au bout du doigt
FAMILLE ATM ET SIGNALISATION DES
DOMMAGES
H2AX-γγ
signalisation
majeure
MRE11
initiation
53BP1
signalisation
secondaire
1) ATM: UNE PROTEINE CLE DE LA
SIGNALISATION DES DOMMAGES
Sérine/thréonine protéine kinase, réponse aux dommages génotoxiques
présente normalement sous forme de dimère inactif
activée suite à une cassure double-brin par auto phosphorylation au niveau de la
sérine 1981, entraînant une dédimérisation
ATM induit une cascade de signalisation
phosphorylation de protéines cibles
recrutement au site d’ADN endommagé de protéines
Translocation nucléaire d’ATM
ATM
ATM
P
signalisation
réparation
La translocation d’ATM serait un paramètre sensible et discriminant
90% des patients groupe II présentent une
séquestration d’ATM dans le cytoplasme
Activité kinase nucléaire d’ATM :
reliée à la radiosensibilité clinique
Groupe I
60
50
Groupe II
40
30
Groupe III
20
10
0
0
1
2
3
4
5
Severity tissue reaction grades
6
Programme INDIRA - ATM
1) étude de la translocation nucléaire d’ATM
analyse de foci
2) activité kinase nucléaire d’ATM
Equipe Lyon coordinatrice d’un projet
Plan Cancer / Aviesan sur l’analyse des foci nucléaires
fournira les moyens mathématiques
et biostatistiques nécessaires à l’analyse
2) MRE11
Mre11 du complexe Nibrine (Mre11-Rad50-Nbs1, MRN)
initiation de la signalisation de la réparation des CDB
recrute ATM
activités 3' to 5' exonuclease et endonuclease
test des foci pour cibler l’initiation
3) L’HISTONE H2AX
Les cassures double brin de l’ADN activent ATM
qui phosphoryle l’histone H2AX sur la sérine 139
(H2AXγ).
signal majeur de recrutement des protéines de
signalisation et de réparation des dommages
se lie à l’ADN sur une très longue séquence de
part et d’autre de la cdb, foci sur plusieurs milliers
de nucléosomes
très bons anticorps, test très sensible
le plus utilisé
5’
Radiorésistance des cellules souches de la peau
Souches
descendance
Doses cliniques
KSC résistantes
4
2 Gy - γ rays
*
n=3
p < 0.05
control
*
2 Gy
100
% survie
12
10
8
12
6
10
4
28
06
Faibles doses
diagnostic médical
*
75
*
50
25
Sensitive KP
Resistant
KSC KSC
0
0 Gy
10 mGy
2 Gy
Rachidi et al., Radiother Oncol, 2007
Control
KP
2 Gy
5min
2 Gy
15min
2 Gy
24H
foci H2AXγ
radiosensibilité liée à une
réparation lente et incomplète
des cassures db
KSC
Harfouche G et al., Stem Cells, 2010
Exemple d’étude sur une patiente déclarée radiosensible : pH2AX
pH2AX
100
80
60
LIG4-/40
Patient
20
pDNA-PK
Témoin
0
0
5
10
15
20
Temps de réparation (h)
Massart et al., submitted
25
Unrepaired DSB recognized by NHEJ: link to clinic
30
Group III
25
20
Group I
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
Severity tissue reaction grades
6
4) 53BP1
signalisation des cassures double brin de l’ADN
53BP1 est transloqué au noyau et forme
de larges foci près de la lésion
interagit avec H2AX-γγ
recrutement indépendant de ATM et AR
favorise le NHEJ et inhibe RH
Test des foci complémentaire
du test H2AX-γγ
Programme INDIRA: analyse des foci
. sur fibroblastes et kératinocytes
. pH2AX, pATM, MRE11 et 53BP1
. doses: 1 à 2000 mGy
. temps post-irradiation: 10 min à 24 h
. cellules ensemencées sur lames d’immunofluorescence.
. microscope Olympus d’analyse de masse
de type ScanR avec automatisation des procédures
. analyse de plusieurs centaines à plusieurs milliers
de noyaux cellulaires par donneur
Programme INDIRA: puces H2AXγγ
cellules sanguines
follicules pileux
Protéines issues
d’extraction rapide
20 s
Quantification de la phosphorylation
Incubation sur puces à anticorps anti-H2AX n
plaques 96 puits
Détection fluorescence /chemiluminescence
Détermination du rapport H2AX/H2AXγγ
Cytométrie en flux
Intercomparaison des données
Les mesures obtenues par les différentes méthodes étant de natures différentes ne
seront initialement pas directement comparables.
Toutes les mesures seront normalisées à une même échelle.
Différentes méthodes de normalisation seront comparées, notamment différents
référentiels internes seront appliqués pour minimiser et/ou éliminer les variations des
signaux dues à une modulation globale de la cible que ne serait pas liée à l'irradiation.
Les mesures obtenues seront comparées par différentes méthodes de corrélation
linéaire et non linéaire (notamment la méthode EM2PCA -CEA/LCE (Equipe FAR).
PROJET INDIRA
Rapid assays to evaluate the INDIvidual RAdiosensitivity
Tests rapides pour l’évaluation de la
radiosensibilité individuelle :
application à une cohorte de volontaires sains
Livrables majeurs:
. identification de facteurs individuels de radiosensibilité
. définition de test prédictif/modèle cellulaire rapides et fiables
pour une situation d’urgence et de masse
. et plus si affinités scientifiques…