Document n° 1 : Quelques caractéristiques de souches Corynebacterium glutamicum type sauvage et de la voie de biosynthèses de la lysine Corynebacterium est un genre du phylum des Actinobacteria (bactéries à paroi de type gram positif et % de GC élevé). Les Corynebacterium sont chimioorganotrophes. Les souches de l'espèce Corynebacterium glutamicum sont aérobies strictes. La lysine est synthétisée chez ces bactéries – sur milieu avec glucose comme source de carbone - selon la voie de biosynthèse présentée ci-dessous : Voie de biosynthèse de la lysine et sa régulation chez Corynebacterium glutamicum de type sauvage. Le glucose est la source de carbone. Des éléments concernant des voies de biosynthèse connexes sont présentés. Des éléments de régulation sont présentés. PEP = phosphoénolpyruvate. OAA = oxaloacétate. ASP = aspartate. βASP-P = β-aspartyl-phosphate. β-SA-ASP = β-semialdéhyde-aspartate. Ec = enzyme aspartokinase. Eh = enzyme homosérine déshydrogénase. Les consommations d'ATP et de pouvoir réducteur (NADPH,H+) liées aux biosynthèses ne sont pas indiquées. Document adapté de JL Simon, Lysine, Techniques de l'ingénieur, J 6 390 -1 à 7. Document n° 2 : Suivi de la croissance de la souche Corynebacterium glutamicum mutant producteur au cours d'un essai de production de lysine La croissance est suivie par mesure de « l'absorbance à 660 nm » (DO), conséquence du trouble lié à la biomasse. AT – 0411 Documents page 1 / 5 Document n° 3 : Relation DO biomasse sèche Une culture est conduite en fiole aérée agitée à 30°C en milieu minimal glucosé complémenté en leucine, valine, methionine et thréonine. La DO au temps zéro est de 1. La DO au temps 30 heures est de 60. 200 mL de milieu sont recueillis au temps 30 heures. La biomasse est collectée, lavée, séchée à 105°C et pesée. La masse obtenue est de 3,00 g. Document n° 4 Suivi de la biomasse, du glucose et de la lysine lors d'un essai de production de lysine Suivi de la biomasse, du glucose et de la lysine en fonction du temps de bioréaction lors d'un essai de production de lysine + : [biomasse] en g/L de biomasse sèche ○ : consommation du glucose en g/L □ : production de lysine en g/L Document adapté de Q. Hua, C. Yang, K. Shimuzu, Metabolic control analysis for lysine synthesis using Corynebacterium glutamicum and experimental verification, Journal of Biotechnology and Bioengineering (2000) vol. 90 N° 2, 184-192. Document n° 5 : Km de la β-fructosidase de Saccharomyces cerevisiae (enzyme libre) pour le saccharose On réalise des mesures de vitesse initiale pour différentes concentrations en saccharose dans le milieu réactionnel. Le mode opératoire et le traitement de chaque cinétique enzymatique est le suivant : - 9,9 mL de tampon de réaction à pH 5 et à 30°C avec une concentration donnée en saccharose ; - ajout de 0,1 mL de préparation enzymatique, homogénéisation, déclenchement du temps ; - prélèvements réguliers de 1 mL de milieu réactionnel, arrêt de la réaction par ajout d'un réactif permettant en outre de mesurer par absorptiométrie visible le glucose et le fructose apparus (méthode à l'acide 2,4dinitrosalycylique qui ne différencie pas le glucose et le fructose) ; - tracé du graphe [P] = f(t) et détermination de la vitesse initiale de réaction. [P] = concentration en glucose plus fructose divisée par deux ; t = temps. On obtient ainsi une série de vitesses initiales fonction de la concentration initiale en saccharose dans le milieu réactionnel. Les deux graphes suivants sont finalement obtenus. AT – 0411 Documents page 2 / 5 Document n° 6 : Analyse du comportement de la β-fructosidase aux concentrations élevées en saccharose Le graphe de gauche est obtenu en travaillant selon les conditions opératoires présentées dans le document n°5. Document n° 7 : Solutions de saccharose concentrées et inhibition de la β-fructosidase L'étude des solutions aqueuses de saccharose conduit aux résultats suivants : Quand la concentration en saccharose s'élève, les molécules de saccharose (S) peuvent s'associer, par interactions faibles, en dimères de saccharose (S+S SS). Les dimères ne sont pas substrat de la βfructosidase. Aux très fortes concentrations en saccharose, et selon des paliers vers 1 mol/L et 1,7 mol/L, les interactions faibles entre l'eau et le saccharose sont modifiées et on voit apparaître des molécules de saccharose à forme particulière sous l'effet d'un repliement du à l'apparition de liaisons faibles intra-moléculaires (formes S*) (S S*). Les formes S* du saccharose ne sont pas substrat de la β-fructosidase. Les deux phénomènes ci-dessus expliquent (au moins en partie) l'inhibition de la β-fructosidase aux concentrations élevées en saccharose : le substrat « réel » de l'enzyme disparaît. Document n° 8 : Inhibition de la β-fructosidase par les produits de la réaction glucose et fructose Du glucose ou du fructose sont introduits dans les milieux réactionnels de départ et on observe les inhibitions obtenues. : sans glucose ajouté ; □ : avec glucose 0,05 mol/L ; ● : : sans fructose ajouté ; ● : avec fructose 0,1 mol/L ; Δ : avec glucose 0,1 mol/L ; Δ : avec glucose 0,2 mol/L ; ○ : avec fructose 0,2 mol/L ; ○ : avec fructose 0,4 mol/L ; dans avec glucose 0,4 mol/L ; dans le milieu réactionnel le milieu réactionnel AT – 0411 Documents page 3 / 5 Document n° 9 : Mécanisme réactionnel de l'hydrolyse du saccharose catalysé par la β-fructosidase Le schéma montre les 2 résidus aminoacyls Glutamate 204 (Glu 204) et Aspartate 23(Asp 23) engagés dans l'acte catalytique. Les résidus aminoacyls intervenant dans la liaison du substrat ne sont pas mentionnés. Document n° 10 : Immobilisation de la β-fructosidase de Saccharomyces cerevisiae sur résine IRA96TM La résine IRA96 est une résine échangeuse d'anions (groupements fonctionnels amines). Les billes de résine fixent la β-fructosidase de Saccharomyces cerevisiae de façon stable à pH 5 et 30°C. La préparation enzymatique à immobiliser est une préparation ajustée à 500 U/mL en tampon pH 5 de faible force ionique. Par convention, 1 unité hydrolyse 1 micromole de saccharose en 1 minute à pH 5, à 30°C et [saccharose]=300 mmol/L dans le milieu réactionnel. 25 g de résine sont équilibrés à pH 5 et faible force ionique, décantés, séchés 24 heures à température ambiante et utilisés pour immobiliser 25 000 U d'enzyme (soit 50 mL de préparation d'enzyme). L'immobilisation est réalisée par agitation douce du mélange préparation enzymatique billes de résine pendant 30 minutes. Les billes de résine sont alors rincées avec le tampon pH 5 jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm du tampon rejeté devienne négligeable. Conservation à 0-4°C. AT – 0411 Documents page 4 / 5 Document n° 11 : Caractéristiques de l'enzyme immobilisée Pour caractériser l'enzyme immobilisée, on récupère les billes d'une manipulation d'immobilisation, on les égouttes à plat sur un tamis préalablement taré, on pèse et on répartit les billes en 50 lots de masse identique. Chaque lot est utilisé selon le mode opératoire suivant : on introduit un lot de billes dans 100 mL de tampon de réaction à pH 5, à 30°C, sous agitation et avec une concentration donnée en saccharose ; on déclenche le temps et on prélève régulièrement 1 mL de milieu réactionnel. On arrête la réaction par ajout d'un réactif permettant en outre de mesurer par absorptiométrie visible le glucose et le fructose apparus dans la phase aqueuse (méthode à l'acide 2,4-dinitrosalycylique qui ne différencie pas le glucose et le fructose) ; on trace le graphe [P] = f(t). [P] = concentration en glucose plus fructose divisée par deux ; t = temps. Le graphe permet de déterminer la vitesse initiale de réaction. (A) (B) Caractéristiques de l'enzyme immobilisée. En (A), droite [P]=f(t) pour [saccharose] = 300 mmol/L. Le coefficient directeur permet de déterminer la vitesse initiale de réaction pour la phase aqueuse. En (B), le tracé utilise les différentes vitesses initiales obtenues pour des concentrations en saccharose de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 mmol/L dans le milieu réactionnel. Les documents 1 à 7 proposés sont adaptés (valeurs numériques modifiées pour rendre les applications numériques très simples) essentiellement de D. Combes, P. Monsan, Sucrose hydrolysis by invertase. Characterization of products and substrate inhibition, Carbohydrate Research, 1983, vol. 117 : 215228 ainsi que de J. Boudrant, Cl. Cheftel, Continuous hydrolysis of sucrose by invertase adsorbed in a tubular reactor, Biotechnology and Bioengineering, (1975 ) vol. 17 : 827-844 et de A. Reddy, F. Maley ; Studies on Identifying the Catalytic Role of Glu-204 in the Active Site of Yeast Invertase, The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271:13953-13958. AT – 0411 Documents page 5 / 5