Rapport final LA VOIE DE SECRETION D`UNE CELLULE HUMAINE

Loïc Martin
6 avril 2012
Rapport final
LA VOIE DE SECRETION D’UNE
CELLULE HUMAINE
Différentes techniques de
visualisation des compartiments
cellulaires
Travail effectué, à l'Université de Genève, Sciences III,
Département de biologie cellulaire dans le laboratoire du
Pr. Katharina Strub, sous la direction du Dr. Elisa
Radosta, du 12 au 17 mars 2012.
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Introduction
La voie de sécrétion
Les protéines sont constituées d’une chaîne d’acides aminés. Dès qu’elles
ont été traduites elles ont besoin d’être acheminées vers le lieu où elles
seront utilisées. Pour cela, environ 30% d’entre elles utilisent la voie de
sécrétion. Les protéines transitent normalement par le réticulum
endoplasmique, l’appareil de Golgi, puis la membrane plasmique avant de
rejoindre le milieu extracellulaire.
Le but de cette expérience est d’observer les différents compartiments
cellulaires qu’empruntent les protéines le long de la voie de sécrétion. Pour ce
faire, nous utilisons trois méthodes de visualisation des protéines dans les
cellules HeLa :
1. Immunofluorescence
2. Absorption d'une molécule marquée (lectine GSII-488 et 594)
3. Transfection de plasmide pour l’expression d’une protéine marquée
Les cellules utilisées lors de cette expérience sont des cellules HeLa
provenant d'une lignée de cellules cancéreuses. Elles ont été prélevées, en
1955 aux Etats-Unis, sur Henrietta Lacks, femme qui était atteinte d'un cancer
de l’utérus.
Méthode
1. Immunofluorescence
Le principe de l’immunofluorescence est basé sur la reconnaissance d’une
protéine d’intérêt par un anticorps spécifique (primaire). Ce dernier est ensuite
reconnu par un anticorps secondaire qui possède un groupement fluorescent
qui permettra de le visualiser en présence de lumière fluorescente et de
déterminer la localisation cellulaire de la protéine d’intérêt
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Les anticorps primaires utilisés sont dirigés contre:



La tubuline, protéine formant les microtubules. Ces dernières forment
une grande partie du cytosquelette et donc la structure de la cellule.
Cet anticorps a été produit dans la souris.
La calnexine, exprimée dans le réticulum endoplasmique. Cet
anticorps a été produit dans le lapin.
L’actine, qui constitue également la structure de la cellule. Cet
anticorps a été produit dans la souris.
Afin de les distinguer, nous devons utiliser des anticorps secondaires qio
reconnaissent spécifiquement les anticorps de souris ou de lapin.
Les anticorps secondaires utilisés :


Anti-souris FITC (vert) ou TexasRed (rouge).
Anti-lapin FITC (vert) et TexasRed (rouge).
Pour permettre aux anticorps de pénétrer dans la cellule, on peut
perméabiliser la membrane. Pour cela on utilise :
 Un mélange d’acétone-méthanol, qui va solubiliser la membrane
plasmique.
 du PFA (paraformaldéhyde), qui fixe les proteines mais n’abime que
peu les membranes. Ceci est idéal pour observer la membrane
plasmique. Si on souhaite perméabiliser les membranes, on peut le
faire après fixation en utilisant un détergent appelé triton.
Pour pouvoir visualiser le noyau qui contient l’ADN, on ajoute aux cellules le
marqueur Hoechst (bleu), qui se lie à l'ADN.
Afin de bloquer les sites non-spécifiques, on ajoute de la BSA (bovine serum
albumine). Entre chaque adjonction d'anticorps, on lave les cellules pour
éliminer les anticorps non- ou faiblement liés (pour éviter le phénomène de
non-spécificité). Cette méthode permet d'éviter au maximum "le bruit de
fond". En effet, les anticorps primaires peuvent se lier à des antigènes qui ne
sont pas forcément ceux que l'on recherche. Selon l’efficacité des anticorps, il
est nécessaire de les laisser en contact avec les cellules soit 1h à
température ambiante ou la nuit à 4C.
2. Absorption d'une molécule marquée (lectines GSII-488 et 594)
On ajoute dans le milieu de culture des lectines (GSII-488, émission verte et
GSII-594, émission rouge) qui vont être absorbées par la cellule. Elles vont
reconnaître et se lier aux sucres présents dans l’appareil de Golgi. Cette
molécule est ici utilisée pour visualiser l’appareil de Golgi dans la cellule.
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3. Transfection de Plasmide codant pour une protéine marquée avec le
groupement fluorescent GFP
Nous avons transfecté des plasmides dans des cellules HeLa afin que cellesci puissent exprimer des protéines chimères qui possèdent un groupement
GFP (green fluorescent protein) additionnel, ceci afin qu'il soit possible de
différencier les protéines déjà présentes dans la cellule (forme endogène) et
celles modifiées par l'ajout du groupement GFP (forme exogène). La protéine
alors exprimée sera visible à la lumière fluorescente sans l’ajout d’anticorps.
La fluorescence déclenchée nous permet donc de suivre la protéine dans les
compartiments cellulaires.
Les plasmides que nous avons utilisés sont :
 pCD63-GFP (vert), il code pour des protéines membranaires
exprimées dans les endosomes et à la surface de la cellule.
 pECFR-ER (bleu), il code pour des protéines exprimées dans le
réticulum endoplasmique (RE). Ces dernières prennent une
couleur bleue.
 phTfnR-GFP (vert), ce plasmide code pour le récepteur à la
transferrine dans la membrane et va donc être détecté tout au long de
la voie de sécrétion.
Cette méthode, contrairement à la première, ne nécessite pas l’ajout
d’anticorps aux cellules pour que l’on puisse observer la protéine et son lieu
d’utilisation. Cependant, nous avons pour certains échantillons de cellules
combiné les deux méthodes; l'adjonction d'anticorps et la transfection de
plasmide.
Nous observerons les résultats à l'aide d'un microscope à fluorescence Zeiss
et un grossissement de 100 fois.
Résultats
Nous avons pu prendre de nombreuses photos de nos différentes
expériences. Certains résultats n'ont pas été convaincants, comme par
exemple, la visualisation de la protéine actine, la visualisation des lectines
ainsi que la transfection du plasmide pECFR-ER. Pour ces trois expériences,
le signal lumineux était très faible, voir inexistant. Les figures I.A et I.B
représentent la visualisation de protéines par immunofluorescence
(expérience n°1). La calnexine dans le R.E et la tubuline dans les
microtubules. La figure II représente une cellule dont la membrane a été
perforée à l'AcMeOH, la protéine ciblée est la calnexine. La figure III
représente des cellules dont la membrane a, cette fois-ci, été perforée au
PFA non perméabilisé, nous observons toujours la calnexine.
La figure IV représente l'appareil de Golgi visualisé à l'aide de lectines
(expérience n°2).
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Les figures V.A et V.B (expérience n°3) représentent la visualisation des
protéines exprimées après transfection du plasmide phTfnR-GFP combiné
avec la méthode de l'immunofluorescence, pour observer la calnexine et la
tubuline.
I
II
III
IV
Les cellules HeLa ont absorbé la lectine GSII qui va marquer le Golgi en vert,
grâce au fluorochrome Alexa 488 (A), ou en rouge grâce au fluorochrome
Alexa 594 (B). Le noyau est observable, grâce au marquage Hoechst (bleu).
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V
Discussion
Expérience n°1
Avec cette expérience, nous avons pu comparer les différences d'expression
de chaque protéine testée (actine, tubuline, calnexine). Les cellules dans
lesquelles nous avons ajouté des anticorps anti-actine n'ont pas pu être
observées. En revanche, la tubuline et la calnexine ont été correctement
visualisées. Nous pouvons également comparer les différents moyens utilisés
pour perforer la membrane. Par exemple, dans les cellules dont la membrane
a été perméabilisée à l'acétone méthanol (AcMeOH) (fig. II) les protéines ont
pu être observées de manière plus convaincante que les cellules fixées au
PFA (fig. III) non perméabilisé. En effet, sur ces photos le signal lumineux est
plus faible, par contre, nous pouvons observer une surface plus grande. Nous
pouvons donc déduire, que pour ce type d'expérience, l'acétone méthanol
paraît plus approprié. En effet, les protéines ciblées sont exprimées à
l'intérieur de la cellule.
Expérience n°2
L'expérience que nous avons menée dans le but d'observer l'appareil de
Golgi à l'aide de lectines n'a pas été convaincante. Les cellules n'ont
probablement pas absorbé les lectines. Nous avons donc utilisés des photos
d'une expérience précédente (mars 2010), pour laquelle des résultats
exploitables ont pu être observés.
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Expérience n°3
Nous avons transfecté deux séries de cellules pendant respectivement 24 et
48 heures. Globalement, un plus grand nombre de cellules exprime le
plasmide lorsque ces dernières ont été transfectées pendant 48 heures. La
plupart des membranes plasmiques ont été perforées à l'acétone méthanol.
Peut-être qu'une fixation au PFA non perméabilisé permettrait de mieux
visualiser les protéines de la transferrine et CD63, qui sont exprimées
notamment sur la membrane cellulaire.
Conclusion
Grace à cette expérience, il est facile d’observer les différents compartiments
cellulaires qui entrent en jeu dans la voie sécrétoire des protéines. Ces
méthodes peuvent aussi être utiles si l’on veut savoir où est expédiée une
protéine. On peut également observer si le lieu de destination ou le taux
d'expression d’une protéine change, si cette dernière subit une mutation. Par
ailleurs, certaines maladies sont dues à un mauvais acheminement des
protéines, comme par exemple la mucoviscidose.
Remerciements
Au Dr. Elisa Radosta, pour ses explications, et son aide au combien
précieuse, pour mener à bien la réalisation de ce projet.
Au Pr. Katharina Strub, pour m'avoir ouvert les portes de son laboratoire.
A l'Université de Genève et à "Frontiers in Genetics".
A la Fondation "La Science appelle les jeunes", sans qui rien de tout cela
n'aurait été possible.
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