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S olutions
CONTRÔLE SANITAIRE
Le diagnostic des legionella, une analyse désormais industrielle
Depuis un arrêté de 2004, les industriels doivent s’assurer que leurs tours aéroré-
frigérantes n’entraînent pas dans leur long panache blanc les bactéries responsa-
bles de la légionellose. Au-delà du seul contrôle réglementaire, un suivi régulier
s’impose pour mieux prévenir tout risque de contamination. Face à la traditionnelle
culture bactérienne, méthode de référence qui nécessite pas moins de 10 jours,
d’autres méthodes alternatives se mettent en place. C’est le cas de la méthode dite
PCR : plus rapide, un peu plus facile à mettre en œuvre et un peu plus automatisa-
ble, elle a été (enfin) normalisée en avril 2006.
Nombre d’industriels se trou-
vent depuis peu confrontés
à une analyse d’un nouveau
genre pour eux : le diagnos-
tic des legionella. L’épidémie de légionel-
lose qui avait fait onze morts au début de
l’année 2004 autour de Lens avait montré
pour la première fois qu’une tour aéroré-
frigérante (TAR) industrielle pouvait être
à l’origine de la con-
tamination. Les legio-
nella, famille de bac-
téries présentes
naturellement dans
l’eau, se développent
à l’intérieur des
tuyauteries dont elles
tapissent la surface en
formant ce qu’on ap-
pelle des biofilms.
Leur dispersion dans
les panaches de va-
peurs peut contami-
ner les populations
vivant à proximité. Le
seul moyen d’empê-
cher leur proliféra-
tion consiste à injec-
ter des biocides dans
les circuits.
Depuis un décret de
décembre 2004,
toutes les installa-
tions de refroidisse-
ment par dispersion
d’eau dans un flux
d’air, autrement dit
les tours aéroréfri-
gérantes (TAR), doi-
vent être déclarées
dans les préfectures et suivre une régle-
mentation stricte en matière de risques
de développement des bactéries. Des
prélèvements pour analyse doivent être
effectués chaque mois (installations
autorisées) ou tous les deux mois (ins-
tallations déclarées). De plus, l’installa-
tion doit faire l’objet d’un contrôle pé-
riodique par un organisme accrédité.
La réglementation s’applique depuis
juillet 2005 pour les installations neu-
ves, depuis janvier 2006 pour les instal-
lations existantes soumises à autorisa-
tion et à partir de janvier 2007 pour
celles soumises à déclaration. Bref, tou-
tes les TAR sont concernées. Soit, selon
un recensement réalisé début 2004, pas
moins de 12 500 installations en France.
Il y en aurait même près de 650 dans
Paris intra-muros. Elles sont utilisées
pour le refroidissement de process in-
dustriels mais aussi pour la climatisation
des locaux de grandes tailles, les salles
informatiques, les hôpitaux. Il y en a des
petites, de quelques mètres, et des gran-
des. Celles des centrales nucléaires peu-
vent s’élever jusqu’à plus de 150 mètres.
Celles-ci font d’ailleurs l’objet d’une
dérogation particulière, du moins pour
l’instant (voir encadré).
Une surveillance sur le long terme
Surveiller les legionella, oui mais com-
ment ? Certainement pas tout seul dans
son coin. Le diagnostic de ces bactéries
relève de la microbiologie ou de la bio-
logie moléculaire. Il nécessite des pro-
tocoles très précis, devant être repro-
duits avec beaucoup de rigueur. Une
affaire de spécialistes, de trop rares spé-
cialistes. Jusqu’ici, les moyens de dia-
gnostic des différentes formes de légio-
nellose étaient peu répandus.
Aujourd’hui, des entreprises ou des la-
boratoires commencent à proposer des
prestations autour de la problématique
legionella dans l’industrie. Parmi
d’autres, on peut citer
Norisko, IRH
Environnement, les Laboratoires Bouisson
Bertrand
(Pasteur Lille)…
Laboratoire issu du milieu médical, la
société
Hygidiag propose depuis 2003
de transférer aux mondes de l’indus-
trie, du bâtiment et des administrations,
la démarche de contrôle des pathogè-
nes microbiologiques telle qu’on la
pratique dans le domaine de la santé
humaine. «
Les bactéries et virus ne peuvent
pas être éradiqués ; par contre, lorsqu’on con-
naît parfaitement le taux d’infection et le
mécanisme de prolifération et d’action du
Circuits d’eau chaude
sanitaire ou installations
aéroréfrigérantes représen-
tent des sources de
contamination bactériennes
par les legionella.
Soumis à une nouvelle
réglementation, les
industriels sont désormais
astreints à des contrôles
périodiques.
Au-delà de la démarche
réglementaire, un suivi
régulier des installations
permet de prévenir plutôt
que guérir (ou fermer son
installation).
La méthode dite PCR qui
vient d’être normalisée
permet un diagnostic en
moins de 48 heures
Elle est donc bien plus rapide
que la méthode par culture
(qui prend 15 jours).
Elle semble être une
méthode alternative plus
adaptée aux contraintes des
industriels
L’essentiel
La méthode PCR vient d’être normalisée pour la détermination des legionella dans l’eau. Sa rapidité (48 heures) et ses possib ilités d’automatisation sont ses
principaux atouts pour répondre à la demande des industriels soumis à de nouvelles réglementations (Source Hygidiag).

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CONTRÔLE SANITAIRE
Le diagnostic des legionella, une analyse désormais industrielle
pathogène, on peut traiter le patient. Il en va
de même sur un circuit aéroréfrigérant ou un
circuit d’eau chaude sanitaire
», souligne
Matthieu Bernier, pharmacien biolo-
giste et directeur médical d’
Hygidiag .
Au-delà d’interventions ponctuelles en
périodes de crise, certains laboratoires
proposent ainsi de prendre en charge
le suivi bactériologique des eaux indus-
trielles. Il s’agit alors de prestations de
prévention sur le long terme.
Les legionella sont des bactéries, ce
n’est pas un paramètre inerte comme
l’amiante ou le plomb : elles évoluent
au cours du temps. La démarche régle-
mentaire, avec un contrôle annuel, est
une démarche de contrôle qu’il ne faut
pas confondre avec une gestion préven-
tive du risque sanitaire. Le suivi régu-
lier des installations est la seule appro-
che pertinente en matière de prévention
de ce risque sanitaire. «
Il est préférable
d’avoir un réseau avec peu de points mais
suivi régulièrement, qu’un réseau laissé de
côté et contrôlé seulement une fois par an
»,
souligne M. Bernier.
En 2004,
Hygidiag et IRH Environnement ont
établi un contrat avec les six sites de produc-
tion de
Saint Gobain Emballage qui comportent
quelque 43 tours aéroréfrigérantes. Le labo-
ratoire assure un suivi hebdomadaire pour
La méthode PCR vient d’être normalisée pour la détermination des legionella dans l’eau. Sa rapidité (48 heures) et ses possib ilités d’automatisation sont ses
principaux atouts pour répondre à la demande des industriels soumis à de nouvelles réglementations (Source Hygidiag).
Lyse, filtration, extraction… la préparation des échantillons reste une étape longue et difficile qui demande une grande rigueur
(Source Hygidiag).

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la surveillance du risque “legionella” et un
suivi mensuel en microbiologie pour le
contrôle réglementaire. Cette prestation,
qui s’étend du prélèvement des échan-
tillons à l’interprétation des résultats, est
incluse dans la solution Légiorisque dé-
veloppée par
IRH Environnement . Cette
solution suit la méthode HACCP (ana-
lyse des points critiques) et s’étend jus-
qu’à la formation du personnel et le
développement de solutions spécifiques
«
Nous travaillons notamment sur des capteurs en
continu pour suivre la formation des biofilms dans
les conduites
», précise Jean-François Louyot,
directeur technique chez
IRH
Environnement
.
Au niveau du diagnostic lui-même, deux
méthodes principales peuvent identifier et
quantifier la présence de legionella dans
les installations à risques. Il s’agit de la
méthode microbiologique normalisée
(NF T90-431 ou ISO 11751) et de la mé-
thode par PCR (
Polymerase Chain Reaction ).
Cette dernière, déjà utilisée dans plusieurs
pays (Afrique du Sud, USA, Japon, Hong
kong…), fait aujourd’hui l’objet d’une
norme française. Longtemps attendue, elle
est parue en avril 2006 sous la
référence “XP T 90-471 -
Qualité de l’eau. Détection et
quantification des Legionella
et Legionella pneumophila par
concentration et amplification
génique par réaction en chaîne
de polymérisation (PCR)”.
Une culture longue,
longue, longue
La partie pré-analytique, qui
touche le prélèvement et la
préparation de l’échantillon,
est similaire dans les deux
méthodes et nécessite une
grande rigueur et un suivi
très précis des protocoles. Par contre, la
phase analytique est foncièrement dif-
férente.
La méthode NF T90-431 est la méthode
dite de référence. Elle s’appuie sur le
dénombrement de legionella cultiva-
bles selon les conditions de culture
fixées par la norme. Pour chaque type
d’analyse, il est nécessaire de prélever
un échantillon d’un litre d’eau. Les
conditions de prélèvement et l’ense-
mencement sur un milieu spécifique
(GVPC) doivent se faire à 37 °C. Dans
ces conditions, les bactéries se repro-
duisent jusqu’à former des colonies
dans un délai de 3 à 10 jours. On parle
en UFC/l, c’est-à-dire en unités for-
mant colonie par litre d’eau. Pour con-
firmation, ces colonies, si elles appa-
raissent, doivent être repiquées sur trois
milieux différents pendant trois jours
encore. Il reste ensuite à déterminer le
type de legionella (legionella spp ou
legionella pneumophila, l’espèce la
plus dangereuse). Il faudra pour cela
réaliser un sérotypage.
Cette analyse de spécialistes peut
pren d re ainsi jusqu ’à 14 jour s.
Pendant ce temps-là, l’épidémie de
légionellose aura fait du chemin.
On reproche ainsi à la méthode de ré-
férence sa lenteur, sa mise en œuvre
longue et difficile. On lui reproche
aussi parfois de sous-évaluer la quanti-
fication de
Legionella spp en cas de flore
bactérienne associée, voire être fausse-
ment négative pour les souches ou es-
pèces de
legionella non cultivables.
La PCR, 48 heures chrono
La méthode dite PCR (méthode basée sur
la recherche d’ADN) n’est pas non plus
très simple à mettre en œuvre mais elle
*UFC/l unités formant colonie par litre d’eau.
Selon l’arrêté du 13 décembre 2004
Documents à disposition
 Les modalités d’application des deux arrêtés
ministériels sont précisées dans une circulaire
de la Direction Générale de la Santé (BOMEDD
n° 03/2006 du 15 février 2006). Les dispositions
relatives aux deux arrêtés sont obligatoires. La
liste des organismes agréés est détaillée dans
un arrêté du 9 novembre 2005.
 En relation avec la publication des arrêtés
ministériels, des guides ont été élaborés à la
demande du Ministère de l’Environnement et
du Développement Durable (documents
disponibles sur www.ecologie.gouv.fr, rubrique
Risques et Pollution):
- un guide sur la mise en place d’une analyse
des risques de prolifération des legionella
sur une installation.
- un guide de formation sur la prévention
des risques de prolifération des legionella,
- un guide technique décrivant les différents
procédés de refroidissement et leurs impacts
sur le risque legionella (rédigé par le Cetiat,
également accessible sur www.cetiat.fr).
La recherche et la quantification des Legionella
par PCR s’effectuent en quatre phases successi-
ves ou simultanées :
Concentration
Par centrifugation ou par filtration.
Extraction - purification des acides nucléiques
Le principe d’une extraction d’acides nucléiques
consiste à libérer l’acide nucléique en lysant les
micro-organismes, puis (ou en parallèle) à
purifier l’acide nucléique en éliminant autant
que possible les autres composants, en
particulier les inhibiteurs de PCR.
Amplification de l’acide nucléique par PCR
Le principe consiste à amplifier en chaîne un
segment d’acide nucléique entre deux bornes
représentées par deux amorces respectivement
complémentaires des deux brins d’acides
nucléiques.
Les étapes préalables de développement de
tests PCR passent par l’optimisation des
paramètres d’amplification (nombre de cycles,
température d’hybridation…) et de la composi-
tion du mélange réactionnel (amorces, tampon,
MgCl2, sondes…).
Une ou plusieurs séquences peuvent être
amplifiées afin de détecter et différencier les
acides nucléiques provenant de bactéries
appartenant au genre Legionella et à l’espèce
L. pneumophila.
Quantification en temps réel
Les thermocycleurs en temps réel utilisent des
systèmes de détection sensibles d’émissions
fluorescentes. Ils permettent d’utiliser des
sondes internes d’hybridation et sont capables
de mesurer directement la quantité d’amplicons
produite à chaque cycle d’amplification.
Cette cinétique d’apparition des amplicons
permet de quantifier le nombre de copies
d’ADN de Legionella présentes dans l’échan-
tillon de départ en la comparant à une droite
d’étalonnage.
Méthode PCR en 4 temps
Seuil d’action (UFC/L*) Actions correctives à mettre en
œuvre par l’exploitant
> 1 000 UFC/L Actions correctives pour abaisser la concen-
tration.
Vérifier sous deux semaines que la concen-
tration est revenue sous le seuil d’action
> 100 000 UFC/l Arrêt immédiat de la tour.
Vidange et nettoyage du circuit.
Informer l’inspection des installations classées.
Effectuer des contrôles tous les 15 jours
pendant 3 mois
Prescriptions applicables

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a le mérite d’être beaucoup plus rapide.
Dans ce procédé, le processus de divi-
sion des cellules (utilisé dans la mé-
thode par culture) est remplacé par un
processus de duplication biochimique
in vitro de l’ADN de Legionella.
L’échantillon (de 100 ml à 1 litre) est
filtré afin de récupérer les bactéries.
Celles-ci sont détruites. Leur ADN ex-
trait est amplifié puis détecté par sonde
fluorescente. La PCR est une technolo-
gie largement utilisée dans différents
domaines depuis plus de 20 ans.
Parmi ses applications médicales, on
peut citer la recherche et la quanti-
fication du virus du Sida dans le
sérum, la quantification et le typage
du virus de l’hépatite C…
La méthode PCR est également utilisée dans
l’agroalimentaire pour les diagnostics
rapides de Listeria ou salmonelles ou
encore dans la détection des OGM
(norme NF). Cette technologie permet
un délai de réponse rapide. On peut
donc réaliser une détection de legionella
dans l’eau en moins de 4 heures, même
si, pour des raisons d’organisation, les
délais de rendu des résultats sont habi-
tuellement de 24 à 48 heures.
Considérée comme une méthode al-
ternative, la méthode PCR paraît
plus facilement adaptée dans le
cadre d’un suivi régulier d’installa-
tions industrielles notamment pour
la mesure (presque en temps réel !)
de l’efficacité d’un traitement d’éra-
dication. Plus facile à utiliser, avec
des dispositifs de prélèvement auto-
matique, elle devrait permettre aussi
aux industriels de pouvoir s’auto-
contrôler, sans passer forcément par un
laboratoire externe.
Quant à la méthode par culture
(norme actuelle NF T 90-431), elle
reste la méthode de référence pour
obtenir les souches de
Legionella in-
dispensables aux études épidémiolo-
giques et pour spécifier le sérotype
nécessaire à la mise en place d’une
politique de prévention et d’informa-
tion. Ainsi, les deux méthodes, toutes
deux normalisées, paraissent
aujourd’hui pouvoir se compléter.
La troisième voie
Mais il n’y a pas qu’elles. D’autres
méthodes pourraient venir également
proposer leur service. C’est déjà le
cas. 72 heures, une solution intermé-
diaire est commercialisée depuis un
an environ par une société suédoise
Diffchamb ( Raisio Diagnostics ) dont la
filiale française est basée à Lyon. Le
principe s’appuie sur le fait que les
bactéries possèdent des empreintes
génétiques spécifiques (des brins
d’ADN) qui peuvent être combinées
à des sondes génomiques (des brins
d’ARN). Une fois ainsi marquées, les
legionella sont mises en évidence par
fluorescence. Cette méthode, contrai-
rement à la PCR, nécessite une mise
en culture mais elle ne dure que
72 heures et prend donc moins de
temps que la méthode normalisée.
Des fluorochromes verts et rouges
permettent de distinguer les différen-
tes espèces de legionella. Une étude
réalisée au sein des
Laboratoires Buisson
Bertrand
à Montpellier n’a pas montré
de différences statistiques significati-
ves entre les deux méthodes en ce qui
conc er ne le déno mbre m en t de
Legionella spp dans des échantillons
d’eau. Le Kit ScanVIT Legionella, un
kit prêt à l’emploi proposé par
Diffchamb , pourrait être utilisé par le
personnel technique en charge de
l’installation.
Marie-Pierre Vivarat-Perrin
Comparaison des méthodes normalisées
Source Hygidiag
Méthode Culture (NF 90-431) PCR (NF XPT 90-471)
Type d’analyse microbiologique biologie moléculaire
Pré-analytique filtration filtration, lyse, extraction
Volume échantillon 1 l (500 ml TAR) 100 ml à 1 l
Délai
phase pré-analytique
analytique 1er résultat
confirmation 1er résultat
résultat complet définitif
1 h
3 j
5 j
10 à 15 j
3 h à 12 h
< 24 h
< 24 h
< 48 h
Domaine de linéarité Au-dessus de 20 000 UFC/l 1 000 à 1 000 0000 UG/l
Automatisation Non Oui
Contrôle interne
(étalonnage, contrôle positif
contrôle négatif)
Non demandé Systématique
La réglementation des 28 tours aéroréfri-
gérantes situées dans 11 centrales
nucléaires de production d’électricité
d’EDF diffère de celle des installations
classées pour la protection de l’environne-
ment (ICPE). Les premières ont en effet des
hauteurs de plus de 150 mètres, bien plus
importantes que les secondes. Et selon la
modélisation du producteur d’électricité
relative à la dispersion atmosphérique des
panaches, le niveau de risque engendré
par ses tours est inférieur à celui d’une tour
d’ICPE, plus petite.
La réglementation actuelle autorise donc
des niveaux de concentration 500 fois,
voire 5 000 fois supérieurs dans les
circuits des tours EDF que dans celles des
autres installations classées. C’est cette
appréciation qui a été sévèrement
critiquée par le comité d’experts réunis
par l’Agence française de sécurité sanitaire
de l’environnement et du travail (Afsset),
suite à une demande de la Direction
générale de la santé, de la direction de la
prévention des pollutions et des risques et
de la direction générale de la sûreté
nucléaire et de la radioprotection, en date
du 15 novembre 2004.
Du coup, l’Autorité de sûreté nucléaire
demande à l’entreprise de réaliser une
nouvelle évaluation du risque des
légionnelles dans ces tours aéroréfrigé-
rantes, d’ici la fin de l’année. Les experts
demandent ainsi de baisser les seuils
d’intervention qui sont actuellement
“bien trop élevés”. Par ailleurs, la mise en
place des traitements de désinfection
apparaît extrêmement tardive. « Or, c’est
justement pendant ces périodes de
dépassement que des contaminations
aiguës peuvent avoir lieu », ont noté les
experts. Plus de 10 jours s’écoulent entre
le prélèvement et le résultat. La faute
encore aux cultures bactériennes.
Les TAR du nucléaire, dans le collimateur