La mucoviscidose
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http://perso.ens-lyon.fr/romain.berardozzi/ LA MUCOVISCIDOSE : ASPECTS CLINIQUES, CELLULAIRES, MOLECULAIRES ET GENETIQUES La mucoviscidose est une pathologie fréquente en France et Amérique du Nord (rare en Afrique et Asie) affectant près d’une personne sur 2500. La morbidité est élevée en l’absence de traitement et l’espérance de vie moyenne d’un patient atteint de mucoviscidose est de 47 ans (contre 7 ans en 1965). L’expressivité de la pathologie est très variable (chiffres Institut Pasteur). Quels sont les phénotypes macroscopique, cellulaire et moléculaire des patients atteints de mucoviscidose ? Quelles sont les causes de cette pathologie ? En quoi cette pathologie diffère-t-elle d’autres pathologies comme le cancer ou le diabète ? Quelles sont les stratégies thérapeutiques actuelles ? La mucoviscidose, une pathologie affectant les éptihélia glandulaires (voies respiratoires, digestives, reproductrices et sudoripares) Tableau clinique d’un patient atteint de mucoviscidose Description du phénotype macroscopique (Tableau 1). De nombreuses fonctions biologiques sont déficientes chez un patient atteint de mucoviscidose. Comment expliquer une telle généralisation des symptômes ? Un mucus visqueux à l’origine des symptômes de la mucoviscidose ou fibrose kystique L’étude par radiographie aux rayons X (Figure 1) et par préparation de lame histologique de bronches de patients atteints de mucoviscidose (Figure 2) montre la présence de mucus abondant et visqueux à la surface de l’épithélium bronchique qui obstrue la bronche. De manière générale, tous les épithélia glandulaires exocrines (glande exocrine du pancréas (acini), foie exocrine, vésicule biliaire, intestin, glandes sudoripares, canaux déférents) sont affectés et produisent un mucus visqueux dont les propriétés rhéologiques sont en défaveur de sa clairance. Cela aboutit à une accumulation de mucus et à un tapissage des épithélia (réduisant leur capacité d’échange : malabsorption intestinale, difficultés respiratoires Tableau 1) voire une obstruction de la lumière des épithelia et des canaux associés (obstruction bronchique, atrésie des canaux déférents, calculs biliaires Figure 4, Tableau 1). L’obstruction aboutit à une perte de fonctionnement de l’organe et à sa dégradation (cirrhose hépatique, fibrose pancréatique et kystes pancréatiques (fibrose kystique) par action des enzymes digestives non libérées dans le duodénum Figure 4, atteinte secondaire du pancréas endocrine aboutissant à des diabètes). La réduction de la clairance muco-ciliaire des voies respiratoires supérieures entraine la colonisation bactérienne du mucus expliquant les infections respiratoires à répétition (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae). Quelles sont les bases cellulaires et moléculaires permettant d’expliquer la formation d’un mucus visqueux ? http://perso.ens-lyon.fr/romain.berardozzi/ Tableau 1 : Tableau clinique d’un patient atteint de mucoviscidose : phénotype à l’échelle macroscopique. De nombreuses fonctions biologiques sont détériorées chez le patient malade. Les organes affectés sont tous des épithélia glandulaires. Les conséquences physiologiques sur les organes concernés sont à mettre en relation avec la viscosité du mucus qui recouvre voire bouche les canaux ménagés par les épithélia. Figure 2: Coupe transversale de bronche mettant en évidence les caractéristiques des epithélia bronchiques chez un patient atteitnde mucoviscidose (A, haut) et un patient sain (B,bas). Remarquer chez le patient atteint de mucoviscidose la présence dans la lumière des bronches de mucus. Ce mucus abondant n’est pas évacué par clairance mucociliaire. C’est ce mucus qui est observé en Figure 1 et qui est opaque aux rayons X. Figure 1 : Clichés de radiographies aux rayons X d’un patient sain (gauche) et d’un patient atteint de mucoviscidose (droite). Remarquer à droite chez le patient atteint de mucoviscidose la présence au niveau des bronches de matériel opaque aux rayons X (blanc sur le cliché comme les os). Figure 3: Coupe transversale de l’iléon d’un porc sain (gauche) et d’un porc atteint de mucoviscidose (droite).. L’iléon est la partie terminale de l’intestin grêle juste en amont du colon. On remarque chez le porc atteint de mucoviscidose une obstruction de la lumière intestinale par un bouchon de mucus. Cette obstruction explique les symptômes digestives et notamment la malabsorption des nutriments conduisant à une malnutrition voire dénutrition. Figure 4: Pancréas et vésicule biliaire chez un porc sain (clichés de gauche sur les deux images) et un porc atteint de mucoviscidose (clichés de droite). On remarque une dégradation du pancréas résultat de l’accumulation intra-tissulaire des enzymes pancréatiques non libérées qui attaquent les cellules exocrines et endocrines (diabètes). La vésicule biliaire chez le porc malade est nécrosée et ne permet plus le stockage de la bile nécessaire à l’émulsion des lipides et par la suite leur dégradation par les lipases. Ces observations mettent en évidence l’existence de troubles digestifs chez les patients atteints de mucoviscidose. Figure 5:Arbre généalogique d’une famille porteuse de la mutation CFTR responsable de la mucoviscidose. Remarquer le caractère autosomique récessif de la transmission. A partir de ce mode de transmission, on en déduit qu’un couple de porteurs sains à une probabilité d’avoir un enfant malade de ¼ . Le génotype des parents porteurs sains est CFTR-/CFTR+ (avec CFTR moins le gène muté). Le génotype des malades est CFTR-/CFTR-. Le génotype des individus sains est CFTR+/CFTR+. http://perso.ens-lyon.fr/romain.berardozzi/ La mucoviscidose, une pathologie héréditaire liée à la mutation du gène codant pour la protéine CFTR Une pathologie génétique transmise de génération en génération L’étude de nombreux arbres généalogiques de familles dont un parent est atteint de mucoviscidose (Figure 5) permet d’observer que : 1. la probabilité d’être atteint de la mucoviscidose est plus forte lorsqu’un parent au moins est atteint la mucoviscidose est une maladie héréditaire (pathologie conséquence d’une anomalie génétique transmise de génération en génération) 2. les hommes (XY) et les femmes (XX) sont indifféremment affectés par la pathologie la mutation responsable de la pathologie n’est pas portée par le chromosome X (sinon 100% mâles (XY ; un unique X) serait atteint de la maladie): la pathologie est transmise par voie autosomique, le gène muté est porté par un autosome. 3. des parents sains donnent naissance à un enfant malade avec une probabilité de ¼ la mutation d’une copie du gène sur les deux présentes n’entraine pas l’apparition d’un phénotype « malade ». Il existe des porteurs sains : la mutation responsable de la mucoviscidose est récessive. Quel est le gène muté ? Où est-il positionné dans le génome ? Une pathologie liée à la mutation d’un gène porté par le chromosome 7 Les méthodes de génétique inverse ont permis de positionner le locus du gène muté chez les patients atteints de mucoviscidose (Figure 6) Pour quelle protéine code le gène muté chez les patients atteints de mucoviscidose et quelle est sa fonction ? Comment la mutation du gène altère la fonction de la protéine ? Une pathologie liée à un défaut de la glycoprotéine canal à anions CFTR Les études de génétique inverse ont permis de mettre en évidence que la protéine mutée chez les patients atteints de mucoviscidose est la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) (Figure 7). Cette protéine est une glycoprotéine transmembranaire : un canal à anions de la membrane plasmique des cellules épithéliales. Son ouverture est dépendante de la fixation d’ATP (pas d’hydrolyse) sur le domaine NBD et est déclenchée par la phosphorylation par la protéine kinase A du domaine de régulation. Cette protéine permet la sortie d’ions chlorure en dehors de la cellule. La sortie d’ions chlorure dans la lumière des épithélia glandulaires entraine par phénomène d’osmose la sortie d’eau ce qui fluidifie le mucus et/ou les sécrétions enzymatiques. Ce phénomène est appelé transport hydro-électrique. La sortie d’eau est amplifiée grâce à l’inhibition des canaux sodiques par CFTR. Le sodium ne rentre alors plus dans la cellule ce qui augmente la pression osmotique extracellulaire et augmente la sortie d’eau (Figure 8). Le canal CFTR permet également la sortie d’ions thiocyanates. Ces ions forment dans la lumière des bronches de l’hypothiocyanate ayant un rôle antimicrobien. On distingue différentes mutations chez les patients atteints de mucoviscidose (Figure 9): +mutation non-sens (codon stop précoce) ou défaut d’épissage conduisant à une protéine tronquée puis rapidement dégradée +mutation empêchant le repliement correct, la maturation et l’adressage de la protéine à la membrane plasmique conduisant à une accumulation dans le Golgi et les vésicules d’exocytose (délétion de la phénylalanine 508) : cette mutation est la plus fréquente, 87% des patients atteints de mucoviscidose. (Figure10, Figure 11) +mutation du domaine R bloquant les phénomènes de régulation de la protéine +mutation empêchant le passage des ions (trouble de la conductance) Figure 6:Méthode de génétique inverse ayant permis de localiser le gène responsable de la mucoviscidose. Les méthodes de génétique inverse reposent sur la capacité à évaluer la distance entre le marqueur de la mucoviscidose (le locus CF) et des marqueurs dont la position est connue dans le génome. Pour cela, il est nécessaire d’étudier un lot important de famille attient de mucoviscidose et de calculer des % de recombinaisons entre le marqueur de position et le marqueur de la maladie. Plus le pourcentage de recombinaison est élevé plus les deux loci sont éloignés physiquement dans le génome (probabilité de crossing over forte). Plus le pourcentage de recombinaison est faible plus les loci sont proches : on dit que les gènes sont liés. Il a été remarqué que le locus CF coségrege souvent avec le locus de la paroxonase (PON) situé sur le chromosome 7. Le gène de la mucoviscidose est donc situé sur le chromosome 7. Plus précisément il a été montré qu’il coségrège avec un marquer situé sur le bras long chromosome 7. http://perso.ens-lyon.fr/romain.berardozzi/ Une fois que la séquence est localisée avec précision, on établit la séquence de la protéine pour laquelle le gène code. Le gène fait 250 000 paires de bases et contient 27 exons. Figure 7:Structure de la protéine CFTR. La protéine CFTR est une protéine canal transmembranaire composée de 12 hélices alpha hydrophobes. Ces hélices aménagent un espace hydrophile dans la membrane permettant le passage des ions chlorures. Du côté intracellulaire, la protéine CFTR possède un domaine de régulation (domaine R) phosphorylable par la protéine kinase A. Elle possède également deux domaines de fixation aux nucléotides (ATP) appelés domaines NBD pour Nucleotide Binsding Domain. Figure 9:Différentes mutations à l’origine de la mucoviscidose. La formation d’un mucus visqueux a pour origine une défaillance de la sortie des ions chlorures dans la lumière des épithélia. L’absence de sortie des ions chlorure peut s’expliquer l’absence de la protéine, son mauvais repliement/adressage à la membrane plasmique (voir Figure 10), à des défauts dans le domaine R de régulation ou encore à des défauts de conductance. Figure 8:Rôle de la protéine CFTR dans la fluidification du mucus bronchique par phénomène de transport hydro-électrique. La protéine CFTR suite à activation par la PKA et fixation d’ATP s’ouvre et permet la sortie d’ions chlorures selon leur potentiel électrochimique. De plus, CFTR inhibe les canaux sodiques et le sodium ne rentrant plus s’accumule dans le milieu extracellulaire. Ces deux phénomènes ont pour conséquence la sortie d’eau par osmose vers le compartiment à la pression osmotique la plus forte : la lumière de la bronche. En l’absence de CFTR, les ions chlorures ne sortent plus, les ions sodium rentrent ce qui fait rentrer l’eau dans le compartiment à plus forte pression osmotique : la cellule. Le mucus se déshydrate donc et devient plus visqueux. Figure 10:Localisation par immunofluorescence de la protéine CFTR chez un patient sain (gauche) et un patient atteint de mucoviscidose porteur de la délétion de la Phe508 (droite). L’utilisation d’anticorps dirigés contre la protéine CFTR et couplé à des molécules fluorescentes permet grâce à l’observation par microscopie de fluorescence de localiser la protéine au sein des cellules de l’épithélium bronchiques. On observe chez le patient sain que le protéine CFTR est localisée à la membrane apicale des cellules de l’épithélium. Chez le patient malade porteur de la délétion Phe508 (à droite), on observe que la protéine est localisée dans l’ensemble de la cellule (plus particulièrement dans le RER, le Golgi et les vésicules d’endocytose). En effet, cette délétion a pour conséquence un défaut de repliement de la protéine qui reste alors dans le RER et d’adressage à la membrane plasmique et qui reste alors dans le Golgi ou les vésicules d’exocytose. Patient « sain » Figure 11 : Origine de la délation de la phénylalanine 508. L’alignement des séquences nucléotdiques et protéiques de patients « sains » et atteints de mucoviscidose met en évidence dans le gène de la mucoviscidose une délétion de 3 paires de bases : CTT. Cette délétion de trois paires de bases n’entraine pas de décalage du cadre de lecture (lecture de 3 en 3). En revanche, les trois paires de bases supprimées ne forment pas un codon : elles sont à cheval sur deux codons successifs. Aussi, le nouveau codon formé par suite à la délétion est le codon ATT qui, en conséquence de la redondance du code génétique, code également pour une isoleucine et n’entraine donc qu’une délétion et non pas une délétion et une mutation. Patient atteint de mucoviscidose http://perso.ens-lyon.fr/romain.berardozzi/ Dans tous les cas, CFTR est non-fonctionnel et entraine : +la séquestration des ions chlorure dans la cellule empêche la sortie d’eau +l’entrée d’ions sodium dans la cellule suite à la levée d’inhibition par CFTR entraine une entrée d’eau dans la cellule ce qui déshydrate le mucus. Les mucus sont donc riches en protéines, glycoprotéines et glucides et pauvre en eau et en conséquence visqueux expliquant par la suite les symptômes décrit dans le tableau clinique. La non-fonctionnalité de CFTR réduit également la production d’hypothiocyanate diminuant ainsi les capacités antimicrobiennes de la muqueuse. De plus, la présence d’un mucus visqueux peu renouvelé favorise la colonisation de bactéries en biofilms. Dépistage Le dépistage de la pathologie peut être fait à plusieurs niveaux (Figure 12) : +prénatal. Dans le cas des familles à risques (dont un des parents est atteint de la mucoviscidose), un test génétique permet de vérifier l’existence de porteurs sains et d’établir les risques encourus lors de la conception d’un enfant. Il y a mise en place d’un conseil génétique en aval de la démarche de procréation. Il faut noter que les tests disponibles ne permettent pas de s’assurer à 100% de l’absence de mutations : il s’agit surtout d’une évaluation des risques. En effet, toutes les mutations ne sont pas facilement testables. +néonatal. A la naissance, ce dépistage systématique depuis 2002 consiste en un dosage de la trypsine sanguine par piqure au niveau du talon. La trypsine sanguine est élevée chez les nouveaunés dont les canaux pancréatiques sont obstrués. Un test à la sueur (dosage de chlore sudoral) peut également être réalisé. En effet, les patients atteints de mucoviscidose ont une sueur très salés ([Cl]>60mM). Cette méthode de dépistage a été la première au cours de l’histoire à être utilisée. +dépistage tardif. Suite à l’apparition de symptômes. Les patients dépistés tardivement sont souvent modérément affectés par la pathologie. La mucoviscidose, une pathologie nécessitant des traitements thérapeutiques lourds Réduire les symptômes par des méthodes prophylactiques En plus des méthodes curatives ci-après, l’apparition des symptômes (notamment les infections chroniques) peut être limitée par l’application de méthodes prophylactiques (port du masque par le malade, bonne hygiène corporelle, désinfection de l’environnement). L’alimentation doit également être surveillé et supplémentée en vitamine afin d’éviter la malnutrition. Dans les stades avancés, des enzymes pancréatiques peuvent être prescrites. L’oxygénothérapie permet de compenser le manque d’oxygénation liée à l’obstruction des bronches L’oxygénothérapie permet d’après des méta-analyses récentes d’améliorer seulement le confort de vie et non pas la durée de vie de manière statistique. L’oxygénothérapie peut être couplée à une inhalation de bronchodilatateur permettant d’améliorer les échanges respiratoires au niveau des surfaces respiratoires. L’antibiothérapie permet de réduire les infections respiratoires chroniques L’utilisation d’antibiotiques par voie orale, nébulisation dans les bronches ou par voie veineuse permet de lutter contre les infections chroniques. L’administration d’antibiotiques à forte dose et de manière chronique a des effets néfastes chez le patient (problème hépatiques par effet sur les transaminases notamment). Un risque de résistance aux antibiotiques est également possible compliquant alors le traitement. La kinésithérapie permet de réduire l’obstruction des bronches La kinésithérapie permet d’améliorer l’expectoration bronchique et donc de limiter l’obstruction des bronches offrant ainsi une meilleure ventilation et une limitation des risques d’infection. La kinésithérapie permet également de maintenir une mécanique efficace de la ventilation par renforcement des muscles de la cage thoracique. http://perso.ens-lyon.fr/romain.berardozzi/ Figure 12 : Exemple de test génétique de la mucoviscidose basé sur le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). KM.19 est un marqueur génétique extragénique du gène mutée CFTR utilisé pour ce test. Dans le cas où le gène CFTR est muté, le locus KM.19 présente une séquence qui permet à l’enzyme de restriction Pst1 de cliver l’ADN à cet endroit en deux fragments d’environ 300 et 600 paires de bases. Sinon, l’enzyme ne clive pas le site et l’ADN reste entier d’une longueur de 900 paires de base environ. La première colonne de la photographie du gel d’électrophorèse de l’ADN révélé suite à coloration par un intercalant de l’ADN (bromure d’étidium) montre que le patient est homozygote pour le gène muté (bande à 600 pb pas de bande à 900 pb et bande à 300 pb non visible car sans doute trop petite). La colonne suivante montre le résultat du test pour un homozygote pour la version non mutée du gène (présence de la bande à 900 pb et absence de la bande à 600 pb). Enfin, la troisième colonne montre le résultat du test pour un porteur sain (bande à 900 et bande à 600 pb). On remarquera sur la quatrième colonne une limite du test avec un faux négatif, détecté par le test comme un homozygote pour la version non mutée alors qu’il s’agit en réalité d’un porteur sain. Figure 13 : Bases de la thérapie génique : du virus aux vecteurs viraux Un vecteur viral peut être obtenu à partir d’un virus adéno-associé(AAV) en remplacant les gènes codant pour la capside et les gènes permettant la réplication de l’ADN viral par le gène d’intérêt thérapeutique. Figure 14 : Effet d’un potentiateur chimique l’Ivacaftor sur le système respiratoire d’un patient atteint de mucoviscidose. L’augmentation en % du volume expiratoire forcé durant la première seconde (FEV1) est ici utilisée comme indice de l’efficacité du traitement sur le système respiratoire, en particulier sur la diminution de l’obstruction des bronches. Comparé au placebo, l’Ivacaftor permet une amélioration significative de la FEV1. Néanmoins, ce type de traitement n’est bénéfique qu’aux patients pour lesquels la protéine CFTR est présente à la membrane plasmique et non fonctionnelle, ce qui représente une minorité des cas de mucoviscidose. http://perso.ens-lyon.fr/romain.berardozzi/ L’obstruction des bronches est également réduire par l’administration de mucolytiques et de fluidifiants bronchiques. La thérapie génique permet d’apporter une copie codant pour une protéine CFTR fonctionnelle La thérapie génique consiste en l’utilisation de virus modifiés appelés vecteurs porteurs d’une copie fonctionnelle du gène que l’on souhaite intégrer dans les cellules du patient. Les vecteurs sont capables d’infecter une cellule et d’y intégrer leur matériel génétique mais incapables de reformer des particules virales comme les virus le font (les vecteurs ne portent pas le matériel génétique permettant la formation des particules virales infectantes : gène de la capside et gène de réplication de l’ADN viral) (Figure 13). Les vecteurs basés sur les adénovirus (virus à ADN) ont été utilisés avec succès mais ne permettent pas de thérapie durable sur le long terme. En effet, l’ADN n’est pas intégré dans le génome mais se trouve dans le cytoplasme sous forme épisomale et au cours des divisions cellulaires sera perdu. En général les vecteurs à adénovirus sont utilisés par inhalation d’aérosols et ont un effet remarquable sur 3 mois. Les vecteurs basés sur les rétrovirus à ARN et les virus adéno-associés permettent une expression stable et durable du gène non-muté grâce à leur capacité à s’insérer au cours de la mitose dans le génome de la cellule. Quelle que soit la méthode utilisée, les essais cliniques pour la mucoviscidose ont été jusqu’alors décevant notamment à cause de l’immunogénicité des vecteurs et de leur faible potentiel à cibler les cellules souches. De nouvelles stratégies consistent à potentialiser le fonctionnement des canaux CFTR déjà présent par l’utilisation de nouveaux médicaments. Le potentiateur Kalydeco (Ivacaftor) a recu une autorisation de mise sur le marché européen depuis 2014 mais n’est bénéfique qu’aux porteurs de la mutation G551D pour lesquels CFTR présente un défaut de conductance (Figure 14). La mucoviscidose est un exemple de pathologie monogénique. La mutation des deux copies du gène est seule responsable de l’apparition de la pathologie. En revanche, l’environnement jour également un rôle dans le développement de la maladie (infections chroniques et règles d’hygiènes mal respectées). Néanmoins, l’influence de l’environnement dans le développement de la mucoviscidose est moins marqué que pour d’autres pathologies comme le cancer et les diabètes dans lequel l’environnement joue un rôle capital (agents mutagènes de l’environnement, alimentation riche en glucides). http://perso.ens-lyon.fr/romain.berardozzi/ Annexe I : Coupe longitudinale d’un épithélium pseudostratifié cilié de bronche de porc coloré au trichrome de Masson et observé en microscopie optique. Remarquer les cils assurant la clairance muco-ciliaire, c’est-à-dire l’évacuation du mucus et des bactéries et poussières qui y sont prisonnières. Remarquer les cellules bleues claires, dites cellules caliciformes et responsables de la production de mucus de nature glucidique et glycoprotéique principalement. Ces cellules semblent ne pas avoir de membrane apicale à cause du fait qu’elle sécrète le mucus par voie apocrine. Le mucus est également produit par des glandes à mucus situées sous l’épithélium et non visibles sur cette coupe. Annexe II : Structure et mécanique ciliaire : rôle dans la clairance-muco-ciliaire. Les cils des bronches ont une structure proche des flagelles de spermatozoïdes chez les mammifères. Ils sont constitués de 9 doublets de microtubule et d’un doublet central. La présence de nexine (pont protéique entre doublets) et de dynéine (moteur moléculaire) permet la mise en mouvement des cils suite à l’hydrolyse d’ATP. Le mouvement ciliaire permet l’évacuation du mucus, phénomène appelé clairance muco-ciliaire.
