TP d`étude de la complémentation et de la recombinaison de

Analyse génétique Aurélien Chateigner Semestre 5 TP d’étude de la complémentation et de la recombinaison de la région rII chez le bactériophage T4 I.
Introduction A.
Phage T4 1.
Structure Ce TP a pour but d’étudier la complémentation et la recombinaison de la région rII chez le bactériophage T4. Nous utilisons les bactériophages dans nos études pour 2 raisons principales. En effet, ils parasitent et tuent les bactéries, et c’est cette propriété qui nous intéresse dans nos expériences. La première raison est que l’on peut croiser 2 génotypes de 2 phages distincts pour mesurer la recombinaison, et ainsi cartographier le génome viral. La deuxième raison est que l’on peut utiliser ces bactériophages pour rassembler des gènes bactériens, afin de réaliser des études de liaison ou d’autres études génétiques. On peut aussi les utiliser en technologie moléculaire comme porteur ou vecteur d’inserts d’ADN étranger provenant de n’importe quel organisme, mais cette utilisation est plus spécifique, et donc moins répandue. Au cours de ce TP, nous étudierons principalement 2 techniques qui sont utilisées pour les 2 raisons citées plus tôt. Ces 2 techniques sont la recombinaison et la complémentation. Nous utiliserons au cours de ce TP des bactériophages T4, et plus particulièrement, nous allons nous concentrer sur la région rII. Les bactériophages T4 font partie de la classe de bactériophages les mieux étudiés. Leur structure se compose de 6 parties : ‐
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La tête (contenant un acide nucléique) Le col et le collier La partie centrale La gaine La plaque basale Les fibres 1
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Cycle bactérien Pour infecter une bactérie, un phage va aller se fixer à la bactérie pour lui injecter son matériel génétique, qui va alors utiliser les différents outils utilisés par l’acide nucléique de la bactérie habituellement. La synthèse de composés ne fabrique plus alors que des composés du phage, et plus de la bactérie. Le matériel alors formé servira à faire de nouveaux phages, qui seront libérés par la lyse de la bactérie (rupture de la paroi). Dans l’étude des caractères des phages, la seule manifestation visible à l’œil est amenée par les bactéries dans lesquelles les phages sont entrés. On ne peut étudier que la morphologie des plages de lyse, ou la gamme des hôtes, qui est la manifestation de la sélection d’infestation du phage. Cellule non infectée Phages libres
Adsorption du phage sur la cellule hôte Assemblage des phages à l’intérieur de l’hôte Lyse de la cellule hôte Entrée de l’acide nucléique du phage Chromosome l’hôte dégradé Acide nucléique du phage Protéine du phage de Les protéines phagiques sont synthétisées et le matériel génétique est répliqué : le chromosome de l’hôte est ensuite dégradé 2
Analyse génétique Aurélien Chateigner Semestre 5 3.
Région rII La région rII étudiée permet la différenciation des croissances en fonction des bactéries. En effet, avec le phénotype rII, le phage ne croit que sur des bactéries de type B, alors que le phénotype sauvage permet de croitre sur les bactéries de type B et de type K. Cette différence de liaison est due au fait que la région rII est responsable de la lyse des bactéries, et donc à la croissance des phages. Ce phénotype est lié à 2 régions géniques distinctes : rIIa et rIIb. Une seule mutation sur l’une de ces deux régions suffit à entrainer un phénotype rII. Le phénotype sauvage se rencontre quand les 2 régions sont sauvages, et la bactérie peut alors croitre sur les bactéries K, et ici, ce sont des bactéries K12. On fait alors la distinction entre les 2 types de bactéries, les bactéries B étant appelée permissives, et les K12 étant appelées restrictives. On présente donc les différents génotypes que l’on peut rencontrer : rIIa+ rIIa‐ rIIa‐ rIIa+ rIIb‐ Phénotype rII : lyse sur bactéries B seulement rIIb+ Phénotype rII : lyse sur bactéries B seulement rIIb‐ Phénotype rII : lyse sur bactéries B seulement rIIb+ Phénotype sauvage : lyse sur tous les types de bactéries On a ici utilisé le code habituel pour signifier la mutation (‐) et le type sauvage (+). B.
Complémentation chez le phage La complémentation chez le phage se fait en infectant une bactérie par 2 phages distincts ou non. On a donc affaire à un système de complémentation haploïde. Zone de mutation rII Infection par 2 phages Pas de complémentation Bactérie Complémentation Suite à l’infection de la bactérie par les 2 phages, on a 2 types de réactions possibles, en fonction des génotypes de 2 phages. On a vu précédemment les différents types de génotypes que les phages 3
Analyse génétique Aurélien Chateigner Semestre 5 peuvent présenter, et donc transmettre à la bactérie. Dans le cas de mutations, on a 2 cas qui se présentent alors : ‐
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Les mutations sont sur le même gène, l’autre gène est sauvage dans les 2 cas : Pas de complémentation, phénotype muté, il n’y a pas de lyse des bactéries. Les mutations ne sont pas sur le même gène, chaque bactérie présente un gène sauvage, et un muté : complémentation, phénotype sauvage, lyse des bactéries. Ce phénomène s’effectue de la manière suivante : rIIa+ rIIb‐ Gènes (phage 1) Enzyme B Trajet (1) Enzyme A (2) lyse Gènes (phage 2) rIIb+ rIIa‐ Dans ce cas, chaque enzyme est apportée par un gène fonctionnel, l’enzyme A par le gène a du phage 1, et l’enzyme B par le gène b du phage 2, et la lyse est effective. C’est le phénomène de complémentation. C.
Recombinaison chez le phage Il faut bien différencier la recombinaison de la complémentation dans l’étude des phages T4. La recombinaison, c’est la formation de nouvelles combinaisons de gènes, par cassure et réunion de chromosomes. Les génotypes des enfants de la recombinaison sont nouveaux, recombinés. C’est ici que se fait la différence avec la complémentation, puisqu’il n’y a pas de mélange, dans le cas de la complémentation, les génotypes restent les parentaux. Ici, nous considérons que la région rIIa est composée de 6 sous‐parties, que l’on nommera a1, a2, a3, a4, a5 et a6 : rIIa rIIb a1 a2 a3 a4 a5 a6 On a alors plusieurs souches de phages qui présentent des délétions différentes : ‐
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La souche de phage X : délétion de toute la région rII La souche de phage Y : délétion de a4, a5 et a6 et rII La souche de phage Z : délétion de a6 et rII. Représentons les phages de la façon suivante : partie délétée Phage X : Phage Y : Phage Z : 4
Analyse génétique Aurélien Chateigner Semestre 5 On peut alors supposer 2 choses : ‐
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Soit la mutation est dans la région délétée la région délétée Soit la mutation n’est pas dans la région délétée Phage connu incapable de lyser K12
Mutation Phage à tester incapable de lyser K12
rII [a‐b‐] rII [a‐b‐]
rII [a‐b+] rII [a+b+]
Les deux phages ne peuvent toujours pas lyser la bactérie, l’un ayant été en grande partie délété, l’autre ayant toujours la mutation qui empêche la lyse des bactéries K12. Cependant, la lyse des bactéries B est possible. Cette recombinaison est dite léthale. Ici, en revanche, on a un phage qui est muté et délété, et donc qui ne peut lyse, mais on a aussi un phage qui a récupéré le génotype sauvage, et donc qui a gagné la capacité à lyser les bactéries de type K12. On peut alors déduire le résultat de ces manipulations, en fonction du phage que l’on va étaler sur les bactéries K12 : ‐
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II.
Phage X : Toute la région rII a été délétée, donc il n’y aura pas de plage de lyse Phage Y : Si les régions a1, a2 et a3 contiennent la mutation, il y aura des plages de lyse, puisqu’elles ne seront pas délétées. Dans le cas contraire, il n’y aura pas de plages de lyses, et donc la mutation sera dans les régions a4, a5 ou a6, qui seront délétées. Phage Z : Le cas est quasiment le même que le précédent, sauf que les régions qui pourraient contenir la mutation en cas de lyse sont les régions a1, a2, a3, a4 et a5, et que celle qui contiendrait la mutation en cas d’absence de lyse serait la région a6. Manipulations Nous avons 3 souches de phages dont nous ne connaissons pas le génotype. Nous allons tenter de déterminer quel gène est muté, et ensuite en quelle partie il l’est. A.
Test de complémentation : détermination du gène muté Le matériel dont nous disposons pour déterminer quel gène est muté est le suivant : ‐
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Une bactérie d’E. coli de type B (permissive) Une bactérie d’E. coli de type K12 (restrictive) Un phage mutant de mutation connue, le mutant tester (rIIa‐/rIIb+) 5
Analyse génétique Aurélien Chateigner Semestre 5 Grâce à ceci, nous avons mis en place un test de complémentation, qui nous sert à déterminer quel gène est muté. Pour cela, nous avons placé les 3 souches de phage de génotype inconnu en contact avec le phage tester, puis nous avons déposé les mélanges sur des boites de pétri avec un tapis bactérien, variant suivant la boite. Nous avons de plus déposé du phage Tester (T) seul et un témoin négatif (du LB seul : 0). 1 2 1
2
1 2 0 3 T 0
3
T
0
3
T Tapis : K12 + LB B + LB K12 + Tester Dans ces boites, la première est un témoin négatif, la 2ème un témoin positif, et la dernière une boite de complémentation. Grâce au témoin négatif, on met en évidence que les mutants ne peuvent pas pousser sur des bactéries K12. Le témoin positif met en évidence que les mutants ont la possibilité de pousser sur des bactéries B. Grâce à ces deux témoins, nos expériences peuvent être validées. La première boite est donc le témoin négatif, et on dépose sur cette boite une solution de bactéries de type K12 en un tapis sur le milieu gélosé. Notre solution contient 100 µl de bactéries, ajoutées à 1 mL de solution LB. Le tout est ajouté à un tube de soft agar en surfusion. La 2ème boite est le témoin positif. On dépose sur cette boite une solution de bactéries B (permissives). La solution est la même que précédemment, à ceci près que les bactéries sont des bactéries de type B. La 3ème boite est la boite de complémentation. On dépose sur cette boite une solution de K12, mais cette fois, on y ajoute les phages Testers (1.107 pfu.mL‐1), qui devront faire de la complémentation, de la même façon que les préparations précédentes. Nous avons à chaque fois fait des dilutions, car nous voulions certaines concentrations pour nos phages : Phage 1 Phage 2 Phage 3 Phage Tester Concentration de la Solution fournie (pfu.mL‐1) 1,6.108 2,1.108
2,8.108 2,5.108 Volume et Concentration auquel utiliser le phage 50 µL à 1.108 50 µL à 1.108 50 µL à 1.108 1,1 mL à 1.107 6
Analyse génétique Aurélien Chateigner Semestre 5 Pour obtenir ces concentrations, nous avons dû faire les dilutions suivantes : Volume de solution mère 31,25 µL 23,81 µL 17,86 µL 440 µL Phage 1 Phage 2 Phage 3 Phage Tester Volume de solution LB 18,75 µL 26,19 µL 32,14 µL 660 µl Volume et concentration finale (en pfu/mL) 50 µL à 1.108 50 µL à 1.108 50 µL à 1.108 1,1 mL à 1.107 B.
Test de recombinaison Pour nos tests de recombinaison, nous disposons de 3 phages, X, Y et Z que nous avons décrits précédemment. Nous devons, avant toute expérience, déterminer la concentration des phages dans les préparations. 1.
Titration des phages X, Y et Z. a)
Numérotation approximative Pour déterminer la concentration, nous avons réalisé des dilutions en cascade à partir de la solution mère. Nous avons dilué 10 fois à chaque étape, et ce jusqu’à 10‐6. Ensuite, nous avons déposé 10 µL des dilutions à 10‐2, 10‐3, 10‐4, 10‐5 et 10‐6 sur une boite de pétri, contenant un tapis de bactéries B (même technique que précédemment). 10‐3
10‐2
10‐4
10‐6
10‐5
Notre but, en faisant ces dépôts, est d’obtenir des dilutions pour lesquelles on pourra compter des plages de lyses. En procédant ainsi, on peut déterminer (de manière peu précise) la concentration en phages dans la solution initiale. Mais cette technique étant peu précise, on utilise la numérotation précise. b)
Numérotation précise. Pour faire la numérotation précise, on a placé sur une boite de pétri les dilutions 10‐5 et 10‐6, à hauteur de 100 µL, mélangé à des bactéries B en soft Agar. 2.
Test de Recombinaison Pour la recombinaison, on a numéroté une série de tubes Eppendorf de A à I, et dans ces tubes, on a placé des mélanges entre les phages 1, 2 et 3 et les phages X, Y et Z. 7
Analyse génétique Phage 1 Phage 2 Phage 3 Aurélien Chateigner Phage X Tube A Tube D Tube G Phage Y Tube B Tube E Tube H Semestre 5 Phage Z Tube C Tube F Tube I Dans chaque tube, on a déposé 25 µL du phage (1, 2, 3, X, Y ou Z) à une concentration de 1,6.108 pfu.mL‐1. Ensuite, on dépose 3 mélanges de soft agar et de 100 µL de bactéries de type K12 sur 3 boites. On fait ensuite un mélange de 300 µL de bactéries de type B dans 1 mL de milieu LB, le mélange sera maintenu à une température élevée avec un bain marie pendant 10 minutes. On dépose ensuite 50 µL de ce mélange dans les tubes A à I. Cette dilution est faite pour que le rapport phages/bactéries soit le plus bas, pour ne pas trouver de complémentation dans les bactéries. Ainsi, on est certains de bien avoir de la recombinaison dans les bactéries. Ensuite, les mélanges sont laissés 10 minutes au bain marie à 37 degré. Il faut faire attention à ne pas les laisser trop longtemps dans le bain marie, sinon il y aura une trop grande multiplication des phages, et donc des résultats inexploitables. Après tout ceci, on obtient nos tubes A à I, contenant les mélanges. On fait une dilution à 10‐1 pour chacun, et on dépose pour chaque tube la dilution et le mélange normal. Au bout de cette manipulation, on obtient 3 boites de pétri, contenant tous les mélanges, étalés sur des bactéries K12. On n’aura alors des plages de lyse que dans le cas où il y aura eu recombinaison entre 2 phages de génotype différent (voir recombinaison I. C.). Enfin, on a dilué la solution du tube F à 10‐6 (F certainement car recombinaison, mais non vérifié à ce stade, on fait confiance au professeur). On place donc 1 mL de cette solution dans un tube de soft agar contenant 100 µL de bactéries B. Enfin, on étale le tout sur une boite de pétri avec un tapis bactérien K12. III.
Résultats A.
Complémentation Nous n’avons obtenu aucune plage de lyse sur nos boites. B.
Recombinaison 1.
Titration Nos résultats n’étant pas significatifs, puisqu’aucune lyse pour l’ensemble de la classe n’a été faite, nous utilisons les résultats d’un autre groupe. Nous avons donc les résultats bruts suivants : Dilution à 10‐5 Dilution à 10‐6 Phage X 165 55 Phage Y 183 15 Phage Z 197 65 8
Analyse génétique 2.
Aurélien Chateigner Semestre 5 Test de recombinaison 9
Analyse génétique IV.
Aurélien Chateigner Semestre 5 Interprétation A.
Complémentation Nous n’avons pas réussi à obtenir de complémentation, donc on en déduit que les 3 phages sont mutés sur le gène rIIa, puisqu’il n’y a pas eu de complémentation, ils sont mutés sur le même locus que le phage Tester. On n’obtient donc pas le cas que l’on aurait pu obtenir en cas de complémentation (voir l’introduction). B.
Recombinaison 1.
Titration Nos résultats ne sont pas crédibles, aux vues des rapports entre les dilutions. En effet, on aurait dû obtenir un facteur 10 entre les dilutions. Ce n’est, cependant (sauf pour Y) pas le cas. Nous avons donc un peu retravaillé les résultats, et obtenu au final la titration. Calcul de la concentration (exemple pour X) : On trouve pour X un titre de 165 à 10‐5 et 55 à 10‐6. En multipliant le résultat de 10‐6 par 10, on obtient une valeur à 10‐5 de 550. En faisant la moyenne avec la valeur obtenue directement à 10‐5, on obtient un titre de 3,6.108 pfu.mL‐1. En faisant de même avec les résultats d’Y et Z, on obtient respectivement 1,7.108 pfu.mL‐1 et 4,25.108 pfu.mL‐1. Pour la recombinaison, il a fallu diluer les solutions. On avait besoin de 25 µL de solution de phage par tube, et donc au total 75 µL de chaque solution. Pour plus de sécurité, nous avons préparé 100 µL de chaque. Nos résultats et mélanges peuvent être regroupés dans le tableau suivant : X Y Z Concentration initiale 3,6.108 pfu 1,7.108 pfu 4,25.108 pfu Volume solution mère 44 µL 94 µL 37,6 µL Volume LB 66µL 6 µL 62,4µL Volume total final 100µl 100µl 100µl Concentration finale 1,6.108 pfu 1,6.108 pfu 1,6.108 pfu 2.
Test de recombinaison 10
Analyse génétique Aurélien Chateigner Semestre 5 11