TP d`étude de la complémentation et de la recombinaison de

AnalysegénétiqueAurélienChateignerSemestre5
TPd’étudedelacomplémentationetde
larecombinaisondelarégionrIIchezle
bactériophageT4
I. Introduction
A. PhageT4
1. Structure
CeTPapourbutd’étudierlacomplémentationetlarecombinaisondelarégionrIIchezle
bactériophageT4.Nousutilisonslesbactériophagesdansnosétudespour2raisonsprincipales.En
effet,ilsparasitentettuentlesbactéries,etc’estcettepropriétéquinousintéressedansnos
expériences.
Lapremièreraisonestquel’onpeutcroiser2génotypesde2phagesdistinctspourmesurerla
recombinaison,etainsicartographierlegénomeviral.
Ladeuxièmeraisonestquel’onpeututilisercesbactériophagespourrassemblerdesgènes
bactériens,afinderéaliserdesétudesdeliaisonoud’autresétudesgénétiques.
Onpeutaussilesutiliserentechnologiemoléculairecommeporteurouvecteurd’insertsd’ADN
étrangerprovenantden’importequelorganisme,maiscetteutilisationestplusspécifique,etdonc
moinsrépandue.
AucoursdeceTP,nousétudieronsprincipalement2techniquesquisontutiliséespourles2raisons
citéesplustôt.Ces2techniquessontlarecombinaisonetlacomplémentation.
NousutiliseronsaucoursdeceTPdesbactériophagesT4,etplusparticulièrement,nousallonsnous
concentrersurlarégionrII.LesbactériophagesT4fontpartiedelaclassedebactériophageslesmieux
étudiés.Leurstructuresecomposede6parties:
‐ Latête(contenantunacidenucléique)
‐ Lecoletlecollier
‐ Lapartiecentrale
‐ Lagaine
‐ Laplaquebasale
‐ Lesfibres
1

AnalysegénétiqueAurélienChateignerSemestre5
2. Cyclebactérien
Pourinfecterunebactérie,unphagevaallersefixeràlabactériepourluiinjectersonmatériel
génétique,quivaalorsutiliserlesdifférentsoutilsutilisésparl’acidenucléiquedelabactérie
habituellement.
Lasynthèsedecomposésnefabriqueplusalorsquedescomposésduphage,etplusdelabactérie.
Lematérielalorsforméserviraàfairedenouveauxphages,quiserontlibérésparlalysedela
bactérie(rupturedelaparoi).
Dansl’étudedescaractèresdesphages,laseulemanifestationvisibleàl’œilestamenéeparles
bactériesdanslesquelleslesphagessontentrés.Onnepeutétudierquelamorphologiedesplages
delyse,oulagammedeshôtes,quiestlamanifestationdelasélectiond’infestationduphage.
Cellulenoninfectée
Lysedelacellulehôte
2
Assemblagedes
phagesàl’intérieurde
l’hôte
Lesprotéinesphagiques
sontsynthétiséesetle
matérielgénétiqueest
répliqué:lechromosome
del’hôteestensuite
dégradé
Adsorptiondu
phagesurla
cellulehôte
Entréedel’acide
nucléiqueduphage
Chromosomede
l’hôtedégradé
Acidenucléique
duphage
Protéine
duphage
Phageslibres

AnalysegénétiqueAurélienChateignerSemestre5
3. RégionrII
LarégionrIIétudiéepermetladifférenciationdescroissancesenfonctiondesbactéries.Eneffet,
aveclephénotyperII,lephagenecroitquesurdesbactériesdetypeB,alorsquelephénotype
sauvagepermetdecroitresurlesbactériesdetypeBetdetypeK.Cettedifférencedeliaisonestdue
aufaitquelarégionrIIestresponsabledelalysedesbactéries,etdoncàlacroissancedesphages.Ce
phénotypeestliéà2régionsgéniquesdistinctes:rIIaetrIIb.Uneseulemutationsurl’unedeces
deuxrégionssuffitàentrainerunphénotyperII.Lephénotypesauvageserencontrequandles2
régionssontsauvages,etlabactériepeutalorscroitresurlesbactériesK,etici,cesontdesbactéries
K12.
IIétudiéepermetladifférenciationdescroissancesenfonctiondesbactéries.Eneffet,
aveclephénotyperII,lephagenecroitquesurdesbactériesdetypeB,alorsquelephénotype
sauvagepermetdecroitresurlesbactériesdetypeBetdetypeK.Cettedifférencedeliaisonestdue
aufaitquelarégionrIIestresponsabledelalysedesbactéries,etdoncàlacroissancedesphages.Ce
phénotypeestliéà2régionsgéniquesdistinctes:rIIaetrIIb.Uneseulemutationsurl’unedeces
deuxrégionssuffitàentrainerunphénotyperII.Lephénotypesauvageserencontrequandles2
régionssontsauvages,etlabactériepeutalorscroitresurlesbactériesK,etici,cesontdesbactéries
K12.
Onfaitalorsladistinctionentreles2typesdebactéries,lesbactériesBétantappeléepermissives,et
lesK12étantappeléesrestrictives.
Onfaitalorsladistinctionentreles2typesdebactéries,lesbactériesBétantappeléepermissives,et
lesK12étantappeléesrestrictives.
Onprésentedonclesdifférentsgénotypesquel’onpeutrencontrer:Onprésentedonclesdifférentsgénotypesquel’onpeutrencontrer:
rIIa+ rIIb‐ PhénotyperII:lysesurrIIa+ rIIb‐ PhénotyperII:lysesur
bactériesBseulementbactériesBseulement
3
rIIa‐rIIb+ PhénotyperII:lysesurrIIa‐rIIb+ PhénotyperII:lysesur
bactériesBseulementbactériesBseulement
rIIa‐rIIb‐ PhénotyperII:lysesurrIIa‐rIIb‐ PhénotyperII:lysesur
bactériesBseulementbactériesBseulement
rIIa+rIIb+ Phénotypesauvage:lysesurrIIa+rIIb+ Phénotypesauvage:lysesur
touslestypesdebactériestouslestypesdebactéries
Onaiciutilisélecodehabituelpoursignifierlamutation(‐)etletypesauvage(+).Onaiciutilisélecodehabituelpoursignifierlamutation(‐)etletypesauvage(+).
B. ComplémentationchezlephageB. Complémentationchezlephage
Lacomplémentationchezlephagesefaiteninfectantunebactériepar2phagesdistinctsounon.On
adoncaffaireàunsystèmedecomplémentationhaploïde.
Lacomplémentationchezlephagesefaiteninfectantunebactériepar2phagesdistinctsounon.On
adoncaffaireàunsystèmedecomplémentationhaploïde.
ZonedemutationrIIZonedemutationrII
Infectionpar2phages Infectionpar2phages
Bactérie
Pasde
complémentation
 Complémentation
Suiteàl’infectiondelabactérieparles2phages,ona2typesderéactionspossibles,enfonctiondes
génotypesde2phages.Onavuprécédemmentlesdifférentstypesdegénotypesquelesphages
Suiteàl’infectiondelabactérieparles2phages,ona2typesderéactionspossibles,enfonctiondes
génotypesde2phages.Onavuprécédemmentlesdifférentstypesdegénotypesquelesphages

AnalysegénétiqueAurélienChateignerSemestre5
peuventprésenter,etdonctransmettreàlabactérie.Danslecasdemutations,ona2casquise
présententalors:
‐ Lesmutationssontsurlemêmegène,l’autregèneestsauvagedansles2cas:Pasde
complémentation,phénotypemuté,iln’yapasdelysedesbactéries.
‐ Lesmutationsnesontpassurlemêmegène,chaquebactérieprésenteungènesauvage,et
unmuté:complémentation,phénotypesauvage,lysedesbactéries.
Cephénomènes’effectuedelamanièresuivante:
rIIa+rIIb‐
Gènes(phage1)
4
Trajet(1) (2)lyse
Gènes(phage2)
rIIa‐ rIIb+
Danscecas,chaqueenzymeestapportéeparungènefonctionnel,l’enzymeAparlegèneadu
phage1,etl’enzymeBparlegènebduphage2,etlalyseesteffective.C’estlephénomènede
complémentation.
C. Recombinaisonchezlephage
Ilfautbiendifférencierlarecombinaisondelacomplémentationdansl’étudedesphagesT4.La
recombinaison,c’estlaformationdenouvellescombinaisonsdegènes,parcassureetréunionde
chromosomes.Lesgénotypesdesenfantsdelarecombinaisonsontnouveaux,recombinés.C’estici
quesefaitladifférenceaveclacomplémentation,puisqu’iln’yapasdemélange,danslecasdela
complémentation,lesgénotypesrestentlesparentaux.
Ici,nousconsidéronsquelarégionrIIaestcomposéede6sous‐parties,quel’onnommeraa1,a2,a3,
a4,a5eta6:rIIarIIb
a1a2a3a4a5a6
Onaalorsplusieurssouchesdephagesquiprésententdesdélétionsdifférentes:
‐ LasouchedephageX:délétiondetoutelarégionrII
‐ LasouchedephageY:délétiondea4,a5eta6etrII
‐ LasouchedephageZ:délétiondea6etrII.
Représentonslesphagesdelafaçonsuivante:partiedélétée
EnzymeAEnzymeB
PhageX:
PhageY:
PhageZ:

AnalysegénétiqueAurélienChateignerSemestre5
Onpeutalorssupposer2choses:
‐ Soitlamutationestdanslarégiondélétéelarégiondélétée
‐ Soitlamutationn’estpasdanslarégiondélétée‐ Soitlamutationn’estpasdanslarégiondélétée
Mutation
PhageconnuincapabledelyserK12
rII[a‐b‐]rII[a‐b‐]
PhageàtesterincapabledelyserK12
 rII[a‐b+]rII[a+b+]
Ici,enrevanche,onaunphagequiest
mutéetdélété,etdoncquinepeut
lyse,maisonaaussiunphagequia
récupérélegénotypesauvage,etdonc
quiagagnélacapacitéàlyserles
bactériesdetypeK12.
Lesdeuxphagesnepeuventtoujours
paslyserlabactérie,l’unayantétéen
grandepartiedélété,l’autreayant
toujourslamutationquiempêchela
lysedesbactériesK12.Cependant,la
lysedesbactériesBestpossible.Cette
recombinaisonestditeléthale.
Onpeutalorsdéduirelerésultatdecesmanipulations,enfonctionduphagequel’onvaétalersur
lesbactériesK12:
Onpeutalorsdéduirelerésultatdecesmanipulations,enfonctionduphagequel’onvaétalersur
lesbactériesK12:
‐ PhageX:ToutelarégionrIIaétédélétée,donciln’yaurapasdeplagedelyse‐ PhageX:ToutelarégionrIIaétédélétée,donciln’yaurapasdeplagedelyse
‐ PhageY:Silesrégionsa1,a2eta3contiennentlamutation,ilyauradesplagesdelyse,
puisqu’ellesneserontpasdélétées.Danslecascontraire,iln’yaurapasdeplagesdelyses,
etdonclamutationseradanslesrégionsa4,a5oua6,quiserontdélétées.
‐ PhageY:Silesrégionsa1,a2eta3contiennentlamutation,ilyauradesplagesdelyse,
puisqu’ellesneserontpasdélétées.Danslecascontraire,iln’yaurapasdeplagesdelyses,
etdonclamutationseradanslesrégionsa4,a5oua6,quiserontdélétées.
‐ PhageZ:Lecasestquasimentlemêmequeleprécédent,saufquelesrégionsquipourraient
contenirlamutationencasdelysesontlesrégionsa1,a2,a3,a4eta5,etquecellequi
contiendraitlamutationencasd’absencedelyseseraitlarégiona6.
‐ PhageZ:Lecasestquasimentlemêmequeleprécédent,saufquelesrégionsquipourraient
contenirlamutationencasdelysesontlesrégionsa1,a2,a3,a4eta5,etquecellequi
contiendraitlamutationencasd’absencedelyseseraitlarégiona6.
II. ManipulationsII. Manipulations
Nousavons3souchesdephagesdontnousneconnaissonspaslegénotype.Nousallonstenterde
déterminerquelgèneestmuté,etensuiteenquellepartieill’est.
Nousavons3souchesdephagesdontnousneconnaissonspaslegénotype.Nousallonstenterde
déterminerquelgèneestmuté,etensuiteenquellepartieill’est.
A. Testdecomplémentation:déterminationdugènemutéA. Testdecomplémentation:déterminationdugènemuté
5
Lematérieldontnousdisposonspourdéterminerquelgèneestmutéestlesuivant:Lematérieldontnousdisposonspourdéterminerquelgèneestmutéestlesuivant:
‐ Unebactéried’E.colidetypeB(permissive)‐ Unebactéried’E.colidetypeB(permissive)
‐ Unebactéried’E.colidetypeK12(restrictive)‐ Unebactéried’E.colidetypeK12(restrictive)
‐ Unphagemutantdemutationconnue,lemutanttester(rIIa‐/rIIb+)‐ Unphagemutantdemutationconnue,lemutanttester(rIIa‐/rIIb+)