phage - Luxembourg Creative

Parole d’expert
La phagothérapie, l'alternative de demain
aux antibiotiques ?
Daniel DE VOS – Chercheur microbiologiste
Une organisation conjointe avec BIOLIEGE
Avec le soutien de :
La phagothérapie, l’alternative de
demain aux antibiotiques?
Daniel De Vos, PhD
Laboratoire de Technologie Moléculaire et Cellulaire,
Centre des Grands Brûlés,
Hôpital Militaire Reine Astrid (HMRA), Bruxelles, Belgique.
LIEGE CREATIVE, Château de Colonster, Liège 2 mai 2012
“Superbugs”
Résistance aux antibiotiques
(AB)
• 
Que s’est-il passé avec ces ‘médicaments miracles’ ? Une certaine
nonchalance naïve dans une société trop commercialisée (Barry
Kreiswirth).
• 
Mais ! Egalement un manque de connaissance de la biologie
évolutionnaire (une médecine trop méchanistique) → utilisation d’une
substance statique non-évolutive comme antimicrobien vs une cellule
vivante (bactérie) → résistance assurée !
• 
Deux aspects méconnus : l’antibiotique lui-même (rôle naturel, phase
planctonique/biofilm bactérien…) et l’intégration de la notion d’évolution
(fondement de la biologie !) (>< durabilité)
Bactériophages ou Phages
•  Antimicrobien évolutif et auto-amplificateur
•  ‘Virus’ de bactéries (incluant les “Superbugs”)
•  Un couple co-évolutif (médecine Darwinienne
ou évolutionnaire)
•  Phages = contrôleurs (prédateurs) bactériens
Structure d’un bactériophage
Tête
Queue
Plaque
terminale
Fibres
Le phage lytique qui ‘tue’ et le
lysogène qui attend
Phagothérapie ?
Une alternative potentielle à la crise mondiale des
résistances bactériennes aux antibiotiques ?
(The Antibiotic Crisis)
La phagothérapie consiste dans l’utilisation des contrôleurs naturels des
bactéries, les virus bactériospécifiques ou phages (mangeurs de bactéries)
contre les bactéries pathogènes afin de contrôler une infection ou une
colonisation bactérienne non souhaitée.
‘Danger phage’ !?! Aucune infection eucaryotique à phage n’a pu être
rapportée jusqu’à ce jour, tandis qu’aucune séquence de traces d’ADN de
phage n’a pu être détectée dans le génome humain (>< séq’s de rétrovirus –
8 - 10 %) (Mi et al, Nature 403, 785-789 (2000).
Nous vivons dans un océan de
phages
•  On estime le nombre total de particules
phagiques sur terre à : 4-6 x 1031 = 10 x le
nombre de procaryotes (Bergh. 1989. Nature
340: 467-468) (Whitamn et al. 1998. PNAS
95: 6578-6583)
•  109 phages par ml d’eau de surface
•  Nous-mêmes sommes en permanence
porteurs de phages et nous en consommons
constamment
Phages vs. Antibiotiques
PHAGE
ANTIBIOTIQUE
•  Très spécifiques (espèce et,
même, souches)
•  Non spécifique (incluant flore
commensale)
•  Le développement d’une
préparation : relativement
facile et peu côuteux
•  Le développement d’un
nouvel AB : long et cher
•  L’agent infectieux doit être
connu (diagnostiques
rapides, cocktails)
•  Pas d’effets secondaires
spécifiques connus (Attention :
aspect immunomodulatoire,
interférence oncologique, impact
environnemental)
•  Large spectre, agent
infectieux ne doit pas être
connu
•  Effets secondaires multiples,
impact écologique énorme
Phagothérapie :
un potentiel de pleine durabilité
Un exemple : le choléra “Host-mediated phage
amplification during the cholera
epidemic likely contributed to
increased environmental phage
abundance, decreased load of
environmental V. cholerae and,
hence, the collapse of the
epidemic”
Faruque et al. Self-limiting nature of seasonal cholera
epidemics: Role of host-mediated amplification of phage.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17):
6119-24.
Phagothérapie :
un potentiel de pleine durabilité
Interactions phage/bactérie dynamiques (coévolution)
• an "arms race", consisting of the repeated origin and fixation of
new parasite virulence and host defence traits
Les phages sont les contrôleurs naturels des
bactéries dans tout système écologique
• phage will rapidly and drastically reduce the population of the
most abundant bacteria, thus preventing the best competitors
from building up a high biomass
Une renaissance?
'Phage/Therapy' papers (PubMed)
1400
1200
1000
800
600
•  Une réelle renaissance dans le
monde occidental qui se reflète par
une augmentation exponentielle de
la littérature sur le sujet;
•  Essais thérapeutiques en cliniques;
•  Un intérêt significatif également
dans l’agro-industrie et à la
Défense.
1230
1031
489
400
200
212
244
182
168
179
0
1970-75
1975-80
1980-85
1985-90
Time periods
1990-95
1995-2000
2000-05
2005-10
(extrapolated)
But
(R)Amener les phages chez le
patient sous forme d’un produit de
qualité et sécurisé, et d’une manière
flexible et durable.
J’ai besoin des
phages… Maintenant !
Obstacles rencontrés dans le
développement de la phagothérapie
1/ La perception d’un phage comme « l’ennemi de
la vie »
2/ L’absence d’un cadre régulateur adapté, bien
que ça bouge dans le domaine…
3/ Le manque de bons produits définis : sécurisés
et caractérisés
4/ Brevets (probablement le problème le plus
important !)
5/ Émergence de résistances et impact écologique
Perception subjective des phages
comme l’ennemi de la vie
(LP Villarreal, 2005)
Vécu dans les rapports avec les comités éthiques, les assurances, le staff médical
Le cadre régulateur 2007-2012
• 
• 
• 
• 
• 
Pas de cadre régulateur spécifique actuellement (classification EMA
comme “Biological” ou vaccin… en discussion);
Après avoir défini officiellement la position aux autorités de la CE et à
l’ITF, le phage est positionné ► comme médicament (2011!);
En 2007, notre option était le Comité d’Ethique de notre institution;
Mais : également possible, La déclaration d’Helsinki;
Et aujourd’hui, bien que toutes les autorités aient été contactées et que les
discussions se multiplient, nous vivons toujours dans le même carcan.
Future Virol. (2012) 7(4), 379-390. (Open Access!)
A specific framework with realistic production and documentation
requirements, which allows a timely (rapid) supply of safe, tailor-made, natural
bacteriophages to patients, should be developed
Un cadre régulatoire spécifique pour la phagothérapie doit être développé
Un cocktail de phages
(BFC-1) avec contrôle
de qualité
• 
• 
• 
Un manque de produits bien
définis et caractérisés
Souvent l’interaction récepteurphage entre la bactérie et les
phages n’était pas optimale
(empirisme)
Présence d’endotoxines.
Une production “GMP-like”
Sécurité et contrôle de qualité
Caractérisation du phage : •  Détermination du morphotype •  Analyse complète du génome (ADN) et protéome (confirmer l’absence lysogeny de gène de toxines) •  Tester l’absence de phage lysogénique (mitomycin test) dans la bactérie hôte de production de phage Tests de CQ par des laboratoires qualifiés et accrédités sur la préparation finale : • 
• 
• 
• 
• 
• 
Titre du phage (agar overlay method) pH (PhEu ) Cytotoxicité (ISO10993-­‐5) Pyrogenicité (10 ml/kg de lapin, suivant l’ USP) Stérilité (PhEu) Confirmer la morphologie et l’activité des phages vis-­‐à-­‐vis des bactéries cibles (Transmission Electron Microscopy) BFC 1
Application thérapeutique chez le Brûlé,
‘une modeste étude pilote’
•  Le protocole modeste et prudent ne permettait pas une évaluation
adéquate de l’efficacité;!
•  L’application de BFC-1 ne montrait aucun effet néfaste secondaire;!
•  Les staffs, médical et soignant, se sont familiarisés avec le concept de
la phagothérapie et sont convaincus de la sécurité et du potentiel
contre les bactéries multi-résistantes rencontrées chez les brûlés;!
•  Ainsi, nous sommes convaincus que cette étude sur le terrain est un
petit pas dans l’implémentation de la phagothérapie dans un futur
proche.!
Verbeken et al., Future Medicine, 2, 485-491, 2007.
Merabishvili et al., PLoS ONE. 2009; 4(3): e4944.
Kutter et al, Current Pharmaceutical Biotechnology,11, 69-86, 2010.
Application de phages à l’Hôpital
Militaire Reine Astrid à Bruxelles,
Belgium (sous couvert d’Helsinki)
Application de phages dans une plaie
de guerre à l’Hop. Mil. de Gori, Géorgie
HMRA, Bruxelles
Eliava Institute, Tbilis
‘Prêt-à-porter’ vs ‘Sur mesure’
Pirnay et al., 2010
Pirnay et al., 2012
IP-issues!
Conclusion
Un petit pas a été réalisé dans la réimplémentation de la phagothérapie en
routine clinique, mais un pas plus
grand a été réalisé dans le domaine des
infections bactériennes
Problèmes majeurs ?
•  Le cadre juridique
•  Brevets (environnement de concept
pharmaco-industriel non durable)
•  Solution : une démarche depuis la base et le
renouveau de la recherche fondamentale !
•  Déduction : cliniciens et patients,
scientifiques et industriels de bonne foi,
unissez-vous !
Activités en cours et perspectives
•  Etude multicentrique pour décoloniser les porteurs de MRSA (UCL –
Prof. Laterre/HMRA)
•  Développement d’un cocktail contre A. baumannii (MHKA.UGent)
•  Etudes scientifiques de base (isolement et caractérisation
génomique et protéomique de phages et leurs interactions
bactériennes – KUL/HMRA/UGent)
•  Etudes de la co-évolution “in vitro” and “in vivo” (animal) Article en
révision chez AEM (Prof. Buckling Exceter, UK)
•  Le développement d’un cadre régulateur adéquat (thèse de
doctorat, KUL/HMRA/ERM)
•  Mise au point d’un protocole spécifique pour plaies chroniques
(ULB, Prof. del Marmol)
Effect of bacteriophage cocktail BFC 1 on nasal and pharyngeal carriage of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in ICU patients A prospec)ve , randomized, double-­‐blind, placebo-­‐
controlled, mul)center study Forma)on Candidat Officier Supérieur (Med Cdt Sophie De Roock) 2 x 20 pa)ents (14 up )l now) Study MED 11: “Evalua0on of the impact of phage – bacterium coevolu0on on phage therapy” WP1: Evolu)on of resistance to mul)ple phages: simultaneous versus sequen)al treatment “Phage cocktails vs sequen)al applica)on of single phages” (in coll. With Prof. Buckling) Résultats, après 100 généra0ons bactériennes in vitro Densité de Bactéries traitées Propor0on de bactéries résistantes au phage u0lisé Propor0on de bactéries résistantes à tous les phages Two phages (red circles) applied sequen)ally can be beWer than a 4 phage cocktail (blue circles): same growth inhibi)on but less resistance! Hall et al, sub. AEM, 2012
Phages can prolong survival of caterpillars (larvae of the waxmoth Galleria mellonella) Hall et al, sub. AEM, 2012
Mixture is best in this context! “EHEC”
Enteroaggregative, Shiga toxin/verotoxin-producing E. coli (EAggEC
STEC/VTEC) strain O104:H4 in Germany caused over 4,000 cases of
diarrhea – 3,167 without the hemolytic-uremic syndrome (16 deaths)
and 908 with the hemolytic-uremic syndrome (34 deaths)
Screening of phage collection against
’EHEC’ O104:H4 (in BSL 3 lab)
K12 EHEC O104:H4 ‘EHEC’ phages
§ Two potent phages were isolated
§ DNA sequencing is nearly finished
« 3S » Myovirus « NES » Myovirus L’équipe des phages
• 
Serge Jennes, Thomas Rose, Sophie Deroock, Patrick Soentjens, Pierre
Neirinckx, Geert Laire. Burn Wound Centre, Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium.
• 
Gilbert Verbeken, Gunther Verween, Peter De Corte, Florence Bilocq, Véronique
Cornu, Dirck Schoeters, Bruno Pascual, Daniel De Vos and Jean-Paul Pirnay.
Laboratory for Molecular and Cellular Technology (LabMCT), Burn Wound Centre, Queen Astrid Military Hospital,
Brussels, Belgium.
• 
Martin Zizi. Department of Physiology (FYSP), Vrije Universiteit Brussel, Brussels and Section Health of the
• 
Luc Van Parys. Section Health of the Division Well-Being (Belgian Defence Staff), Queen Astrid Military
• 
Maya Merabishvili, Nina Chanishvili, Marina Tediashvili, Nino Lashkhi, Thea Glonti
and Revaz Adamia. Eliava Institute of Bacteriophage, Microbiology and Virology (EIBMV), Tbilisi, Georgia.
• 
Mario Vaneechoutte. Laboratory of Bacteriology Research (LBR), Ghent University Hospital, Gent, Belgium.
• 
Rob Lavigne, Wesley Mattheus and Guido Volckaert, Isabelle Huys,. Laboratory of Gene
• 
Victor Krylov and M. Yu Beburov. Laboratory of Bacteriophage Genetics, State Institute for Genetics
• 
Jan Mast. Unit Electron Microscopy, Veterinary and Agricultural Research Centre (VAR), Brussels, Belgium.
• 
Angus Buckling, Evolutionary Biology Unit, Exeter University, UK
Division Well-Being (Belgian Defence Staff), Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium.
Hospital, Brussels, Belgium.
Technology (LoGT), and the Unit of pharmacy and Law ,Katholieke Universiteit Leuven, Leuven, Belgium.
and Selection of Industrial Microorganisms (SIGSIM), Moscow, Russia.