Test de recombinaison

Simonnet Jean Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie 2000/2008
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Analyse Génétique : Compte rendu de TP
Etude de la complémentation et de la recombinaison au
niveau de la région RII chez le bactériophage T4.
Notre but sera de montrer le déterminisme génétique chez différentes souches du phage T4 mutés
au niveau de la région RII, région impliquée dans la lyse bactérienne, par des tests de
complémentation pour savoir quel gène est touché et également par des tests de recombinaison
pour déterminer plus précisément la localisation des mutations.
I. Généralités
A. Phage T4
1. Structure
Le phage T4 affecte Escherichia coli (E. coli). C’est un virus, de la famille des myoviridae, à ADN
double brin.
Il présente une nucléocapside qui comporte la capside, formée de protéines virales, qui contient le
matériel génétique, ici de l’ADN double brin. Il présente aussi une queue qui va lui permettre de
s’adsorber à la bactérie, grâce à des fibres présentes à son extrémité, avant l’injection de son
matériel génétique.
2. Cycle viral
Le virion libre s’attache à la paroi bactérienne d’E. coli. Il injecte son ADN double brin dans la bactérie
qui va être répliqué après digestion de l’ADN de l’hôte. On a alors une phase de biosynthèse qui va
aboutir à l’assemblage de nouveaux virions qui seront libéré après la lyse de la bactérie. Les
nouveaux virions formés pourront alors infecter d’autres bactéries. Une bactérie peut être infectée
par 2 phages en même temps. Le cycle viral est très court, il dure environ 30 minutes, ce qui en fait
un outil très utile en génétique du fait de sa rapidité à se multiplier.
3. Région RII
C’est la région responsable de la lyse des bactéries. Elle se compose de 2 gènes distincts, RIIa et RIIb.
La mutation des 2 gènes empêche la lyse de la bactérie. Cependant, selon le type de bactérie, la
mutation d’un seul des 2 gènes ne peut avoir aucun incident : pour les bactéries B, on à lyse des
bactéries, pour les bactéries K12, la lyse n’a pas lieu. On dit que les bactéries B sont permissives et les
bactéries K12 sont restrictives. Pour une lyse de la bactérie K12, les deux gènes doivent être
fonctionnels.

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B. Complémentation chez le phage
Lors d’une infection par 2 phages ayant un génotype opposé, on peut avoir complémentation.
Considérons deux gènes A et B commandant chacun l’expression d’une protéine spécifique.
Considérons également qu’un phage (1) comporte le gène A sauvage et le gène B muté (donnant
protéine défectueuse) et qu’un phage (2) comporte le gène A muté (donnant une protéine
défectueuse) et le gène B sauvage.
Si les 2 phages infectent la même bactérie, chaque génome va être introduit. Le génome (1) va
exprimer une protéine B défectueuse et le génome (2) une protéine A défectueuse, cependant, le
génome (1) produit une protéine A fonctionnelle et le génome (2) va produire une protéine B
fonctionnelle : les deux génomes sont défectueux sur 2 gènes différents et peuvent donc se
complémenter. Si la mutation avait touché le même gène chez les 2 phages, il n’y aurait pas eu
complémentation, le cycle phagique ne se serait pas produit.
Pour ce qui est du phage T4, une complémentation est possible entre les gènes RIIa et RIIb.
RIIa +
RIIb +
RIIa +
RIIb -
RIIa -
RIIb +
RIIa -
RIIb -
Souche sauvage
Souches mutés
Lyse de B
et K12
Lyse de B,
pas de K12
Lyse de B,
pas de K12
Pas de lyse
Différentes Souches en fonction de la région RII
Le «-» signifie que le gène est muté et le «+» signifie que le gène est sauvage

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C. Recombinaison chez le phage
Considérons la région RII comme il suit : la région RIIa se divise en 6 sous unités (a1 à a6).
La souche de phage X présente une délétion de toute la région RII
La souche de phage Y présente une délétion de A4, A5, A6 et RII
LA souche de phage Z présente une délétion de A6 et RII.
Pour la recombinaison, deux hypothèses sont envisageable pour chaque test de recombinaison. Soit
la mutation est dans la région délétée, soit elle est en dehors de cette région.
RIIa
RIIb
a1
a2
a3
a4
a5
a6
Phage RIIa- RIIb+
Phage RIIa- RIIb +
E. coli
Apporte RIIb+
Apporte RIIb+
Pas de Complémentation
Pas de lyse de la bactérie
Phage RIIa+ RIIb -
Phage RIIa- RIIb +
E. coli
Apporte RIIa+
Apporte RIIb+
Complémentation
Lyse de la bactérie

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Sur K12:
Avec X : il n’y aura pas de plage de lyse, car il n’y a plus de région RII : on vérifiera que la mutation est
bien dans la région RII.
Avec Y : S’il y a des plages de lyses, c’est que la mutation se situe en a1 a2 a3. S’il n’y en a pas, c’est
que la mutation est comprise dans la région délétée.
Avec Z : s’il y a des plages de lyse, c’est que la mutation se situe avant a6. (De a1 à a5) S’il n’y en a
pas, c’est qu’elle est après a5.
Délétion
Phage connu (X, Y ou Z),
incapable de lyser K12
Phage à tester (1, 2 ou 3),
incapable de lyser K12
Mutation
Hypothèse 2 : Mutation hors de la région délétée
Crossing
over
Phage présentant et un
mutation et une délétion :
pas de lyse.
Génotype sauvage
récupérée : lyse des
bactéries K12
Délétion
Phage connu (X, Y ou Z),
incapable de lyser K12
Phage à tester (1, 2 ou 3),
incapable de lyser K12
Mutation
Hypothèse 1 : Mutation dans la région délétée
Crossing
over
Mutation
Les 2 phages ne peuvent
toujours pas lyser K12 : un
est délété et l’autre muté :
recombinaison léthale. Le
deuxième phage peut lyser
les bactéries B : RIIb sauvage

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II. Manipulations
On dispose de 3 souches de phages inconnues. Notre but sera, dans un premier temps, de
déterminer quel gène est touché, puis par la suite nous préciserons quelle partie du gène est touché.
A. Test de complémentation : détermination du gène muté
On dispose de 2 souches bactériennes d’E. coli. Une souche B, permissive, et une souche K12,
restrictive.
On dispose également d’une souche de phages mutants, dont la mutation est connue : RIIa- RIIb+. On
appelle ce mutant le mutant tester.
On va faire des tests de complémentation entre les différentes souches de phages (1, 2 et 3) et le
phage T, c'est-à-dire que l’on va mettre en présence la souche 1, 2 ou 3 et T, dans un milieu
comportant des bactéries. Dans chaque boite (a, b et c), place 10 µl des solutions de 1, 2, 3, T et LB
(0) en des points bien distincts.
On réalise 3 boites de culture : 1 témoin négatif, un témoin positif et la boite de complémentation.
Le témoin positif montre que les mutants ne poussent pas sur des bactéries restrictives. Le témoin
positif montre que les phages mutants peuvent pousser sur les bactéries permissives, et donc qu’ils
ont gardé leur capacité à lyser.
a : Témoin négatif, on dispose une solution de bactéries K12 dans la boite de Pétri contenant un
milieu gélosé. On réalise une solution contenant 100µl de K12 et 1 mL de solution LB que l’on met
dans un tube de solution soft agar fournie.
b : Témoin positif, on dispose une solution de B dans la boite de Pétri contenant un milieu gélosé. On
réalise une solution contenant 100µl de B et 1ml de solution LB que l’on met dans un tube de
solution soft agar fournie.
c : boite de complémentation : on dispose une solution contenant des bactéries K12 et les phages T
(1.107pfu/mL) dans une boite de Pétri contenant un milieu gélosé que l’on met dans un tube de
solution soft agar fournie.
1
2
3
T
0
1
2
3
T
0
1
2
3
T
0
a
b
c
Milieu avec E. coli K12
Milieu avec E. coli B
Milieu avec E. coli K12