Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
BIOCHIMIE STRUCTURALE– Biotech 1
Chapitre 6
Enzymologie
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Enzymologie
SOMMAIRE
1. Généralités
1.1. Classification des enzymes
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique
3. La cinétique enzymatique simple
3.1. Influence de la concentration en enzyme
3.2. Influence du pH
3.3. Influence de la température
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
3.6. Influence des inhibiteurs
4. Contrôle de l’activité enzymatique
4.1. La protéolyse ménagée
4.2. Modifications covalentes réversibles
4.3. Les enzymes allostériques
5. Les cofacteurs et coenzymes
6. Les isoenzymes
2
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Enzymologie
SOMMAIRE
1. Généralités
1.1. Classification des enzymes
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
1.2.1. Modèle de Fischer
1.2.2. Modèle de Koshland
2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique
3. La cinétique enzymatique simple
3.1. Influence de la concentration en enzyme
3.2. Influence du pH
3.3. Influence de la température
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
3.6. Influence des inhibiteurs
4. Contrôle de l’activité enzymatique
4.1. La protéolyse ménagée
4.2. Modifications covalentes réversibles
4.3. Les enzymes allostériques
5. Les cofacteurs et coenzymes
6. Les isoenzymes
3
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1. GÉNÉRALITÉS
- réaction chimique = transformation : A + B → C + D
- dans nos cellules : des milliers de réactions chimiques en permanence
→ nécessité de catalyseurs pour :
- accélérer la réaction
Catalyseurs et catalyse (1)
- contrôler
la réaction
E6
Notion de catalyse. Propriétés des catalyseurs biologiques
Réaction
très
lente
(années/siècles)
réaction
très
lente
Libération de chaleur « inutilisable »
++
O202
(années / siècles)
Saccharose
saccharose
CO
CO
2 2
+ +HH02O
2
réaction
rapide
(secondes)
Réaction
trèstrès
rapide
(secondes)
Production d’énergie
→ production
d’énergie utilisable
utilisable (ATP)
(sucre courant)
Muqueuse intestinale
muqueuse
intestinale
(contenant la saccharase et les enzymes de la glycolyse aérobie)
(saccharase + enzymes glycolyse)
Les catalyseurs biologiques sont les enzymes
- ils ont une STRUCTURE PROTEIQUE, souvent globulaire
- catalyseurs
biologiques : enzymes (E)
- ils agissent à 37°C, dans un milieu à pH spécifique
= protéines (sauf ribozymes)
- ils ont une grande SPECIFICITE : choix du substrat et présentation
→ transformation
d’un substrat S en produit P
- ils ont des CAPACITES DE REGULATION
(site actif)
S
E
P
4
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1. GÉNÉRALITÉS
DÉFINITIONS
- ENZYME : protéine présentant des propriétés de catalyse spécifique d’une réaction
chimique du métabolisme
- SUBSTRAT : molécule qui entre dans la réaction pour y être transformée grâce à l’activité
catalytique d’une enzyme
- PRODUIT : molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme
- LIGAND : corps chimique ayant une liaison spécifique avec une protéine
5
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1. GÉNÉRALITÉS
- métabolisme = ensemble des réactions chimiques d’une cellule
- réactions organisées en voies (séquences ou chaînes) métaboliques :
- suite ordonnée de réactions biochimiques permettant des transformations
successives de substrats en produits
→ le produit d’une réaction devient substrat de la suivante
étape est2catalysée
par une enzyme spécifique
- chaque BIOTECH
/ 2011-2012
Biochimie
- l’absence d’une enzyme ou d’un substrat perturbe en général l’ensemble de la voie
Introduction à l’étude du métabolisme
Métabolismeprécurseur
: processus au travers
duquel le monde vivant acquiert et utilise
l’énergie libre requiseE1pour exécuter ses
diverses fonctions
métabolite 1
Voies métaboliquesE2
: succession d’étapes
catalysées par des enzymes résultant en
métabolite 2
produits spécifiques
Catabolique
E3
Anabolique
...
Amphibolique
Ex
produit
schéma simplifié du métabolisme
10
6
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1. GÉNÉRALITÉS
1.1. Classification des enzymes
- classification des enzymes selon une nomenclature internationale : E.C.
- 6 classes principales selon la nature de la réaction catalysée :
classe
E.C.1 oxydo-réductases
action
transfert d’électrons
E.C.2
transférases
transfert de groupes chimiques
E.C.3
hydrolases
réaction d’hydrolyse : transfert de groupes fonctionnels à l’eau
E.C.4
lyases
addition de groupes sur double liaison ou formation de double
liaison par soustraction de groupe
E.C.5
isomérases
transfert de groupes à l’intérieur d’une molécule pour former un
isomère
E.C.6
ligases
formation de liaison C-C, C-S, C-O ou C-N par réaction de
condensation. Nécessite un apport d’énergie (ATP)
7
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1. GÉNÉRALITÉS
1.1. Classification des enzymes
- chaque type de réaction est divisé en classes puis en sous-classes
- chaque enzyme possède un matricule à 4 chiffres :
ex : chymotrypsine EC.3.4.4.5
X - X - X - X
réaction
chimique
classe
sous
classe
caractéristique
de l'enzyme
-
3
4
4
5
(hydrolase)
(hydrolyse de peptide)
(protéase à sérine)
(chymotrypsine)
- nom usuel : nom du substrat et/ou de la réaction + suffixe “ase”
Exemples : saccharase → hydrolyse du saccharose
lactate déshydrogénase → oxydation réversible du lactate en pyruvate
8
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1. GÉNÉRALITÉS
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
- enzymes étroitement spécifiques (≠ catalyseurs chimiques) :
- UNE réaction chimique donnée
- sur UN substrat ou UN type de substrats défini
EXEMPLES :
- trypsine et chymotryspine = peptidases
reconnaît résidus
basiques chargés >0
(Lys, Arg)
reconnaît résidus
aromatiques
(Tyr, Phe, Trp)
- hexokinase et glucokinase = kinases
phosphoryle les hexoses
(glucides à 6C)
phosphoryle le glucose
(6C)
9
érines protéases, avec notamment la trypsine,
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liaison peptidique. Ce sont des endopeptidases
1. GÉNÉRALITÉS
H O
H
1.2.
Spécificité de la
réaction enzymatique
NH- C - C - OH
+
NH2 - C – CO-
Rn
Rn+1
- spécificité
due à l’adéquation
entre les structures site actif / substrat
bulaire de forme ellipsoïde
) réunies par des ponts
fure intrachaînes
: partie protéique
- composé d’acides aminés parfois
éloignés dans la structure primaire
- fonctions chimiques portées par les
chaînes latérales des acides aminés
SITE ACTIF
C
dans lequel 3
ur : H57,
Site actif
site actif
(acides aminés)
substrat
substrat
- site actif :
- site de reconnaissance : reconnaît le substrat (en 3D)
→ formation liaisons faibles entre acides aminés du site actif et substrat
- site catalytique : transforme le substrat
→ fonctions chimiques nécessaires à la réaction présents sur les chaînes latérales des
acides aminés
10
ppartient à la superfamille des sérines protéases, avec notamment la trypsine,
sine…
Biotech
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sent
une réaction
d’hydrolyse de la liaison peptidique. Ce sont des endopeptidases
1. GÉNÉRALITÉS
Enzymologie
H
H O
H
- C 1.2.
– CO- Spécificité
+ H2O
Rn+1
C - C - OHenzymatique
de-NH
la -réaction
+ NH2 - C – CORn
Rn+1
st une protéine de 25 kDa, globulaire de forme ellipsoïde
rois chaînes polypeptidiques (A,B,C) réunies par des ponts
s et stabilisées par des ponts disulfure intrachaînes
B
C
protéine génère un site actif dans lequel 3
culiers vont jouer un rôle majeur : H57,
rment la triade catalytique.
Site actif
site actif
(acides aminés)
substrat
substrat
- tout acide aminé nécessaire à l’activité enzymatique appartient au site actif
- site actif petit : < 5% de la surface protéique
- si le substrat est une macromolécule : seule la partie à transformer entre en contact
avec le site actif
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1. GÉNÉRALITÉS
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
7896!4-)5.'!)'!:(,&;'$!
1.2.1. Modèle de Fischer
MODÈLE DE FISCHER (CLÉ-SERRURE)
4-)5.'!&.'36,'$$%$'!!
pré-existence de la complémentarité de forme entre l’enzyme et le substrat
<,',(#'!1&#(3!%'/#,'."(2,'!"2=-*2,#$%+(,'4,'!,--,'4/'&/0&$
12
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1. GÉNÉRALITÉS
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
1.2.2. Modèle de Koshland
)*+%(+%,'-.*/0(%
MODÈLE DE KOSHLAND (AJUSTEMENT INDUIT)
%
déformation de l’enzyme pour s’adapter à la structure du substrat
!
→ les acides aminés s’orientent de façon à permettre la fixation du substrat
!
13
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SOMMAIRE
1. Généralités
1.1. Classification des enzymes
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique
3. La cinétique enzymatique simple
3.1. Influence de la concentration en enzyme
3.2. Influence du pH
3.3. Influence de la température
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
3.6. Influence des inhibiteurs
4. Contrôle de l’activité enzymatique
4.1. La protéolyse ménagée
4.2. Modifications covalentes réversibles
4.3. Les enzymes allostériques
5. Les cofacteurs et coenzymes
6. Les isoenzymes
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2. MÉCANISMES
GÉNÉRAUX
RÉACTION CHIMIQUE ET ÉNERGIE
- pour avoir lieu, une réaction doit être thermodynamiquement favorable
→ énergie de l’état final plus faible que celle de l’état initial
Effet de la température
libre entre l’état final et l’état initial
- ∆G (ou dE, ou ∆E) : différence d’énergie
- ∆G < 0 : réaction exergonique, spontanée
9.4 Energie
d’activation
- ∆G > 0 : réaction
endergonique
→ n’aura lieu que si elle est couplée à une réaction exergonique qui apporte l’énergie
(ex : hydrolyse d’ATP)
15
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2. MÉCANISMES
GÉNÉRAUX
ÉTAT DE TRANSITION ET ÉNERGIE D’ACTIVATION
Effet de
la température
- lors d’une réaction chimique, formation
d’un
état de transition
→ énergie plus élevée que celle de S ou P
9.4 Energie d’activation
- énergie d’activation (Ea, dEA) : énergie nécessaire à la formation de l’état de transition
= barrière énergétique entre état initial et état final
dEA = énergie
d’activation
EE 61
- si Ea trop élevée, réaction quasi-impossible dans la cellule
•
Au cours de la réaction enzymatique les corps en présence, enzyme, substrats, cofacteurs,
etc... échangent donc de la chaleur avec les autres molécules de ce milieu : on dit qu’il y a
16
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2. MÉCANISMES
GÉNÉRAUX
RÔLE DE LA CATALYSE (chimique ou biologique)
- diminuer l’énergie d’activation de la réaction
- formation d’un ou plusieurs intermédiaires plus stables : Ea plus faible
- catalyse enzymatique : intermédiaire(s)
= complexe(s) enzyme-substrat ES
stabilisé(s) par des liaisons non
covalentes entre E et S
- plus Ea est faible, plus la réaction est
rapide
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2. MÉCANISMES
GÉNÉRAUX
CATALYSE ENZYMATIQUE
E + S ⇄ ES (⇄ EP) ⇄ E + P
E + S ⇄ ES ⇄ E + P
- étape 1 : formation complexe enzyme-substrat stéréospécifique de l’affinité et de la
complémentarité des structures
- éventuellement formation d’autres complexes intermédiaires EP
- étape 2 : décomposition du complexe en enzyme libre et substrat transformé en
produit
18
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2. MÉCANISMES
GÉNÉRAUX
CATALYSE ENZYMATIQUE
- cinétique accélérée : Ea plus faible
- thermodynamique inchangée : ∆G identique
énergies
inchangées
!
un catalyseur agit EXCLUSIVEMENT sur la vitesse, pas sur l’équilibre
19
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2. MÉCANISMES
GÉNÉRAUX
CATALYSE ENZYMATIQUE
!
un catalyseur agit EXCLUSIVEMENT sur la vitesse, pas sur l’équilibre
→ une réaction "non faisable" ne deviendra pas "faisable" en présence d’enzyme
substrat
- plusieurs possibilités :
- réversible
- irréversible
substrat
substrat
substrat
substrat
enzyme 1
enzyme 1
enzyme 1
enzyme 1
enzyme 2
enzyme 2
produit
produit
substrat
produit
produit
substrat
- éventuellement nécessité d’un cofacteur
enzyme 1
enzyme 1
+ cofacteur
substrat + cofacteur produit
substrat
produit
enzyme 1
enzyme 1
enzyme 2
enzyme 1
+ cofacteur
produit
produit
produit
20
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2. MÉCANISMES
GÉNÉRAUX
CATALYSE ENZYMATIQUE
- modification de la vitesse, pas de la thermodynamique :
→ formation d’intermédiaires (ES, EP), d’Ea basse → accélération de la vitesse (x 106)
→ constante d’équilibre de la réaction inchangée
→ enzyme inchangée en fin de réaction
- diminution de l’Ea grâce à :
- effet de proximité : rapprochement E-S
- catalyse acide /base : acide donneur de protons, électrophile
base accepteur de protons, nucléophile
- interactions E/S : électrostatiques, liaisons hydrogène
- catalyse covalente : formation liaison temporaire entre résidus polaires non chargés
(E : Cys, Ser) → intermédiaires plus réactifs
- changements conformationnels, flexibilité
21
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2. MÉCANISMES
GÉNÉRAUX
CATALYSEURS BIOLOGIQUES = ENZYMES
!
- accélèrent la vitesse de réaction
- sont retrouvées inchangées en fin de réaction
- agissent en petites concentrations
- ne modifient pas l’équilibre d’une réaction réversible
- l’équilibre final est le même qu’en absence d’enzyme… mais obtenu plus rapidement
→ modification de la cinétique, pas de la thermodynamique
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SOMMAIRE
1. Généralités
1.1. Classification des enzymes
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique
3. La cinétique enzymatique simple
3.1. Influence de la concentration en enzyme
3.2. Influence du pH
3.3. Influence de la température
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
3.6. Influence des inhibiteurs
3.6.1. Inhibitions “irréversibles” : exemple des AINS
3.6.2. Inhibitions réversibles
4. Contrôle de l’activité enzymatique
4.1. La protéolyse ménagée
4.2. Modifications covalentes réversibles
4.3. Les enzymes allostériques
5. Les cofacteurs et coenzymes
6. Les isoenzymes
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3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
- analyse et quantification de la catalyse
- influencée par différents facteurs :
%%
- ceux contenus dans la relation E + S ⇄ ES ⇄ EP ⇄ E + P
- ceux liés à l’environnement de la réaction :
- pH
- température
- ions
- coenzymes et autres composés que S et P
8 
(%
!
"
- mesure de la vitesse de réaction transformant S en P,
catalysée par l’enzyme E : [P] = f (t)
d[S] d[P]
=
vitesse de réaction v = dt
dt
- v tangente à la courbe
- v varie au cours du temps
(mol.L-1.s-1)
24
Effet de la concentration d’enzyme
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3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.3 Phases de la réaction
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
- vitesse réaction directe =
vitesse réaction réverse
- équilibre
- [S] et [P] constantes
- v nulle et constante
EE 10
-
- [P] ↑
- la réaction réverse P → S
•
Revenons
phase très brève
(invisible)à notre échelle, en mesurant la concentration du produit P en fonction du temps.
- toutes les E sont sous
commence
à se produire
Dans un milieu
oùSil n’y a au temps 0 que des molécules de l’enzyme et du substrat,
la réaction
liaison rapide et réversible
E+
forme ES
- v diminue
se déroule de façon non uniforme.
[ES]↑
- [ES] constante
On distingue une première phase très brève, au cours de laquelle la vitesse de la réaction est
v croissante •
- v maximale et constante
croissante. Durant cette phase, les molécules de substrat se lient avec l’enzyme : la concentratant que [S] ≫ [P]
tion du complexe enzyme-substrat augmente.
25
•
Lorsque toutes les molécules de l’enzyme sont occupées par des molécules du substrat la vi-
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3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
Effet de la concentration d’enzyme
Phases
de laENZYMATIQUE
réaction
CINÉTIQUE
QUE ENZYMATIQUE SIMPLE
!
En enzymologie, TOUJOURS étude de :
- la phase stationnaire
“conditions de vitesse initiale”
- vitesse initiale (Vi, V0)
→ vitesse la plus grande de toutes les
vitesses mesurables
EE 10
→ variation linéaire
enons à notre échelle, en mesurant la concentration du produit P en fonction du→
temps.efficacité catalytique maximale
- toutes les E sont sous
s un milieu où il n’y a au temps
0 que des molécules de l’enzyme et du substrat, la réaction
forme ES
éroule de façon non uniforme.
- [ES] constante
distingue une première phase
très brève, au cours de laquelle la vitesse de la réaction est
- v maximale et constante
ssante. Durant cette phase, tant
les molécules
de substrat se lient avec l’enzyme : la concentraque [S] ≫ [P]
du complexe enzyme-substrat augmente.
sque toutes les molécules de l’enzyme sont occupées par des molécules du substrat la vie de la réaction est maximum et reste constante tant que la concentration du substrat est
26
Effet de la concentration d’enzyme
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ncentration de l’enzyme
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.1. Influence de la concentration en enzyme
- [E] variable, tous autres paramètres constants
- [S] ≫ [E]
Effet de la concentration d’enzyme
- mesure de V0 pour différentes [E], conditions
de Dosage
Vi
3.7
enzymatique
EE 12
s l’évolution de la réaction lorsqu’on change la concentration de l’enzyme.
es de la concentration du produit en fonctions du temps sont différentes pour chaoncentrations de l’enzyme essayées. Lorsque la concentration de l’enzyme est granxemple E3) la vitesse initiale est plus grande que lorsque la concentration de
est petite (par exemple E1).
→ V0 varie linéairement avec [E]
27
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3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
Effet du pH
3.2. Influence du pH
énaturation
- pH variable, tous autres paramètres constants
- modification de l’état d’ionisation des acides aminés
(site actif ou non)
Effet du pH
- dénaturation de l’enzyme (perte structure 3D)
8.3 pH optimum
- vitesse de formation ou de dissociation de ES affectée
EE 54
me, les substrats, les cofacteurs sont les corps chimiques qui interviennent obligatoidans la réaction enzymatique.
es facteurs qui interviennent il y a aussi des facteurs physiques : le pH et la température
mple. Le pH intervient de deux manières différentes : soit en modifiant la structure see ou tertiaire de l’enzyme, soit en modifiant les charges électriques des radicaux des
aminés du site actif.
une enzyme est conservée dans un milieu dont le pH est défavorable au maintien de
pHuneoptimum
caractéristique de chaque
ture, elle→
va subir
dénaturation.
ons cet effet sur un graphe représentant l’activité résiduelle d’une enzyme qui a été
ée pendant 24 heures à une température de 30°C., en fonction du pH de ce milieu de
ation.
cette enzyme a été conservée dans des conditions optimales et son activité résiduelle
lus grande : 100%. A pH 6 l’enzyme a subi une dénaturation partielle si bien qu’au
24 heures son activité n’est plus que de la moitié de ce qu’elle aurait été si on l’avait
ée à pH 3. A pH 9 ou bien en dessous de pH 3, cet effet dénaturant est encore plus
.
enzyme
28
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Enzymologie
Effet de
la température
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE
SIMPLE
3.3. Influence9.1
deTempérature
la températureoptimum
- température variable, tous autres paramètres constants
EE 58
- augmentation de la température → accélération
de la vitesse de réaction (loi d’Arrhénius)
•
Examinons
maintenant l’effet
la température du
sur la réaction enzymatique
qui s’y
- puis dénaturation
progressive
dedel’enzyme
→milieu
température
d’inactivation
spécifique
déroule.
de chaque enzyme
- dénaturation
•
Le graphe qui représente les quantités de produit transformées par une enzyme (A) en fonction
de la température
(θ) duθmilieu
d’incubation,
est une courbe ascendante
une tempéranégligeable
pour
< 30°C,
appréciable
pour θjusqu’à
> 40°C
ture (ici 45°C.) où l’activité de l’enzyme est la plus grande, puis rapidement descendante.
- enzymes biologiques : température optimale 37°C
- cas particulier : certaines bactéries thermophiles (Taq polymérase θoptimale = 75-80°C)
29
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3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
Effet de la concentration de substrat
oncentration
substrat
- [S] variable,du
tous
autres paramètres constants
- [S] ≫ [E]
- mesure de Vi pour chaque [S] (tangentes)
- lorsque [S] augmente, V0 augmente
- report des V0 sur un graphe V0 = f([S])
EE 14
inons à nouveau l’évolution de la réaction lorsqu’on change cette fois-ci la concentrau substrat.
30
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
Effet de la concentration de substrat
ENZYMATIQUE SIMPLE
4.2 Cinétique michaélienne
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
Effet de la concentration de substrat
4.1 Concentration du substrat
EE 14
[P] = f(t)
Vo = f([S])
Examinons à nouveau l’évolution de la réaction lorsqu’on change cette fois-ci la concentraEE 15
tion du substrat.
Les mesures de la concentration du produit en fonction du temps sont différentes pour chacune des concentrations de substrat essayées. Lorsque la concentration
du substrat est grande
•
Représentons
cette fois ces vitesses initiales en fonction des concentrations du su
(par exemple S10) la vitesse initiale est plus
que lorsque la concentration
duessayées.
substrat
hyperboles
- grande
nous avons
est petite (par exemple S1).
différents
- axes
• de concentration
Les vitesses
croissent en fonction des concentrations du substrat. Mais cet
On peut mesurer ces vitesses !initiales en calculant
la différence
de mesurées
produit
n’est graphes
pas linéaire :et
le graphe
de cette fonction
est une hyperbole (tirets longs).
au cours d’un temps donné, pour chaque concentration
du substrat. des
des tangentes
différentes
- signification
31 l’
•
Lorsque la concentration du substrat est nulle la vitesse est évidemment 0, donc
passe par l’origine du graphe. La fonction n’a pas de sens en dessous de cet origin
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
Effet de la concentration de substrat
3.4.4.20
Influence
de la concentration
en substrat : équation de Michaelis-Menten
Hyperbole
de Michaelis-Menten
COURBE DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES
!
!
!
courbe Vo = f([S]) de
Michaelis-Menten
hyperbolique
EE 27
Détermination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme :
•
-
Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confirme ces conclusions mathématiques.
vitesse
initiale maximale Vmax (Vm) : activité enzymatique maximale lorsque
•
Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples enl’enzyme
saturée
en substrat
→ ∞)
tiers deest
K m aboutit
à des fractions
entières de([S]
la vitesse
maximum. On trace une hyperbole à
partir des points obtenus, qui permet de voir la signification réelle des paramètres géométriques K m et V max que nous avons choisis au début de cette étude.
constante
de Michaelis Km : concentration de S qui permet d’obtenir Vmax/2
•
V max est une vitesse initiale que la réaction aurait si la concentration du substrat était infinie.
32
•
K m est la concentration du substrat pour laquelle on observe une vitesse égale à la moitié de
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN
E+S
k+1
k-1
ES
k+2
k-2
E+P
constantes de vitesse k
E+S
k+1
k-1
ES
état pré-stationnaire
k+2
E+P
état stationnaire
→ k-2 est négligée
- étape 1 → formation réversible complexe ES, état pré-stationnaire
- étape 2 →
→
→
→
toutes les enzymes sont complexées
état stationnaire : [ES] constante et [S] ≫ [P]
réaction réverse P → S négligée
k+2 = constante catalytique (= constante de vitesse de la réaction enzymatique)
33
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN : ÉQUATION DE LA COURBE V0 = f[S]
- 2016-2017
gie
3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE
Effet de la concentration de substrat
kMichaelis-Menten
+k
[S]
nfluence
de la concentration
en
substrat
:
équation
de
20
Hyperbole
de Michaelis-Menten
Vo = Vm
avec Km =
E DE
−1
Km + [S]
+2
k +1
!
MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES
!
!
!
- hyperbole équilatère
courbe Vo = f([S]) de
- si [S] → ∞ alors Vo → Vm
Michaelis-Menten
hyperbolique
- si [S] → 0 alors Vo → 0
- si Vo = Vm/2 alors Km = [S]
EE 27
mination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme :
34
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Enzymologie
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE
Effet de la concentration de substrat
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.4.
Influence
de la concentration
en substrat : équation
4.20
Hyperbole
de Michaelis-Menten
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
COURBE
DE
MICHAELIS-MENTEN →
ENZYMES MICHAELIENNES
ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN
!
Vo = Vm
courbe
Micha
hyp
[S]
Km + [S]
- Km (mol.L-1) :
EE 27
E / S des 2 paramètres
- caractéristique fondamentale couple
Détermination
cinétiques de-1l’enzyme
:
-1
Vm
(mol.L
.s
)
:
•
Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confir- ne dépend pas de [E]
me cesinitiale
conclusionsmaximale
mathématiques. Vmax :- activité
Vo maximale
- vitesse
enzymatique maxi
S
- indicateur de l’affinité de E pour
•
Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples en- dépend
de [E]
enK substrat
([S]
→ ∞)
- assimilée à KD du complexe ES saturée
tiers de
aboutit
à
des
fractions
entières
de
la
vitesse
maximum. On trace une hyperbole à
m
- Vm =réelle
kcatdes[Eparamètres
T]
partir des points obtenus, qui permet de voir la signification
géométri-
ques K m etde
V maxMichaelis
que nous avons Km
choisis:auconcentration
début de cette étude. de S qui permet
- constante
deestturn-over
- cte catalytique kcat (= k2) = nombre
une vitesse initiale que la réaction aurait si la concentration du substrat était infinie.
•
V max
•
K m est la concentration
du substrat pour
= nombre de molécules de S transformées
/sec / molécule
delaquelle
E on observe une vitesse égale à la moitié de
- efficacité catalytique kcat/Km
•
la vitesse maximum.
Malheureusement, l’extrapolation d’une hyperbole à partir de quelques points n’est pas facile
et ne permet pas de faire le tracé d’une telle courbe à partir des mesures de vitesses initiales
35
faites réellement au cours d’expériences avec des concentrations de substrat différentes.
Biotech 1 - 2016-2017
Biotech 1 -Enzymologie
2016-2017
Enzymologie
3. CINÉTIQUE
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
Effet de la concentration de substrat
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.4.
Influence
de la concentration
en substrat : équation de Michael
4.20
Hyperbole
de Michaelis-Menten
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
COURBE
DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES
ÉQUATION
DE MICHAELIS-MENTEN
[S]
Vo = Vm
Km + [S]
!
courbe Vo = f([S]) de
Michaelis-Menten
hyperbolique
EE 27
Détermination
desla2représentation
paramètresde
cinétiques
de l’enzyme
:
- exploitation
difficile de
Michaelis-Menten
:
•
Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confir-
- tracé délicat me
à partir
des valeurs
expérimentales (hyperbole)
ces
conclusions
mathématiques.
- vitesse initiale
maximale
Vmax
: activité enzymatique maximale lorsque
- sous-estimation
de
Vmax
(il
faudrait
[S]
→
∞)
•
Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples ensaturée
en
substrat
∞)
- Km déterminée
graphiquement
à→
partir
dedeVmax
→maximum.
sous-estimée
tiers de
Km
aboutit à des([S]
fractions
entières
la vitesse
On trace une hyperbole à
-
partir des points obtenus, qui permet de voir la signification réelle des paramètres géométriques K m etde
V maxMichaelis
que nous avons Km
choisis:auconcentration
début de cette étude. de S qui permet
constante
36
d’obtenir Vm
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
REPRÉSENTATION DE LINEWEAVER ET BURK
- transformation de Lineweaver et Burk (doubles inverses) : 1/V0 = f(1/[S])
- obtenue en prenant la double inverse de l’équation de Michaelis-Menten
- droite, plus facile à extrapoler et à exploiter (régression linéaire)
!
1
Km 1
1
=
+
Vo
Vm [S]
Vm
- ordonnée à l’origine = 1/Vm
- pente = Km/Vm
- par prolongation, intersection avec
axe des abscisses = -1/Km
37
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
- dosage par spectrophotométrie : absorbance (DO) à λ donnée
loi de Beer-Lambert :
A = ε.l.[P]
→ concentration de P
- dosage direct de S ou P
- dosage indirect : substrat ou produit d’une réaction couplée
NAD+
EXEMPLE : réaction d’oxydo-réduction
NADH, H+
A
B
ε
- 2 réactions couplées :
- oxydation de A en B
- réduction de NAD+ en NADH, H+
NH2
O
O
- NAD+ et NADH, H+ absorbent à 260 nm
CH 2 O P O P O
340 nmO- O- absorption spécifique du NADH, H+ à OHHO
O
→ dosage NADH, H+ réduit
→ vitesse d’apparition du NADH, H+
NADH
→ vitesse réaction
H
N
N
NH2
N
N
NAD+
NADH
N
N
O
CH 2
O
OH
OH
λ (nm)
Spectre UV des coenzymes nicotiniques38
260
300
340
380
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3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
UNITÉS DE MESURE
- UI : unité internationale
= quantité d’enzyme transformant 1 µmole (10-6 M) de substrat par minute (µmol/min)
dans les conditions standard (température et pH)
- Katal (kat) : unité SI (catalyseurs)
= quantité d’enzyme transformant 1 mole de substrat par seconde (mole/s)
- activité molaire spécifique ou nombre de rotation ("turn-over number")
= nombre de molécules de substrat transformées / sec / molécule d’enzyme
- activité spécifique (AS) utilisation pour le suivi de la purification d’une enzyme
= activité enzymatique par unité de masse de protéines totales (UI/mg)
traduit le degré de pureté de l’enzyme
AS = activité enzymatique / masse totale de protéines
39
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
UNITÉS DE MESURE
protéines totales
purification
E
protéines
totales
E
- indice de purification (sans unité)
= degré d’enrichissement en enzyme après purification par rapport à l’extrait de départ
enrichissement = AS de la fraction / AS de l’extrait de départ
- rendement
= pourcentage d’enzyme récupérée par rapport à la quantité de départ
R = (activité totale extrait final / activité totale extrait initial) x100
dans l’idéal : enrichissement le plus grand possible
rendement 100 %
40
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.6. Influence des inhibiteurs
EFFECTEURS
- molécules de natures diverses
- interfèrent avec une étape de la catalyse
- soit en l’accélérant : activateurs
- soit en la ralentissant : inhibiteurs
- irréversibles
- réversibles
→ très utiles pour compréhension des mécanismes enzymatiques et en thérapeutique
41
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.6. Influence des inhibiteurs
3.6.1. Inhibitions “irréversibles” : exemple des AINS
- liaison covalente à l’enzyme : “inhibiteurs suicides”
- destruction d’un groupement essentiel à l’activité
→ enzyme incapable de fixer ou transformer le substrat
- pas d’inhibition irréversible dans l’organisme, mais intérêt thérapeutique
EXEMPLE : l’aspirine
- classe des AINS (AntiInflammatoires Non Stéroïdiens)
- inhibition des COX (cyclo-oxygénases)
→ liaison covalente avec une sérine
→ encombrement stérique
- empêche acide arachidonique d’entrer dans le canal
COOH
O
O
acide
acétylsalicylique
- pas de production de prostaglandines
42
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Enzymologie
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
3.6. Influence des inhibiteurs
3.6.2. Inhibitions réversibles
Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzymatique
Influence des inhibiteurs (1)
Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mé
Modélisation
desMICHAELIENNES
réactions enzymatiques
INHIBITION RÉVERSIBLE DES
ENZYMES
E19
: la cinétique enzymatique simple (6)
Influence des inhibiteurs (1)
Inhibiteur
compétitif
Inhibiteur
non
compétitifd’action
Les inhibiteurs réversibles sont de trois
types possibles
qui se distinguent
par leur
mécanisme
S
S
- 3 types :
Ic
Inhibiteur compétitif
S
- inhibition compétitive
Inhibiteur non compétitif
SES
Inhibi
ES
Inhibiteur incompétitif
Inc
S
Iic
EI
ES
Modélisation
des réactions enzymatiques : la cinétique
EIenzymatique simple (6)
Ic
ES
- inhibition non compétitive
Influence
des inhibiteurs
ES (1)
E1
ESI
Inc
IicES
E+S
ES
E+P
E+S
E+P
E+S
Les inhibiteurs réversibles
sont
de
trois
types
possibles
qui
se
distinguent
par
leur
mécanisme
d’action
EI
+
+
+
EI
ESI
ESI
Ic
Inc
Inc
- inhibition incompétitive
E+S
+
ES
E+P
Inhibiteur compétitif
S
Ic
faibles
- fixation sur l’enzyme par liaisons
→ formation et rupture faciles
IcKI et rapides
→ mécanismes différents
EI
EI
ES
EI
E+S
ES
E+P
KIE+SInhibiteur ES
KE+S
I
non compétitif
+
+
S
EI+ S
Inc
Inc
KI
Inc
EI+ S
K ’I
E+S
ic
K ’I
ES
ES
Iic ESI
ESI
EI
E+P
E+P
K ES
’I
Inhibiteur
incompétitif
+
S
ESI
I
ESI
ESI
ES
E+P
E+S
ES
43
E+P
V
Modélisation
des réactions enzymatique
V
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Enzymologiele substrat.
Influence des inhibiteurs (1)
CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE SIMPLE
Donc, la3.Vmax
par sont
rapport
celle
Les
réversibles
de troisàtypes
Vdéterminée en présence de I ne changera
V inhibiteurs pas
Vpo
max
max
m
obtenue en
absence
de I. En revanche, la fixation de I sur E déplace l'équilibre E +S <---->
3.6. Influence
des
inhibiteurs
V ma
Inhibiteur compétitif
Inhibite
3.6.2.
Inhibitions
réversibles
en faveur
de E, dont
la concentration
augmente aux dépensVmade
V max 2
x 2celle de ES.
Mmax
S Donc, le KV
Vma x'
(apparent) augmente en présence de I. L'affinité apparenteVde' l'enzyme
pour S diminueV (fi'
2I
max
ma x
INHIBITION
COMPÉTITIVE
ci-dessous).
KM
KM '
!
V
[S]
KM ' K M
V
1/V
EI
KM
KM '
[S]
E+P
E+S
-1/K M -1/K M ' 0
nc
I
1/V
EI+ S
Vma x
1/
-VVmax
inchangée
'
max
1/V max'
- Km
augmente
V max
2
→ diminution de l’affinité
V max' 2 1/V max
apparente pour S
Vma x 2
V x'
1/Vma
ma x
Vma x' 2
de liaisons
ES
EI
I
V
Vmax
2
EI
+
+
Représentation de Lineweaver-Burk
I
I
inhibiteur
incompétitif
inhibiteur
non
compétitif
inhibiteur compétitif
inhibiteur
incompétitif
inh
K
K
ques ; ils
V max
E+S
[S]
c
!
max
c uneVétape
Inc
ES
- analogie structurale avec le substrat
→ fixation au niveau
du site actif, à la place du substrat
Représentation
de Michaelis-Menten
inhibiteur compétitif
c
KM ' K M
1/[S][S]
-1/KM '
-1/K M K
M
0
[S] 1/[S]
1/
-1/K M
bition
- levée de l’inhibition par excès de substrat : déplacement de l’équilibre entre EI et E
Représentation de Lineweaver-Burk
44
Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzy
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
chaelis-Menten
3. CINÉTIQUE
Influence des inhibiteurs (1)
ENZYMATIQUE
SIMPLE
Les inhibiteurs
réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent p
inhibiteur incompétitif
inhibiteur non compétitif
3.6. Influence
des inhibiteurs16V
Inhibiteur compétitif
V
3.6.2. Inhibitions réversibles
de I ne changera
pas par rapport à celle
V
max
INHIBITION NON COMPÉTITIVE
Ic
Vma x
ES
EI
V max'
d’analogie
structurale
le substrat
- pasde
Vma
dépens
celle
de ES.
Donc, le Kavec
x 2
M V max 2
Vma x' sur un site distinct du site catalytique
→ fixation
V max' 2
E+S
' 2
parente de Vl'enzyme
pour S diminue (figure
S]
S
S
e I sur E déplace l'équilibre E +S <----> ES
ma x
Inhibiteur non compétitif
ES
EI
E+P
+
I
de catalyse
- changements de conformation → diminution de la vitesse
c
[S]
KM ' K M
KM
[S]
KI
complexée
- se fixe avec la même affinité sur forme libre E et forme
EI
ES
→ indépendamment de S
eweaver-Burk
→ fixation simultanée de I et S possible
/[S]
!
inhibiteur
nonincompétitif
compétitif
inhibiteur
V
!
1/V
V max' 2
1/V max
-1/KM '
-1/K
KMM
ES
+
+
Inc
Inc
KI
EI+ S
E+P
K ’I
ESI
- Vmax diminue
- Km inchangée
→ affinité pour S inchangée
V max'
1/V max'
E+S
1/V
1/Vma x'
2
ESI
inhibiteur non compétitif
Vma x
V max
ES
Inc
1/Vma x
0
[S]
1/[S]
-1/K M
0
1/[S]
45
Influence des inhibiteurs (1)
16
Biotech
1 - 2016-2017
Représentation
de
Michaelis-Menten
3. CINÉTIQUE
ENZYMATIQUE
SIMPLE
Les inhibiteurs réversibles
sont de trois types
possibles qui se distinguent
par leur mécanisme d’action
Enzymologie
inhibiteur compétitif
inhibiteur incompétitif
inhibiteur non compétitif
V pas par rapport à celle
V
ax 3.6.
déterminée
en présence
de I ne changera
Influence
des inhibiteurs
Inhibiteur compétitif
V
Inhibiteur non compétitif
3.6.2. la
Inhibitions
réversibles
. En revanche,
fixation
de
I
surS E déplace
l'équilibre ES+S <---->
ES
V
V
V
max
max
c
Inc
ES
ES
V max'
2
présence
de
l'enzyme
pour S diminue V(figure
2
V
2 I. L'affinité apparente de V
ma x
max
max
Vma x'
EI
→ équilibre E +E+S
S ⇌ ES [S]déplacé
en
faveur
de ES
ES
E+P
E+S
KM '
KM ' K M
Ic
Inc
- complexe ESI n’évolue pas → Vm ↓
ESI
ESI
ES
[S]
→ affinité apparente
de E pour S augmente
+
+ → Km+ ↓
-Menten
E+P
E+S
KM
!
V
EI
inhibiteur compétitif
1/V
Vmax
inhibiteur non ESI
compétitif
1/V
1/V
Vma x
1/Vma x'
- Vmax
diminue
- Km diminue
→ augmentation de l’affinité
pour S
1/Vmaapparente
x
V max'
Vma x 2
Vma x'
Vma x' 2
K ’I
I
V
EI+incompétitif
S
ESI
inhibiteur
!
E+P
Iic
Inc
I
[S]
ES
+
K Lineweaver-Burk
K ’
Représentation
de
inhibiteur
incompétitif
inhibiteur non Kcompétitif
I
Iic
V max' 2
EI S
Vma x' 2
- fixation sur forme ES déjà complexée
au
KM
S
ma x
concentration augmente
aux dépens de celle de ES. Donc, le KMES
I
INHIBITION INCOMPÉTITIVE
Inhibiteur incompétitif
V max
1/Vma x
-1/K M -1/K M ' 0
KM ' K M
[S] 1/[S]
2
1/V max'
V max' 2
1/V max
-1/KM '
-1/K M
KM
0
[S]
1/[S]
-1/K M
0
1/[S]
46
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
SOMMAIRE
1. Généralités
1.1. Classification des enzymes
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique
3. La cinétique enzymatique simple
3.1. Influence de la concentration en enzyme
3.2. Influence du pH
3.3. Influence de la température
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
3.6. Influence des inhibiteurs
4. Contrôle de l’activité enzymatique
4.1. La protéolyse ménagée
4.2. Modifications covalentes réversibles
4.3. Les enzymes allostériques
4.3.1. Caractéristiques structurales
4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques
4.3.3. Les deux modèles de l’allostérie
5. Les cofacteurs et coenzymes
6. Les isoenzymes
47
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
NOMBREUX PROCESSUS DE CONTRÔLE
- concentration, localisation des enzymes : biosynthèse, dégradation, trafic
intracellulaire
- environnement : pH, [cofacteurs], [substrats], [inhibiteurs]…
- activation irréversible par protéolyse ménagée
- modifications covalentes réversibles : phosphorylation, formation ou rupture de
ponts disulfures…
- régulation allostérique
Contrôle de l ’activité des enzymes (2)
- association possible de plusieurs modes de contrôle
Contrôle de l’activité enzymatique par protéolyse ménagée
La protéolyse ménagée est un mode d’activation courant d
digestives et les enzymes de la cascade de la coagulation
4.1. La protéolyse ménagée
- modification covalente (lyse) irréversible
On appelle zymogène le précurseur inactif d’une enzyme a
Exemple de la chymotrypsine
Trypsine
- mode d’activation courant (enzymes
digestives, cascade de coagulation du sang)
- précurseur inactif = zymogène
Chymotrypsininogène
(inactif)
Chymotrypsine
A
B
C
Chymotrypsine
(active)
Chymotrypsine
(active)
48
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.2. Modifications covalentes réversibles
- interactions covalentes avec groupement chimique
- liaison et clivage catalysés par enzymes différentes
→ chaque réaction est irréversible
→ processus global réversible
- exemples : ribosylation, acétylation / désacétylation, ubiquitination, phosphorylation /
déphosphorylation…
PHOSPHORYLATION / DÉPHOSPHORYLATION
- la plus fréquente
- activation ou inhibition temporaire de l’enzyme
- ajout / retrait de groupements phosphates sur résidus alcool (Ser, Thr, Tyr)
- kinases / phosphatases
- le plus souvent en réponse à un signal extracellulaire
- kinases souvent AMPc-dépendantes : liaison avec AMPc (2nd messager) pour activation
49
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.2. Modifications covalentes réversibles
PHOSPHORYLATION / DÉPHOSPHORYLATION
- phosphorylation = ajout d’un groupement phosphate, catalysé par une protéine kinase
groupement
phosphate
OH
ATP
O
ADP
O
O-
kinase
fonction alcool
libre
O-
P
fonction alcool
phosphorylée
- déphosphorylation = retrait du groupement phosphate, catalysé par une phosphatase
groupement
phosphate
O
O
P
O-
OH
O-
+
phosphatase
fonction alcool
phosphorylée
O
-
O
P
O-
Ofonction alcool
libre
phosphate inorganique
(Pi)
phosphorylation / déphosphorylation → régulation de très nombreuses
protéines impliquées dans des voies de signalisation
!
50
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.3. Les enzymes allostériques
4.3.1. Caractéristiques structurales
- RÉPONSE RAPIDE, FINE ET ADAPTÉE aux conditions intracellulaires
- leur cinétique ne suit pas l’équation de Michaelis-Menten
ENZYMES ALLOSTÉRIQUES = PROTÉINES ALLOSTÉRIQUES
!
1) protéines complexes, multimériques (plusieurs sous-unités)
2) plusieurs sites de fixation pour un ou plusieurs ligands
→ liaison d’un effecteur par des liaisons faibles, sur un site régulateur distinct du
site catalytique
→ site régulateur et site catalytique sur même sous-unité ou sous-unités différentes
3) la fixation d’un premier ligand modifie la liaison des autres ligands
→ liaison d’un effecteur provoque un changement conformationnel
= transition allostérique (forme active R ⇌ forme inactive T)
→ modifie la fixation du substrat ou d’autres modulateurs
→ coopérativité modulateur et/ou substrat pour l’activité
51
ou du substrat pour l'activité.
Biotech
2016-2017
- 1il -existe
au moins un site de fixation pour le substrat (site catalytique, ou site actif) et au
4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
Enzymologie
moins un site de fixation pour un modulateur (site régulateur). Le changement
conformationnel est aussi appelé "transition allostérique".
site enzymes
catalytique et
le site régulateur peuvent être sur la même sous-unité protéique, ou sur
4.3.LeLes
allostériques
des sous-unités différentes. Les modulateurs peuvent jouer le rôle d'activateurs ou
4.3.1. Caractéristiques
structurales
d’inhibiteurs,
et chaque modulateur
peut posséder son propre site.
Les enzymes allostériques catalysent très souvent les étapes clé des chaînes métaboliques,
qui doivent
être finement
régulées,
exemple de façon
:
étapes-clé
des
chaînespar
métaboliques
→ régulation
fine et rapide
- catalysent
- positive par un ou plusieurs activateurs, en particulier par le substrat lui-même
- négative par un ou plusieurs inhibiteurs, en particulier par le produit final de la voie
- régulation positive : activateur(s), en particulier substrat lui-même
métabolique : on parle alors de rétro-inhibition ou de rétro-contrôle négatif. L’enzyme se
transforme (modification conformationnelle) de sa forme active R en forme inactive T.
négative
: inhibiteur(s),
en particulier
produit final
de la voie
- régulation
Ainsi, la voie
métabolique
entière est activée
par la présence
du substrat
initial et inhibée
= quand
rétro-inhibition,
négatif
son produit rétro-contrôle
final est abondant.
effet
effecteur
particularité
homotrope positif
substrat S de l’enzyme
favorise sa propre transformation
hétérotrope
positif
activateur allostérique A de
l’enzyme
pas d’analogie structurale avec S
hétérotrope
négatif
inhibiteur allostérique I de
l’enzyme
pas d’analogie structurale avec S
La cinétique des enzymes allostériques ne suit plus l'équation de Michaelis-Menten. Elle
→ siest
le tout
produit
final
de la voieàmétabolique
est abondant,
la voiesur
entière
sera inhibée par inhibition des
à fait
comparable
celle de fixation
de l'oxygène
l'hémoglobine.
étapes
clé (dont
d’engagement)
La courbe
de laétape
vitesse
initiale en fonction de la concentration en substrat est une sigmoïde,
qui traduit le phénomène de coopérativité : les changements dans la structure d'une sous52
unité protéique se traduisent par des changements dans la structure des autres sous-unités, à
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
19
4.3. Les enzymes allostériques
symétrique peut
être considéré comme un cas limite, tout ou rien, du m
4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes
allostériques
réalité, le mécanisme précis des interactions allostériques n’a pas été é
otéines allostériques présentant des propriétés
- cinétique allostérique ≠ cinétique michaelienne
T
"inactive"
nir une liaison réversible, non covalente, d’une
- comparable à la fixation de O2 sur Hb (≠ enzyme)
R
"active"
ur, ou effecteur, allostérique. Le terme allostérique
rme.-Les
enzymes allostériques
prennent
une autre
courbe
sigmoïde
: phénomène
de coopérativité
ite de la liaison du modulateur. Ce sont des protéines
→ transmission des changements conformationnels d’une sous-unité à l’autre
sieurs →
sous-unités.
existe au
moins un site de fixation
grâceIl aux
interactions
non covalentes à l’interface entre les sous-unités
et au moins un site de fixation (spécifique) pour un
ains cas, le site régulateur et le site actif sont sur des
!
V
rs des enzymes allostériques peuvent être des
urs. 2
types d’enzymes allostériques :
Vma x
système
V : rares
rare,-des
enzymes allostériques
dits du système V, pour
→ Vpar=unef([S])
(≃des
enzymes michaeliennes)
représentée
hyperbolehyperbole
(comme dans le cas
→ Vmax
varie
en présence
d’effecteur
des enzymes
allostériques
(enzymes
du système K), si
Vma x
2
, non pas une hyperbole, mais une courbe sigmoïde,
système K : les plus fréquentes
V = f([S])
sigmoïde
ons de →
S suffisantes.
Bien qu’il
existe sur la courbe
→ K1/2
en
présence
d’effecteur
on en substrat
pour varie
laquelle la
vitesse
est égale à la
n de -l’oxygène sur l’hémoglobine. La saturation est tout
pas correct de l’appeler KM, puisque l’enzyme n’est pas
s S0,5 ou K0,5 (K1/2) pour désigner cette concentration de
K 1/ 2
V
enzyme allostérique du système K
[S]
53
mme dans le cas des enzymes michaeliennes)
S+A
S+I
ystème K : V = f([S]) est une courbe sigmoïde, leur cinétique ne suit plus
Biotech 1V - 2016-2017
ichaelis-Menten.
ma x 2
4. CONTRÔLE
Enzymologie
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
V
aractéristiques cinétiques des enzymes allostériques
4.3. Les enzymes allostériques
4.3.2.1. Les enzymes allostériques de type K [S]
K 1/ 2
4.3.2. Caractéristiques
cinétiques des enzymes allostériques
est saturée,
la vitesse de catalyse est maximale (Vmax).
Vma x
ntration de substrat qui permet d'atteindre la moitié de la vitesse maximale :
du Km des enzymes michaeliennes.
ENZYMES ALLOSTÉRIQUES DE TYPE K
bstrat, l’état T prédomine (T possède peu d’affinité pour S).
e rôle
de
modulateur
positif
: il favorise
sa propre fixation.
x 2
Vmax
: vitesse
maximale
à saturation
de l’enzyme
-Vma
tivateur ou d'un inhibiteur allostérique modifie l'affinité de l'enzyme pour
qui permet
Vmax/2
(équivalent
Km pour les enzymes michaeliennes)
-K
donc
le1/2
K1/2:) [S]
: l’affinité
pour le d’atteindre
substrat diminue
en présence
d’un inhibiteur
augmente), elle augmente en présence d’un activateur allostérique (K1/2
- en absence de substrat : forme T prédominante (faible affinité pour S)
effecteur
→ modification
depeut
l’affinité
du K1/2)
- liaison d’un
ncentrations
d’activateurs
sont
fortes, la courbe
parfois(et
devenir
[S]
e "pseudo-hyperbolique").K 1/2
V
Vma x
- inhibiteur : affinité ↓
K1/2 ↑
+ activateur
S+A
+S
inhibiteur
+I
- activateur : affinité ↑
K1/2 ↓
Vma x 2
- forte activation : “pseudo-hyperbole”
K 1/2
[S]
- dans tous les cas : Vmax inchangée
!
ariations de la concentration en substrat permettent une adaptation très fine
enzymatique pour les enzymes allostériques par rapport aux enzymes
54
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.3. Les enzymes allostériques
4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques
MODÈLE DE L’ASPARTATE TRANSCARBAMYLASE ATCase (type K) (E. Coli)
bases pyrimidiques
C, T, U
- étape clé synthèse des bases pyrimidiques
aspartate + carbamoyl-phosphate
ATCase
carbamoyl-L aspartate
bases puriques
A, G
ATP, GTP, CTP, TTP et UTP doivent
être disponibles en quantités
équivalentes dans la cellule
bases pyrimidiques
Pi
- inhibée par CTP (pyrimidique, produit final de la voie) → Vmax inchangée
diminution affinité pour substrats
- activée par ATP (purique) → il faut rétablir l’équilibre entre nucléotides
55
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
Contrôle
de l ’activité des enzymes (7)
E27
4.3. Les enzymes
allostériques
Les enzymes allostériques (4)
4.3.2. Caractéristiques
cinétiques
des(ATCase)
enzymes
allostériques
Mécanisme d’‛action de l’aspartate
transcarbamoylase
(2)
MODÈLE DE L’
Comme l’hémoglobine, l’ATCase présente deux états extrêmes. Un état T et un état R et un grand nombre
d’états intermédiaires. L’état précis de l’enzyme dépend des rapports de concentrations des substrats,
de l’ATP et du TRANSCARBAMYLASE
CTP.
ASPARTATE
ATCase (type K) (E. Coli)
L’état T est défavorable à la catalyse et est stabilisé par le CTP.
L’ état R est favorable à la catalyse et est stabilisé par l’ATP ou les substrats.
C
R
R
C
état T
état R
La fixation sur une sous-unité régulatrice d’un modulateur positif écarte les sous unités catalytiques en les
faisant pivoter autour d’un axe de symétrie 3. Ce changement conformationnel les rend plus actives. La fixation
d’un modulateur négatif a l’effet inverse.
- 12 sous-unités :
- 6 sous-unités catalytiques : fixation des substrats
- 6 sous-unités régulatrices : fixation ATP ou CTP (sites distincts)
- 2 états extrêmes (grand nombre d’intermédiaires)
- état tendu T : défavorable à la catalyse, stabilisé par CTP
- état relâché R : favorable à la catalyse, stabilisé par ATP
→ liaison ATP (activateur) : les sous-unités pivotent autour d’un axe et s’écartent
→ liaison CTP (inhibiteur) : effet inverse
56
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.3. Les enzymes allostériques
4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques
ENZYMES ALLOSTÉRIQUES DE TYPE V
!"#$!%&$!&'()*&$!#++,$-./012&$!%&!!"#$%&%
'
- passage d’une
forme à l’autre sans changement d’affinité
pour le substrat
($%)*+)!,-!%.%&/%0-,1$%$!%2/%-##-,$3!%42
5678%,$)!$%#,$)9*$%:;3)!-3!%
- Vmax diminue, K1/2 pratiquement constant
11
57
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.3. Les enzymes allostériques
4.3.3. Les deux modèles de l’allostérie
2 états
T
R
état tendu T
état relâché R
2 modèles pour la transition allostérique
T
!
R
- modèle du “tout ou rien” (ou modèle symétrique, transition concertée)
T
R
modèle de Monod,
Wyman
et Changeux
T
T
T
T
T
T
T
T
R
R
R
R
R
R
R
R O2
R
R
R
O2
R
R
R
O2
O2
R
R
O2
O2
R
R O2
O2
R
O2
O2
O2
R
O2 O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
- modèle séquentiel (modèle de Koshland)
T
T
T
T
T
T
T
T
T
O2
T
T
T
O2
T
T
O2
O2
T
T
O2
O2
T
T
O2
O2
O2
T
O2
O2
O2
T O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
58
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
4. CONTRÔLE
DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.3. Les enzymes allostériques
L’ALLOSTÉRIE EN BREF
- les critères de l’allostérie :
- la protéine possède plusieurs sous-unités, elle est multimérique
- il existe plusieurs sites de liaison pour un ou plusieurs ligand(s)
- la fixation d’un premier ligand modifie la liaison des autres ligands
- tout effecteur d’une enzyme allostérique qui modifie l’équilibre entre R et T est un
effecteur allostérique de l’enzyme allostérique
- tout effecteur d’une enzyme allostérique qui laisse cet équilibre inchangé est un
effecteur non allostérique de l’enzyme allostérique
59
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
SOMMAIRE
1. Généralités
1.1. Classification des enzymes
1.2. Spécificité de la réaction enzymatique
2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique
3. La cinétique enzymatique simple
3.1. Influence de la concentration en enzyme
3.2. Influence du pH
3.3. Influence de la température
3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten
3.5. Mesure de l’activité enzymatique
3.6. Influence des inhibiteurs
4. Contrôle de l’activité enzymatique
4.1. La protéolyse ménagée
4.2. Modifications covalentes réversibles
4.3. Les enzymes allostériques
5. Les cofacteurs et coenzymes
5.1. Les deux types de coenzymes
5.2. Exemples de coenzymes d’oxydoréduction
5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements
6. Les isoenzymes
60
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
5. LES
COFACTEURS ET COENZYMES
2 TYPES DE COFACTEURS
obligatoirement
partie protéique
apoenzyme
+
éventuellement
- transporte ou complète un substrat
- accepte un produit
- participe à la structure de l’enzyme
coenzymes
petites molécules
organiques, souvent
dérivées de vitamines
holoenzyme
pour certaines enzymes,
cofacteur non protéique
nécessaire à l’activité
cofacteurs inorganiques
= ions métalliques
(métallo-enzymes) :
cations divalents
(Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+,…)
activateurs ou inhibiteurs
font partie du site actif
61
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
5. LES
COFACTEURS ET COENZYMES
5.1. Les deux types de coenzymes
interviennent dans des réactions :
- d’oxydoréduction : transfert d’électrons et de protons (oxydoréductases)
- de transfert de groupements : mono-carbonés, amines (transférases)
- de formation de liaisons covalentes (ligases)
- éventuellement d’isomérisation (isomérases)
coenzymes
petites molécules
organiques, souvent
dérivées de vitamines
coenzymes libres
= cosubstrats
- dissociation du site actif à chaque réaction
catalysée
- stoechiométrique : [coenzyme] ≃ [substrat]
- régénérés dans une réaction annexe
- 1 fonction spécifique : 1 type de réaction,
même coenzyme pour plusieurs apoenzymes
- ex : NAD+ (accepteur d’électrons)
coenzymes liés
= groupements prosthétiques
-
liés de façon permanente à l’apoenzyme
ne quittent pas la protéine après la catalyse
régénérés au cours de la réaction
catalytique :
[coenzyme] ≃ [enzyme] ≫ [substrat]
- ex : FAD accepteur d’électrons)
il existe plus de 1000 enzymes différentes, mais seulement une vingtaine de coenzymes
62
- inorganiques : ce sont les ions métalliques
Biotech
1 - 2016-2017: ils sont appelés coenzymes. On distingue :
- organiques
5. LES COFACTEURS ET COENZYMES
Enzymologie
- les coenzymes libres qui se dissocient du site actif de l’enzyme à la fin de la
réaction : ils sont appelés cosubstrats
5.2. Exemples
de coenzymes
- les coenzymes
liés qui d’oxydoréduction
restent associés à l’enzyme après la catalyse : ils sont
appelés groupements prosthétiques.
transferts
de protons
et d’électrons
de coenzymes
d’oxydo-réduction
5.2. Exemples
Ils catalysent le transfert de protons et d’électrons.
nom
transfert
type
caractéristiques
- cosubstrats des déshydrogénases
- NADH pour les réactions du catabolisme
- NADPH pour les réactions de biosynthèse
nicotinamides
NAD+ et NADP+
2 e- et 2 H+
libres
flavines (FAD, FMN)
2 e- et 2 H+
lié
- oxydoréduction
- coenzymes des flavo-protéines, cytochromes
acide lipoïque
2 e- et 2 H+
lié
coenzyme des décarboxylations oxydatives
ubiquinone (CoQ)
2 e- et 2 H+
libre
chaîne respiratoire mitochondriale
hème
1 e-
lié
coenzyme des hémoprotéines
(ex : hémoglobine, cytochromes)
5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements
Selon le coenzyme, les groupements transférés peuvent être :
- un groupement carboné
- un groupement amine
63
1 e-
hème
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
5. LES
lié
coenzyme des hémoprotéines
(ex : hémoglobine, cytochromes)
COFACTEURS ET COENZYMES
5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements
5.3.
deles
coenzymes
de
transfert
de groupements
SelonExemples
le coenzyme,
groupements
transférés
peuvent
être :
- un groupement carboné
- un groupement amine
transferts de groupements carbonés, amine, phosphates
- un groupement phosphorylé.
nom
nucléosides
phosphates
transfert
- phosphate
- base + ribose
- base + ribose
-
coenzyme A
type
caractéristiques
libre
phosphotransférases
nucléotidyl-transférases
ligases
libre
acyltransférases
CoA-transférases
monoP
base + ribose diP
groupement acyle
thiamine
pyrophosphate
résidus aldéhydes
phosphate de
pyridoxal
exemples d’enzymes
décarboxylases
oxoacide
déshydrogénases
transcétolases
lié
vitamine B1 (Béribéri)
porc, graines, poisson
groupements
amines
lié
vitamine B6
viande, graines,
légumes
biotine
CO2
libre
vitamine H
oeufs, foie, légumes
carboxylases
acide
tétrahydrofolique
groupements
monocarbonés
vitamine B9
légumes
C1 transférases
transaminases
64
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
SOMMAIRE
1. Généralités
2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique
3. La cinétique enzymatique simple
4. Contrôle de l’activité enzymatique
4.1. La protéolyse ménagée
4.2. Modifications covalentes réversibles
4.3. Les enzymes allostériques
5. Les cofacteurs et coenzymes
5.1. Les deux types de coenzymes
5.2. Exemples de coenzymes d’oxydoréduction
5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements
6. Les isoenzymes
6.1. Définition
6.2. Propriétés : exemple de la LDH
6.3. Importance médicale
65
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
6. LES
ISOENZYMES
6.1. Définition
enzymes de structures différentes, qui catalysent la même réaction chimique :
- séparables par électrophorèse ou chromatographie
- spécifiques des tissus chez les eucaryotes
- propriétés différentes (affinité pour le substrat)
→ permettent une régulation fine du métabolisme
6.2. Propriétés : exemple de la LDH
- catalyse étape cytosolique du métabolisme du glucose en conditions anaérobies :
- réduction réversible du pyruvate en lactate
- couplée à l’oxydation d’un NADH, H+ en NAD+
O-
O
NADH, H+
C
C
O-
NAD+ O
C
O
CH3
pyruvate
lactate
déshydrogénase
LDH
HC
OH
CH3
lactate
66
Biotech 1 - 2016-2017
Enzymologie
6. LES
6.2. Propriétés : exemple de la LDH
ISOENZYMES
3,*#%(6'2*+,-*'-(.,)/01,-**
+9*
*+,*%$&**
$"#
$&!#
$%!%#
$!&#
- 4 chaînes polypeptidiques
$9*7(9%-*+9*+":,2(##,1,)&*
!"#
'(###')##'*##+*%##+%*##,-./01#
- 2 types de chaînes : H dans le coeur, M dans le muscle
- 5 formes possibles selon le développement ou!"#$%&'&'()*+,-*'-(.,)/01,-*+,*2$*345*,)*6()7&'()*+,-*(%8$),-!
les organes
- LDH1 coeur : H4
- LDH2 : H3M
- LDH3 : H2M2
- LDH4 : HM3
- LDH5 muscle squelettique, foie : M4
6.3. Importance médicale
→ utilisation de certaines isoenzymes comme marqueurs de pathologies
Exemple : augmentation de LDH2 et LDH3 en cas d’infarctus du myocarde
67