Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie
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Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie BIOCHIMIE STRUCTURALE– Biotech 1 Chapitre 6 Enzymologie Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie SOMMAIRE 1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique 3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs 4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques 5. Les cofacteurs et coenzymes 6. Les isoenzymes 2 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie SOMMAIRE 1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 1.2.1. Modèle de Fischer 1.2.2. Modèle de Koshland 2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique 3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs 4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques 5. Les cofacteurs et coenzymes 6. Les isoenzymes 3 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 1. GÉNÉRALITÉS - réaction chimique = transformation : A + B → C + D - dans nos cellules : des milliers de réactions chimiques en permanence → nécessité de catalyseurs pour : - accélérer la réaction Catalyseurs et catalyse (1) - contrôler la réaction E6 Notion de catalyse. Propriétés des catalyseurs biologiques Réaction très lente (années/siècles) réaction très lente Libération de chaleur « inutilisable » ++ O202 (années / siècles) Saccharose saccharose CO CO 2 2 + +HH02O 2 réaction rapide (secondes) Réaction trèstrès rapide (secondes) Production d’énergie → production d’énergie utilisable utilisable (ATP) (sucre courant) Muqueuse intestinale muqueuse intestinale (contenant la saccharase et les enzymes de la glycolyse aérobie) (saccharase + enzymes glycolyse) Les catalyseurs biologiques sont les enzymes - ils ont une STRUCTURE PROTEIQUE, souvent globulaire - catalyseurs biologiques : enzymes (E) - ils agissent à 37°C, dans un milieu à pH spécifique = protéines (sauf ribozymes) - ils ont une grande SPECIFICITE : choix du substrat et présentation → transformation d’un substrat S en produit P - ils ont des CAPACITES DE REGULATION (site actif) S E P 4 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 1. GÉNÉRALITÉS DÉFINITIONS - ENZYME : protéine présentant des propriétés de catalyse spécifique d’une réaction chimique du métabolisme - SUBSTRAT : molécule qui entre dans la réaction pour y être transformée grâce à l’activité catalytique d’une enzyme - PRODUIT : molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme - LIGAND : corps chimique ayant une liaison spécifique avec une protéine 5 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 1. GÉNÉRALITÉS - métabolisme = ensemble des réactions chimiques d’une cellule - réactions organisées en voies (séquences ou chaînes) métaboliques : - suite ordonnée de réactions biochimiques permettant des transformations successives de substrats en produits → le produit d’une réaction devient substrat de la suivante étape est2catalysée par une enzyme spécifique - chaque BIOTECH / 2011-2012 Biochimie - l’absence d’une enzyme ou d’un substrat perturbe en général l’ensemble de la voie Introduction à l’étude du métabolisme Métabolismeprécurseur : processus au travers duquel le monde vivant acquiert et utilise l’énergie libre requiseE1pour exécuter ses diverses fonctions métabolite 1 Voies métaboliquesE2 : succession d’étapes catalysées par des enzymes résultant en métabolite 2 produits spécifiques Catabolique E3 Anabolique ... Amphibolique Ex produit schéma simplifié du métabolisme 10 6 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 1. GÉNÉRALITÉS 1.1. Classification des enzymes - classification des enzymes selon une nomenclature internationale : E.C. - 6 classes principales selon la nature de la réaction catalysée : classe E.C.1 oxydo-réductases action transfert d’électrons E.C.2 transférases transfert de groupes chimiques E.C.3 hydrolases réaction d’hydrolyse : transfert de groupes fonctionnels à l’eau E.C.4 lyases addition de groupes sur double liaison ou formation de double liaison par soustraction de groupe E.C.5 isomérases transfert de groupes à l’intérieur d’une molécule pour former un isomère E.C.6 ligases formation de liaison C-C, C-S, C-O ou C-N par réaction de condensation. Nécessite un apport d’énergie (ATP) 7 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 1. GÉNÉRALITÉS 1.1. Classification des enzymes - chaque type de réaction est divisé en classes puis en sous-classes - chaque enzyme possède un matricule à 4 chiffres : ex : chymotrypsine EC.3.4.4.5 X - X - X - X réaction chimique classe sous classe caractéristique de l'enzyme - 3 4 4 5 (hydrolase) (hydrolyse de peptide) (protéase à sérine) (chymotrypsine) - nom usuel : nom du substrat et/ou de la réaction + suffixe “ase” Exemples : saccharase → hydrolyse du saccharose lactate déshydrogénase → oxydation réversible du lactate en pyruvate 8 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 1. GÉNÉRALITÉS 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique - enzymes étroitement spécifiques (≠ catalyseurs chimiques) : - UNE réaction chimique donnée - sur UN substrat ou UN type de substrats défini EXEMPLES : - trypsine et chymotryspine = peptidases reconnaît résidus basiques chargés >0 (Lys, Arg) reconnaît résidus aromatiques (Tyr, Phe, Trp) - hexokinase et glucokinase = kinases phosphoryle les hexoses (glucides à 6C) phosphoryle le glucose (6C) 9 érines protéases, avec notamment la trypsine, Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie liaison peptidique. Ce sont des endopeptidases 1. GÉNÉRALITÉS H O H 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique NH- C - C - OH + NH2 - C – CO- Rn Rn+1 - spécificité due à l’adéquation entre les structures site actif / substrat bulaire de forme ellipsoïde ) réunies par des ponts fure intrachaînes : partie protéique - composé d’acides aminés parfois éloignés dans la structure primaire - fonctions chimiques portées par les chaînes latérales des acides aminés SITE ACTIF C dans lequel 3 ur : H57, Site actif site actif (acides aminés) substrat substrat - site actif : - site de reconnaissance : reconnaît le substrat (en 3D) → formation liaisons faibles entre acides aminés du site actif et substrat - site catalytique : transforme le substrat → fonctions chimiques nécessaires à la réaction présents sur les chaînes latérales des acides aminés 10 ppartient à la superfamille des sérines protéases, avec notamment la trypsine, sine… Biotech 1 - 2016-2017 sent une réaction d’hydrolyse de la liaison peptidique. Ce sont des endopeptidases 1. GÉNÉRALITÉS Enzymologie H H O H - C 1.2. – CO- Spécificité + H2O Rn+1 C - C - OHenzymatique de-NH la -réaction + NH2 - C – CORn Rn+1 st une protéine de 25 kDa, globulaire de forme ellipsoïde rois chaînes polypeptidiques (A,B,C) réunies par des ponts s et stabilisées par des ponts disulfure intrachaînes B C protéine génère un site actif dans lequel 3 culiers vont jouer un rôle majeur : H57, rment la triade catalytique. Site actif site actif (acides aminés) substrat substrat - tout acide aminé nécessaire à l’activité enzymatique appartient au site actif - site actif petit : < 5% de la surface protéique - si le substrat est une macromolécule : seule la partie à transformer entre en contact avec le site actif 11 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 1. GÉNÉRALITÉS 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 7896!4-)5.'!)'!:(,&;'$! 1.2.1. Modèle de Fischer MODÈLE DE FISCHER (CLÉ-SERRURE) 4-)5.'!&.'36,'$$%$'!! pré-existence de la complémentarité de forme entre l’enzyme et le substrat <,',(#'!1&#(3!%'/#,'."(2,'!"2=-*2,#$%+(,'4,'!,--,'4/'&/0&$ 12 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 1. GÉNÉRALITÉS 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 1.2.2. Modèle de Koshland )*+%(+%,'-.*/0(% MODÈLE DE KOSHLAND (AJUSTEMENT INDUIT) % déformation de l’enzyme pour s’adapter à la structure du substrat ! → les acides aminés s’orientent de façon à permettre la fixation du substrat ! 13 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie SOMMAIRE 1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique 3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs 4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques 5. Les cofacteurs et coenzymes 6. Les isoenzymes 14 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX RÉACTION CHIMIQUE ET ÉNERGIE - pour avoir lieu, une réaction doit être thermodynamiquement favorable → énergie de l’état final plus faible que celle de l’état initial Effet de la température libre entre l’état final et l’état initial - ∆G (ou dE, ou ∆E) : différence d’énergie - ∆G < 0 : réaction exergonique, spontanée 9.4 Energie d’activation - ∆G > 0 : réaction endergonique → n’aura lieu que si elle est couplée à une réaction exergonique qui apporte l’énergie (ex : hydrolyse d’ATP) 15 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX ÉTAT DE TRANSITION ET ÉNERGIE D’ACTIVATION Effet de la température - lors d’une réaction chimique, formation d’un état de transition → énergie plus élevée que celle de S ou P 9.4 Energie d’activation - énergie d’activation (Ea, dEA) : énergie nécessaire à la formation de l’état de transition = barrière énergétique entre état initial et état final dEA = énergie d’activation EE 61 - si Ea trop élevée, réaction quasi-impossible dans la cellule • Au cours de la réaction enzymatique les corps en présence, enzyme, substrats, cofacteurs, etc... échangent donc de la chaleur avec les autres molécules de ce milieu : on dit qu’il y a 16 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX RÔLE DE LA CATALYSE (chimique ou biologique) - diminuer l’énergie d’activation de la réaction - formation d’un ou plusieurs intermédiaires plus stables : Ea plus faible - catalyse enzymatique : intermédiaire(s) = complexe(s) enzyme-substrat ES stabilisé(s) par des liaisons non covalentes entre E et S - plus Ea est faible, plus la réaction est rapide 17 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX CATALYSE ENZYMATIQUE E + S ⇄ ES (⇄ EP) ⇄ E + P E + S ⇄ ES ⇄ E + P - étape 1 : formation complexe enzyme-substrat stéréospécifique de l’affinité et de la complémentarité des structures - éventuellement formation d’autres complexes intermédiaires EP - étape 2 : décomposition du complexe en enzyme libre et substrat transformé en produit 18 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX CATALYSE ENZYMATIQUE - cinétique accélérée : Ea plus faible - thermodynamique inchangée : ∆G identique énergies inchangées ! un catalyseur agit EXCLUSIVEMENT sur la vitesse, pas sur l’équilibre 19 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX CATALYSE ENZYMATIQUE ! un catalyseur agit EXCLUSIVEMENT sur la vitesse, pas sur l’équilibre → une réaction "non faisable" ne deviendra pas "faisable" en présence d’enzyme substrat - plusieurs possibilités : - réversible - irréversible substrat substrat substrat substrat enzyme 1 enzyme 1 enzyme 1 enzyme 1 enzyme 2 enzyme 2 produit produit substrat produit produit substrat - éventuellement nécessité d’un cofacteur enzyme 1 enzyme 1 + cofacteur substrat + cofacteur produit substrat produit enzyme 1 enzyme 1 enzyme 2 enzyme 1 + cofacteur produit produit produit 20 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX CATALYSE ENZYMATIQUE - modification de la vitesse, pas de la thermodynamique : → formation d’intermédiaires (ES, EP), d’Ea basse → accélération de la vitesse (x 106) → constante d’équilibre de la réaction inchangée → enzyme inchangée en fin de réaction - diminution de l’Ea grâce à : - effet de proximité : rapprochement E-S - catalyse acide /base : acide donneur de protons, électrophile base accepteur de protons, nucléophile - interactions E/S : électrostatiques, liaisons hydrogène - catalyse covalente : formation liaison temporaire entre résidus polaires non chargés (E : Cys, Ser) → intermédiaires plus réactifs - changements conformationnels, flexibilité 21 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX CATALYSEURS BIOLOGIQUES = ENZYMES ! - accélèrent la vitesse de réaction - sont retrouvées inchangées en fin de réaction - agissent en petites concentrations - ne modifient pas l’équilibre d’une réaction réversible - l’équilibre final est le même qu’en absence d’enzyme… mais obtenu plus rapidement → modification de la cinétique, pas de la thermodynamique 22 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie SOMMAIRE 1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique 3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs 3.6.1. Inhibitions “irréversibles” : exemple des AINS 3.6.2. Inhibitions réversibles 4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques 5. Les cofacteurs et coenzymes 6. Les isoenzymes 23 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - analyse et quantification de la catalyse - influencée par différents facteurs : %% - ceux contenus dans la relation E + S ⇄ ES ⇄ EP ⇄ E + P - ceux liés à l’environnement de la réaction : - pH - température - ions - coenzymes et autres composés que S et P 8 (% ! " - mesure de la vitesse de réaction transformant S en P, catalysée par l’enzyme E : [P] = f (t) d[S] d[P] = vitesse de réaction v = dt dt - v tangente à la courbe - v varie au cours du temps (mol.L-1.s-1) 24 Effet de la concentration d’enzyme Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.3 Phases de la réaction CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - vitesse réaction directe = vitesse réaction réverse - équilibre - [S] et [P] constantes - v nulle et constante EE 10 - - [P] ↑ - la réaction réverse P → S • Revenons phase très brève (invisible)à notre échelle, en mesurant la concentration du produit P en fonction du temps. - toutes les E sont sous commence à se produire Dans un milieu oùSil n’y a au temps 0 que des molécules de l’enzyme et du substrat, la réaction liaison rapide et réversible E+ forme ES - v diminue se déroule de façon non uniforme. [ES]↑ - [ES] constante On distingue une première phase très brève, au cours de laquelle la vitesse de la réaction est v croissante • - v maximale et constante croissante. Durant cette phase, les molécules de substrat se lient avec l’enzyme : la concentratant que [S] ≫ [P] tion du complexe enzyme-substrat augmente. 25 • Lorsque toutes les molécules de l’enzyme sont occupées par des molécules du substrat la vi- Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE Effet de la concentration d’enzyme Phases de laENZYMATIQUE réaction CINÉTIQUE QUE ENZYMATIQUE SIMPLE ! En enzymologie, TOUJOURS étude de : - la phase stationnaire “conditions de vitesse initiale” - vitesse initiale (Vi, V0) → vitesse la plus grande de toutes les vitesses mesurables EE 10 → variation linéaire enons à notre échelle, en mesurant la concentration du produit P en fonction du→ temps.efficacité catalytique maximale - toutes les E sont sous s un milieu où il n’y a au temps 0 que des molécules de l’enzyme et du substrat, la réaction forme ES éroule de façon non uniforme. - [ES] constante distingue une première phase très brève, au cours de laquelle la vitesse de la réaction est - v maximale et constante ssante. Durant cette phase, tant les molécules de substrat se lient avec l’enzyme : la concentraque [S] ≫ [P] du complexe enzyme-substrat augmente. sque toutes les molécules de l’enzyme sont occupées par des molécules du substrat la vie de la réaction est maximum et reste constante tant que la concentration du substrat est 26 Effet de la concentration d’enzyme Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie ncentration de l’enzyme 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.1. Influence de la concentration en enzyme - [E] variable, tous autres paramètres constants - [S] ≫ [E] Effet de la concentration d’enzyme - mesure de V0 pour différentes [E], conditions de Dosage Vi 3.7 enzymatique EE 12 s l’évolution de la réaction lorsqu’on change la concentration de l’enzyme. es de la concentration du produit en fonctions du temps sont différentes pour chaoncentrations de l’enzyme essayées. Lorsque la concentration de l’enzyme est granxemple E3) la vitesse initiale est plus grande que lorsque la concentration de est petite (par exemple E1). → V0 varie linéairement avec [E] 27 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE Effet du pH 3.2. Influence du pH énaturation - pH variable, tous autres paramètres constants - modification de l’état d’ionisation des acides aminés (site actif ou non) Effet du pH - dénaturation de l’enzyme (perte structure 3D) 8.3 pH optimum - vitesse de formation ou de dissociation de ES affectée EE 54 me, les substrats, les cofacteurs sont les corps chimiques qui interviennent obligatoidans la réaction enzymatique. es facteurs qui interviennent il y a aussi des facteurs physiques : le pH et la température mple. Le pH intervient de deux manières différentes : soit en modifiant la structure see ou tertiaire de l’enzyme, soit en modifiant les charges électriques des radicaux des aminés du site actif. une enzyme est conservée dans un milieu dont le pH est défavorable au maintien de pHuneoptimum caractéristique de chaque ture, elle→ va subir dénaturation. ons cet effet sur un graphe représentant l’activité résiduelle d’une enzyme qui a été ée pendant 24 heures à une température de 30°C., en fonction du pH de ce milieu de ation. cette enzyme a été conservée dans des conditions optimales et son activité résiduelle lus grande : 100%. A pH 6 l’enzyme a subi une dénaturation partielle si bien qu’au 24 heures son activité n’est plus que de la moitié de ce qu’elle aurait été si on l’avait ée à pH 3. A pH 9 ou bien en dessous de pH 3, cet effet dénaturant est encore plus . enzyme 28 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie Effet de la température 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.3. Influence9.1 deTempérature la températureoptimum - température variable, tous autres paramètres constants EE 58 - augmentation de la température → accélération de la vitesse de réaction (loi d’Arrhénius) • Examinons maintenant l’effet la température du sur la réaction enzymatique qui s’y - puis dénaturation progressive dedel’enzyme →milieu température d’inactivation spécifique déroule. de chaque enzyme - dénaturation • Le graphe qui représente les quantités de produit transformées par une enzyme (A) en fonction de la température (θ) duθmilieu d’incubation, est une courbe ascendante une tempéranégligeable pour < 30°C, appréciable pour θjusqu’à > 40°C ture (ici 45°C.) où l’activité de l’enzyme est la plus grande, puis rapidement descendante. - enzymes biologiques : température optimale 37°C - cas particulier : certaines bactéries thermophiles (Taq polymérase θoptimale = 75-80°C) 29 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten Effet de la concentration de substrat oncentration substrat - [S] variable,du tous autres paramètres constants - [S] ≫ [E] - mesure de Vi pour chaque [S] (tangentes) - lorsque [S] augmente, V0 augmente - report des V0 sur un graphe V0 = f([S]) EE 14 inons à nouveau l’évolution de la réaction lorsqu’on change cette fois-ci la concentrau substrat. 30 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE Effet de la concentration de substrat ENZYMATIQUE SIMPLE 4.2 Cinétique michaélienne 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten Effet de la concentration de substrat 4.1 Concentration du substrat EE 14 [P] = f(t) Vo = f([S]) Examinons à nouveau l’évolution de la réaction lorsqu’on change cette fois-ci la concentraEE 15 tion du substrat. Les mesures de la concentration du produit en fonction du temps sont différentes pour chacune des concentrations de substrat essayées. Lorsque la concentration du substrat est grande • Représentons cette fois ces vitesses initiales en fonction des concentrations du su (par exemple S10) la vitesse initiale est plus que lorsque la concentration duessayées. substrat hyperboles - grande nous avons est petite (par exemple S1). différents - axes • de concentration Les vitesses croissent en fonction des concentrations du substrat. Mais cet On peut mesurer ces vitesses !initiales en calculant la différence de mesurées produit n’est graphes pas linéaire :et le graphe de cette fonction est une hyperbole (tirets longs). au cours d’un temps donné, pour chaque concentration du substrat. des des tangentes différentes - signification 31 l’ • Lorsque la concentration du substrat est nulle la vitesse est évidemment 0, donc passe par l’origine du graphe. La fonction n’a pas de sens en dessous de cet origin Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE Effet de la concentration de substrat 3.4.4.20 Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten Hyperbole de Michaelis-Menten COURBE DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES ! ! ! courbe Vo = f([S]) de Michaelis-Menten hyperbolique EE 27 Détermination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme : • - Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confirme ces conclusions mathématiques. vitesse initiale maximale Vmax (Vm) : activité enzymatique maximale lorsque • Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples enl’enzyme saturée en substrat → ∞) tiers deest K m aboutit à des fractions entières de([S] la vitesse maximum. On trace une hyperbole à partir des points obtenus, qui permet de voir la signification réelle des paramètres géométriques K m et V max que nous avons choisis au début de cette étude. constante de Michaelis Km : concentration de S qui permet d’obtenir Vmax/2 • V max est une vitesse initiale que la réaction aurait si la concentration du substrat était infinie. 32 • K m est la concentration du substrat pour laquelle on observe une vitesse égale à la moitié de Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN E+S k+1 k-1 ES k+2 k-2 E+P constantes de vitesse k E+S k+1 k-1 ES état pré-stationnaire k+2 E+P état stationnaire → k-2 est négligée - étape 1 → formation réversible complexe ES, état pré-stationnaire - étape 2 → → → → toutes les enzymes sont complexées état stationnaire : [ES] constante et [S] ≫ [P] réaction réverse P → S négligée k+2 = constante catalytique (= constante de vitesse de la réaction enzymatique) 33 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN : ÉQUATION DE LA COURBE V0 = f[S] - 2016-2017 gie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE Effet de la concentration de substrat kMichaelis-Menten +k [S] nfluence de la concentration en substrat : équation de 20 Hyperbole de Michaelis-Menten Vo = Vm avec Km = E DE −1 Km + [S] +2 k +1 ! MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES ! ! ! - hyperbole équilatère courbe Vo = f([S]) de - si [S] → ∞ alors Vo → Vm Michaelis-Menten hyperbolique - si [S] → 0 alors Vo → 0 - si Vo = Vm/2 alors Km = [S] EE 27 mination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme : 34 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE Effet de la concentration de substrat ENZYMATIQUE SIMPLE 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation 4.20 Hyperbole de Michaelis-Menten 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten COURBE DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN ! Vo = Vm courbe Micha hyp [S] Km + [S] - Km (mol.L-1) : EE 27 E / S des 2 paramètres - caractéristique fondamentale couple Détermination cinétiques de-1l’enzyme : -1 Vm (mol.L .s ) : • Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confir- ne dépend pas de [E] me cesinitiale conclusionsmaximale mathématiques. Vmax :- activité Vo maximale - vitesse enzymatique maxi S - indicateur de l’affinité de E pour • Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples en- dépend de [E] enK substrat ([S] → ∞) - assimilée à KD du complexe ES saturée tiers de aboutit à des fractions entières de la vitesse maximum. On trace une hyperbole à m - Vm =réelle kcatdes[Eparamètres T] partir des points obtenus, qui permet de voir la signification géométri- ques K m etde V maxMichaelis que nous avons Km choisis:auconcentration début de cette étude. de S qui permet - constante deestturn-over - cte catalytique kcat (= k2) = nombre une vitesse initiale que la réaction aurait si la concentration du substrat était infinie. • V max • K m est la concentration du substrat pour = nombre de molécules de S transformées /sec / molécule delaquelle E on observe une vitesse égale à la moitié de - efficacité catalytique kcat/Km • la vitesse maximum. Malheureusement, l’extrapolation d’une hyperbole à partir de quelques points n’est pas facile et ne permet pas de faire le tracé d’une telle courbe à partir des mesures de vitesses initiales 35 faites réellement au cours d’expériences avec des concentrations de substrat différentes. Biotech 1 - 2016-2017 Biotech 1 -Enzymologie 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE Effet de la concentration de substrat ENZYMATIQUE SIMPLE 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michael 4.20 Hyperbole de Michaelis-Menten 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten COURBE DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN [S] Vo = Vm Km + [S] ! courbe Vo = f([S]) de Michaelis-Menten hyperbolique EE 27 Détermination desla2représentation paramètresde cinétiques de l’enzyme : - exploitation difficile de Michaelis-Menten : • Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confir- - tracé délicat me à partir des valeurs expérimentales (hyperbole) ces conclusions mathématiques. - vitesse initiale maximale Vmax : activité enzymatique maximale lorsque - sous-estimation de Vmax (il faudrait [S] → ∞) • Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples ensaturée en substrat ∞) - Km déterminée graphiquement à→ partir dedeVmax →maximum. sous-estimée tiers de Km aboutit à des([S] fractions entières la vitesse On trace une hyperbole à - partir des points obtenus, qui permet de voir la signification réelle des paramètres géométriques K m etde V maxMichaelis que nous avons Km choisis:auconcentration début de cette étude. de S qui permet constante 36 d’obtenir Vm Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten REPRÉSENTATION DE LINEWEAVER ET BURK - transformation de Lineweaver et Burk (doubles inverses) : 1/V0 = f(1/[S]) - obtenue en prenant la double inverse de l’équation de Michaelis-Menten - droite, plus facile à extrapoler et à exploiter (régression linéaire) ! 1 Km 1 1 = + Vo Vm [S] Vm - ordonnée à l’origine = 1/Vm - pente = Km/Vm - par prolongation, intersection avec axe des abscisses = -1/Km 37 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.5. Mesure de l’activité enzymatique - dosage par spectrophotométrie : absorbance (DO) à λ donnée loi de Beer-Lambert : A = ε.l.[P] → concentration de P - dosage direct de S ou P - dosage indirect : substrat ou produit d’une réaction couplée NAD+ EXEMPLE : réaction d’oxydo-réduction NADH, H+ A B ε - 2 réactions couplées : - oxydation de A en B - réduction de NAD+ en NADH, H+ NH2 O O - NAD+ et NADH, H+ absorbent à 260 nm CH 2 O P O P O 340 nmO- O- absorption spécifique du NADH, H+ à OHHO O → dosage NADH, H+ réduit → vitesse d’apparition du NADH, H+ NADH → vitesse réaction H N N NH2 N N NAD+ NADH N N O CH 2 O OH OH λ (nm) Spectre UV des coenzymes nicotiniques38 260 300 340 380 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.5. Mesure de l’activité enzymatique UNITÉS DE MESURE - UI : unité internationale = quantité d’enzyme transformant 1 µmole (10-6 M) de substrat par minute (µmol/min) dans les conditions standard (température et pH) - Katal (kat) : unité SI (catalyseurs) = quantité d’enzyme transformant 1 mole de substrat par seconde (mole/s) - activité molaire spécifique ou nombre de rotation ("turn-over number") = nombre de molécules de substrat transformées / sec / molécule d’enzyme - activité spécifique (AS) utilisation pour le suivi de la purification d’une enzyme = activité enzymatique par unité de masse de protéines totales (UI/mg) traduit le degré de pureté de l’enzyme AS = activité enzymatique / masse totale de protéines 39 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.5. Mesure de l’activité enzymatique UNITÉS DE MESURE protéines totales purification E protéines totales E - indice de purification (sans unité) = degré d’enrichissement en enzyme après purification par rapport à l’extrait de départ enrichissement = AS de la fraction / AS de l’extrait de départ - rendement = pourcentage d’enzyme récupérée par rapport à la quantité de départ R = (activité totale extrait final / activité totale extrait initial) x100 dans l’idéal : enrichissement le plus grand possible rendement 100 % 40 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.6. Influence des inhibiteurs EFFECTEURS - molécules de natures diverses - interfèrent avec une étape de la catalyse - soit en l’accélérant : activateurs - soit en la ralentissant : inhibiteurs - irréversibles - réversibles → très utiles pour compréhension des mécanismes enzymatiques et en thérapeutique 41 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.6. Influence des inhibiteurs 3.6.1. Inhibitions “irréversibles” : exemple des AINS - liaison covalente à l’enzyme : “inhibiteurs suicides” - destruction d’un groupement essentiel à l’activité → enzyme incapable de fixer ou transformer le substrat - pas d’inhibition irréversible dans l’organisme, mais intérêt thérapeutique EXEMPLE : l’aspirine - classe des AINS (AntiInflammatoires Non Stéroïdiens) - inhibition des COX (cyclo-oxygénases) → liaison covalente avec une sérine → encombrement stérique - empêche acide arachidonique d’entrer dans le canal COOH O O acide acétylsalicylique - pas de production de prostaglandines 42 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE 3.6. Influence des inhibiteurs 3.6.2. Inhibitions réversibles Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzymatique Influence des inhibiteurs (1) Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mé Modélisation desMICHAELIENNES réactions enzymatiques INHIBITION RÉVERSIBLE DES ENZYMES E19 : la cinétique enzymatique simple (6) Influence des inhibiteurs (1) Inhibiteur compétitif Inhibiteur non compétitifd’action Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme S S - 3 types : Ic Inhibiteur compétitif S - inhibition compétitive Inhibiteur non compétitif SES Inhibi ES Inhibiteur incompétitif Inc S Iic EI ES Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique EIenzymatique simple (6) Ic ES - inhibition non compétitive Influence des inhibiteurs ES (1) E1 ESI Inc IicES E+S ES E+P E+S E+P E+S Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action EI + + + EI ESI ESI Ic Inc Inc - inhibition incompétitive E+S + ES E+P Inhibiteur compétitif S Ic faibles - fixation sur l’enzyme par liaisons → formation et rupture faciles IcKI et rapides → mécanismes différents EI EI ES EI E+S ES E+P KIE+SInhibiteur ES KE+S I non compétitif + + S EI+ S Inc Inc KI Inc EI+ S K ’I E+S ic K ’I ES ES Iic ESI ESI EI E+P E+P K ES ’I Inhibiteur incompétitif + S ESI I ESI ESI ES E+P E+S ES 43 E+P V Modélisation des réactions enzymatique V Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologiele substrat. Influence des inhibiteurs (1) CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE Donc, la3.Vmax par sont rapport celle Les réversibles de troisàtypes Vdéterminée en présence de I ne changera V inhibiteurs pas Vpo max max m obtenue en absence de I. En revanche, la fixation de I sur E déplace l'équilibre E +S <----> 3.6. Influence des inhibiteurs V ma Inhibiteur compétitif Inhibite 3.6.2. Inhibitions réversibles en faveur de E, dont la concentration augmente aux dépensVmade V max 2 x 2celle de ES. Mmax S Donc, le KV Vma x' (apparent) augmente en présence de I. L'affinité apparenteVde' l'enzyme pour S diminueV (fi' 2I max ma x INHIBITION COMPÉTITIVE ci-dessous). KM KM ' ! V [S] KM ' K M V 1/V EI KM KM ' [S] E+P E+S -1/K M -1/K M ' 0 nc I 1/V EI+ S Vma x 1/ -VVmax inchangée ' max 1/V max' - Km augmente V max 2 → diminution de l’affinité V max' 2 1/V max apparente pour S Vma x 2 V x' 1/Vma ma x Vma x' 2 de liaisons ES EI I V Vmax 2 EI + + Représentation de Lineweaver-Burk I I inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif inhibiteur compétitif inhibiteur incompétitif inh K K ques ; ils V max E+S [S] c ! max c uneVétape Inc ES - analogie structurale avec le substrat → fixation au niveau du site actif, à la place du substrat Représentation de Michaelis-Menten inhibiteur compétitif c KM ' K M 1/[S][S] -1/KM ' -1/K M K M 0 [S] 1/[S] 1/ -1/K M bition - levée de l’inhibition par excès de substrat : déplacement de l’équilibre entre EI et E Représentation de Lineweaver-Burk 44 Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzy Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie chaelis-Menten 3. CINÉTIQUE Influence des inhibiteurs (1) ENZYMATIQUE SIMPLE Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent p inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif 3.6. Influence des inhibiteurs16V Inhibiteur compétitif V 3.6.2. Inhibitions réversibles de I ne changera pas par rapport à celle V max INHIBITION NON COMPÉTITIVE Ic Vma x ES EI V max' d’analogie structurale le substrat - pasde Vma dépens celle de ES. Donc, le Kavec x 2 M V max 2 Vma x' sur un site distinct du site catalytique → fixation V max' 2 E+S ' 2 parente de Vl'enzyme pour S diminue (figure S] S S e I sur E déplace l'équilibre E +S <----> ES ma x Inhibiteur non compétitif ES EI E+P + I de catalyse - changements de conformation → diminution de la vitesse c [S] KM ' K M KM [S] KI complexée - se fixe avec la même affinité sur forme libre E et forme EI ES → indépendamment de S eweaver-Burk → fixation simultanée de I et S possible /[S] ! inhibiteur nonincompétitif compétitif inhibiteur V ! 1/V V max' 2 1/V max -1/KM ' -1/K KMM ES + + Inc Inc KI EI+ S E+P K ’I ESI - Vmax diminue - Km inchangée → affinité pour S inchangée V max' 1/V max' E+S 1/V 1/Vma x' 2 ESI inhibiteur non compétitif Vma x V max ES Inc 1/Vma x 0 [S] 1/[S] -1/K M 0 1/[S] 45 Influence des inhibiteurs (1) 16 Biotech 1 - 2016-2017 Représentation de Michaelis-Menten 3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action Enzymologie inhibiteur compétitif inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif V pas par rapport à celle V ax 3.6. déterminée en présence de I ne changera Influence des inhibiteurs Inhibiteur compétitif V Inhibiteur non compétitif 3.6.2. la Inhibitions réversibles . En revanche, fixation de I surS E déplace l'équilibre ES+S <----> ES V V V max max c Inc ES ES V max' 2 présence de l'enzyme pour S diminue V(figure 2 V 2 I. L'affinité apparente de V ma x max max Vma x' EI → équilibre E +E+S S ⇌ ES [S]déplacé en faveur de ES ES E+P E+S KM ' KM ' K M Ic Inc - complexe ESI n’évolue pas → Vm ↓ ESI ESI ES [S] → affinité apparente de E pour S augmente + + → Km+ ↓ -Menten E+P E+S KM ! V EI inhibiteur compétitif 1/V Vmax inhibiteur non ESI compétitif 1/V 1/V Vma x 1/Vma x' - Vmax diminue - Km diminue → augmentation de l’affinité pour S 1/Vmaapparente x V max' Vma x 2 Vma x' Vma x' 2 K ’I I V EI+incompétitif S ESI inhibiteur ! E+P Iic Inc I [S] ES + K Lineweaver-Burk K ’ Représentation de inhibiteur incompétitif inhibiteur non Kcompétitif I Iic V max' 2 EI S Vma x' 2 - fixation sur forme ES déjà complexée au KM S ma x concentration augmente aux dépens de celle de ES. Donc, le KMES I INHIBITION INCOMPÉTITIVE Inhibiteur incompétitif V max 1/Vma x -1/K M -1/K M ' 0 KM ' K M [S] 1/[S] 2 1/V max' V max' 2 1/V max -1/KM ' -1/K M KM 0 [S] 1/[S] -1/K M 0 1/[S] 46 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie SOMMAIRE 1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique 3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs 4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques 4.3.1. Caractéristiques structurales 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques 4.3.3. Les deux modèles de l’allostérie 5. Les cofacteurs et coenzymes 6. Les isoenzymes 47 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE NOMBREUX PROCESSUS DE CONTRÔLE - concentration, localisation des enzymes : biosynthèse, dégradation, trafic intracellulaire - environnement : pH, [cofacteurs], [substrats], [inhibiteurs]… - activation irréversible par protéolyse ménagée - modifications covalentes réversibles : phosphorylation, formation ou rupture de ponts disulfures… - régulation allostérique Contrôle de l ’activité des enzymes (2) - association possible de plusieurs modes de contrôle Contrôle de l’activité enzymatique par protéolyse ménagée La protéolyse ménagée est un mode d’activation courant d digestives et les enzymes de la cascade de la coagulation 4.1. La protéolyse ménagée - modification covalente (lyse) irréversible On appelle zymogène le précurseur inactif d’une enzyme a Exemple de la chymotrypsine Trypsine - mode d’activation courant (enzymes digestives, cascade de coagulation du sang) - précurseur inactif = zymogène Chymotrypsininogène (inactif) Chymotrypsine A B C Chymotrypsine (active) Chymotrypsine (active) 48 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE 4.2. Modifications covalentes réversibles - interactions covalentes avec groupement chimique - liaison et clivage catalysés par enzymes différentes → chaque réaction est irréversible → processus global réversible - exemples : ribosylation, acétylation / désacétylation, ubiquitination, phosphorylation / déphosphorylation… PHOSPHORYLATION / DÉPHOSPHORYLATION - la plus fréquente - activation ou inhibition temporaire de l’enzyme - ajout / retrait de groupements phosphates sur résidus alcool (Ser, Thr, Tyr) - kinases / phosphatases - le plus souvent en réponse à un signal extracellulaire - kinases souvent AMPc-dépendantes : liaison avec AMPc (2nd messager) pour activation 49 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE 4.2. Modifications covalentes réversibles PHOSPHORYLATION / DÉPHOSPHORYLATION - phosphorylation = ajout d’un groupement phosphate, catalysé par une protéine kinase groupement phosphate OH ATP O ADP O O- kinase fonction alcool libre O- P fonction alcool phosphorylée - déphosphorylation = retrait du groupement phosphate, catalysé par une phosphatase groupement phosphate O O P O- OH O- + phosphatase fonction alcool phosphorylée O - O P O- Ofonction alcool libre phosphate inorganique (Pi) phosphorylation / déphosphorylation → régulation de très nombreuses protéines impliquées dans des voies de signalisation ! 50 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE 4.3. Les enzymes allostériques 4.3.1. Caractéristiques structurales - RÉPONSE RAPIDE, FINE ET ADAPTÉE aux conditions intracellulaires - leur cinétique ne suit pas l’équation de Michaelis-Menten ENZYMES ALLOSTÉRIQUES = PROTÉINES ALLOSTÉRIQUES ! 1) protéines complexes, multimériques (plusieurs sous-unités) 2) plusieurs sites de fixation pour un ou plusieurs ligands → liaison d’un effecteur par des liaisons faibles, sur un site régulateur distinct du site catalytique → site régulateur et site catalytique sur même sous-unité ou sous-unités différentes 3) la fixation d’un premier ligand modifie la liaison des autres ligands → liaison d’un effecteur provoque un changement conformationnel = transition allostérique (forme active R ⇌ forme inactive T) → modifie la fixation du substrat ou d’autres modulateurs → coopérativité modulateur et/ou substrat pour l’activité 51 ou du substrat pour l'activité. Biotech 2016-2017 - 1il -existe au moins un site de fixation pour le substrat (site catalytique, ou site actif) et au 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE Enzymologie moins un site de fixation pour un modulateur (site régulateur). Le changement conformationnel est aussi appelé "transition allostérique". site enzymes catalytique et le site régulateur peuvent être sur la même sous-unité protéique, ou sur 4.3.LeLes allostériques des sous-unités différentes. Les modulateurs peuvent jouer le rôle d'activateurs ou 4.3.1. Caractéristiques structurales d’inhibiteurs, et chaque modulateur peut posséder son propre site. Les enzymes allostériques catalysent très souvent les étapes clé des chaînes métaboliques, qui doivent être finement régulées, exemple de façon : étapes-clé des chaînespar métaboliques → régulation fine et rapide - catalysent - positive par un ou plusieurs activateurs, en particulier par le substrat lui-même - négative par un ou plusieurs inhibiteurs, en particulier par le produit final de la voie - régulation positive : activateur(s), en particulier substrat lui-même métabolique : on parle alors de rétro-inhibition ou de rétro-contrôle négatif. L’enzyme se transforme (modification conformationnelle) de sa forme active R en forme inactive T. négative : inhibiteur(s), en particulier produit final de la voie - régulation Ainsi, la voie métabolique entière est activée par la présence du substrat initial et inhibée = quand rétro-inhibition, négatif son produit rétro-contrôle final est abondant. effet effecteur particularité homotrope positif substrat S de l’enzyme favorise sa propre transformation hétérotrope positif activateur allostérique A de l’enzyme pas d’analogie structurale avec S hétérotrope négatif inhibiteur allostérique I de l’enzyme pas d’analogie structurale avec S La cinétique des enzymes allostériques ne suit plus l'équation de Michaelis-Menten. Elle → siest le tout produit final de la voieàmétabolique est abondant, la voiesur entière sera inhibée par inhibition des à fait comparable celle de fixation de l'oxygène l'hémoglobine. étapes clé (dont d’engagement) La courbe de laétape vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat est une sigmoïde, qui traduit le phénomène de coopérativité : les changements dans la structure d'une sous52 unité protéique se traduisent par des changements dans la structure des autres sous-unités, à Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE 19 4.3. Les enzymes allostériques symétrique peut être considéré comme un cas limite, tout ou rien, du m 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques réalité, le mécanisme précis des interactions allostériques n’a pas été é otéines allostériques présentant des propriétés - cinétique allostérique ≠ cinétique michaelienne T "inactive" nir une liaison réversible, non covalente, d’une - comparable à la fixation de O2 sur Hb (≠ enzyme) R "active" ur, ou effecteur, allostérique. Le terme allostérique rme.-Les enzymes allostériques prennent une autre courbe sigmoïde : phénomène de coopérativité ite de la liaison du modulateur. Ce sont des protéines → transmission des changements conformationnels d’une sous-unité à l’autre sieurs → sous-unités. existe au moins un site de fixation grâceIl aux interactions non covalentes à l’interface entre les sous-unités et au moins un site de fixation (spécifique) pour un ains cas, le site régulateur et le site actif sont sur des ! V rs des enzymes allostériques peuvent être des urs. 2 types d’enzymes allostériques : Vma x système V : rares rare,-des enzymes allostériques dits du système V, pour → Vpar=unef([S]) (≃des enzymes michaeliennes) représentée hyperbolehyperbole (comme dans le cas → Vmax varie en présence d’effecteur des enzymes allostériques (enzymes du système K), si Vma x 2 , non pas une hyperbole, mais une courbe sigmoïde, système K : les plus fréquentes V = f([S]) sigmoïde ons de → S suffisantes. Bien qu’il existe sur la courbe → K1/2 en présence d’effecteur on en substrat pour varie laquelle la vitesse est égale à la n de -l’oxygène sur l’hémoglobine. La saturation est tout pas correct de l’appeler KM, puisque l’enzyme n’est pas s S0,5 ou K0,5 (K1/2) pour désigner cette concentration de K 1/ 2 V enzyme allostérique du système K [S] 53 mme dans le cas des enzymes michaeliennes) S+A S+I ystème K : V = f([S]) est une courbe sigmoïde, leur cinétique ne suit plus Biotech 1V - 2016-2017 ichaelis-Menten. ma x 2 4. CONTRÔLE Enzymologie DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE V aractéristiques cinétiques des enzymes allostériques 4.3. Les enzymes allostériques 4.3.2.1. Les enzymes allostériques de type K [S] K 1/ 2 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques est saturée, la vitesse de catalyse est maximale (Vmax). Vma x ntration de substrat qui permet d'atteindre la moitié de la vitesse maximale : du Km des enzymes michaeliennes. ENZYMES ALLOSTÉRIQUES DE TYPE K bstrat, l’état T prédomine (T possède peu d’affinité pour S). e rôle de modulateur positif : il favorise sa propre fixation. x 2 Vmax : vitesse maximale à saturation de l’enzyme -Vma tivateur ou d'un inhibiteur allostérique modifie l'affinité de l'enzyme pour qui permet Vmax/2 (équivalent Km pour les enzymes michaeliennes) -K donc le1/2 K1/2:) [S] : l’affinité pour le d’atteindre substrat diminue en présence d’un inhibiteur augmente), elle augmente en présence d’un activateur allostérique (K1/2 - en absence de substrat : forme T prédominante (faible affinité pour S) effecteur → modification depeut l’affinité du K1/2) - liaison d’un ncentrations d’activateurs sont fortes, la courbe parfois(et devenir [S] e "pseudo-hyperbolique").K 1/2 V Vma x - inhibiteur : affinité ↓ K1/2 ↑ + activateur S+A +S inhibiteur +I - activateur : affinité ↑ K1/2 ↓ Vma x 2 - forte activation : “pseudo-hyperbole” K 1/2 [S] - dans tous les cas : Vmax inchangée ! ariations de la concentration en substrat permettent une adaptation très fine enzymatique pour les enzymes allostériques par rapport aux enzymes 54 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE 4.3. Les enzymes allostériques 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques MODÈLE DE L’ASPARTATE TRANSCARBAMYLASE ATCase (type K) (E. Coli) bases pyrimidiques C, T, U - étape clé synthèse des bases pyrimidiques aspartate + carbamoyl-phosphate ATCase carbamoyl-L aspartate bases puriques A, G ATP, GTP, CTP, TTP et UTP doivent être disponibles en quantités équivalentes dans la cellule bases pyrimidiques Pi - inhibée par CTP (pyrimidique, produit final de la voie) → Vmax inchangée diminution affinité pour substrats - activée par ATP (purique) → il faut rétablir l’équilibre entre nucléotides 55 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE Contrôle de l ’activité des enzymes (7) E27 4.3. Les enzymes allostériques Les enzymes allostériques (4) 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des(ATCase) enzymes allostériques Mécanisme d’‛action de l’aspartate transcarbamoylase (2) MODÈLE DE L’ Comme l’hémoglobine, l’ATCase présente deux états extrêmes. Un état T et un état R et un grand nombre d’états intermédiaires. L’état précis de l’enzyme dépend des rapports de concentrations des substrats, de l’ATP et du TRANSCARBAMYLASE CTP. ASPARTATE ATCase (type K) (E. Coli) L’état T est défavorable à la catalyse et est stabilisé par le CTP. L’ état R est favorable à la catalyse et est stabilisé par l’ATP ou les substrats. C R R C état T état R La fixation sur une sous-unité régulatrice d’un modulateur positif écarte les sous unités catalytiques en les faisant pivoter autour d’un axe de symétrie 3. Ce changement conformationnel les rend plus actives. La fixation d’un modulateur négatif a l’effet inverse. - 12 sous-unités : - 6 sous-unités catalytiques : fixation des substrats - 6 sous-unités régulatrices : fixation ATP ou CTP (sites distincts) - 2 états extrêmes (grand nombre d’intermédiaires) - état tendu T : défavorable à la catalyse, stabilisé par CTP - état relâché R : favorable à la catalyse, stabilisé par ATP → liaison ATP (activateur) : les sous-unités pivotent autour d’un axe et s’écartent → liaison CTP (inhibiteur) : effet inverse 56 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE 4.3. Les enzymes allostériques 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques ENZYMES ALLOSTÉRIQUES DE TYPE V !"#$!%&$!&'()*&$!#++,$-./012&$!%&!!"#$%&% ' - passage d’une forme à l’autre sans changement d’affinité pour le substrat ($%)*+)!,-!%.%&/%0-,1$%$!%2/%-##-,$3!%42 5678%,$)!$%#,$)9*$%:;3)!-3!% - Vmax diminue, K1/2 pratiquement constant 11 57 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE 4.3. Les enzymes allostériques 4.3.3. Les deux modèles de l’allostérie 2 états T R état tendu T état relâché R 2 modèles pour la transition allostérique T ! R - modèle du “tout ou rien” (ou modèle symétrique, transition concertée) T R modèle de Monod, Wyman et Changeux T T T T T T T T R R R R R R R R O2 R R R O2 R R R O2 O2 R R O2 O2 R R O2 O2 R O2 O2 O2 R O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 - modèle séquentiel (modèle de Koshland) T T T T T T T T T O2 T T T O2 T T O2 O2 T T O2 O2 T T O2 O2 O2 T O2 O2 O2 T O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 58 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE 4.3. Les enzymes allostériques L’ALLOSTÉRIE EN BREF - les critères de l’allostérie : - la protéine possède plusieurs sous-unités, elle est multimérique - il existe plusieurs sites de liaison pour un ou plusieurs ligand(s) - la fixation d’un premier ligand modifie la liaison des autres ligands - tout effecteur d’une enzyme allostérique qui modifie l’équilibre entre R et T est un effecteur allostérique de l’enzyme allostérique - tout effecteur d’une enzyme allostérique qui laisse cet équilibre inchangé est un effecteur non allostérique de l’enzyme allostérique 59 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie SOMMAIRE 1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique 3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs 4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques 5. Les cofacteurs et coenzymes 5.1. Les deux types de coenzymes 5.2. Exemples de coenzymes d’oxydoréduction 5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements 6. Les isoenzymes 60 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 5. LES COFACTEURS ET COENZYMES 2 TYPES DE COFACTEURS obligatoirement partie protéique apoenzyme + éventuellement - transporte ou complète un substrat - accepte un produit - participe à la structure de l’enzyme coenzymes petites molécules organiques, souvent dérivées de vitamines holoenzyme pour certaines enzymes, cofacteur non protéique nécessaire à l’activité cofacteurs inorganiques = ions métalliques (métallo-enzymes) : cations divalents (Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+,…) activateurs ou inhibiteurs font partie du site actif 61 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 5. LES COFACTEURS ET COENZYMES 5.1. Les deux types de coenzymes interviennent dans des réactions : - d’oxydoréduction : transfert d’électrons et de protons (oxydoréductases) - de transfert de groupements : mono-carbonés, amines (transférases) - de formation de liaisons covalentes (ligases) - éventuellement d’isomérisation (isomérases) coenzymes petites molécules organiques, souvent dérivées de vitamines coenzymes libres = cosubstrats - dissociation du site actif à chaque réaction catalysée - stoechiométrique : [coenzyme] ≃ [substrat] - régénérés dans une réaction annexe - 1 fonction spécifique : 1 type de réaction, même coenzyme pour plusieurs apoenzymes - ex : NAD+ (accepteur d’électrons) coenzymes liés = groupements prosthétiques - liés de façon permanente à l’apoenzyme ne quittent pas la protéine après la catalyse régénérés au cours de la réaction catalytique : [coenzyme] ≃ [enzyme] ≫ [substrat] - ex : FAD accepteur d’électrons) il existe plus de 1000 enzymes différentes, mais seulement une vingtaine de coenzymes 62 - inorganiques : ce sont les ions métalliques Biotech 1 - 2016-2017: ils sont appelés coenzymes. On distingue : - organiques 5. LES COFACTEURS ET COENZYMES Enzymologie - les coenzymes libres qui se dissocient du site actif de l’enzyme à la fin de la réaction : ils sont appelés cosubstrats 5.2. Exemples de coenzymes - les coenzymes liés qui d’oxydoréduction restent associés à l’enzyme après la catalyse : ils sont appelés groupements prosthétiques. transferts de protons et d’électrons de coenzymes d’oxydo-réduction 5.2. Exemples Ils catalysent le transfert de protons et d’électrons. nom transfert type caractéristiques - cosubstrats des déshydrogénases - NADH pour les réactions du catabolisme - NADPH pour les réactions de biosynthèse nicotinamides NAD+ et NADP+ 2 e- et 2 H+ libres flavines (FAD, FMN) 2 e- et 2 H+ lié - oxydoréduction - coenzymes des flavo-protéines, cytochromes acide lipoïque 2 e- et 2 H+ lié coenzyme des décarboxylations oxydatives ubiquinone (CoQ) 2 e- et 2 H+ libre chaîne respiratoire mitochondriale hème 1 e- lié coenzyme des hémoprotéines (ex : hémoglobine, cytochromes) 5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements Selon le coenzyme, les groupements transférés peuvent être : - un groupement carboné - un groupement amine 63 1 e- hème Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 5. LES lié coenzyme des hémoprotéines (ex : hémoglobine, cytochromes) COFACTEURS ET COENZYMES 5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements 5.3. deles coenzymes de transfert de groupements SelonExemples le coenzyme, groupements transférés peuvent être : - un groupement carboné - un groupement amine transferts de groupements carbonés, amine, phosphates - un groupement phosphorylé. nom nucléosides phosphates transfert - phosphate - base + ribose - base + ribose - coenzyme A type caractéristiques libre phosphotransférases nucléotidyl-transférases ligases libre acyltransférases CoA-transférases monoP base + ribose diP groupement acyle thiamine pyrophosphate résidus aldéhydes phosphate de pyridoxal exemples d’enzymes décarboxylases oxoacide déshydrogénases transcétolases lié vitamine B1 (Béribéri) porc, graines, poisson groupements amines lié vitamine B6 viande, graines, légumes biotine CO2 libre vitamine H oeufs, foie, légumes carboxylases acide tétrahydrofolique groupements monocarbonés vitamine B9 légumes C1 transférases transaminases 64 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie SOMMAIRE 1. Généralités 2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique 3. La cinétique enzymatique simple 4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques 5. Les cofacteurs et coenzymes 5.1. Les deux types de coenzymes 5.2. Exemples de coenzymes d’oxydoréduction 5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements 6. Les isoenzymes 6.1. Définition 6.2. Propriétés : exemple de la LDH 6.3. Importance médicale 65 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 6. LES ISOENZYMES 6.1. Définition enzymes de structures différentes, qui catalysent la même réaction chimique : - séparables par électrophorèse ou chromatographie - spécifiques des tissus chez les eucaryotes - propriétés différentes (affinité pour le substrat) → permettent une régulation fine du métabolisme 6.2. Propriétés : exemple de la LDH - catalyse étape cytosolique du métabolisme du glucose en conditions anaérobies : - réduction réversible du pyruvate en lactate - couplée à l’oxydation d’un NADH, H+ en NAD+ O- O NADH, H+ C C O- NAD+ O C O CH3 pyruvate lactate déshydrogénase LDH HC OH CH3 lactate 66 Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie 6. LES 6.2. Propriétés : exemple de la LDH ISOENZYMES 3,*#%(6'2*+,-*'-(.,)/01,-** +9* *+,*%$&** $"# $&!# $%!%# $!&# - 4 chaînes polypeptidiques $9*7(9%-*+9*+":,2(##,1,)&* !"# '(###')##'*##+*%##+%*##,-./01# - 2 types de chaînes : H dans le coeur, M dans le muscle - 5 formes possibles selon le développement ou!"#$%&'&'()*+,-*'-(.,)/01,-*+,*2$*345*,)*6()7&'()*+,-*(%8$),-! les organes - LDH1 coeur : H4 - LDH2 : H3M - LDH3 : H2M2 - LDH4 : HM3 - LDH5 muscle squelettique, foie : M4 6.3. Importance médicale → utilisation de certaines isoenzymes comme marqueurs de pathologies Exemple : augmentation de LDH2 et LDH3 en cas d’infarctus du myocarde 67
