UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires Unité de Physiologie Animale Rôle des cellules myéloïdes immatures + + GR1 CD11b dans le rejet du mastocytome P815 Lanaya Hanane Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Promoteur : Dr Muriel Moser - JUIN 2008 - Abstract The failure of the immune system to provide efficient protection against tumour cells has been considered as a major issue in immunology. It is now well established that inadequate function of the host immune system is one of the main mechanisms by which tumours escape from immune control contributing to the limited success of cancer immunotherapy. Several cell populations have been described which display immunosuppressive properties and may impede tumor-specific immunity. Among them, GR1+CD11b+ immature myeloid suppressor cells and CD4+CD25+ regulatory T cells seem to play an important role. These cells accumulate in the spleens of tumour bearing mice and patients with cancer and contribute to immunosuppression by inhibiting the function of CD8+ T cells and/or by promoting tumour angiogenesis. The aim of our work was to define the mechanisms by which a single dose of cyclophosphamide (CTX), a chemical agent commonly used in chemotherapy treatment, induces the rejection of established P815 mastocytoma. Our data show that CTX treatment leads to the selective loss of GR1medCD11b+ splenic myeloid cell producing TGF-β, a cytokine which is known to suppress antitumoral response. Furthermore, injection of CTX causes a decrease in the number of naturally occurring regulatory T cells (CD4+CD25+Foxp3+) in the spleen and the tumor. Finally, CTX treatment induces the differentiation of GR1highCD11b+ splenic myeloid cells into mature GR1highCD11b+CD11c+ (possibly dendritic cells?) which express high levels of CD11c, MHC class II and CD86 molecules. Of note, these cells are mainly detected in tumour necrosis areas. Collectively, these results suggest that CTX prevents suppressive mechanisms and induces a population of CD11c+ myeloid cells which may present tumor antigens and activate T lymphocytes, an hypothesis in line with the requirement for CD4+ cells in CTX-induced long term resistance. 1 « Le mérite appartient à celui qui commence, même si le suivant fait mieux. » (Proverbe Arabe) « En vérité, le chemin importe peu, la volonté d’arriver suffit à tout. » (Le Mythe de Sisyphe, Albert Camus) Remerciements : Je remercie le Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture ainsi que le Télévie qui m’ont permis, par leur soutien financier, de réaliser ces cinq années de recherche scientifique. Je remercie le Dr Muriel Moser pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire. Je tiens à remercier spécialement le Professeur Jacques Urbain pour sa grande disponibilité, ses précieux conseils scientifiques et son encouragement. Je n’ai pas de plus jolis mots pour vous témoigner ma gratitude mais mon merci vient du plus profond de mon cœur. Merci infiniment de croire en mes capacités…Je remercie également sa charmante épouse. Merci Georgette pour ton aide et ta grande patience pour les longues expériences que je t’ai fait subir auprès de cette machine complexe. Merci Marjorie, pour ton aide technique, ta patience, ta persévérance… Ce fût un plaisir de collaborer et de travailler avec toi… Merci à mes compagnons de laboratoire pour les beaux moments passés durant ces années de thèse, pour vos conseils, pour votre bonne humeur et votre soutien… Merci à vous…Geoffroy, Virginie, Annesophie, Soraya, Fouad, Françoise, Fabienne, Isabelle, Delphine, Sébastien, Alice…et tous les autres qui se reconnaîtront… Merci Anna, Louis, Jacob et Sadia pour votre grande écoute, pour votre gentillesse et vos précieux encouragements… Je remercie du fond du cœur Mademoiselle Jacqueline Wautelet de m’avoir encouragée à poursuivre mes études à l’université et d’avoir fait confiance en mes capacités. Je remercie chaleureusement tous mes amis, toujours à mes côtés pour m’encourager…J’ai beaucoup de chance de vous avoir… Samira Ahanour, Lydia et Sina Ramechfar, Zhinus Jahangosha, Nathalie Demoulin, Stani Angoyi, Flavio Genco, Vafa Izadinia, Raouf Boudjemaa, Babak Yazdani, ainsi que Samandar Yazdani et tous les autres qui se reconnaîtront… Enfin, je remercie du fond du coeur ma famille pour son amour, pour sa grande patience durant ces derniers mois. Un grand merci à mes chers parents de m’avoir donné la chance d’arriver à ce moment et de me soutenir jusqu’au bout…Je tiens à remercier particulièrement mon frère Majd Lanaya pour toute sa générosité, son aide et son soutien dans les moments difficiles. Merci petit frère… Je dédie cette thèse à mon grand-père Haj Chahmoun Mohamed (1930 -2004). Merci de m’avoir dit que tu étais fier de moi avant que tu nous quittes subitement… 2 TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1. Généralités 1 2. Définitions 1 2.1 Les mastocytes 2.2 La mastocytose 2.2.1 Le mastocytome 2.2.1 Le mastocytome murin P815 3. La Réponse Immunitaire 3.1 Déclenchement d’une réponse immunitaire adaptative 4. L’Immunité Antitumorale 4.1 La surveillance immunitaire innée 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 Les Lymphocytes T γδ Les cellules NK et NKT Les cellules dendritiques tueuses productrices d’IFNγ (IKDC) Les cytokines et molécules effectrices de l’immunosurveillance 4.2 La surveillance immunitaire adaptative 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 Les différentes classes d’antigènes tumoraux Les cellules dendritiques Les lymphocytes T La synapse immunologique La cytotoxicité lymphocytaire 5. Mécanismes d’Echappement des tumeurs à l’immunosurveillance 5.1 Les Facteurs liés aux cellules tumorales 5.1.1 Perte ou diminution de l’expression des molécules du CMH I 5.1.2 Résistance des cellules tumorales à l’apoptose 5.1.3 Cytokines immunosuppressives sécrétées par la tumeur 5.2 Les Facteurs liés au dysfonctionnement cellulaire du système immunitaire 5.2.1 Tolérance immunitaire due aux cellules dendritiques 5.2.2 Tolérance immunitaire due aux lymphocytes T régulateurs 5.2.3 Tolérance immunitaire due aux cellules myéloïdes immatures 1 2 3 3 4 5 6 7 7 8 10 11 13 14 17 19 20 21 22 23 23 24 24 28 28 29 30 3 6. Intérêt Médical : des concepts au traitement des tumeurs 6.1 L’Immunothérapie 6.2 La Chimiothérapie 6.2.1 Le cyclophosphamide 34 34 37 BUT DU TRAVAIL 39 RESULTATS 40 1. Effet de l’injection de cellules dendritiques chargée de peptides tumoraux 2. Un traitement au cyclophosphamide induit le rejet du mastocytome P815 3. Analyse des populations immunes suite à l’administration de cyclophosphamide 3.1 3.2 3.3 3.4 Les cellules myéloïdes GR1+CD11b+ Les lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ Les cellules dendritiques CD11c+ 40 41 42 42 47 48 49 DISCUSSION 51 MATERIEL ET METHODES 61 BIBLIOGRAPHIE 69 ANNEXE 4 ABREVIATIONS : BAGE : Bladder antigen CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité CPA : Cellule Présentatrice d’Antigène CTL : Lymphocyte T cytotoxique CTLA-4 : Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 CTX : Cyclophosphamide DC : Dendritic Cell EBV : Epstein-Barr Virus EC : Endothelial Cell FASL : Fas Ligand GAGE : Gastric antigen GITR : Glucocorticoid Induced TNF Receptor GMCSF : Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor HAT : Histone-Acetyl Transferase HDAC : Histone-Déacetylase IDO : Indoleamine 2,3 Dioxygénase IFNγ : Interferon gamma IKDC : Interferon producing Killer Dendritic Cell IL : Interleukine iMC : immature Myeloid Cell IMQ : Imiquimod iNOS : inducible NO Synthase LAG-3 : Lymphocyte Activated Gene 3 LAK : Lymphokine Activated Killer LAP : Latency Associated Protein LB : Lymphocyte B LPS : Lipopolysaccharide LT : Lymphocyte T LTBP : Latent TGFβ Binding Protein MAGE : Melanoma antigen MCA : Méthylcholanthrène MDSC : Myeloid Derived Suppressor Cell NK : Natural Killer NKT : Natural Killer T cell RAGE : Renal antigen ROS : Reactive oxygen species TAA : Tumor Associated Antigen TAM : Tumor Associated Macrophage TAP : Transporter Associated with Antigen Processing TGFβ : Tumor Growth Factor beta TID : Tumor Infiltrating Dendritic cell 5 TIL : Tumor Infiltrating Lymphocyte TLR : Toll Like Receptor TNFα : Tumor Necrosis Factor alpha TRAIL : Tumor necrosis factor Related Apoptosis Inducing Ligand Treg : Regulatory T cell (Lymphocyte T régulateur) VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor 6 Introduction 7 1. GÉNÉRALITÉS Depuis leur apparition sur la terre, les êtres vivants doivent faire face aux attaques des pathogènes qui se trouvent dans leur environnement. Par conséquent, le système immunitaire est un mode de défense des organismes qui a dû se développer très tôt au cours de l’évolution. C’est au savant russe d’origine ukrainienne Elie Metchnikoff (1845-1916) que l’on doit la première description, en 1883, de cellules capables d’incorporer et de digérer dans leur cytoplasme de particules étrangères qu’il baptise phagocytes (de phagein qui signifie manger et kytos, cellule) et attribue leur activité le terme de phagocytose. Selon une logique darwinienne, Metchnikoff a pensé que ce mécanisme d’ingestion (phagocytose) observé, au départ, chez de nombreux êtres unicellulaires comme l’amibe aurait évolué chez les vertébrés pour constituer le premier mécanisme immunitaire de défense contre les agressions microbiennes. Ces cellules phagocytaires sont une composante importante de l’immunité naturelle. Les premières observations de la protection conférée par une maladie antérieure lors de la résurgence de la même maladie ne peuvent s’expliquer par l’immunité naturelle. Il s’agit ici d’une immunité acquise qui protège l’individu spécifiquement contre les agents pathogènes qu’il a rencontrés auparavant. C’est au savant Paul Ehrlich (1854-1915) que l’on doit ces observations anciennes, il développe la théorie de la réponse immunitaire basée sur l’interaction entre l’antigène (particule étrangère) et l’anticorps (molécule qui reconnaît l’antigène). Cette autre catégorie de la réponse immune est apparue beaucoup plus tard au cours de l’évolution. En 1908, les travaux sur l’immunité d’Elie Metchnikoff et de Paul Ehrlich leur valurent le prix Nobel de Médecine et ont conduit actuellement à la distinction classique entre la réponse immunitaire innée (ou naturelle) et la réponse immunitaire adaptative. 2. DÉFINITIONS 2.1 LES MASTOCYTES Les mastocytes ont été découverts par Paul Ehrlich en 1878 pendant sa thèse de doctorat. Il a observé que ces cellules se localisent préférentiellement au niveau des vaisseaux sanguins et des nerfs aussi bien dans des situations inflammatoires que cancéreuses. Les mastocytes sont des cellules mononucléées situées dans le tissu conjonctif qui interviennent dans les processus de cicatrisation et d’inflammation. 8 Figure 1 : Schéma expliquant l'éventuel rôle des mastocytes dans la tumeur. • Les mastocytes pourraient être recrutés par chimiotactisme dans le site tumoral afin de sécréter des facteurs angiogéniques (histamine, VEGF, héparine, IL-8) qui favorisent la formation des vaisseaux sanguins ainsi que la carcinogenèse. • Les mastocytes pourraient également sécréter du TNFα et autres cytokines capables d'induire l'apoptose des cellules tumorales. "Mast cells : the JEKYLL and HYDE of tumor growth : Theoharides C." 9 Il s’agit de cellules mesurant entre 20 et 30 microns de diamètre qui possèdent un noyau volumineux et massif dont la périphérie est irrégulière et qui est généralement masqué par la présence de granulations métachromatiques. L’origine du mastocyte est peu connue. Selon certaines études, les mastocytes dériveraient de cellules indifférenciées hématopoïétiques issus de la moëlle osseuse qui migrent vers les tissus périphériques afin d’achever leur maturation 1. Les mastocytes jouent un rôle important dans l’inflammation et les réactions d’allergie, en particulier, dans les réactions d’hypersensibilité de type I. Des études scientifiques ont montré que les mastocytes peuvent également jouer un rôle dans l’angiogenèse et dans la carcinogenèse 2-4. Bien que le rôle exact des mastocytes dans les processus angiogéniques soit mal connu jusqu’à nos jours, plusieurs études semblent montrer que ces cellules peuvent favoriser le développement de la tumeur vers le stade métastatique. En effet, des rapports scientifiques ont montré l’accumulation de mastocytes dans le stroma de plusieurs types de tumeurs et en particulier dans les carcinomes et suggèrent la participation des facteurs produits par les mastocytes dans le processus de carcinogenèse. L’héparine, l’interleukine-8 ainsi que le facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF) sécrétés par les mastocytes favorisent la néovascularisation, d’autre part, les mastocytes produisent de l’histamine qui joue un rôle immunosuppresseur de la réponse immune. Par exemples, l’histamine inhibe la présentation de l’antigène par les cellules dendritiques, l’histamine régule la réponse immune vers une réponse de type TH2 ou vers une tolérance en induisant entre autre la production d’IL-10 par les cellules dendritiques et les lymphocytes Th2 5,6. Les mastocytes sécrètent également des facteurs mitogènes, par exemple le facteur de croissance dérivé de plaquettes (PDGF) ainsi que des protéases qui favorisent le remodelage tissulaire 2,3,7 . Cependant, pour des raisons inconnues, les mastocytes peuvent induire l’apoptose des cellules tumorales en sécrétant le facteur de nécrose tumorale (TNFα) mais aussi induire la thrombose des vaisseaux sanguins en produisant de la protamine qui neutralise l’effet de l’héparine 4(Figure 1). 2.2 LA MASTOCYTOSE La mastocytose est une maladie qui se caractérise par l’accumulation de nombreux mastocytes. Nous distinguons deux types de mastocytose : la mastocytose cutanée ou mastocytome et la mastocytose systémique. 10 Figure 2 : Photo d'un patient souffrant d'un mastocytome cutané. Il s'agit d'une tumeur bénigne localisée sur la peau qui se présente sous la forme d'un nodule brun/rouge. (dictionnaire médical en ligne : http //dermis.net) 11 2.2.1 Le mastocytome (mastocytose cutanée) Le mastocytome est la transformation tumorale des mastocytes, le plus souvent à localisation cutanée ou sous-cutanée qui ressemble à de l’urticaire. Il s’agit de tumeurs bénignes sous forme de nodules brun/rouge (Figure 2) apparaissant généralement chez les nourrissons ou les jeunes enfants. Ces tumeurs se composent essentiellement d’infiltrats denses de cellules inflammatoires telles que les mastocytes, les neutrophiles et les éosinophiles. Les lésions peuvent être isolées ou multiples et se transformer en papules oedémateuses. L’examen clinique du patient montre ce que l’on appelle un signe pathognomonique c’est-à-dire une caractéristique permettant de diagnostiquer sans ambiguïté la maladie. Le signe de Darier qui est l’apparition d’une tuméfaction après avoir pratiqué une friction rigoureuse de la peau du patient permet de diagnostiquer de manière univoque le mastocytome. Ces lésions cutanées peuvent régresser spontanément en quelques années mais dans certains cas, elles peuvent persister chez l’adulte. Pour des raisons encore inconnues, le mastocytome peut évoluer vers une mastocytose systémique qui est la prolifération maligne des mastocytes au niveau de la moëlle osseuse, du foie, de l’estomac et de l’intestin : sarcomes à mastocytes, réticulose mastocytaire maligne, leucémies, métastases pulmonaires. 2.2.2 Le mastocytome murin P815 Le mastocytome murin P815 (qui est une tumeur d’une souris DBA/2 induite par un agent chimique, le méthylcholanthrène) est un modèle expérimental tumoral utilisé pour l’étude in vivo et in vitro de réponses immunes antitumorales. L’expérience de clonage des lymphocytes T spécifiques des antigènes tumoraux a consisté à cultiver des cellules tumorales provenant d’une biopsie, à les irradier, puis à les mélanger à des lymphocytes circulants du même individu en présence d’interleukine-2. Les lymphocytes dirigés contre un antigène tumoral prolifèrent et se différencient. Ils sont alors clonés et testés pour leur capacité de lyser certaines cellules tumorales issues de la culture primaire 8. Les clones T ont permis de définir les antigènes exprimés par les cellules P815 à savoir les antigènes P815A, P815B, P815C, P815D et P815E qui sont présentés par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité H-2Ld 9-11. Une étude a montré que l’antigène P815A, en particulier, est l’antigène le plus fréquemment perdu par les cellules tumorales P815 et permet donc à celles-ci d’échapper à la réponse antitumorale. Cette observation suggère que l’antigène P815A joue un rôle majeur dans le rejet du mastocytome médié par les lymphocytes T cytotoxiques 9. En 1991, une étude portant sur l’identification des gènes codant 12 pour ces antigènes tumoraux a permis de découvrir le gène P1A 12. Celui-ci code pour l’antigène P815AB, un peptide contenant les épitopes antigéniques P815A et P815B 13-15 . L’expression du gène P1A est silencieux dans les tissus normaux à l’exception des cellules germinales mâles et le placenta. Les cellules néotransformées expriment ce gène non muté qui se retrouve dans plusieurs types de tumeurs. Le mastocytome P815 constitue un excellent modèle préclinique pour l’étude du mélanome humain. En effet, l’expression du gène P1A est similaire aux gènes humains de type MAGE (exprimés par le mélanome et autres types de tumeurs) qui sont également silencieux dans les tissus normaux sauf les cellules germinales mâles 16-18. Par contre, l’antigène P815E qui est aussi un antigène immunodominant 15,19 résulte d’une mutation ponctuelle du gène et n’est donc pas exprimé par d’autres types de tumeurs. Cette mutation est responsable de l’oncogenèse accompagnée d’une prolifération incontrôlée des cellules tumorales et d’une inhibition de l’apoptose 20,21. 3. LA RÉPONSE IMMUNITAIRE On appelle la réponse immunitaire l’activation des mécanismes du système immunitaire face à une agression de l’organisme. Les mécanismes de défense du système immunitaire sont : 1. Les mécanismes de défense non spécifiques ou la réponse immunitaire innée (naturelle) dont les composants sont la peau, les muqueuses, les cellules phagocytaires (macrophages, granulocytes), les cellules naturelles tueuses (NK), le système du complément, etc.. 2. Les mécanismes de défense spécifiques ou la réponse immunitaire adaptative : dont les composants cellulaires sont les cellules dendritiques (DC), les lymphocytes T (LT), et les lymphocytes B. Les principaux composants cellulaires de ces deux types de réponses immunes à savoir les cellules phagocytaires, les NK, les DC ainsi que les lymphocytes T sont largement explicités dans le point suivant intitulé l’immunité antitumorale. Toutefois, les lymphocytes B, qui sont les cellules productrices d’anticorps jouant un rôle prépondérant dans l’immunité humorale, ne seront pas présentés dans ce travail. Nous aborderons, dans le paragraphe suivant, un bref rappel de la mise en place d’une réponse immunitaire adaptative. 13 3.1 DÉCLENCHEMENT D’UNE RÉPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE Plusieurs études ont montré que les cellules dendritiques sont les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) les plus efficaces pour engendrer des effecteurs T spécifiques de l’antigène. Ces cellules jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immune. Dans un premier temps, les DC immatures disséminées dans la plupart des tissus périphériques jouent un rôle de surveillance. A ce stade, les DC ont une grande aptitude à capturer les antigènes exogènes par endocytose ou par macropinocytose. Sous l’influence de signaux de « danger » d’origine microbienne tels que le lipopolysaccharide (LPS) ou d’origine cellulaire (stress provoquant la libération de protéines de choc thermique), les DC ayant capturé l’antigène deviennent matures et migrent de la périphérie vers les organes lymphoïdes secondaires où elles peuvent présenter l’antigène dans le contexte des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et ainsi activer les lymphocytes T naïfs (lymphocytes n’ayant jamais rencontré l’antigène). Les lymphocytes T CD4+ reconnaissent les antigènes associés aux molécules du CMH de classe II, tandis que les lymphocytes T CD8+ reconnaissent les antigènes associés aux molécules du CMH de classe I. Ces lymphocytes T ne seront activés que si le premier signal (reconnaissance du peptide antigénique) est accompagné de signaux dits de costimulation. Ce second signal se traduit par l’interaction des molécules de costimulation (CD86, CD80) présentes à la surface des DC avec la molécule CD28 des LT. Les LT CD8+ activés sont capables de lyser des cellules qui portent l’antigène dont ils sont spécifiques, d’où leur nom de lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Quant aux LT CD4+ activés, connus sous le nom de lymphocytes T helper (Th) ou auxiliaires, ceux-ci jouent un rôle très important dans la régulation de la réponse immune. En effet, les LT CD4+ peuvent se différencier soit en cellules Th1 productrices d’interféron gamma (IFNγ) et de l’interleukine-2 (IL-2) nécessaire à la prolifération des LT CD8+, soit en cellules Th2 qui sécrètent principalement de l’interleukine-4 (IL-4), de l’interleukine-10 (IL-10) et de l’interleukine-13 (IL-13). De nombreux travaux ont démontré que ces deux types de LT sont capables de s’inhiber mutuellement. Les cytokines Th1 inhibent le développement des lymphocytes Th2, alors que les LT Th2 inhibent la réponse immune Th1. Bien que les facteurs déterminant la différenciation cellulaire de type Th1 ou Th2 soient encore mal connus, il semble que les cytokines produites par les DC influencent l’orientation de la réponse immune. L’engagement des molécules de costimulation CD80/CD86 sur leur ligand ainsi que la production d’IFNγ et d’interleukine-12 (IL-12) au début de la réponse immune par les DC, favorisent la différenciation des cellules Th0 en cellules Th1 productrices d’ IFNγ qui inhibe les réponses Th2 14 22-25 . Par contre, la présence d’IL-10 éventuellement produite par des DC et du facteur de croissance tumorale TGFβ favorise les réponses Th2 directement 26 et/ou indirectement en inhibant les réponses Th1. A ce jour, plusieurs rapports suggèrent que la dichotomie Th1-Th2 serait désormais désuète et qu’il existerait d’autres voies de différenciation pour les cellules T CD4+. En effet, plusieurs auteurs ont montré l’existence de cellules Th17 qui se développent en présence d’interleukine-23 (IL-23) mais aussi en présence d’IL-6 et du facteur de croissance TGFβ (Tumor Growth Factor Beta) 27 . Cette sous-population de cellules T CD4+ produit de l’interleukine-17 (IL-17), une cytokine proinflammatoire dont l’expression est augmentée chez les patients souffrant d’allergie chronique et de maladies autoimmunes 28-31. 4. L’IMMUNITÉ ANTITUMORALE La découverte de l’immunité antitumorale a débuté par les observations de William Coley en 1893 32 . Il observe chez un de ses patients une régression tumorale complète à la suite d’une injection à base d’extraits de bactéries pyogènes (streptocoque). Le système immunitaire a été capable de mettre en place une réponse antitumorale efficace après une activation non spécifique. Mais les toxines de Coley (inoculation de germes inactivés), n’aboutissant qu’à des résultats sporadiques et partiels, sont abandonnées à partir de 1910. En 1909, Paul Ehrlich introduit la notion d’une protection de l’hôte contre les cellules néoplasiques par le système immunitaire. Cette hypothèse n’a pas pu être vérifiée expérimentalement faute de connaissances moléculaires et cellulaires en immunité. Ce n’est que 50 ans plus tard, grâce aux développements d’outils immunologiques, que le concept d’immunosurveillance a été élaboré et vérifié expérimentalement par Burnet et Thomas. Ils suggèrent que les lymphocytes agissent comme des sentinelles en reconnaissant et éliminant continuellement les cellules néotransformées 33-38 . Le développement d’une tumeur résulterait d’une incapacité du système immunitaire à reconnaître et détruire certaines cellules tumorales. Cette notion d’immunosurveillance a évolué parallèlement aux progrès majeurs réalisés en immunologie. Actuellement, on parle « d’immunoediting » des cellules tumorales 39-42 . Ce processus complexe est divisé en trois phases (Figure 3) : la phase d’élimination, la phase d’équilibre ainsi que la phase d’échappement. La phase d’élimination correspond à la théorie initiale de l’immunosurveillance qui stipule que le système immunitaire détecte et élimine les cellules néotransformées. 15 Figure 3 : Les trois phases du "Cancer immunoediting". Ce processus complexe se divisant en 3 phases commence par la phase d'élimination qui se caractérise par le fait que le système immunitaire détecte et élimine les cellules anormales. Cette phase peut être incomplète lorsque toutes les cellules tumorales ne sont pas éliminées, il existe donc une phase d'équilibre. Durant cette phase d'équilibre, des mutations au niveau de l'AND, par exemple, peuvent survenir et donner naissance à de nouveaux variants de cellules qui échappent au contrôle du système immunitaire (la phase d'échappement). "Interferons, immunity and cancer immunoediting : Dunn GP, Koebel MC, Schreiber RD" 16 Cependant, cette phase d’élimination peut être incomplète lorsque les cellules tumorales ne sont pas toutes éliminées. Il y a donc une phase d’équilibre entre le système immunitaire et le développement des cellules tumorales. Durant cette phase d’équilibre, des mutations de l’ADN et/ou des changements d’expression de gènes au sein des cellules tumorales peuvent survenir et donner naissance à d’autres variants cellulaires (immunosélection). A ce stade, le système immunitaire peut encore éliminer les nouveaux clones tumoraux et contrôler la progression de la tumeur. Il se peut que les nouveaux variants de cellules tumorales résistent à la réponse antitumorale mise en place par le système immunitaire qui, dès lors, n’est plus capable de contrôler la croissance de la tumeur. Ce processus constitue la phase d’échappement. L’immunosurveillance serait un processus hétérogène nécessitant l’action de différents effecteurs du système immunitaire 43 . Dans ce processus, l’immunité innée et l’immunité adaptative sont toutes les deux impliquées et collaborent pour éliminer les cellules tumorales. Dans cette première partie, nous discuterons des rôles respectifs de l’immunité innée et de l’immunité acquise, et plus particulièrement de leurs cellules effectrices respectives dans la surveillance immunitaire antitumorale. 4.1 LA SURVEILLANCE IMMUNITAIRE INNÉE Les cellules impliquées dans l’immunité innée ou naturelle constituent une première barrière pour éliminer les cellules anormales, en particulier les cellules tumorales 44. Cette réponse antitumorale innée est assurée par différentes cellules effectrices dont les principales sont les lymphocytes Tγδ, les cellules tueuses naturelles NK (Natural Killer) et les cellules NKT exprimant un récepteur T ainsi que des marqueurs des cellules NK. Les macrophages participent aussi à la surveillance immune antitumorale 45. Il existe plusieurs mécanismes différents intervenant dans l’immunosurveillance des tumeurs qui nous permettent de comprendre pourquoi une souris « nude » dépourvue de thymus et donc des cellules T conventionnelles, ne développe pas plus de tumeurs spontanées ou induites qu’une souris sauvage. Afin de mieux comprendre cette observation expérimentale, nous présentons, dans les points suivants, les différents mécanismes du système immunitaire innée qui jouent un rôle important dans l’immunosurveillance des tumeurs. 4.1.1 Les lymphocytes Tγδ Une classe particulière de lymphocytes T intra épithéliaux, exprimant le récepteur γδ, semble jouer un rôle important dans l’immunosurveillance vis-à-vis des tumeurs. En effet, le rôle des cellules T 17 γδ dans la défense antitumorale a été mis en évidence in vitro par leur capacité à reconnaître et à lyser diverses lignées tumorales ou cellules tumorales isolées de patients (carcinomes du sein et de l’ovaire notamment) 46 et in vivo dans des modèles de souris athymiques reconstituées avec des lymphocytes T γδ purifiés de donneurs sains 47. On distingue au moins deux sous-ensembles de T γδ (Vδ1, phénotype « résident » dans l’épithélium et Vδ2, phénotype « circulant » dans le sang) qui chez l’homme sont associés à la lutte contre les cancers hématologiques en plus des cancers cutanés 48 . Les lymphocytes T γδépondent r à des molécules de petit poids moléculaire, non peptidiques, généralement phosphatées, notamment des dérivés phosphorylés de la thymidine (Vδ2) impliqués dans la réparation de l’ADN 48 . Ces lymphocytes reconnaissent également des molécules de choc thermique (Vδ1 et Vδ2) et les pro téines MIC-A et MIC-B (Vδ1) 46. MIC-A et MIC-B sont deux molécules humaines du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) qui sont induites par le stress. Elles sont présentes sur l’épithélium gastro-intestinal, mais sont surexprimées dans un grand nombre de tumeurs. MIC-A et MIC-B interagissent directement avec NKG2D, un récepteur de costimulation exprimé par les cellules NK, NKT et Tγδ 49. Les souris ne possèdent pas de gènes homologues à MIC-A et MIC-B. En revanche, le récepteur NKG2D murin se lie à d’autres protéines telles que H60 et les cinq isoformes de Rae-1. Les molécules Rae-1 et H60 ne sont pas exprimées par les cellules de la peau, mais leur expression est induite après exposition à des carcinogènes ou à un stress. Il a été montré que l’expression ectopique de Rae-1 ou de H60 dans une série de tumeurs murines conduit au rejet des tumeurs 50 . Les travaux de Girardi et al. 51 montrent que des souris transgéniques n’ayant pas de lymphocytes T γδ (TCR γ -/) sont particulièrement sensibles à certains agents mutagènes et développent plus de tumeurs cutanées que les souris de phénotype sauvage. Cette étude suggère que l’effet antitumoral des lymphocytes T γδ est associé à l’engagement du récepteur NKG2D des lymphocytes T γδ par les molécules Rae-1 et H60 exprimées à la surface des cellules tumorales chez la souris. Les lymphocytes T γδ semblent doncêtre des effecteurs cellulaires importants susceptibles de limi ter le développement des tumeurs primaires. 4.1.2 Les cellules NK et NKT De nombreuses études in vitro ont démontré la capacité des cellules NK à lyser les cellules tumorales et particulièrement les cellules tumorales ayant perdu l’expression des molécules du 52 complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH-I) . De plus, le rôle des cellules NK dans l’immunosurveillance antitumorale a été mis en évidence in vivo. Les souris beige déficientes en cellules NK (gène CHS muté, modèle murin du syndrome de Chediak-Higashi) ont une incidence élevée de tumeurs spontanées ou induites 53,54 . D’autre part, Kim et al. ont montré 18 que des souris sélectivement déficientes en cellules NK (NK1.1+CD3-) perdent la capacité à contrôler le développement de tumeurs 55 . Récemment, des avancées significatives ont été réalisées dans l’identification de récepteurs inhibiteurs (KIR : Killer Inhibitory Receptors) et activateurs (KAR : Killer Activating Receptors) exprimés à la surface des cellules NK, et dans la compréhension de leur rôle dans la cytotoxicité vis-à-vis des cellules tumorales 56,57 . La majorité des récepteurs exprimés à la surface des cellules NK participe à la balance des signaux activateurs et inhibiteurs au cours de réponses immunes médiées par les NK. Il a été également montré que les cellules NK sont capables de rejeter une tumeur CMH-I positive si celle-ci exprime également la molécule Rae-1, un des ligands à NKG2D exprimé notamment par les cellules NK comme nous l’avons vu précédemment 58 . La synthèse des signaux activateurs et inhibiteurs dans l’environnement tumoral permet aux cellules NK de contribuer ou pas aux réponses immunes antitumorales. Des cellules T non conventionnelles exprimant des marqueurs cellulaires des NK (NK1.1 entre autre) appelées cellules NKT ont la capacité de reconnaître des antigènes glycolipidiques présentés par des molécules du CMH-I et CD1d, via leur récepteur T invariant (Vα14Jα281 chez la souris et Vα24JαQ chez l’homme). En réponse à l’engagement de leur TCR, les cellules NKT peuvent produire des cytokines pro inflammatoires de type Th1, tel que l’interféron gamma (IFN γ) mais aussi des cytokines anti-inflammatoires de type Th2 comme l’IL-4, l’IL-10 et l’IL-13. Diverses études ont mis en évidence une dualité fonctionnelle des NKT pouvant assurer des fonctions immunosuppressives via l’interleukine-13 ainsi que des fonctions immunoprotectrices via l’interleukine-12 et l’IFNγ 52 . En effet, une inhibition de l’immunité antitumorale par les NKT produisant de l’IL-13 a pu être mis en évidence dans un modèle de fibrosarcome 15-12RM 59,60 . Mais d’autre part, des expériences réalisées dans d’autres modèles tumoraux tels que le mélanome B16 ou les sarcomes chimio-induits, ont impliqué des cellules NKT dans le rejet tumoral 61,62 . Enfin, des études in vivo menées chez des souris déficientes en cellules NKT ont démontré un rôle immunoprotecteur de ces cellules dans le contrôle du développement de tumeurs induites par un agent chimique 63,64 . Mais l’ensemble de ces travaux montre la complexité de la réponse antitumorale et les rôles variables que peuvent jouer les cellules NKT dans ces réponses. 19 4.1.3 Les cellules dendritiques tueuses productrices d’IFNγ (IKDC) Une sous-population de DC impliquée dans l’immunosurveillance a été découverte récemment par deux équipes scientifiques indépendantes chez la souris 65,66 . Ces cellules sont présentes dans les organes lymphoïdes primaires et secondaires, dans le sang, dans le foie de souris naïves C57BL/6 et BALB/c et représente environ 1% de la population totale de DC 65 . Le pourcentage de cette population augmente d’un facteur 2 à 4 et celle-ci infiltre les métastases pulmonaires B16F10 en phase de régression suite à un traitement par un inhibiteur de tyrosine kinase (GLEEVEC (Imatinib mesylate) / ST1571) combiné à l’interleukine-2 67. Cette population cellulaire exprime le marqueur des DC (CD11c), le marqueur B220, les marqueurs des cellules NK (NK1.1, NKG2D, DX5, CD49b) et ne possède pas le marqueur des granulocytes GR1 65,67 . Les microscopies optique et électronique à transmission ont montré que ces cellules ont une morphologie unique et ne ressemblent pas aux DC plasmacytoïdes (cellules dendritiques d’origine lymphoïde qui ont une forte capacité à produire les interférons α/β en réponse à des stimuli viraux ou microbiens). En effet, ces cellules CD11c+B220+NK1.1+GR1- ont une membrane lisse dépourvue de dendrites, un rapport nucléo-cytoplasmique élevé et possèdent un nombre élevé de granules cytoplasmiques 67,68 . Ces chercheurs ont montré que ces DC sécrètent de grande quantité d’IFN γ, cyt okine clé impliquée dans l’immunosurveillance de tumeurs (voir point suivant) et sont capables de lyser les cellules tumorales de manière TRAIL (Tumor necrosis factor Related Apoptosis Inducing Ligand) dépendant, d’où leur nom IKDC pour Interferon producing Killer Dendritic Cell 65,66. Les IKDC expriment également les molécules L-selectin et CCR7 qui leur permettent de migrer du sang vers les organes lymphoïdes, comme l’a démontré Chan et al. 66. De plus, ces auteurs ont montré que les IKDC perdent les marqueurs de NK ainsi que leur capacité lytique pour devenir des CPA fonctionnelles après stimulation par le CpG ODN 66 et acquièrent donc la capacité à stimuler des lymphocytes T naïfs. Des cellules « équivalentes » aux IKDC ont été mises en évidence par Josien et al. chez le rat. Ils ont montré l’existence d’une sous-population de DC capables de lyser ,in vitro, des cellules YAC sans stimulation préalable, par un mécanisme dépendant du calcium et indépendant de TRAIL, TNF-α (Tumor Necrosis Factor alpha), et FASL (Fas Ligand) 69. Cependant, la nature des IKDC est actuellement controversée. En effet, trois travaux récents ont montré que les cellules « IKDClike » seraient des cellules NK activées 70-72. Chez l’homme, des sous-populations de DC myéloïdes (mDC) et plasmacytoïdes (pDC) ayant des propriétés tumoricides ont été mises en évidence, par Stary et al., après traitement à l’Imiquimod (IMQ), un agoniste synthétique des toll-like receptor (TLR) 7 et 8 qui est utilisé avec succès dans le traitement de certains cancers de la peau 73 . Ces chercheurs ont montré, par une technique 20 d’immunohistochimie réalisée sur des coupes histologiques de tumeurs issues de patients traités à l’IMQ, que les mDC qui infiltrent la tumeur expriment des molécules effectrices telles que la perforine, le granzyme B, l’iNOS (inducible NO synthase) et le TNF-α. Tandis que les pDC infiltrant la tumeur expriment plutôt la molécule TRAIL. Ces molécules effectrices, présentées dans le point suivant, sont connues pour jouer un rôle primordial dans le mécanisme de destruction des cellules tumorales. Ces chercheurs ont également montré que ces deux types de DC sont capables de lyser, in vitro, la majorité des lignées de cellules tumorales . Cependant, ils ont montré que ces populations de DC n’expriment pas les marqueurs de NK et donc semblent être différentes des IKDC 73. 4.1.4 Les cytokines et molécules effectrices de l’immunosurveillance Le répertoire cytokinique présent dans l’environnement tumoral conditionne en partie le type de réponse immunitaire. En effet, on distingue deux classes de cytokines : les cytokines de type 1 et de type 2. Les cytokines de type 1 (IL-2, IL-12, IL-15, IFNγ, IFNα, IFNβ) sont impliquées dans les réponses immunes Th1 (T helper 1) principalement à médiation cellulaire. Par contre, les cytokines de type 2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 et l’IL-13) sont impliquées dans les réponses immunes Th2 qui promeuvent une immunité humorale contre les tumeurs et/ou la déviation de la réponse immune vers une réponse non protectrice appelée la tolérance immunitaire. Nous savons actuellement, grâce à de nombreux travaux de recherche, que le niveau basal d’IFNγ joue un rôle particulièrement important dans la protection de l’organisme contre l’émergence et la croissance des cellules néotransformées. Les premières conclusions montrant l’importance de l’IFNγ ont été obtenues à partir d’expériences de neutralisation à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique dans un modèle de rejet de tumeur Meth A préimplanté (fibrosarcome induit par le 3-méthylcholantrène (MCA)) médié par le lipopolysaccharide (LPS) chez la souris BALB/c. En effet, ces expériences ont montré que la neutralisation de l’IFNγ abolit le rejet de la tumeur Meth A et permet une croissance rapide et efficace de celle-ci contrairement aux souris BALB/c non traitées 74. Les souris 129/SvEv invalidées pour les gènes codant la sous-unité IFNGR1 du récepteur de l’IFNγ et/ou pour le facteur de transcription STAT1 (facteur responsable des effets biologiques de l’IFNγ sur les cellules cibles) sont susceptibles de développer 10 à 20 fois plus de tumeurs induites par le MCA 75. Ces souris développent rapidement plus de tumeurs à des doses faibles de MCA que les souris de phénotype sauvage. Ces résultats ont été reproduits dans des expériences indépendantes sur des souris C57BL/6 invalidées pour le gène codant l’IFNγ lui-même 76. 21 D’autres études ont montré la coopération γdeavec l’IFNd’autres cytokines dans l’immunosurveillance des tumeurs. Les souris invalidées pour les gènes codant l’IFNγ et le GMCSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor), aussi bien les souris invalidées pour ces gènes ainsi que celui de l’IL-3 développent un nombre plus important de lymphomes et de cancers solides que les souris invalidées pour le gène codant une seule cytokine (GMCSF ou GMCSF et IL-3, ou IFNγ seul) 77. Certains travaux ont tenté d’identifier les sources d’IFN γ durant la phase élimination d’ des cellules néotransformées. Une étude réalisée par Gao et ses collaborateurs a montré que les cellules Tγδ sont une source importante d’IFNγ durant cette phase. Ils ont montré que les souris chimères ayant des cellules Tγδ i ncapables de produire de l’IFNγ sont susceptibles de développer des tumeurs après exposition au MCA contrairement aux souris contrôles et montrent une incidence tumorale identique aux souris déficientes pour le gène codant l’IFNγ 78. Plusieurs travaux de recherche ont montré le développement spontané de tumeurs dans des souris invalidées pour des gènes qui codent d’autres molécules jouant également un rôle important dans l’immunosurveillance des tumeurs notamment le gène codant pour la perforine qui est un des composants des granules cytotolytiques sécrétés par les cellules T cytotoxiques et les cellules NK 61,79,80 , le gène RAG-1 et/ou RAG-2 (gène qui code pour une recombinase permettant le réarrangement du récepteur à l’antigène des lymphocytes) 81 , le gène codant pour la protéine TRAIL 82 ainsi que le gène codant pour la sous-unité p40 de l’IL-12 64,83. TRAIL est un membre de la superfamille du TNF exprimé constitutivement chez une sous population hépatique de NK. L’IFNγ ou IFNα/β induit l’expression de TRAIL chez les monocytes, les DC ainsi que les NK 84. Ce membre de la superfamille du TNF induit la voie de l’apoptose de la cellule lorsqu’il s’engage sur son récepteur TRAILR2 (chez la souris). Après exposition à de faibles doses de carcinogène MCA, les souris C57BL/6 traitées à l’aide d’un anticorps neutralisant TRAIL 85 ou les souris génétiquement invalidées pour le gène qui code TRAIL 82 développent plus de fibrosarcomes que les souris contrôles. L’IL-12 (notamment produit par les DC activées) joue un rôle physiologique important dans l’interaction entre la réponse immunitaire innée et adaptative 86. En effet, l’IL-12 est la principale cytokine responsable de la différenciation des cellules Th0 en cellules Th1 capables de produire de grandes quantités d’IFNγ. De plus, les souris déficientes pour le gène codant la sous-unité p40 de l’IL-12 développent 2 à 3 fois plus de sarcomes induits par le MCA que les souris de phénotype sauvage. Ces observations montrent que la production basale d’IL-12 joue également un rôle primordial dans l’immunité antitumorale 83. 22 4.2 LA SURVEILLANCE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE Les lymphocytes T (LT) sont les effecteurs cellulaires de la réponse immunitaire acquise spécifique. La réponse immunitaire adaptative ou spécifique se caractérise par l’existence de récepteurs issus de réarrangements de gènes au cours de la différenciation des lymphocytes T et B. Les réponses immunes acquises sont des réactions contre des « défis antigéniques spécifiques » dont les principales caractéristiques sont la discrimination entre le soi et le non soi, la spécificité antigénique, la diversité et la mémoire immunitaire. La mise en évidence de l’implication de réponses immunes spécifiques antitumorales a été essentiellement réalisée par des travaux portant sur le mélanome. La combinaison de nouveaux outils tels que les banques génomiques, le SEREX (technique permettant l’identification sérologique des gènes exprimés recombinants 87 , les tétramères de molécules CMH-I a permis de suivre l’histoire immunologique de patients cancéreux et de révéler l’existence de réponses adaptatives antitumorales. L’équipe de Rosenberg a traité une série de patients atteints de mélanome avec des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) ou de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL : Tumor Infiltrating Lymphocytes) combinés à un traitement à l’IL-2. Ce traitement a permis d’obtenir des réponses objectives dans environ un tiers des patients atteints de mélanome métastatique 88,89 . Leurs observations suggèrent que les lymphocytes T jouent un rôle important dans la réponse immune antitumorale. Afin de comprendre les bases moléculaires de l’immunité antitumorale médiée par les LT, un certain nombre de gènes ont été identifiés comme codant des antigènes de rejet de tumeur dans le mélanome humain pouvant être responsables de la régression tumorale médiée par les CTL 90,91 . L’antigène tumoral humain MAGE1 a été le premier antigène spécifique de tumeur décrit en 1991 par l’équipe du professeur Boon 16 et depuis, plusieurs dizaines d’autres antigènes associés aux tumeurs (TAA : Tumor Associated Antigens) ont été identifiés. Ils peuvent être classés en plusieurs catégories : les antigènes uniques issus de mutations ponctuelles, les antigènes viraux associés aux tumeurs, les antigènes de différenciation ainsi que les antigènes communs spécifiquement exprimés ou surexprimés dans les tumeurs. 23 4.2.1 Les différentes classes d’antigènes tumoraux Les antigènes uniques issus de mutations ponctuelles Des protéines ubiquitaires peuvent être mutées dans certaines cellules tumorales et générer des antigènes spécifiques de tumeurs (TAA) car ces mutations présentent une expression strictement restreinte aux cellules tumorales. Parmi les mutations découvertes dans les tumeurs, certaines sont « neutres » donc uniquement antigéniques, d’autres par contre se sont avérées être oncogéniques. Ainsi, une mutation dans la protéine kinase CDK4 empêche la liaison de la protéine inhibitrice p16 92 , une mutation dans la β-caténine entraîne sa stabilisation 93 . Ces mutations stimulent la prolifération cellulaire. D’autre part, une mutation dans le gène codant la caspase 8 retrouvée dans des carcinomes de la cavité orale diminue leur sensibilité à l’apoptose induite par Fas ou le TNF 21 . Mais leur diversité extrême et leur identification laborieuse font qu’elles ne peuvent pas être actuellement envisagées comme cibles potentielles dans des vaccinations antitumorales ou dans des immunothérapies. Certaines mutations au niveau de l’oncogène ras ou du gène suppresseur de tumeur p53 conduisent à une protéine anormale antigénique reconnue par les LT CD4+ et CD8+ 9497 . Ces antigènes dérivés des protéines mutées ras ou p53 sont particulièrement intéressants, car les mutations retrouvées au niveau de ces oncogènes sont fréquentes et communes à plusieurs types de cancer. Les antigènes viraux La transformation tumorale peut être induite par des virus. Certains antigènes viraux peuvent donc être associés à des tumeurs. Ainsi, le papillomavirus, en particulier ses protéines de l’enveloppe virale E6 et E7 sont responsables du cancer du col de l’utérus Barr (EBV) est présent dans divers lymphomes 99 98 , le virus d’Epstein- et est également responsable du cancer du nasopharynx, ou encore le virus de l’hépatite B responsable de certaines tumeurs hépatiques. Des études initiales menées chez la souris ont montré que des tumeurs provoquées par un virus sont capables d’induire une réponse CTL efficace conduisant au rejet tumoral 100. Ces deux types d’antigènes tumoraux spécifiquement exprimés par les cellules tumorales et qui n’induisent pas de risques d’auto-immunité pourraient être de bons candidats pour l’immunothérapie. 24 Les antigènes communs spécifiques de tumeurs La transformation tumorale d’une cellule s’accompagne fréquemment de la réactivation de gènes normalement exprimés aux stades embryonnaires mais absents dans les tissus adultes sains mis à part les testicules et le placenta. Le premier gène identifié de cette catégorie chez l’homme est le gène MAGE-A1 (Melanoma AntiGEn) 16 et le premier gène murin identifié de cette catégorie est le gène P1A 12. De nombreux autres gènes ont été caractérisés par analogie au gène MAGE-A1 sur des mélanomes humains. La famille des gènes MAGE regroupe 12 membres, de MAGE-A1 à MAGE-A12. Ces gènes sont aussi exprimés dans des proportions variables de tumeurs de divers types histologiques, le plus souvent des tumeurs solides. L’expression spécifique des gènes MAGE dans les cellules tumorales et dans les cellules germinales mâles serait liée à une hypométhylation de l’ADN génomique 101. En effet, les cellules tumorales présentent souvent une déméthylation globale du génome et les cellules germinales mâles ont un niveau de méthylation faible. Or, le promoteur des gènes MAGE contient des sites de liaison de facteurs de transcription indispensables pour son activation. Ces sites contiennent des îlots CpG qui, lorsqu’ils sont méthylés, empêchent la liaison des facteurs de transcription. D’autres gènes du type MAGE-A ont été identifiés, notamment les familles MAGE-B et MAGEC, appartenant à la même grande famille dont les 3 loci se trouvent sur le chromosome X 102. Les gènes BAGE (Bladder AntiGEn), GAGE (Gastric AntiGEn) et RAGE (Renal AntiGEn) ont été identifiés au moyen de clones CTL antitumoraux provenant de patients atteints de mélanome 18,103. Les antigènes de différenciation Il a été montré que les CTL de certains patients atteints de mélanome reconnaissent des antigènes de différenciation exprimés non seulement par les cellules du mélanome mais aussi par les mélanocytes normaux 103. Les antigènes spécifiques de la lignée mélanocytaire sont issus pour la plupart des protéines de la membrane du mélanosome, organelle impliquée dans la synthèse de la mélanine. Plusieurs antigènes de différenciation de la lignée mélanocytaire ont été identifiés tels que la tyrosinase, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1 et TRP-2 104-106 . L’immunodominance de l’antigène Melan-A/MART-1 est reflétée par la fréquence élevée de CTL précurseurs circulants chez la majorité des patients atteints du mélanome, mais aussi chez des donneurs sains 107 . Des travaux précédents avaient associé la dépigmentation due à la destruction de mélanocytes sains (vitiligo) avec une régression tumorale et une amélioration du pronostic clinique de patients atteints de mélanome 108 . En effet, les LT infiltrant les lésions tumorales reconnaissent ces antigènes de différenciation mélanocytaires exprimés sur les cellules tumorales et les mélanocytes sains 105. Ces données mettent en évidence la rupture de la tolérance immunitaire aux antigènes de 25 différenciation et le développement d’une réponse auto-immune contre ces antigènes du soi chez des patients atteints du mélanome. D’autre part, des lymphocytes précurseurs sont présents chez des individus sains 107. Dans le cas du mélanome, la réponse immune antitumorale qui induit une auto-immunité limitée à la dépigmentation de la peau est acceptable. Cependant, l’immunothérapie basée sur ces antigènes de différenciation pourrait induire des atteintes autoimmunes irréversibles si elle est appliquée à d’autres modèles tumoraux. Les antigènes surexprimés Ces antigènes sont ubiquitaires et exprimés dans les cellules normales à des taux d’expression faibles mais dans certains cas, ils peuvent être surexprimés spécifiquement dans les tissus tumoraux d’origines variées. Or, les CTL spécifiques de ces antigènes reconnaissent uniquement les cellules tumorales et non les cellules saines. Ce phénomène s’explique par le fait qu’il existe un seuil d’expression du gène au-dessous duquel il n’y a pas assez de protéines, et donc de peptides antigéniques présentés, pour permettre une reconnaissance par un CTL 109 . Le gène HER-2/neu surexprimé dans environ 30% des cancers du sein et de l’ovaire code des peptides antigéniques reconnus par des CTL 110 . Les premiers essais cliniques utilisant un peptide dérivé du gène HER-2/neu montrent que les CTL spécifiques de cet antigène, induits après vaccination, ne reconnaissent pas les cellules normales mais ne lysent pas non plus les cellules tumorales 111 . Cet antigène ne semble pas être dans ce protocole clinique une cible efficace. Le gène de la télomérase (TERT) est surexprimé dans 85% des cancers et semble quasi silencieux dans la plupart des tissus normaux. Des CTL, provenant de patients, dirigés contre le peptide hTERT présenté par HLA-A2 lysent spécifiquement les cellules tumorales 112. L’induction d’une réponse immunitaire chez des souris vaccinées contre l’analogue murin de l’antigène de la télomérase n’induit pas de réaction auto-immune dirigée contre les tissus sains, comme les cellules de la moëlle osseuse ou du foie qui expriment le gène TERT. L’intérêt de cet antigène provient du fait que des CTL spécifiques de cet antigène TERT peuvent reconnaître des cellules tumorales de types histologiques différents et les souris vaccinées sont partiellement protégées vis-à-vis de l’inoculation de trois modèles différents de tumeur 113 . Néanmoins, il est difficile d’évaluer le danger que représente l’immunisation à l’aide d’un antigène tumoral également présent à un niveau moindre sur des cellules saines. Ces antigènes spécifiques de tumeurs peuvent être des cibles pour l’immunité adaptative, dont les lymphocytes T CD4+ et CD8+. Par leurs récepteurs spécifiques (TCR : T Cell Receptor) et d’une 26 extrême diversité, les LT reconnaissent les peptides antigéniques et deviennent les effecteurs de la réponse immune. 4.2.2 Les cellules dendritiques Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) professionnelles qui interviennent dans les processus d’immunosurveillance au niveau des interfaces de l’organisme. Elles constituent une catégorie cellulaire extrêmement importante au niveau de la mise en place et de l’orchestration des différents acteurs lymphocytaires impliqués dans la réponse immunitaire antitumorale 114. Les DC sont caractérisées par leur haut pouvoir de migration depuis le sang périphérique jusqu’aux muqueuses où elles vont capter l’antigène, et ensuite de ces interfaces épithéliales jusqu’aux organes lymphoïdes secondaires où elles vont initier la réponse immunitaire en présentant les peptides antigéniques aux lymphocytes T 115 . Au niveau des interfaces telles que la peau et les muqueuses, les DC sont exposées aux antigènes et sont à un stade immature caractérisé par une forte capacité de capture et d’internalisation des antigènes. Après capture de l’antigène associée à une stimulation par des signaux de « danger », les DC vont être activées et progressivement acquérir un profil de DC « matures » caractérisé par une perte des capacités de capture et d’internalisation des antigènes et par une forte capacité à présenter les antigènes aux lymphocytes T. Le stade mature des DC se traduit également par une forte augmentation de l’expression de molécules du CMH de classe I et II, ainsi que des molécules de costimulation CD80, CD86 et CD40 116,117. Les cellules dendritiques expriment à leur surface des glycoprotéines membranaires du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH-I) et de classe II (CMH-II) dont la fonction principale est la présentation des antigènes peptidiques aux lymphocytes T. Le CMH (système HLA chez l’homme et H-2 chez la souris) est un système multigénique, multiallélique et d’expression codominante. Les molécules de classe I (HLA-A, B, C chez l’homme et H-2 K, L, D chez la souris) sont formées par l’association non covalente d’une chaîne légère non polymorphique, la β2-microglobuline (β2M), et d’une chaîne lourde α polymorphique formée de trois domaines extracellulaires. Les molécules de classe II (HLA-DR, DP, DQ chez l’homme et H-2 I-A, I-E chez la souris) sont formées de deux chaînes polypeptidiques α et β comportant chacune deux domaines extracellulaires. La structure tridimensionnelle de ces molécules de classe I et II fait apparaître une cavité interagissant avec les peptides. La présentation des peptides antigéniques à la surface des cellules présentatrices d’antigènes résulte de la dégradation intracellulaire des protéines normales ou pathologiques et de l’assemblage de ces peptides avec les molécules du CMH-I. La dégradation des protéines 27 cellulaires est réalisée au niveau cytoplasmique par un complexe protéique multicatalytique ubiquitaire appelé protéasome 118. Les peptides générés par le protéasome sont la source majeure de peptides antigéniques présentés par le CMH-I. Les peptides générés au niveau cytoplasmique sont pris en charge par des protéines de « heat shock » (HSP70 et HSP90) dont le rôle est de transporter les peptides et de les protéger d’une dégradation supplémentaire 119. Les peptides sont ensuite transportés de façon active dans le réticulum endoplasmique par les protéines transporteurs TAP (Transporters Associated with antigen Processing). Les transporteurs TAP sont formés d’un hétérodimère TAP1 et TAP2 et possèdent une spécificité de liaison pour les peptides présentant des résidus particuliers au sein de la séquence peptidique 120 . Les peptides antigéniques s’associent avec la chaîne lourde de CMH-I et la β2M au niveau du réticulum. La formation de ce complexe nécessite plusieurs protéines chaperonnes (calnexine, calreticuline, Erp57) nécessaires au repliement correct de la molécule de CMH et son association avec laβ2M. La tapasi ne permet ensuite le rapprochement du complexe CMH- β2M avec les TAP. Apr ès liaison du peptide antigénique, le complexe CMH-peptide- β2M migre vers la surface de la cellule 121. Une voie différente est empruntée par les antigènes dérivés de protéines d’origine exogène qui sont généralement présentés par le CMH de classe II. Dans la plupart des cellules, les protéines exogènes n’ont pas accès au compartiment cytosolique. Néanmoins, un certain nombre de travaux ont mis en évidence l’existence d’une présentation « croisée », permettant la présentation d’antigènes d’origine exogène par le CMH-I 122-124 . La présentation croisée utilise des voies alternatives d’apprêtement de l’antigène qui peuvent être cytosoliques et dépendantes du protéasome et des TAP 125 ou non cytosoliques et indépendantes du protéasome et des TAP 126 . Les protéines exogènes sont internalisées, puis transférées dans le cytoplasme pour suivre la voie classique de dégradation et de présentation par le CMH-I, ou bien dégradées par des enzymes lysosomiales après fusion phagosome-lysosome au niveau des endosomes avant de s’associer au CMH-I 122. La présentation croisée est un phénomène extrêmement important pour la présentation efficace par les DC d’antigènes dérivés de cellules tumorales, en particulier de corps apoptotiques de cellules tumorales ou provenant de la nécrose tumorale 100,127. La capacité des DC à induire une réponse immune antitumorale a été décrite dans de nombreux modèles animaux 128, mais aussi chez l’homme 116,129. Plusieurs études ont montré que des DC infiltrant les tumeurs (TID) corrèle avec un pronostic clinique favorable chez certains cancers humains plusieurs modèles tumoraux chez la souris 131 130 . Cette observation a été démontrée dans . Cependant, d’autres auteurs ont montré que la présence des TID au sein des tumeurs corrèle avec un mauvais pronostic clinique 132 . En effet, certains auteurs ont montré que les TID peuvent favoriser directement la croissance de la tumeur 28 133,134 , d’autres auteurs ont également montré que les TID peuvent avoir des effets immunosuppresseurs sur la réponse antitumorale 135,136 . Néanmoins, le rôle précis des TID dans l’immunité antitumorale reste actuellement controversé. 4.2.3 Les lymphocytes T Les LT reconnaissent spécifiquement, par l’intermédiaire de leur TCR, des peptides antigéniques présentés par les molécules du CMH de classe I pour les LT CD8+ (CTL) ou de classe II pour les LT auxiliaires CD4+. De nombreux travaux ont démontré l’implication des LT CD4+ et CD8+ dans la génération d’une réponse immune antitumorale spécifique et une mise en place d’une mémoire. L’activation des LT CD4+ permet la prolifération des clones T CD8+ spécifiques de l’antigène assurant ainsi l’amplification de la réponse. Ces lymphocytes auxiliaires acquièrent un profil cytokinique polarisé de type Th1 (sécrétion d’IL-2, IFNγ, TNFα) et orientent la mise en place d’une réponse immune à médiation cellulaire avec l’activation des cellules effectrices cytotoxiques LT CD8+. Des travaux expérimentaux sur des modèles de tumeurs murines 137 et des données cliniques 91 ont montré l’importance des CTL CD8+ comme les cellules effectrices de la réponse immune antitumorale. D’autre part, comme nous l’avons rappelé précédemment, ces CTL CD8+ spécifiques de tumeurs ont permis de mettre en évidence de nombreux antigènes tumoraux. Une accumulation de LT spécifiques de l’antigène de différenciation gp100 après injection du peptide antigénique a été observée dans 8 tumeurs sur 11 post-vaccinations 138. Chez des patients recevant des injections de clones CTL spécifiques de gp100 ou de MART-1, l’analyse des CTL par l’utilisation de tétramères spécifiques a également montré l’accumulation au niveau des sites tumoraux des CTL transférés. Ceux-ci représenteraient jusqu’à 38 % des LT infiltrant les tumeurs 139 . Ces expériences montrent le rôle essentiel en tant qu’effecteurs cellulaires des lymphocytes T et en particulier des lymphocytes T CD8+ dans la réponse antitumorale. 29 Figure 4 : Représentation schématique de la synapse immunologique. Vue de profil montrant les molécules clé impliquées dans l'activation des lymphocytes T (Tcell) par une cellule présentatrice d'antigène (APC). 30 Par ailleurs, le rôle des lymphocytes T auxiliaires CD4+ dans l’immunité antitumorale semble se confirmer. Plusieurs études montrent que les lymphocytes T CD4+ produisent de l’IFNγ et contribuent à la mise en place d’une réponse antitumorale efficace médiée par les LT CD8+, induisant ainsi une régression totale de la tumeur 140,141 . Des études ont également montré la contribution des LT CD4+ dans la mise en place d’une réponse CTL efficace par l’interaction CD40/CD40L 142 . Un des mécanismes important utilisé par les lymphocytes T CD4+ est la sécrétion d’IFNγ qui semble être un médiateur majeur. L’IFNγ peut agir directement sur la cellule tumorale en induisant une augmentation de l’expression des molécules de CMH-I et de CMH-II la rendant sensible à une reconnaissance et une destruction par les CTL. De plus, il présente une activité cytotoxique directe sur les cellules tumorales et induit la synthèse de cytokines anti-angiogéniques au niveau du stroma tumoral et des chimiokines permettant l’attraction des monocytes et des LT. L’identification des épitopes reconnus par les LT CD4+ est plus délicate que celle des épitopes reconnus par les LT CD8+, du fait de la voie de présentation particulière des antigènes de CMH-II empruntant une voie non cytosolique. Cependant, différents épitopes CD4 ont été mis en évidence au sein du gène codant pour des antigènes reconnus par les lymphocytes CD8+. Zeng et al. ont montré que le gène humain Melan-A/MART-1, connu pour engendrer un épitope peptidique restreint HLA-A2 et reconnu par les LT CD8+ (Melan-A/MART-127-35), code également pour un peptide présenté par HLA-DR4 reconnu par les LT CD4+ (Melan-A/MART151-73) 143. 4.2.4 La synapse immunologique : interaction entre la cellule présentatrice d’antigène et le lymphocyte T L’interface ou la région de contact entre un lymphocyte T et une cellule présentatrice est nommée la synapse immunologique (Figure 4). L’interaction entre ces deux types cellulaires, indépendamment de la reconnaissance de l’antigène, consiste en une organisation spatiale de la synapse avec une polarisation du cytosquelette des deux types cellulaires. On observe également une redistribution de certaines molécules de surface vers les zones de contact. Il a été montré que ces molécules ségrègent à l’interface en formant des zones distinctes. Cette synapse se forme après une trentaine de minutes de contact et possède un diamètre de quelques microns. La synapse est encore observée après une heure de contact. La synapse immunologique se forme également entre le LT et la cellule tumorale. Lors de la rencontre entre le LT et la CPA, des contacts très étroits sont rendus très difficiles par les forces de répulsion intercellulaire dues aux charges négatives du glycocalyx formant une barrière de 50 à 100 nm, distance qui rend toute liaison impossible entre le TCR et les molécules 31 du CMH 144,145. L’intervention de grandes molécules comme les intégrines LFA-1 et ICAM-1 va permettre la phase initiale d’adhérence entre les deux types cellulaires et favoriser ainsi la liaison entre le peptide antigénique présenté par la CPA et son TCR. La synapse mature génère un microenvironnement cellulaire propice aux interactions des molécules costimulatrices dont le rôle est d’amplifier les signaux d’activation. De plus, la synapse immunologique serait nécessaire à la sécrétion polarisée des cytokines par les LT 146. La nature des signaux moléculaires engagés à travers la synapse immunologique est déterminante pour le devenir de la CPA et du LT, et la mise en place ou non d’une réponse immune efficace et spécifique de l’antigène. De cet ensemble d’interactions qui ont lieu au niveau de la synapse immunologique en résulte l’avidité du lymphocyte, c’est-à-dire la sensibilité d’activation d’un lymphocyte pour un antigène. L’affinité du TCR pour le complexe peptide-CMH constitue une approximation de l’avidité d’un lymphocyte T qui englobe l’ensemble des phénomènes moléculaires conduisant à l’activation lymphocytaire 147 . Slifka et Whitton ont montré que la variation de l’avidité des LT n’est pas due à une sélection clonale de LT présentant un TCR de plus haute affinité, mais à une maturation fonctionnelle des LT spécifiques de l’antigène 148 . Les LT de haute avidité présentent une expression plus importante de la protéine tyrosine-kinase Lck impliquée dans la signalisation intracellulaire. De plus, il a été montré chez des patients atteints de cancer du poumon par l’utilisation de tétramères HLA-A2/ACTN-4 (TAA : α-actinine-4) qu’il existerait une expansion clonale sélective de clones CTL ayant une haute avidité et conduisant à une forte cytotoxicité envers la tumeur. Par contre, les clones T, aussi spécifiques pour l’antigène mais de basse avidité, sont retrouvés en périphérie de la tumeur parmi les lymphocytes sanguins circulants 149 . Dans des protocoles d’immunothérapie antitumorale, il serait donc préférable d’utiliser des clones de CTL provenant des TIL du patient plutôt que ceux provenant du sang périphérique. 4.2.5 La cytotoxicité lymphocytaire Les cellules NK et les LT sont des cellules capables d’entraîner leurs cellules cibles vers la mort par apoptose associée ou non à de la nécrose. Deux voies moléculaires ont été identifiées jusqu’à présent, l’une est une voie d’exocytose de granules cytotoxiques (voie perforine/granzyme) dépendante du calcium, l’autre est la voie cytotoxique médiée par l’interaction Fas/FasL indépendante du calcium. Ces deux voies nécessitent la formation du conjugué cellule effectrice/cellule cible, la mise en place de la synapse immunologique et donc la polarisation de la cellule effectrice permettant l’orientation de la réponse cytotoxique vers la cellule cible. 32 La voie perforine/granzyme Après la réorganisation du cytosquelette des cellules effectrices CD8+ et NK, celles-ci libèrent des granules d’exocytose dans l’espace délimité par la synapse immunologique 150 . Ces granules contiennent différentes protéines dont la perforine et des granzymes. La perforine est capable de polymériser en présence de calcium et de former des pores dans la membrane de la cellule cible. Ces pores permettent aux granzymes et autres protéines de pénétrer dans le cytosol des cellules cibles. Les granzymes (dont les plus abondants et les mieux caractérisés sont les granzymes A et B) sont des sérines protéases capables de déclencher l’apoptose des cellules cibles en clivant des substrats cellulaires dont les procaspases. Mais en plus des dommages nucléaires, les granzymes peuvent entraîner une protéolyse cytoplasmique déclenchant également la mort cellulaire. Parmi les autres protéines contenues dans les granules, nous pouvons citer la granulysine qui est une protéine bactéricide provoquant des lésions au niveau de la membrane bactérienne, mais pouvant également induire l’apoptose de lignées tumorales in vitro 151. La voie Fas/FasL Les cellules effectrices CD4+, CD8+ et NK expriment à leur surface des molécules FasL, qui sous forme trimérisée se lient au récepteur Fas présent à la surface de nombreuses cellules cibles. Cette interaction induit le recrutement de diverses protéines (dont la molécule adaptatrice FADD pour Fas Associated Death Domain) et la formation de complexe appelé DISC (Death Inducing Signaling Complex) qui permet d’aboutir à l’activation de la caspase 8 152 . La caspase 8 activée, déclenchant l’activation des caspases effectrices ou par l’intermédiaire du relargage de cytochrome-c par la mitochondrie, peut ainsi induire l’apoptose des cellules cibles. 33 5. MÉCANISMES D’ÉCHAPPEMENT DES TUMEURS À L’IMMUNOSURVEILLANCE Le système immunitaire, comme nous venons de le voir dans le chapitre précédent, semble donc potentiellement compétent pour la détection et l’élimination des cellules tumorales. Cependant, la réponse antitumorale doit faire face à de nombreux obstacles qui résultent de la pression de sélection du système immunitaire exercée sur les cellules tumorales (phase d’équilibre ou d’immunosélection) 39-42 . Plutôt que de conduire à l’éradication de la tumeur, cette pression de sélection exercée par le système immunitaire pourrait favoriser le développement des cellules tumorales faiblement immunogènes, des variants tumoraux sélectionnés selon la théorie de Darwin. Ainsi, le système immunitaire joue un rôle important dans le « cancer immunoediting ». Ce concept permet d’expliquer les phénomènes d’échappement tumoral. Différents mécanismes entraînant l’échappement tumoral à la surveillance immunitaire ont été identifiés 153, certains sont indépendants des antigènes tumoraux, d’autres sont liés à la cellule tumorale, et d’autres enfin sont associés à un dysfonctionnement du système immunitaire. Nous présenterons dans les points suivants des mécanismes d’échappement tumoraux qui semblent à l’heure actuelle prédominants et qui ne sont pas exclusifs. 5.1 LES FACTEURS LIÉS AUX CELLULES TUMORALES 5.1.1 Perte ou diminution de l’expression des molécules du CMH I L’échappement tumoral à la réponse immune est le plus souvent associé à des anomalies concernant la présentation des antigènes par les molécules du CMH I à la surface des cellules tumorales, altérant ainsi la reconnaissance par les LT 154 . Une immunosélection des cellules tumorales induit des variants tumoraux qui ont perdu l’expression des antigènes qui étaient la cible de la réponse immune 155,156 . Plusieurs phénotypes d’altération de l’expression des molécules du CMH I ont été décrits, pouvant entraîner une perte totale ou partielle d’expression des molécules à la surface des cellules tumorales 157 . La perte partielle d’expression des molécules CMH I peut provenir de défauts dans la machinerie d’apprêtement des antigènes tels que TAP1 (transporter associated with antigen processing 1), TAP2, LMP2 (low molecular mass protein 2), LMP7 158,159. Johnsen et al. montrent dans un modèle murin une relation de cause à effet in vivo entre l’absence de protéines TAP1 et la prolifération tumorale. En effet, lorsqu’un mélange de fibroblastes murins 34 transformés TAP1- et TAP1+ est inoculé à des souris, les tumeurs TAP1- et TAP1+ se développent, puis seulement une immunocompétentes 158 régression des tumeurs TAP1+ est observée chez les souris . Par contre, les deux types cellulaires se développent chez des souris athymiques. Ces résultats montrent que le rejet tumoral est induit par une réponse immune cellulaire T qui est dépendante de la présentation antigénique. L’instabilité génétique des cellules tumorales conduit dans certains cas à des altérations chromosomiques pouvant entraîner la perte totale d’expression des molécules de CMH I, par exemple des mutations dans le gène codant la chaîne β2 -microglobuline 160 , ou encore une perte sélective d’un haplotype d’un locus ou d’un allèle entraînant une diminution de l’expression des molécules de CMH I 161 . L’absence ou l’altération de présentation des antigènes par les molécules de CMH I à la surface des cellules tumorales est responsable de la propagation tumorale. Ce mécanisme d’échappement tumoral est également observé chez les patients cancéreux souffrant de mélanome 162 , carcinome colorectal 163 162 , carcinome du poumon : en effet, les cellules métastatiques sont le plus souvent dépourvues d’expression de molécules de CMH I. De plus, certaines études suggèrent une corrélation entre le faible taux d’expression des molécules CMH I dans les tumeurs et un mauvais pronostic, notamment pour des tumeurs pancréatiques et cervicales 164-166. 5.1.2 Résistance des cellules tumorales à l’apoptose La cytotoxicité médiée par la voie perforine/granzyme ou par les molécules Fas et TRAIL peut être contrée par les cellules tumorales. En effet, les cellules tumorales peuvent perdre la capacité à lier la perforine 167 ou peuvent exprimer un inhibiteur de la voie granzyme B 168. D’autre part, il a été montré que certaines tumeurs surexpriment c-FLIP, une protéine inhibitrice des procaspases 8 et 10 qui sont activées par Fas 168, ou que certaines cellules tumorales perdent l’expression de Fas 169 . Concernant l’apoptose induite par TRAIL, certaines cellules tumorales échappent à la réponse immune grâce à une altération de l’expression du récepteur à TRAIL comportant un domaine de mort qui permet d’activer la voie des caspases. Par conséquent, ce récepteur muté à TRAIL n’est plus capable d’activer la voie de l’apoptose 170. 5.1.3 Cytokines immunosuppressives sécrétées par la tumeur Plusieurs facteurs immunosuppresseurs synthétisés et sécrétés par les cellules tumorales ont été identifiés et contribuent à l’échappement des tumeurs à l’immunosurveillance. Parmi ceux-ci, nous aborderons dans ce point l’interleukine-10, le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) ainsi que le facteur de croissance tumorale (TGFβ). 35 L’interleukine-10 L’IL-10 est une cytokine immunosuppressive de 18kDa sécrétée par plusieurs types de cellules tumorales. Elle inhibe la production de cytokines telles que IL-2, TNF-α, IFN-γ et le GMCSF par les cellules Th1 en réponse aux antigènes présentés par les CPA. Des études ont montré que des cellules de mélanome prétraitées avec de l’IL-10 recombinant sont moins sensibles à la cytotoxicité des CTL spécifiques. Cette insensibilité s’explique par le fait que l’IL-10 régule de manière négative les molécules du CMH I et II 171 . Des études supplémentaires ont montré que l’IL-10 inhibe la présentation antigénique par une diminution de l’expression des molécules du CMH mais aussi des molécules TAP-1 et TAP-2 dans des modèles murins de tumeurs qui exprime l’IL-10 (plasmacytome P815, lymphome) 172-174 . Ce dysfonctionnement au niveau du mécanisme de la présentation de l’antigène permet aux cellules tumorales d’être insensibles à la lyse médiée par les CTL et les NK. L’IL-10 est également responsable du dysfonctionnement des DC. En effet, certaines études ont montré que l’IL-10 est capable de convertir les DC immatures en DC tolérogènes dont l’expression des molécules de costimulation est faible 175 . Des DC humaines traitées avec de l’IL-10 induisent des cellules T anergiques capables de supprimer la réponse CTL 176 . L’IL-10 est également connue pour inhiber la maturation des monocytes en DC 177. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire VEGF Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire est produit par la plupart des tumeurs et joue un rôle crucial dans le développement de nouveaux vaisseaux sanguins qui permettent d’irriguer la tumeur en croissance. Un taux élevé de VEGF dans le sérum des patients cancéreux est un mauvais pronostic clinique 178,179 . Le VEGF est non seulement un facteur important pour l’angiogenèse mais il joue également un rôle clé dans l’inhibition du système de reconnaissance et de destruction des cellules tumorales par les cellules immunes 180. De plus, des études ont montré l’implication du VEGF dans le défaut de maturation et de différenciation des DC à partir de progéniteurs 181 : ce défaut résulte de l’inhibition de l’activation du facteur de transcription nucléaire NF-κB 182 . Chez les patients cancéreux, une corrélation entre le taux élevé de VEGF dans le sang et l’augmentation de cellules myéloïdes immatures GR1+ (voir point 5.2.3) a été décrite dans une étude clinique 183,184. 36 Le facteur de croissance tumorale TGFβ Le facteur de croissance tumorale TGFβ est une cytokine qui joue un rôle central dans la régulation de réponses immunes ainsi que dans les processus biologiques qui favorisent la carcinogenèse 185. A) Expression et activation du TGFβ Il existe trois isoformes du TGFβ chez les mammifères codés par différents gènes 186 qui sont les isoformes TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3. Le TGFβ1 est l’isoforme le plus exprim é par le système immunitaire. Il est synthétisé sous forme d’un précurseur appelé pro TGFβ qui sera ensuite modifié dans l’appareil de Golgi, pour ensuite s’associer à une protéine LAP (Latency associated protein). Ce complexe protéique se lie de manière non covalente à un homodimère pour former une nouvelle protéine appelée la protéine TGFβ latente ou SLC (Small latent Complex). La protéine SLC peut être sécrétée comme telle ou se lier avec une autre protéine latente appelée LTBP (Latent TGFβ binding protein) pour former un autre complexe protéique latent appelé LLC (Large Latent Complex). Sous cette forme latente, le TGFβ ne peut se lier à son récepteur. Après clivage protéolytique, le « TGFβ » se libère des protéines LAP et LTBP pour former la forme active du TGFβ capable de se lier au récepteur et induire la voie de signalisation dépendante du TGFβ. B) Voie de signalisation du TGFβ Les fonctions biologiques du TGFβ se mettent en place après la liaison de la forme active du TGFβ au récepteur tétramérique formé par les sous-unités protéiques ALK5 et TGFβRII. La formation du complexe ligand/récepteur induit l’activation du domaine intracellulaire du récepteur qui phosphoryle les protéines Smad (Smad 2, Smad 4, Smad 3). Après translocation nucléaire, ces protéines Smad recrutent soit des co-activateurs contenant un domaine activateur de type histone-acetyl transferase (HAT), par exemple CBP/p300, soit des co-répresseurs possédant un domaine inhibiteur de type histone-déacetylase (HDAC) tel que Sno/Ski qui activent ou répriment respectivement l’expression des gènes cibles après liaison à l’élément nucléaire SBE (Smad Binding Element) 187. La protéine Smad 7 supprime la cascade de signalisation induite par le TGFβ par deux mécanismes. Le premier est la compétition de la protéine Smad 7 avec les autres protéines Smad pour le site de liaison à la sous-unité ALK5. Le deuxième mécanisme est le recrutement par Smad 7 d’un complexe protéique qui dégrade la sous-unité ALK5. Des études 37 utilisant des souris déficientes pour les protéines Smad ou génétiquement invalidées pour le gène qui code la sous-unité ALK5 ont permis de mettre en évidence une autre voie de signalisation du TGFβ indépendante des protéines Smad. Ce tte voie de signalisation peu connue met en jeu d’autres facteurs tels que TAK-MKK4-JNK, Ras-ERK etc…187. C) Effets biologiques du TGFβ Le rôle essentiel du TGFβ est la suppression de laéponse r immune médiée par les LT et le contrôle de l’immunité. Le TGFβ inhibe l’expression de l’IL-2 qui permet la prolifération des LT 188 . Le TGFβ peut également inhiber la prolifération des LT en modulant l’expression des régulateurs du cycle cellulaire 189. Les souris déficientes pour le récepteur TGFβ souffrent de désordres inflammatoires dus à une prolifération incontrôlée de cellules T et meurent après 3 à 4 semaines 190 . Le TGFβ permet de maintenir l’homéostasie des cellules T et d’empêcher tout désordre lymphoprolifératif. Le TGFβ inhibe également la différenciation des cellules T helper en présence d’IL-2 qui ne peuvent acquérir leurs fonctions 191 . Plusieurs études montrent que le TGFβ emp êche la différenciation des cellules T en cellules Th2 en inhibant l’expression du facteur de transcription GATA-3 192 ainsi que le développement des cellules Th1 en inhibant l’expression du facteur de transcription T-bet et du récepteur à l’IL-12 193. Le TGFβ inhibe la fonction cytotoxique des CTL activés en réprimant l’expression des gènes qui codent pour la perforine 194 et le FasL 195. Le TGFβ jou e u nôlr e important dans le développement, la maintenance et l’activation d’une population cellulaire à fonction inhibitrice appelée les lymphocytes T régulateurs (Treg) (voir point suivant). Le mécanisme par lequel le TGF β induit les Treg est peu connu à ce jour . L’inhibition de la voie de signalisation du TGFβ êche emp leur prolifération chez des souris traitées avec du sulfate dextran, une drogue qui provoque une colite. Ces Treg ne sont plus capables de protéger la souris contre l’inflammation 196 . Une autre étude montre que les souris génétiquement invalidées pour le gène codant le TGFβ ont un faible nombre de Treg dans le sang périphérique 197. Ce résultat suggère une fonction endogène du TGFβ dans l’homéostasie des LT régulateurs périphériques. D’autres études expérimentales chez la souris ont montré que le TGFβ inhibe la maturation des DC à partir de progéniteurs issus de la moëlle osseuse en présence du facteur de croissance GMCSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) 198 . Ce résultat montre que le TGFβ favorise la énération g de DC possédant un phénotype immature. En effet, ces DC expriment peu les molécules du CMH ainsi que les molécules de costimulation. Le TGF β régule donc la fonction de présentation de l’antigène des DC qui ne peuvent stimuler de manière efficace 38 les LT 199. De plus, la sécrétion d’IL-12 par les DC induite par des cytokines inflammatoires telles que IL-1 et TNFα (Tumor Necrosis Factor alpha) est inhibée par le TGFβ 199. Les cellules tumorales sont capables de produire de grande quantité de TGFβ et favorisent également la production de celui-ci par d’autres types cellulaires faisant partie du stroma tumoral. La production de TGFβ permet aux cellules tumorales échapper d’ aux cellules immunitaires comme nous l’avons vu précédemment favorisant ainsi la croissance de la tumeur. Des études expérimentales ont montré que la surexpression de TGF β dans des cellules tumorales fortement immunogènes supprime la réponse immune chez la souris production de TGFβ par les cellules tumorales 200 . Ces observations montrent que la semble être impliquée dans le mécanisme d’évasion. 5.2 LES FACTEURS LIÉS AU DYSFONCTIONNEMENT CELLULAIRE DU SYSTÈME IMMUNITAIRE 5.2.1 Tolérance immunitaire due aux cellules dendritiques Comme nous l’avons vu précédemment, les DC jouent un rôle critique dans la génération et la maintenance d’une réponse antitumorale. En effet, les DC capturent les antigènes tumoraux provenant de cellules nécrosées ou apoptotiques afin d’activer des LT cytotoxiques aptes à détruire la tumeur. Plusieurs travaux de recherches ont montré l’implication des DC myéloïdes dans l’échappement des tumeurs à la réponse immune. Des études descriptives chez les souris portant des tumeurs 201 et chez les patients cancéreux 202 ont montré une diminution significative du nombre de DC myéloïdes fonctionnelles dans les organes lymphoïdes, la rate ainsi que la peau. Des études ont également montré que le nombre faible de DC, présentes également dans les tumeurs, possède un phénotype immature 203,204. De plus, il a été montré que le traitement in vitro de ces DC isolées à partir de tumeurs par du GMCSF et du TNF α ou du CD40L n’induit pas l’expression des molécules CD80 et CD86 204 . Cette observation suggère que la perte de l’expression des molécules de costimulation n’est pas le résultat d’un problème d’activation de ces cellules dans l’environnement tumoral mais bien la conséquence d’un défaut dans la différenciation cellulaire. D’autres études ont identifié le facteur de transcription STAT3 comme étant la molécule clé jouant un rôle important dans la différenciation des progéniteurs de la moëlle osseuse en DC fonctionnelles 205. En effet, les chercheurs ont montré qu’une hyperactivation de la voie JAK2/STAT3 affecte négativement la différenciation cellulaire des progéniteurs en DC 206 . Les DC à un stade immature sont incapables d’activer de manière appropriée les LT et donc de 39 générer une réponse antitumorale. Cependant, ce signal inapproprié provoque l’anergie ou la tolérance des LT 207. D’autre part, plusieurs études ont montré la présence de sous populations de DC plasmacytoïdes capables de supprimer la réponse T. Des chercheurs ont montré, chez la souris, que les ganglions lymphatiques drainant la tumeur B16F10 (mélanome murin) contiennent une sous population de DC plasmacytoïdes qui exprime de manière constitutive un enzyme appelé l’ indoleamine 2,3 dioxygénase (IDO) 208 . Cette enzyme joue un rôle dans la tolérance et l’expansion clonale des cellules T en modulant leur catabolisme du tryptophane. L’expression d’IDO dans les DC myéloïdes murines et humaines a été également décrite 209,210. D’autres types de DC ont également été mis en évidence dans plusieurs rapports. Ces DC régulatrices sont générées en réponse à diverses cytokines ou cellules présentes dans le stroma et l’environnement tumoral. Ces DC régulatrices ont une faible expression des molécules CMH II, CD86 et CD11c. Par contre, ces DC expriment fortement les molécules CD80, CD40, CD106 ainsi que CD11b. Ces DC régulatrices sécrètent une quantité importante d’IL-10 et de NO et moins de TGFβ et d’IL-12. Leur rôle dans la suppression de la réponse T a été également démontré 211. 5.2.2 Tolérance immunitaire due aux lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ Récemment, de plus en plus de rapports montrent que les tumeurs inhibent la réponse immune en favorisant l’expansion, le recrutement ainsi que l’activation de cellules T régulatrices 212,213. Les cellules T régulatrices naturelles CD4+CD25+ (Tregs) ont été identifiées par Sakaguchi 212 comme une sous population cellulaire de LT CD4+ qui exprime de manière constitutive la molécule CD25 (ou la sous-unité du récepteur α de l’IL -2) et supprime la réponse T in vivo. Ces cellules régulatrices expriment également le facteur de transcription Foxp3 (Forkhead box P3), le récepteur CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4), le récepteur GITR (glucocorticoidinduced TNF receptor), la molécule LAG-3 (Lymphocyte Activated Gene-3) ainsi que la neuropiline 213 . Ces cellules CD4+CD25+ Foxp3+ se retrouvent en grand nombre dans le sang périphérique mais aussi au sein de la tumeur chez des patients souffrant de cancer de la peau, du pancréas, du poumon, de l’ovaire, du sein 214. Curiel et al. ont montré que la présence d’un grand nombre de cellules CD4+CD25+ Foxp3+ dans les tumeurs malignes corrèle inversement avec la survie des patients souffrant du carcinome ovarien 214 . De manière intéressante, ils ont montré dans leur étude clinique que les Tregs sont recrutés vers le foyer tumoral sous l’influence de la chimiokine CCL22 214 . Les premières expériences ont montré que la déplétion des Tregs à l’aide de l’anticorps monoclonal anti-CD25 restore le rejet de tumeurs murines ASL1 (leucémie), 40 MOPC-70A (myélome), MethA et CMS17 (deux types de fibrosarcome induits par le méthylcholanthrène) médié par les LT cytotoxiques 215,216 . De même, Turk et al. ont montré que l’élimination sélective des Tregs augmente la réponse T CD8+ vis-à-vis des tumeurs faiblement immunogènes 217 . De plus, le traitement à l’aide d’un anticorps agoniste anti-GITR permet de reverser l’état de tolérance des cellules T via l’atténuation de la fonction suppressive des Tregs 218. D’autres études ont montré que l’élimination des Tregs circulants par un traitement au cyclophosphamide restore la réponse antitumorale 219,220. Ces résultats prometteurs ont permis de mettre en place une approche thérapeutique visant à éliminer cette population cellulaire chez l’homme en utilisant un médicament appelé OntakR. Celui-ci se compose de la chaîne entière de l’IL-2 fusionnée avec le domaine de translocation et enzymatique de la toxine diphtérique. L’endocytose de ce complexe par les cellules CD25+ provoque l’inhibition de la synthèse protéique conduisant à la mort cellulaire par apoptose 213. 5.2.3 Tolérance immunitaire due aux cellules myéloïdes immatures Définitions Chez la souris, les cellules myéloïdes sont caractérisées par le phénotype GR1+CD11b+. L’antigène de différenciation de la lignée myéloïde GR1 (Ly6G) est exprimé sur les précurseurs myéloïdes, les granulocytes et de manière transitoire sur les monocytes (Mac-1) est une intégrine α M 221 . Le récepteur CD11b qui est exprimée sur la surface des monocytes/macrophages, les granulocytes, les DC ainsi que sur les lymphocytes B et T activés. Les cellules GR1+CD11b+ représentent environ 20 à 30 % des cellules de la moëlle osseuse et 2 à 4 % des cellules spléniques chez une souris saine. Des études ont montré que la proportion des cellules GR1+CD11b+, dans la rate de souris porteuses de tumeur, peut augmenter jusqu’à 50% des splénocytes totaux 222-227 . L’analyse morphologique a montré que ces cellules myéloïdes GR1+CD11b+ constituent une population hétérogène de cellules composées de macrophages, de granulocytes, de DC ainsi que d’autres précurseurs myéloïdes à des stades précoces de différenciation 228. 41 Figure 5 : Modèle de la voie de signalisation médiée par le facteur de transcription STAT3 dans la différenciation des cellules myéloïdes immatures en cellules dendritiques. La liaison de la cytokine (ex : VEGF sécrété par les cellules tumorales) à son récepteur active la voie de signalisation JAK-STAT. L'hyperactivation du facteur de transcription STAT3 bloque la différenciation des cellules myéloïdes immatures en cellules dendritiques. " Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic cells defects: Gabrilovich,DI" 42 Cette population hétérogène de cellules indifférenciées GR1+CD11b+ est appelée cellules myéloïdes suppressives ou Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC) 229. Les données récentes provenant de plusieurs équipes de chercheurs ont montré que des cellules myéloïdes qui s’accumulent dans la rate et dans certains ganglions lymphatiques d’individus cancéreux jouent un rôle important dans la suppression de la réponse antitumorale médiée par les cellules T 221,224,230,231 . Des auteurs ont montré que l’ablation chirurgicale des tumeurs murines réduit le nombre des cellules myéloïdes immatures dans le sang 232. Chez les patients cancéreux, les MDSC sont définis comme des cellules qui expriment le marqueur myéloïde CD33 mais qui ont perdu certains marqueurs myéloïdes et lymphoïdes ainsi que la molécule de CMH de classe II HLA-DR 233. Les voies de différenciation des MDSC dans un état de cancer Des études ont montré qu’en présence du facteur de croissance GMCSF, les cellules myéloïdes immatures GR1+ issues de souris portant des tumeurs peuvent se différencier in vitro en cellules dendritiques, en granulocytes et en macrophages. Des résultats similaires ont été obtenus, in vivo, après un transfert adoptif de cellules myéloïdes immatures GR1+ dans une souris saine 231 . Ces résultats montrent que l’accumulation des MDSC dans le sang et dans la rate des souris cancéreuses résulte d’un défaut de différenciation des progéniteurs en DC et en macrophages. En effet, une étude a montré que l’administration du facteur recombinant VEGF dans des souris naïves inhibe le développement des DC et est associée à une augmentation du nombre de cellules myéloïdes immatures GR1+ dans le sang et la rate 183,234. Ces résultats suggèrent que des facteurs solubles produits par les cellules tumorales peuvent altérer la différenciation des progéniteurs issus de la moëlle osseuse en DC. Des études complémentaires à celles-ci ont identifié les mécanismes moléculaires responsables du défaut de différenciation des MDSC. En effet, des chercheurs ont montré que les facteurs sécrétés par les tumeurs activent la voie de signalisation JAK2/STAT3 dans les cellules myéloïdes immatures qui, dès lors, ne sont plus capables de se différencier en DC (Figure 5) 206. Un autre mécanisme a été également identifié : des auteurs ont montré que les MDSC provenant de souris porteuses de tumeurs produisent de grandes quantités de réactifs oxydatifs ROS (reactive oxygen species) tels que H2O2 et la catalase. Ils ont également montré que les facteurs sécrétés par les cellules tumorales comme le VEGF induisent la production de ROS qui maintient l’état indifférencié des MDSC 231. 43 Figure 6 : Modèle proposé d'une régulation négative de l'activité des CTL par les cellules GR1+CD11b+ productrices de TGFβ. Les NKT activés produisent de l'interleukine-13 qui se lie au récepteur (IL-13R) exprimé à la surface des cellules GR1+CD11b+. La liaison de l'IL-13 à son ligand active la voie de signalisation STAT6 qui est responsable de la transcription du gène codant pour le TFGβ. Le TGFβ actif produit par les cellules GR1+CD11b+ inhibe la lyse des cellules tumorales par les CTL. " Transforming Growth Factor-Production and Myeloid Cells Are an Effector Mechanism through Which CD1d-restricted T Cells Block Cytotoxic T Lymphocyte– mediated Tumor Immunosurveillance: Abrogation Prevents Tumor Recurrence : Terabe et al." 44 Plusieurs auteurs pensent que les MDSC sont des macrophages associés aux tumeurs (TAM). Les TAM sont des cellules inflammatoires connues pour promouvoir la croissance des tumeurs et la formation de métastases 235,236 et jouent également un rôle important dans la suppression des réponses immunes 237,238. Comme nous l’avons dit précédemment, les MDSC issues de souris portant des tumeurs peuvent se différencier, in vitro, en macrophages en présence du facteur de croissance GMCSF 222,239. Un groupe de chercheurs a montré que les MDSC peuvent être une source de TAM. En effet, ils ont montré, par un transfert adoptif de cellules MDSC GR1+ dans des souris portant des tumeurs, que plus de 70% de cellules transférées et isolées au sein des tumeurs des souris receveuses sont positives pour le marqueur F4/80 (marqueur des macrophages) 237. Ces résultats suggèrent que les cellules MDSC GR1+ pourraient être des précurseurs de TAM F4/80+. D’autres travaux de recherche ont montré que les MDSC sont également des précurseurs de cellules endothéliales (EC) qui jouent un rôle direct dans la vascularisation de la tumeur. En effet, Yang et al. ont démontré que les cellules GR1+CD11b+ se différenciant en EC fusionnent avec l’endothélium vasculaire, favorisant ainsi la vascularisation et la croissance de la tumeur 240 . De plus, les cellules GR1+CD11b+ provenant de souris portant des tumeurs produisent de grandes quantités de MMP9 qui est impliqué dans la régulation de l’angiogenèse. Les auteurs suggèrent que MMP9 produit par ces cellules immatures régule la biodisponibilité du facteur VEGF dans les tumeurs afin de promouvoir l’angiogenèse et la stabilité vasculaire 240. Mécanismes de suppression de la réponse immune médiés par les MDSC Plusieurs travaux de recherche ont montré que l’expansion des MDSC est associée à une suppression de la réponse T antitumorale. Plusieurs mécanismes potentiels ont été décrits récemment : la production de TGFβ, le étabolisme m de la L -arginine, les ROS ainsi que l’induction de cellules Tregs. A) Production de TGFβ Young et al. montrent que le TGFβ et le NO produits par les MDSC sont les principaux médiateurs responsables de la suppression de la prolifération des cellules T 241 . Terabe et al. ont proposé un mécanisme de suppression de la réponse antitumorale basé sur leurs résultats expérimentaux. Ils montrent que les cellules NKT CD1d+ qui produisent de l’IL-13, suite à l’inoculation de la tumeur chez la souris, active la production de TGFβ par les MDSC GR1+qui inhibe l’activation des CTL (Figure 6) 59,60,242,243. 45 B) Métabolisme de la L-arginine Un autre mécanisme faisant intervenir le métabolisme de l’arginine dans les MDSC a été identifié comme étant responsable du dysfonctionnement des cellules T. La L-arginine est le substrat de deux enzymes : l’iNOS qui génère le NO et la citrulline ainsi que l’arginase 1 qui converti la Larginine en urée et la L-ornithine. Rodriguez et al. ont montré, par des expériences in vitro, que l’activité élevée de l’arginase 1 dans les MDSC module l’expression de la chaîne CD3ζ qui est le principal composant du complexe TCR des lymphocytes T. Ce résultat suggère que le défaut d’expression de la chaîne CD3 ζ pourrait être responsable du dysfonctionnement des LT 244-246 . Otsuji et al. a montré que les ROS (principalement le NO, l’H2O2) produits par les cellules GR1+CD11b+,dans un modèle murin, inhibent et ou diminuent l’expression de la chaîne CD3ζ par les cellules T 247 . Schmielau et Finn ont observé également dans le sang des patients cancéreux une accumulation de cellules myéloïdes possédant un phénotype de granulocyte qui corrèle avec une diminution de l’expression de la chaîne CD3 ζ des cellules T. Ils ont également montré que l’inhibition de la production de cytokines (telles que l’IFNγ) par les cellules T estédiée m par l’ H2O2 248. D’autres études réalisées par Kusmartsev et al. ont montré que les ROS produits par les MDSC peuvent inhiber la production d’IFNγ par les cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène 249 . Ces auteurs ont également montré que la production de ROS peut être supprimée par des inhibiteurs de l’arginase 1, restaurant ainsi la production d’ IFNγ par les LT CD8+. Ce résultat suggère que l’activité de l’arginase 1 joue un rôle majeur dans l’accumulation de ROS dans les MDSC 249. De manière intéressante, ils ont également montré que des MDSC interagissant avec des LT CD8+ spécifiques de l’antigène produisent plus de ROS. Et que l’augmentation de la production de ROS par les MDSC est indépendante de la production d’IFNγ par les cellules T mais est dépendante des intégrines CD11b, CD18 ainsi que CD29 249. C) Induction de cellules Tregs Les cellules T régulatrices, comme nous l’avons expliqué dans le point précédent, sont capables d’inhiber les réponses T antitumorales. Des auteurs ont montré qu’une sous population de MDSC GR1+CD115+ est non seulement capable de supprimer la prolifération des cellules T in vitro, mais induit également le développement des cellules T régulatrices CD4+ CD25+ Foxp3+ in vivo 228 . Dans cette étude, les chercheurs ont démontré que le développement des cellules Tregs requiert la présentation du peptide antigénique en présence d’IFNγ et d’IL-10 mais pas du NO 228. 46 6. INTÉRÊT MÉDICAL : DES CONCEPTS AU TRAITEMENT DES TUMEURS Les connaissances acquises récemment sur l’immunité antitumorale ont permis de mieux comprendre la régulation de la réponse immune dans le contexte tumoral et de définir les points faibles du système immunitaire à améliorer afin de mettre en place une réponse immunitaire efficace. Ce que l’on attend, aujourd’hui, de la thérapie du cancer est l’éradication complète des cellules néoplasiques sans affecter les cellules normales, et cela quelle que soit leur localisation, notamment dans le cas des métastases. L’idée d’amplifier sur le plan qualitatif et quantitatif, in vitro ou in vivo, les effecteurs de la réponse immunitaire antitumorale est le concept de base. Les stratégies thérapeutiques sont très variées allant de la chimiothérapie à l’immunothérapie. 6.1 L’IMMUNOTHÉRAPIE L'immunothérapie est un traitement qui consiste à administrer des substances qui vont stimuler les défenses immunitaires de l'organisme afin de lutter contre différentes maladies, en particulier certains cancers hématologiques ainsi que les maladies dégénératives. Par extension, l'immunothérapie désigne également toute thérapie utilisant des protéines produites par les cellules du système immunitaire, en particulier les immunoglobulines, sans que l'objectif de cette thérapie soit nécessairement la stimulation de l'immunité. Les expériences pionnières de l’équipe de Rosenberg 88,89,250,251 d’immunothérapie cellulaire, chez la souris, ont montré que l’injection de lymphocytes LAK (Lymphokine Activated Killer) permet de réduire la taille et le nombre de métastases pulmonaires. De plus, ces chercheurs ont montré que l’injection d’IL-2 potentialise l’efficacité des cellules LAK transférées dans leur modèle tumoral. Ces résultats observés sur les tumeurs murines ayant été confirmées par d’autres équipes, des essais cliniques, chez l’homme, ont été envisagés dans le traitement du mélanome et du cancer du rein. Ceux-ci ont consisté à transférer chez les patients atteints de cancer, des lymphocytes LAK ou des TILs afin de détruire les lésions tumorales. Des réponses objectives ont pu être observées dans 35 % des cas, et des régressions de cancers métastatiques dans 20 % des cas 250,251. Les données expérimentales ont permis également d’envisager d’utiliser certaines cytokines (IFNγ, GMCSF, IL-12, IL-2, TRAIL) dans un but d’immunothérapie des cancers 172,252 . Ces 47 différentes protéines recombinantes peuvent agir directement au niveau de la présentation antigénique, la cytotoxicité des cellules effectrices, l’angiogenèse des tumeurs, ou encore l’apoptose des cellules tumorales. Cependant, cette approche immunothérapeutique n’a pas permis d’obtenir des résultats cliniques performants. En effet, si nous devions considérer la complexité du réseau de communication de cytokines (synergie et antagonisme, rétrocontrôles positif et négatif), il n’est pas surprenant que l’utilisation d’une seule cytokine en immunothérapie présente quelques difficultés. Depuis la découverte des premiers antigènes de tumeur, plus de 80 peptides antigéniques ont été caractérisés. Actuellement, une centaine d’essais cliniques de thérapie vaccinale du cancer sont référencés par le NCI (National Cancer Institute, USA) (http://cancernet.nci.nih.gov). Certains de ces essais utilisent des peptides antigéniques seuls ou chargés sur des cellules dendritiques en combinaison ou pas à des cytokines. Par exemple, le vaccin thérapeutique MVAMUC1-IL2 contenant l’antigène tumoral MUC1, l’antigène MVA issu du virus de la vaccine atténué capable d’induire une réponse immunitaire importante contre les antigènes ainsi que l’interleukine 2 permet de traiter le cancer du poumon et le cancer de la prostate. 6.2 LA CHIMIOTHÉRAPIE La chimiothérapie est l'usage de certaines substances chimiques pour traiter une maladie. La première utilisation connue de la chimiothérapie remonte à l'usage de l'écorce de quina par les Indiens du Pérou dans le but de traiter certaines fièvres telles que la malaria. Le père de la chimiothérapie moderne est Paul Ehrlich qui, en 1909, a découvert l'arsphénamine, un composé d’arsenic utilisé pour traiter la syphilis. Plus tard, vinrent les sulfamidés découverts par Domagk et la pénicilline G découverte en 1929 par Alexander Fleming. La majorité des substances chimiothérapeutiques fonctionnent par arrêt de la mitose (division cellulaire) en ciblant efficacement les cellules se divisant trop rapidement. Comme ces substances peuvent endommager les cellules, elles sont dites « cytotoxiques ». Certaines de ces molécules provoquent l'apoptose de la cellule. 48 Figure 7 : Effets de la chimiothérapie sur les cellules tumorales et immunogénicité. Certains agents chimiothérapeutiques (classe des anthracyclines) favorisent la production de complexes eIF2α qui conduit à une rapide translocation d'une protéine chaperonne nommée la calréticuline (CRT) à la surface des cellules tumorales apoptotiques. La calréticuline reconnue par les récepteurs des cellules dendritiques favorise la phagocytose des cellules tumorales apoptotiques. " D'après le rapport d'Obeid et al. A good death for tumor immunology : Storkus,WJ" 49 Malheureusement, les chercheurs ne sont pas, à ce jour, capables de localiser des caractéristiques particulières des cellules malignes, qui les rendraient précisément identifiables. Cela implique la destruction d’autres cellules saines de l’organisme à division rapide. Il existe plusieurs catégories de médicaments en chimiothérapie : les agents alkylants, les antimétabolites, les alcaloïdes végétaux, les inhibiteurs de la topoisomérase ainsi que les antibiotiques antitumoraux. Tous ces médicaments affectent à un certain point la mitose, la synthèse et la fonction de l'ADN. Certains nouveaux agents n'agissent pas directement sur l'ADN. C'est le cas du nouvel inhibiteur de la tyrosine kinase, l’imatinib mesylate ou GLEEVEC, qui cible directement une anomalie moléculaire chez certains types de cancer (« chromosome de Philadelphie » résultant de la translocation des chromosomes 9 et 22 [nommée t(9 ; 22)(q34 ; q11) ] qui est responsable de certaines leucémies). Des données obtenues récemment ont permis de « redéfinir » l’utilisation de certains agents chimiothérapeutiques dans le traitement du cancer. Des études pionnières ont montré que l’induction de la mort des cellules tumorales par apoptose était faiblement immunogène voir tolérogène contrairement au phénomène de nécrose 253-255. Les cellules tumorales apoptotiques ou nécrotiques induites par un traitement chimiothérapeutique peuvent être une source importante d’antigènes pouvant être présentés par les DC aux LT. Les récents travaux d’Obeid et al. 256 suggèrent que certains agents chimiothérapeutiques peuvent induire l’apoptose des cellules tumorales d’une manière « plus immunogénique » que d’autres. En effet, ces chercheurs ont induit l’apoptose des cellules tumorales à l’aide de différents agents chimiothérapeutiques, ensuite, ils ont testé si la vaccination à l’aide de ces cellules tumorales apoptotiques permet de mettre en place une réponse immune protectrice dans un modèle murin de carcinome colorectal. Cette expérience a montré qu’une classe d’agents chimiothérapeutiques, en particulier les antracyclines (Doxorubicine, Idarubicine, Mitoxantrone) peuvent induire la formation de cellules tumorales apoptotiques fortement immunogènes. Ces chercheurs ont également montré que l’efficacité de ce vaccin corrèle avec la capacité du traitement à induire la mobilisation rapide d’une molécule intracellulaire chaperonne nommée la calreticuline (CRT) à la surface des cellules tumorales apoptotiques. Ils ont montré, in vitro, que les cellules tumorales qui expriment à la surface la CRT sont phagocytées par les DC (Figure 7) 257 . De manière intéressante, ces chercheurs ont montré que la vaccination à l’aide de ces mêmes DC traitées in vitro induit la régression des tumeurs chez toutes les souris vaccinées et que ce rejet tumoral est médié par les LT CD4+ et T CD8+. 50 Figure 8 : Biotransformation du cyclophosphamide dans le foie. Après administration orale du cyclophosphamide, la molécule est biotransformée dans les hépatocytes par les enzymes microsomiales (en particulier, le cytochrome P450) en deux métabolites actifs : la phosphoramide (ou la moutarde azotée) et l'acroléine. 51 Enfin, ces chercheurs ont montré que la vaccination à l’aide de cellules tumorales traitées à l’aide de la protéine recombinante CRT n’active pas une réponse immune spécifique. Ces données montrent que la translocation intracellulaire de la CRT induite par les antracyclines joue un rôle critique dans la réponse antitumorale. Il a été rapporté par d’autres études que la CRT peut lier des protéines solubles telles que C1q et la thrombospondine TSP-1 qui sont reconnus par les récepteurs C1qR et CD36-αVβ3 des DC 258,259 . La reconnaissance de ce complexe ligand-récepteur pourrait expliquer la phagocytose des cellules tumorales apoptotiques par les DC. 6.2.1 Le cyclophosphamide (CTX) Généralités Le cyclophosphamide (EndoxanR) est un agent chimiothérapique dont l'utilisation est réservée dans le traitement du cancer (lymphomes malins hodgkiniens et non hodgkiniens, myélomes, cancers ovariens, leucémies aiguës) ainsi que dans certaines maladies auto-immunes. Le cyclophosphamide appartient à la famille des agents alkylants. Ceux-ci sont ainsi nommés grâce à leur capacité à ajouter un groupe alkyle à des groupes électronégatifs dans certaines conditions notamment présentes dans les cellules cancéreuses. L’ajout de ce groupe alkyle permet de lier ensemble les nucléotides guanines présents dans la double hélice d'ADN. Par conséquent, les deux brins d’ADN ne peuvent ni se dérouler ni se séparer, ce qui entraîne pour la cellule l’incapacité à répliquer son ADN, et donc de se diviser. Après administration orale du cyclophosphamide, la molécule est biotransformée dans les hépatocytes par les enzymes microsomiales, en particulier le cytochrome P450, en ses métabolites actifs : la phosphoramide et l’acroléine (Figure 8). La phosphoramide est l’agent le plus actif, celui qui induit une alkylation de l’ADN avec inhibition de sa réplication et donc de l’entrée en mitose. Des études ont montré que l’acroléine qui se lie à des groupes sulfhydriques présents sur les protéines et les peptides est responsable de l’effet toxique du cyclophosphamide 260,261 . La cystite hémorragique, liée à la toxicité de l’acroléine, est l’une des complications majeures d’un traitement anticancéreux utilisant le cyclophosphamide. D’autres complications hématologiques, entre autre la myélosuppression, surtout de type leucopénie, constitue un facteur limitant du traitement. Après administration intraveineuse, une leucopénie apparaît en général entre le 8 ième et le 12 ième jour et la récupération demande 18 à 25 jours. 52 Effet du cyclophosphamide sur la réponse immunitaire Les premières études réalisées par Maguire et Ettore 262 en 1967 ont montré qu’un pré-traitement au cyclophosphamide peut augmenter l’amplitude de la réponse immune induite, telle une réaction d’hypersensibilité (DTH). Des auteurs ont suggéré une explication aux premières observations de Maguire et Ettore. En effet, ils ont montré que les précurseurs de cellules T suppressives sont particulièrement sensibles à l’action du phosphoramide. Ces auteurs montrent que l’élimination de ces précurseurs corrèle avec une augmentation de l’amplitude de la réponse immune 263 . Récemment, des rapports scientifiques montrent que l’élimination des cellules T régulatrices CD4+CD25+ (qui sont des cellules T suppressives) par le cyclophosphamide augmente l’amplitude de la réponse immune et favorise l’immunothérapie 264,265 , ce qui confirme les résultats pionniers obtenus par Maguire et Ettore. Le cyclophosphamide peut également induire la production, par les splénocytes, d’IFN de type I qui favorise la survie des cellules T spécifiques de l’antigène 266. Des études ont montré que l’administration seule de l’acroléine un jour avant la mise en place d’une réaction d’hypersensibilité DTH ou d’une réponse humorale médiée par les cellules productrices d’anticorps de type IgM (AFC) augmente l’amplitude de la réponse immune après sensibilisation des souris avec des cellules sanguines de mouton 267 . Cependant, Angulo et al. montrent que l’injection de cyclophosphamide induit des cellules myéloïdes suppressives qui suppriment la réponse T CD8+ 268. 53 But du Travail 54 La reconnaissance par le système immunitaire des tumeurs humaines et murines a été démontrée par le groupe du Professeur Boon qui a mis en évidence le premier antigène tumoral ciblé par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques 12,16,18,269 . Depuis, un grand nombre d’antigènes tumoraux ont été identifiés et leur utilisation dans le cadre d’une vaccination antitumorale semble prometteur. Cependant, les antigènes tumoraux sont des antigènes faiblement immunogènes et la réponse antitumorale induite est soit trop faible ou soit inefficace. Le but de notre travail a été d’étudier le rôle des différentes populations immunes dans la résistance antitumorale. Nous avons utilisé comme modèle le mastocytome P815, une tumeur faiblement immunogène qui exprime cinq antigènes tumoraux dont l’antigène P815A (codé par le gène P1A) qui est l’antigène le plus fréquemment perdu par les cellules tumorales P815 et permet donc à celles-ci d’échapper à la réponse antitumorale 9 et nous avons injecté le cyclophosphamide, un agent chimiothérapeutique utilisé dans les protocoles cliniques anticancéreux, qui permet le rejet du mastocytome P815 dans 100% des souris traitées. Nous avons comparé les cellules spléniques et les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs P815 mises en jeu lors de la régression de la tumeur induite après un traitement au CTX et lors de la tumeur en phase de progression. Nous avons en particulier étudié le rôle des : 1) populations immunitaires suppressives telles que les cellules myéloïdes suppressives (MDSC) et les cellules T régulatrices. 2) populations immunitaires effectrices tels que les lymphocytes T CD4+ et CD8+ ainsi que les cellules dendritiques. 55 Résultats 56 1. Effet de l’injection de cellules dendritiques chargées de peptides tumoraux sur la croissance d’une tumeur préétablie. Les DC matures ont la capacité de présenter des antigènes associés aux molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I et II et d’activer une réponse immune spécifique contre l’antigène présenté. De nombreux antigènes tumoraux, exprimés sélectivement par les cellules cancéreuses, ont pu être clonés ces dernières années. Nous avons utilisé des cellules dendritiques dérivées de la moëlle osseuse (BMDC), maturées en présence d’un composant de la paroi bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS), et chargées de peptides tumoraux afin de vacciner des souris contre une tumeur préétablie depuis quelques jours. Pour cela, nous avons utilisé deux modèles tumoraux différents à savoir une tumeur « artificielle » appelée EG7-OVA qui est un thymome (EL-4) dans lequel le gène complet de l’ovalbumine a été transfecté. Cette tumeur EG7-OVA expose donc à sa surface des peptides de l’ovalbumine (peptide OVA). L’autre modèle tumoral que nous avons également utilisé est le mastocytome P815 (clone PHRT-3). Pour rappel, la tumeur P815 exprime un antigène dominant qui est le produit du gène P1A ( cette étude est réalisée en collaboration avec l’équipe du Dr Benoît Van den Eynde : Institut de pathologie cellulaire Christian de Duve (ICP) : UCL ). Modèle tumoral EG7-OVA Les cellules tumorales EG7-OVA sont injectées par voie sous-cutanée à raison de 5x106 cellules dans le flanc droit de souris C57BL/6. Cinq jours plus tard, deux groupes de 10 souris sont vaccinés par quatre injections de BMDC activées au LPS et chargées ou non du peptide OVA I (SIINFEKL) à raison de 3x105 cellules/patte arrière. Le peptide OVA I est présenté dans le contexte des molécules du CMH de classe I de type H-2Kb. Les immunisations sont espacées de quatre jours. Nous avons évalué la réponse antitumorale en terme de rejet de la tumeur préimplantée. Les résultats présentés dans la figure 1A montrent que l’injection de BMDC chargées de peptides OVA I induit le rejet de la tumeur EG7-OVA dans 60 à 70 % des souris traitées alors que 20 % des souris vaccinées à l’aide de BMDC non chargées de peptides OVA I rejettent spontanément la tumeur. 57 % de souris rejetant la tumeur Tumeur EG7-OVA Figure 1A : Pourcentage de souris rejetant la tumeur EG7-OVA, in vivo, après immunisation à l'aide de BMDC chargées ou non de peptide tumoral. 80 60 40 20 0 BMDC BMDC+OVAI Tumeur P815 5x106 cellules tumorales de la lignée EG7-OVA sont injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de souris C57BL/6. Les souris (10 souris/groupe) sont ensuite vaccinées par 4 injections de BMDC matures cultivées en présence de LPS et chargées ou non de peptides OVA (SIINFELKL) à raison de 3x105 cellules/patte arrière. Les immunisations sont espacées de 4 jours. La réponse antitumorale est évaluée en terme de rejet total de la tumeur. Cette expérience a été réalisée 5 fois et des résultats similaires ont été obtenus. Les résultats sont exprimés en pourcentage de rejet (ce pourcentage correspond au nombre de souris ayant rejeté totalement la tumeur) et représentent la moyenne ± SD de 5 expériences. Volume tumoral (mm3) BMDC 8000 6000 Figure 1B : Evolution du mastocytome P815, in vivo, après immunisation à l'aide de BMDC chargées ou non de peptide P1A au cours du temps. 4000 2000 0 Volume tumoral (mm3) J11 J13 J15 J17 J19 8000 BMDC + P1A 6000 106 cellules tumorales P815 (clone PHRT-3) sont injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de 2 groupes de 10 souris DBA/2. Cinq jours plus tard, les souris sont immunisées à quatre reprises à l'aide de BMDC matures cultivées en présence de LPS et chargées ou non de peptide P1A. Le volume de la tumeur exprimé en mm3 a été estimé tous les deux jours. Des résultats similaires ont été obtenus dans quatre expériences indépendantes. 4000 2000 0 J11 J13 J15 J17 J19 Jours après inoculation de la tumeur 58 Modèle tumoral P815 Nous avons testé si la vaccination à l’aide de BMDC chargées de peptides tumoraux activerait le rejet d’une autre tumeur préétablie (tumeur P815). Les cellules tumorales de la lignée P815 sont injectées par voie sous-cutanée à raison de 106 cellules dans le flanc droit de deux groupes de 10 souris DBA/2. Cinq jours plus tard, les souris sont immunisées à quatre reprises à l’aide de BMDC activées au LPS et chargées ou non de peptide P1A. Le peptide P1A est présenté dans le contexte des molécules du CMH de classe I H-2Ld. La figure 1B indique la croissance de la tumeur (exprimée en mm3) de chaque individu au cours du temps et montre que la vaccination à l’aide de BMDC chargées de peptides P1A n’induit pas le rejet de la tumeur P815 contrairement au modèle tumoral EG7-OVA résultant à 100 % de mortalité dans les deux groupes de souris. Nous pouvons également observer dans cette figure que le volume de la tumeur P815 a diminué au jour 15 pour ensuite augmenter de manière rapide au jour 17 dans les groupes de souris vaccinées à l’aide de BMDC chargées ou non de peptides P1A. Ce résultat suggère que la réponse antitumorale spontanée mise en place a été soit supprimée, soit est trop faible. 2. Un traitement au cyclophosphamide induit le rejet du mastocytome P815 in vivo. Nous avons utilisé le cyclophosphamide (CTX), un agent alkylant utilisé en chimiothérapie anticancéreuse, connu pour induire sous certaines conditions expérimentales le rejet de plusieurs types de tumeurs murines en modulant l’interaction des cellules du stroma tumoral 270. Nous avons testé dans un premier temps si cet agent chimiothérapeutique a un effet sur une tumeur P815 préétablie depuis quelques jours. Les cellules tumorales de la lignée P815 sont injectées par voie sous-cutanée à raison de 106 cellules dans le flanc droit de deux groupes de 6 souris DBA/2. Dix jours après implantation des cellules tumorales, une dose de 4 mg de CTX est administrée à chaque souris par voie intrapéritonéale. Un rejet rapide (entre 24 et 48h) qui se traduit par la disparition complète de la tumeur a été observé dans tous les individus traités. Par contre, les souris non traitées ne rejettent pas la tumeur et meurent au bout de 40 jours (résultats non présentés). Un résultat semblable a été observé lorsque des souris porteuses de tumeurs établies depuis 25 jours sont traitées au CTX. La figure 2 indique le volume de la tumeur de chaque individu au cours du temps. 59 B) P815+CTX 8000 Volume tumoral (mm3) Volume tumoral (mm3) A) 6000 4000 2000 0 -2000 J25 J28 P815 8000 6000 4000 2000 0 -2000 J31 Jours après inoculation de la tumeur J25 J28 J31 Jours après inoculation de la tumeur C) Nbre de souris 7 6 5 4 3 2 1 0 P815 P815+CTX J25 J28 J31 J34 J37 J40 J43 Jours après inoculation de la tumeur Figure 2 : L'injection de cyclophosphamide (CTX) induit le rejet du mastocytome P815. 2x106 cellules tumorales P815 (clone PHRT-3) sont injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de 2 groupes de 6 souris DBA/2. 25 jours après implantation des cellules tumorales, une dose de CTX (4mg) est administrée par voie intrapéritonéale dans un groupe de souris (P815+CTX). Les graphiques A et B indiquent le volume de la tumeur au cours du temps lorsque les souris sont traitées (P815+CTX) ou non au CTX (P815). Chaque point indique le volume de la tumeur d'une souris. Le graphe C représente la courbe de survie des souris traitées ou non au CTX. Cette expérience a été réalisée à 5 reprises et des résultats similaires ont été obtenus. 60 Lorsqu’un groupe de souris reçoit une dose de CTX 25 jours après l’implantation de la tumeur, un rejet est observé 72h après le traitement, en effet, le volume de la tumeur a diminué considérablement après un traitement au CTX (le volume moyen tumoral dans le groupe de souris non traitées est passé de 4131 mm3 à 613 mm3 dans le groupe de souris traitées au CTX). Six jours après le traitement, toutes les souris ont complètement rejeté la tumeur et sont toujours vivantes après 40 jours (Fig. 2A,C). Par contre, les souris non traitées ne rejettent pas la tumeur et meurent toutes au bout de 43 jours (Fig. 2B,C). Nous avons ensuite tenté d’identifier les mécanismes qui sont à la base du rejet de la tumeur P815 lorsque le CTX est administré aux souris, et particulièrement, la contribution des cellules immunes dans ce rejet. 3. Analyse des populations immunes suite à l’administration de cyclophosphamide. 3.1 Les cellules myéloïdes GR1+CD11b+ Plusieurs travaux ont montré l’accumulation de cellules myéloïdes qui expriment les molécules GR1+ et CD11b+ dans la rate de souris porteuses de tumeurs 222,223,233 . Ces cellules s’infiltrent dans une tumeur et semblent participer à l’angiogenèse de la tumeur en fusionnant avec les cellules de l’endothélium vasculaire afin d’accroître la vascularisation 240 . D’autres études ont attribué aux cellules myéloïdes GR1+CD11b+ un rôle activateur ou inhibiteur de la réponse antitumorale. Le rôle de ces cellules dans la réponse immune et en particulier, la réponse antitumorale n’est pas bien définie. Notre objectif est donc d’évaluer la fonction de ces cellules dans la régulation de la réponse antitumorale. 3.1.1 Le cyclophosphamide diminue le pourcentage des cellules spléniques CD11b+ qui expriment de manière modérée le marqueur GR1. Dans un premier temps, nous avons analysé par cytométrie de flux, la présence de cellules qui coexpriment les marqueurs GR1 et CD11b dans la rate de souris porteuses de tumeurs établies depuis 17 jours. Nous pouvons distinguer dans la figure 3A deux sous populations de cellules qui co-expriment les marqueurs GR1 et CD11b dans la rate de souris porteuses de tumeurs. Nous avons défini ces 2 sous populations sur base de l’expression du marqueur GR1. 61 A) NAIVE P815 GR1med GR1high P815+CTX GR1med GR1high GR1med GR1high CD11b GR1 7 6 5 4 3 2 1 0 Gr1med GR1high GR1med GR1high NAIVE 26,67 ± 6,66 3 2 9,33 ± 2,52 1 0,49 ± 0,33 0 NAIVE P815 P815+CTX % of GR1highCD11b+/spleen % of GR1medCD11b+/spleen % of GR1+CD11b+/spleen B) 65,33 ± 12,50 7 13,00 ± 7,10 6 5 4 23,33 ± 9,01 3 2 1 0 NAIVE P815 P815+CTX P815 Figure 3 : L'injection de CTX diminue GR1medCD11b+. le pourcentage des cellules spléniques Deux groupes de souris DBA/2 (n=4) ont été inoculés avec 2x106 cellules tumorales P815 au jour 0, un troisième groupe de souris n'a pas été injecté. Dix-sept jours après inoculation de la tumeur, les souris reçoivent par voie intrapéritonéale ( P815+CTX) ou pas (P815) une dose de 4mg de CTX. Deux jours plus tard, les rates sont prélevées et les cellules spléniques sont marquées à l'aide des anticorps anti-GR1 et anti-CD11b. Le pourcentage des cellules GR1+CD11b+ est analysé par cytométrie de flux. Le panel A montre les courbes de niveau d'expression des molécules GR1 et CD11b obtenues après analyse au cytomètre de flux d'une souris naïve (NAIVE), d'une souris porteuse de tumeur P815 non traitée au CTX (P815) et d'une souris porteuse de tumeur P815 traitée au CTX (P815+CTX). Le panel B montre les graphiques qui représentent le pourcentage de cellules exprimant les marqueurs CD11b et Gr1 pour les différents groupes de souris sous forme d'histogrammes. Les expériences ont été réalisées à quatre reprises et des résultats similaires ont été obtenus. Les résultats représentent la moyenne des pourcentages des cellules étudiées parmi les cellules totales spléniques de chaque individu ± SD. Les résultats obtenus sont représentatifs de 4 expériences indépendantes. Les valeurs situées au dessus des barres d'histogramme représentent le nombre absolu des cellules étudiées parmi les cellules totales spléniques et sont exprimées en x105. 62 Une population cellulaire qui exprime fortement le marqueur GR1 que nous avons appelée GR1highCD11b+ ainsi qu’une autre population cellulaire exprimant modérément ce marqueur et que nous avons nommée GR1medCD11b+. Le pourcentage de ces deux sous populations augmente dans la rate de souris porteuses de tumeurs (2,2% ± 0,5% de cellules GR1medCD11b+ et 5,5% ± 1,1% de cellules GR1highCD11b+) comparée à celle de souris naïves (1,4% ± 0,2% de cellules GR1medCD11b+ et 3,3% ± 0,3% de cellules GR1highCD11b+) (Fig. 3B). Nous avons donc étudié l’effet du CTX sur les cellules spléniques GR1+CD11b+ de souris porteuses de tumeurs établies depuis 17 jours, 48h après le traitement. Les figures 3A et 3B montrent qu’un traitement au CTX diminue fortement le pourcentage de cellules GR1medCD11b+ dans la rate de souris porteuses de tumeurs (2,2% ± 0,5% pour le groupe P815 vers 0,1% ± 0,0% pour le groupe P815+CTX). Par contre, les pourcentages des cellules GR1highCD11b+ dans la rate de souris porteuses de tumeurs traitées au CTX et non traitées restent semblables. Etant donné que nous avons observé qu’un traitement au CTX diminue macroscopiquement la taille de la rate d’un facteur 2 ou 3 (résultat non présenté), nous avons également exprimé les résultats en nombre absolu de cellules. Ces valeurs exprimées en 105 cellules sont indiquées dans chaque graphique. 3.1.2 Les cellules spléniques GR1medCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs expriment l’ARN messager du TGFβ. L’élimination de la population cellulaire GR1medCD11b+ corrèle avec le rejet, in vivo, du mastocytome P815. Nous avons donc supposé que celle-ci peut supprimer la réponse spontanée antitumorale. Le TGFβ est largement écritd dans la littérature comme étant une cytokine immunosuppressive. Nous avons donc testé si les cellules GR1medCD11b+ produisent du TGFβ. Nous avons réalisé une PCR quantitative dans le but de déterminer le taux d’ARNm codant pour ce gène. Pour cela, nous avons isolé par cytométrie de flux les cellules GR1med à partir d’une population enrichie en cellules CD11b+ issues de rates de souris porteuses de tumeurs établies depuis 17 jours. Nous avons également isolé les cellules GR1high, comme contrôles, provenant de rates de souris porteuses de tumeurs traitées ou pas au CTX. Une RT-PCR quantitative est alors menée sur les ARNm extraits pour chacune de ces fractions. 63 Expression relative ARNm TGFb/ubiquitine Figure 4 : Les cellules GR1medCD11b+ expriment l'ARNm du TGFβ. 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 GR1medCD11b + GR1highCD11b + GR1highCD11b + P815 P815 + CTX P815 GR1med 2x106 cellules tumorales P815 sont injectées par voie souscutanée dans le flanc droit de souris DBA/2. 17 jours plus tard, un groupe de souris est traité avec 4mg de CTX. Deux jours plus tard, les différentes populations cellulaires GR1+ sont isolées par cytométrie de flux. Une RT-PCR est ensuite menée sur les ARNm extraits pour chacune des fractions. Les histogrammes représentent l'expression relative de l'ARNm spécifique du facteur de croissance tumoral TGFβ de chacune des fractions (qui est relativisée en fonction du gène de ménage ubiquitine). Cette expérience a été réalisée cinq fois et des résultats similaires ont été obtenus. GR1high P815+CTX high GR1med GR1 CD11b GR1 Gate:GR1highCD11b+ Gate:GR1highCD11b+ 84,3% 35,8% 15,7% CD86 64,2% CD11b CD11c CMH II Figure 5 : L'injection de CTX induit l'apparition de cellules spléniques GR1highCD11b+ qui expriment les molécules CD11c, CD86 et CMH II. 2x106 cellules tumorales P815 sont injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de souris DBA/2. 17 jours après implantation des cellules tumorales, un groupe de souris est traité avec 4mg de CTX (P815+CTX), l'autre groupe n'ayant pas été traité (P815). Deux jours plus tard, les rates sont prélevées et les cellules spléniques sont marquées à l'aide des anticorps anti-GR1, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD86 et anti-CMH II. Le phénotype des cellules GR1highCD11b+ est analysé par cytométrie de flux. Le panel de gauche représente les courbes de niveau d'expression des molécules GR1, CD11b ainsi que de la molécule CD11c au sein des cellules GR1highCD11b+. Le panel de droite montre l'expression de la molécule CD86 et l'expression de la molécule CMH II sous forme d'histogramme de la population cellulaireGR1highCD11b+. L' expérience a été réalisée à 5 reprises et des résultats similaires ont été obtenus. 64 De manière intéressante, nos résultats montrent que les cellules GR1medCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs expriment 13,8 fois plus d’ARN messagers codant pour le TGFβ que les cellules GR1highCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs traitées ou pas au CTX (Fig. 4). Nous n’avons pas détecté les messagers codant pour les interleukines 10 et 4 dans les cellules GR1medCD11b+ (résultats non présentés). Ce résultat suggère que les cellules GR1medCD11b+ pourraient supprimer la réponse antitumorale par un mécanisme faisant intervenir le TGFβ. 3.1.3 Le cyclophosphamide induit l’apparition de cellules spléniques GR1high CD11b+ qui expriment les marqueurs de maturation CD11c, CD86 et CMH II. Précédemment, nous avons montré que les pourcentages des cellules GR1highCD11b+ dans la rate de souris porteuses de tumeurs traitées au CTX et non traitées restent semblables (Fig. 3B). Nous nous sommes également intéressés à cette population qui est toujours présente dans la rate de souris dont la tumeur est en phase de rejet après un traitement au CTX (48h). Plusieurs auteurs ont décrit les cellules myéloïdes comme étant une population hétérogène de cellules immatures, c’est-à-dire des cellules n’ayant pas atteint leur stade final de différenciation. Ces cellules indifférenciées ne sont pas capables d’induire une réponse immunitaire efficace. Des travaux récents ont montré que ces cellules myéloïdes immatures peuvent se différencier in vitro en cellules dendritiques en présence de facteurs de croissance spécifiques 221. L’expression élevée du marqueur GR1 sur les cellules CD11b+ est une caractéristique des neutrophiles et pourrait suggérer que les cellules GR1highCD11b+ soient des neutrophiles. L’analyse par cytométrie de flux a montré que les cellules GR1highCD11b+ n’expriment pas le marqueur 1A8 qui est un marqueur spécifique des neutrophiles (résultat non présenté). Afin de tester si un traitement au CTX peut induire la maturation des cellules GR1highCD11b+ en cellules dendritiques, nous avons analysé par cytométrie de flux l’expression des molécules CD11c (marqueur de surface des cellules dendritiques) ainsi que celui des molécules du CMH II et CD86 nécessaires à la présentation antigénique, sur les cellules spléniques GR1highCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs établies depuis 17 jours traitées ou pas au CTX (48h). La figure 5 montre que le pourcentage des cellules GR1highCD11b+ qui expriment les molécules CD11c, CD86 et CMH II parmi les cellules GR1highCD11b+ totales augmente deux jours après un traitement au CTX (64,2%) contrairement au groupe de souris porteuses de tumeurs et non traitées (15,7%). Ce résultat suggère que le cyclophosphamide pourrait induire la maturation des cellules GR1highCD11b+ en cellules GR1highCD11b+CD11c+. 65 IL23p19/ubiquitine Expression relative ARNm Expression relative ARNm IFNγ/ubiquitine 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 GR1medCD11b + GR1highCD11b + P815 GR1highCD11b + 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 P815 + CTX GR1highCD11b + Expression relative ARNm P815 GR1highCD11b + P815 + CTX Expression relative ARNm iNOS/ubiquitine 400 300 200 100 0 GR1medCD11b + GR1highCD11b + P815 GR1highCD11b + P815 + CTX GR1highCD11b + P815 + CTX IL12p35/ubiquitine Expression relative ARNm GR1medCD11b + GR1highCD11b + P815 IL12p40/ubiquitine 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 GR1medCD11b + 250 200 150 100 50 0 GR1medCD11b + GR1highCD11b + P815 GR1highCD11b + P815 + CTX Figure 6 : Les différentes populations de cellules spléniques GR1highCD11b+ expriment des ARN messagers différents. 2x106 cellules tumorales P815 sont injectées par voie souscutanée dans le flanc droit de souris DBA/2. 17 après inoculation des cellules tumorales, un groupe de souris est traité avec 4mg de CTX. Deux jours plus tard, les différentes populations cellulaires GR1+ sont isolées par cytométrie de flux. Une RT-PCR est ensuite menée sur les ARNm extraits pour chacune des fractions. Les histogrammes représentent l'expression relative de l'ARNm spécifique du gène étudié des différentes fractions (qui est relativisée en fonction du gène de ménage ubiquitine). Cette expérience a été réalisée trois fois et des résultats similaires ont été obtenus. 66 3.1.4 Les cellules spléniques GR1highCD11b+ issues de souris traitées et non traitées au cyclophosphamide expriment des ARN messagers codant pour des cytokines différentes. Nous avons également testé par PCR quantitative le niveau d’expression des ARN messagers qui codent pour les interleukines 12, 10, 4, 23 ainsi que l’iNOS et l’IFNγ dans la ême m expérience décrite dans le point 3.1.2. Les résultats présentés dans la figure 6 montrent que les cellules spléniques GR1highCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs et traitées au CTX expriment 3 fois plus l’ARN messager codant pour l’IFNγ, 2,8 fois plus l’ARN messager codant pour l’IL-12p40, 1,8 fois plus l’ARN messager codant pour l’IL-12p35 et 27,3 fois plus l’ARN messager codant pour l’IL-23 que les cellules GR1highCD11b+ issues de souris non traitées. Par contre, les cellules GR1highCD11b+ issues de souris traitées au CTX expriment 7 fois moins d’ARN messager codant pour l’iNOS que les cellules GR1highCD11b+ issues de souris porteuses de tumeur et non traitées. Aucun messager codant pour les interleukines 10 et 4 n’a été détecté dans nos 3 types de cellules (résultats non présentés). Nous pouvons également remarquer dans cette figure que les cellules GR1medCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs et non traitées expriment peu les ARN messagers codant pour ces cytokines. Ces résultats suggèrent que les cellules GR1highCD11b+ issues de souris traitées au CTX pourraient contribuer à la mise en place d’une réponse immune de type TH1 contrairement aux cellules GR1highCD11b+ issues de souris non traitées qui, quant à elles, pourraient jouer un rôle dans la progression de la tumeur via l’expression d’iNOS. 3.1.5 Le transfert de cellules spléniques GR1+ issues de souris traitées au cyclophosphamide diminue la croissance de la tumeur P815 in vivo. Nous avons ensuite testé l’effet des cellules spléniques GR1highCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs et traitées au CTX sur la croissance d’une tumeur P815 in vivo. Pour cela, nous avons injecté par voie intraveineuse dans des souris receveuses porteuses de tumeurs établies depuis 6 jours, 2 x 107 cellules spléniques purifiées GR1+ ou GR1- issues de souris porteuses de tumeurs établies depuis 17 jours et traitées au CTX (48h). Nous avons vérifié par cytométrie de flux la pureté et le phénotype des cellules transférées. 67 Volume tumoral (mm3) 12500 Transfert GR1+ Transfert GR1pas de Transfert 10000 7500 5000 2500 0 J5 J9 J13 J17 J21 J5 J9 J13 J17 J21 J5 J9 J13 J17 J21 Jours après inoculation de la tumeur Figure 7 : Le transfert de cellules spléniques GR1+ issues de souris traitées au CTX diminue la croissance de la tumeur P815 in vivo. Des souris DBA/2 porteuses de tumeurs établies depuis 6 jours ont reçu, par voie intraveineuse, 2x107 cellules spléniques purifiées GR1+ ou GR1- issues de souris porteuses de tumeurs établies depuis 17 jours et traitées au CTX. Les histogrammes montrent l'évolution de la tumeur dans les différents groupes de souris (n=4) au cours du temps. Cette expérience a été réalisée à trois reprises et des résultats similaires ont été obtenus. Les résultats représentent la moyenne des volumes de tumeur de chaque individu exprimée en mm3 ± SD de 3 expériences indépendantes. P815+CTX (Tumeur en régression) P815 (Tumeur en progression) GR1 ZN 10X 10X Figure 8 : Localisation des cellules GR1+ au sein des tumeurs P815. Un marquage immunohistochimique à l'aide de l'anticorps anti-GR1 a été réalisé sur des coupes histologiques de tumeurs en phase de régression (48h après un traitement au CTX) (P815+CTX) et de tumeurs en phase de progression (P815). De nombreuses cellules GR1+ (bleu) se localisent principalement dans les zones de nécrose (ZN) des tumeurs en phase de régression. Dans les tumeurs en progression, peu de cellules GR1+ se localisent au sein des tumeurs. Des résultats similaires ont été obtenus dans quatre expériences indépendantes. 68 Les cellules transférées sont bien des cellules GR1highCD11b+ et sont pures à 96% (résultat non présenté). Nous avons ensuite évalué la croissance de la tumeur P815 au cours du temps. La figure 7 montre qu’un transfert de cellules GR1+ issues de souris porteuses de tumeurs et traitées au CTX diminue la croissance de la tumeur P815 in vivo. Ce résultat suggère qu’un traitement au CTX semble induire des cellules GR1highCD11b+ capables de moduler in vivo la croissance de la tumeur. 3.1.6 Les cellules GR1highCD11b+CD11c+ se localisent dans les zones de nécrose de tumeurs 48h après traitement au cyclophosphamide. Le résultat précédent semble suggérer un rôle potentiel des cellules GR1highCD11b+ au niveau de la tumeur. Nous avons donc analysé la présence et la localisation des cellules GR1+ au sein des tumeurs de souris traitées ou pas au CTX par les microscopies optique et confocale. Pour cela, nous avons prélevé et réalisé des coupes histologiques de tumeurs en phase de régression 48h après un traitement au CTX (P815 + CTX) ainsi que de tumeurs en phase de progression issues de souris non traitées au CTX (P815). Dans un premier temps, nous avons réalisé sur les coupes histologiques une coloration immunohistochimique à l’aide de l’anticorps anti-GR1 afin de localiser les cellules GR1+ au sein des tumeurs P815. La figure 8 montre que de nombreuses cellules GR1+ (en bleu) mises en évidence par la microscopie optique se localisent essentiellement dans les zones de nécrose (ZN) de tumeurs en phase de régression. Les zones de nécrose se distinguent aisément par une structure désorganisée du tapis cellulaire après un traitement au CTX. Par contre, dans les tumeurs en progression, ces zones cellulaires désorganisées sont absentes et peu de cellules GR1+ se localisent parmi les cellules tumorales. Nous avons ensuite analysé, par la microscopie confocale, la présence du marqueur CD11c sur les cellules GR1+ présentes dans les zones de nécrose de tumeur en phase de régression. Pour cela, nous avons utilisé des anticorps anti-CD11c et anti-GR1 qui révèlent respectivement les cellules CD11c+ en rouge et les cellules GR1+ en vert. La figure 9 montre que les cellules GR1+ situées dans les zones de nécrose de tumeurs en phase de régression (P815 + CTX) sont CD11c+ (la colocalisation des deux marqueurs montre des cellules de couleur jaune) contrairement aux cellules GR1+ situées dans les tumeurs en phase de progression (P815). 69 P815+CTX (Tumeur en régression) GR1 CD11c P815 (Tumeur en progression) Figure 9 : Les cellules GR1+CD11c+ se localisent dans les zones de nécrose de tumeurs 48h après un traitement au CTX. Un marquage immunohistochimique à l'aide des anticorps anti-GR1 et anti-CD11c a été réalisé sur des coupes histologiques de tumeurs en phase de régression (48h après un traitement au CTX) (P815+CTX) et de tumeurs en phase de progression (P815). Les cellules GR1+ apparaissent en vert, tandis que les cellules CD11c+ apparaissent en rouge en microscopie confocale. La colocalisation des deux marqueurs (panels de droite) sur les cellules apparaît en jaune. Des résultats similaires ont été obtenus dans quatre expériences indépendantes. 70 Toutes les cellules GR1+ présentes dans les tumeurs en phase de régression et en progression sont CD11b+ (résultat non présenté). Ces résultats montrent que les cellules GR1+CD11b+CD11c+ pourraient contribuer au rejet in vivo de la tumeur P815. 3.2 Les lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ 3.2.1 Le cyclophosphamide diminue le pourcentage des cellules CD4+Foxp3+ au sein du mastocytome P815. Des rapports récents indiquent que les cellules T régulatrices CD4+CD25+ sont particulièrement sensibles à l’action du CTX 220,271. Nous avons évalué, en collaboration avec Gwendoline Rahir et Nathalie Wathelet (thèses de doctorat) dans notre modèle tumoral P815, la proportion de lymphocytes T CD4+Foxp3+ parmi les cellules totales de la tumeur de souris porteuses de tumeurs et traitées au CTX. Quinze jours après l’implantation de la tumeur, les souris sont traitées au CTX (4mg). Les cellules issues d’une tumeur totale sont colorées, après dissociation, à l’aide des anticorps antiCD4 et anti-Foxp3 24h, 48h et 72h après un traitement au CTX. L’expression du marqueur Foxp3 qui est un facteur de transcription important pour l’activité suppressive des cellules T régulatrices et constitue donc un marqueur de choix pour identifier ces cellules ainsi que l’expression du marqueur CD4 sont analysées par cytométrie de flux. Le pourcentage de cellules CD4+Foxp3+ parmi les cellules totales issues de la tumeur est indiqué dans chaque graphique. Nos résultats montrent qu’une injection de CTX diminue le pourcentage des cellules T régulatrices au sein du mastocytome P815 au cours du temps (Fig. 10). Des résultats similaires ont été obtenus dans la rate des souris traitées au CTX (résultat non présenté). 71 A) P815 P815 + CTX 3,1% 1,4% Foxp3 CD4 Pourcentage de CD4+/Foxp3+ au sein du mastocytome P815 B) 7 % de CD4+/Foxp3+ 6 5 4 3 2 1 0 24h 48h P815 72h 24h 48h 72h P815 + CTX Figure 10 : L'injection de CTX diminue le pourcentage de cellules CD4+Foxp3+ au sein du mastocytome P815. 2x106 cellules tumorales P815 sont injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de souris DBA/2. 17 jours après implantation des cellules tumorales, un groupe de souris est traité avec 4mg de CTX (P815+CTX). Les tumeurs ont été prélevées 24h, 48h, 72h après traitement au CTX, les cellules sont ensuite dissociées et marquées à l'aide des anticorps anti-Foxp3 et anti-CD4. Le pourcentage des cellules CD4+Foxp3+ est analysé par cytométrie de flux. (A) Graphes représentant les courbes de niveau d'expression des molécules CD4 et Foxp3 d'une souris non traitée au CTX (P815) et d'une souris traitée au CTX (P815+CTX) 48h après un traitement au CTX (résultat représentatif). (B) Graphique représentant le pourcentage de cellules CD4+Foxp3+ au sein du mastocytome P815 de 3 souris testées individuellement à 24h, 48h et 72h après un traitement au CTX. L' expérience a été réalisée à 2 reprises et des résultats similaires ont été obtenus. 72 3.3 Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ 3.3.1 Les lymphocytes T CD4+ sont requis pour la résistance antitumorale à long terme après un traitement au cyclophosphamide. Nous avons évalué la contribution des lymphocytes T CD4+ et CD8+ dans le rejet tumoral observé après une injection de cyclophosphamide. Des souris DBA/2 sont traitées à l’aide des anticorps anti-CD4 et anti-CD8 qui déplètent les cellules sept et onze jours après implantation de la tumeur P815. Neuf jours après inoculation des cellules tumorales, les souris reçoivent une dose de CTX (4mg) et le rejet est évalué par la mesure de la tumeur au cours du temps. La figure 11 montre qu’après un traitement au CTX seul , l’ensemble des souris a rejeté totalement la tumeur et a survécu. Par contre, les souris non traitées au CTX meurent rapidement lorsque la tumeur atteint un volume trop important. Lorsque les souris reçoivent un traitement au CTX en l’absence des lymphocytes T CD8+ et CD4+, la tumeur régresse dans un premier temps, mais progresse après 15 jours, résultant en la létalité de 100% des animaux. Cette observation est similaire lorsque des souris reçoivent un traitement au CTX en l’absence des lymphocytes T CD4+ uniquement. Par contre, les souris recevant une dose de CTX en l’absence des lymphocytes T CD8+ uniquement rejettent la tumeur, résultant en la survie de 90% des animaux. Ce résultat montre que la résistance antitumorale à long terme mise en place lors d’un traitement au CTX pourrait dépendre essentiellement des lymphocytes T CD4+. 3.3.2 La résistance antitumorale à long terme après un traitement au cyclophosphamide semble être spécifique de la tumeur P815. Suite aux résultats précédents, nous avons examiné si la résistance antitumorale à long terme mise en place après un traitement au CTX est spécifique de la tumeur P815. Quinze jours après implantation de la tumeur P815, les souris ont reçu une injection de CTX (4mg) par voie intrapéritonéale. Toutes les souris ont rejeté totalement la tumeur 3 jours après le traitement au CTX. Nous avons réinoculé, 42 jours après le rejet de la tumeur P815, dans un groupe de souris 2 x 106 cellules P815 et dans l’autre groupe 2 x 106 cellules L1210 (tumeur conduisant à une leucémie chez les souris DBA/2). Nous avons ensuite suivi l’évolution de la tumeur au cours du temps. 73 Nbre de souris 6000 5000 10 8 6 4 PBS 2 0 4000 J0 J30 J35 J40 J45 J50 Jours après inoculation de la tumeur 3000 PBS aCD4+CTX aCD4+aCD8+CTX aCD8+CTX CTX 2000 αCD4+CTX αCD4+αCD8+ CTX 1000 αCD8+CTX CTX 0 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 temps (jours) P815 mAb CTX mAb Figure 11 : Les LT CD4+ sont requis dans la résistance antitumorale à long terme après un traitement au CTX. Des souris DBA/2 sont traitées à l'aide d'anticorps anti-CD4 et/ou anti-CD8 sept et onze jours après inoculation des cellules tumorales P815. Neuf jours après l'implantation de la tumeur, les souris reçoivent une dose de CTX (4mg). Les graphes montrent la croissance de la tumeur au cours du temps et la courbe de survie dans les différents groupes de souris traitées. Cette expérience a été réalisée à deux reprises et des résultats similaires ont été obtenus. 3000 Volume tumoral (mm3) Volume tumoral (mm3) 12 (P815+CTX) P815 (P815+CTX) L1210 P815 L1210 2000 1000 0 J7 J11 J15 J7 J11 J15 J7 J11 J15 J7 J11 J15 Jours après inoculation de la tumeur Figure 12 : La résistance antitumorale à long terme après un traitement au CTX semble être spécifique de la tumeur P815. Les souris DBA/2 ayant rejeté la tumeur P815 après un traitement au CTX sont inoculées une seconde fois, 42 jours après le rejet, soit avec 2x106 cellules P815 [(P815+CTX)P815] soit avec 2x106 cellules L1210 [(P815+CTX)L1210]. Les histogrammes indiquent la croissance de la tumeur au cours du temps dans les différents groupes de souris (n=5). Cette expérience a été réalisée une seule fois. Les résultats représentent la moyenne du volume de la tumeur de chaque individu exprimé en mm3 ± SD. 74 Nos résultats préliminaires montrent que le groupe de souris ayant rejeté préalablement la tumeur P815 et ayant été réinoculé avec la même tumeur ne développe pas le mastocytome P815. Par contre, le groupe de souris ayant rejeté préalablement la tumeur P815 et ayant été réinoculé avec une tumeur différente (tumeur L1210) développe une tumeur (Fig. 12). Cette observation suggère qu’une réponse immune de mémoire a été mise en place après un traitement au CTX et est spécifique de la tumeur P815. 3.4 Les cellules dendritiques CD11c+ 3.4.1 Le cyclophosphamide peut induire in vivo la maturation des cellules dendritiques spléniques. De nombreuses études, notamment celles réalisées dans notre laboratoire, démontrent la capacité des DC matures à activer la différenciation des lymphocytes T CD8+ en CTL spécifiques. Nos résultats, bien que préliminaires, montrent que le CTX augmente le pourcentage de lymphocytes T CD8+, spécifiques du peptide P1A, parmi les lymphocytes T CD8+ spléniques de souris DBA/2 porteuses de tumeurs (Fig. 13). Ces études nous ont conduits à examiner si l’administration de cyclophosphamide modifierait le statut de maturation et la capacité migratoire des DC spléniques de souris porteuses de tumeurs. Dix jours après implantation du mastocytome P815, un groupe de souris reçoit une dose de CTX (4mg) par voie intrapéritonéale. Nous avons étudié par cytométrie de flux le statut de maturation des DC spléniques 48h après l’administration du CTX. Nous avons comparé, après coloration à l’aide d’anticorps anti-CD11c et anti-CD86, le phénotype des DC spléniques suite à l’administration de CTX, de PBS ou de LPS (lipopolysaccharide) qui est connu pour induire la maturation des DC. La figure 14 illustre l’expression de la molécule co-stimulatrice CD86 à la surface des DC, suite aux différents traitements. Les résultats montrent qu’une forte dose de CTX active la maturation des DC spléniques qui se traduit par une augmentation du niveau d’expression de la molécule CD86. 75 % de TCD8+P1A+ 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 NAIVE P815 P815+CTX Figure 13 : Un traitement au CTX augmente le pourcentage de lymphocytes T CD8+ spécifiques du peptide P1A. 2x106 cellules tumorales P815 sont injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de souris DBA/2. 17 jours après implantation des cellules tumorales, un groupe de souris est traité avec 4mg de CTX (P815+CTX). Deux jours plus tard, les rates sont prélevées et les cellules spléniques sont marquées à l'aide de l'anticorps anti-CD8 et de tétramères anti-P1A. Le pourcentage de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène P1A est analysé par cytométrie de flux . L' expérience a été réalisée à 2 reprises et des résultats similaires ont été obtenus. Les résultats représentent la moyenne du pourcentage des cellules T CD8+P1A+ de chaque individu ± SD de deux expériences indépendantes. PBS LPS 5ug CTX 250ug CTX 4mg CD86 CD11c Expression de CD86 : cellules CD11c+ LPS CTX 4mg PBS CTX 250 µg Figure 14 : L'administration de CTX active la maturation des DC spléniques. 250ug ou 4 mg de CTX sont administrés à des souris DBA/2 (n = 4) porteuses de tumeurs P815 par voie intrapéritonéale. 15 jours après implantation des cellules tumorales, les cellules spléniques sont marquées, 48 h après l'administration de CTX, à l'aide des anticorps anti-CD11c et anti-CD86. L'expression de la molécule CD86 à la surface des cellules dendritiques CD11c+ est analysée par cytométrie de flux. Les groupes contrôles (PBS/LPS) reçoivent une injection par voie intrapéritonéale de PBS ou de LPS (5ug/souris) 6 h avant l'analyse. Cette expérience a été réalisée à 3 reprises et des résultats similaires ont été obtenus. 76 Dans ce même type d’expérience, nous nous sommes également intéressés à la capacité migratoire des DC. En effet, les cellules dendritiques immatures se localisent dans les zones marginales de la rate. Lorsque les cellules dendritiques passent du stade immature vers un stade mature après un « signal de danger », elles migrent vers les zones T de la rate où se localisent les lymphocytes T afin d’initier la réponse immune qui requiert l’engagement des récepteurs T avec leurs ligands présents à la surface des cellules dendritiques 272 . Afin de localiser les DC spléniques 48h après un traitement au CTX, une étude immunohistochimique utilisant un anticorps anti-CD11c a été réalisée sur des coupes histologiques de rates de souris porteuses de tumeurs. La figure 15 montre la présence de DC (cellules colorées en bleu) au sein des zones T dans la rate de souris porteuses de tumeurs traitées au CTX. Par contre, dans la rate de souris non traitées au CTX, les DC se localisent dans les zones marginales. Ces observations suggèrent que le CTX activerait la migration de DC spléniques de la zone marginale vers la zone T de la rate, où résident les lymphocytes T CD4+ et CD8+. 77 P815 (Rate) ZT P815+CTX (Rate) ZM ZM ZT 10X 10X Figure 15 : L' administration de cyclophosphamide active la migration des DC spléniques de la zone marginale vers la zone T. Dix-sept jours après implantation du mastocytome P815, les souris DBA/2 (n = 4) sont traitées (P815+CTX) ou non au CTX (4mg) (P815). Les rates sont prélevées 48h après le traitement et une étude histologique est réalisée. Les cellules dendritiques sont révélées en bleu après un marquage immunohistochimique à l'aide d'un anticorps anti-CD11c. (ZM) zone marginale, (ZT) zone T où se situent les lymphocytes T. Après un traitement au CTX, les cellules dendritiques se localisent au niveau de la zone T (flèche). 78 Discussion 79 ETUDE IN VIVO DE LA RÉGULATION DE L’IMMUNITÉ ANTITUMORALE. 1. L’injection de cellules dendritiques matures chargées d’antigène P1A n’induit pas le rejet in vivo du mastocytome P815. Plusieurs études ont montré qu’il existe une réponse immune spontanée contre la tumeur chez des souris porteuses de tumeurs. En particulier, une étude réalisée par Uyttenhove et al. a montré que la diminution de la croissance de la tumeur P815 entre le douzième et le quatorzième jour après l’implantation des cellules tumorales (ce qui est en accord avec nos résultats) corrèle avec l’augmentation du nombre de cellules cytotoxiques dirigées contre la tumeur dans la rate durant cette période. Après le quatorzième jour, la réponse cytotoxique vis-à-vis des cellules tumorales P815 décroît dans la rate conduisant à la reprise de la croissance de la tumeur 269,273. Nous avons montré que l’injection de cellules dendritiques chargées à l’antigène tumoral P1A durant cette phase ne permet pas l’éradication de la tumeur P815. Ce résultat suggère que la vaccination à l’aide de cellules dendritiques chargées à l’antigène P1A ne permet pas d’augmenter « l’amplitude » de la réponse immune spontanée mise en place alors que la vaccination à l’aide de cellules dendritiques chargées à l’antigène OVA permet le rejet dans 80% des cas de la tumeur EG7-OVA. Ce résultat pourrait s’expliquer par le fait que l’antigène OVA qui est un antigène « artificiel » est fortement immunogène contrairement à l’antigène P1A qui est faiblement immunogène. L’échec de la vaccination à l’aide des cellules dendritiques chargées à l’antigène P1A pourrait être attribué à plusieurs facteurs. Une des raisons possibles de l’échappement des tumeurs à la réponse immune est l’apparition de nouveaux variants de cellules tumorales P815 ayant perdu leur antigène P1A 9. Par conséquent, les lymphocytes T CD8+ spécifiques du peptide P1A pouvant être induits par la vaccination à l’aide de cellules dendritiques ne seraient pas capables de reconnaître les nouveaux variants de cellules tumorales P815. Une autre explication plausible serait le choix de notre antigène tumoral. En effet, l’équipe de Boon a identifié cinq antigènes différents présents sur le mastocytome P815 269 . Il se pourrait que l’antigène P1A, utilisé dans notre modèle, ne soit pas l’antigène majeur, bien que Van den Eynde et al. aient identifié celui-ci comme l’antigène le plus fréquemment reconnu par les CTL qui sont responsables du rejet in vivo de la tumeur P815 12. Bien que nous n’ayons pas testé si le mastocytome P815 sécrète de l’histamine, celle-ci produite par les mastocytes pourrait être un facteur responsable de l’échec de l’immunothérapie. En effet, l’histamine peut inhiber la réponse immune par différents mécanismes : (1) inhibition de la 80 présentation de l’antigène par les cellules dendritiques 2, (2) induction de cellules dendritiques tolérogènes productrices d’interleukine-10 qui peuvent inhiber les lymphocytes T 6, (3) induction de lymphocytes Th2 qui inhibent la réponse immune TH1 6. L’échec de l’immunothérapie pourrait être également dû à la présence de cellules suppressives telles que les cellules myéloïdes suppressives GR1+CD11b+ et les cellules T régulatrices CD4+CD25+ qui sont des cellules capables d’inhiber la réponse immune. En effet, l’élimination des cellules T régulatrices par le cyclophosphamide favorise l’immunothérapie et conduit à l’éradication des tumeurs murines in vivo 220,271 et l’élimination des cellules myéloïdes GR1+CD11b+ par l’acide trans-rétinoïque (ATRA) augmente l’effet de la vaccination contre une tumeur 223. 2. L’injection de cyclophosphamide induit le rejet du mastocytome P815. Nous avons montré qu’une seule injection de cyclophosphamide induit le rejet total de tumeurs implantées depuis 17 jours mais également celles implantées depuis 25 jours dans 100 % des souris traitées. En plus de son action direct cytotoxique sur les cellules tumorales, nous avons montré que le cyclophosphamide a un double effet sur le système immunitaire qui corrèle avec le rejet du mastocytome P815 : un effet sur les cellules suppressives (cellules T régulatrices et cellules myéloïdes suppressives) ainsi qu’un effet sur les cellules GR1highCD11b+ qui sont des cellules appartenant au système immunitaire innée. 2.1 Effet cytotoxique direct du cyclophosphamide sur les cellules tumorales P815. L’utilisation de drogues anticancéreuses causent des dommages au niveau cellulaire mais aussi au niveau de l’ADN et induisent la mort programmée de la cellule ou apoptose. La majorité des agents chimiothérapeutiques tuent les cellules tumorales par activation de la voie des caspases, protéines nécessaires à l’induction de l’apoptose. Le cas du cyclophosphamide est particulier : contrairement aux autres drogues anticancéreuses, le cyclophosphamide devient actif après biotransformation dans le foie par une enzyme (le cytochrome P450) en phosphoramide et acroléine qui alkylent respectivement l’ADN et les protéines. Après biotransformation du cyclophosphamide, les métabolites actifs sont véhiculés par le sang et peuvent endommager aussi bien les cellules tumorales que les cellules saines. Les mécanismes par lesquels le cyclophosphamide tue les cellules tumorales sont encore mal connus jusqu’à ce jour. La voie apoptotique médiée par la protéine caspase 9 après alkylation de l’ADN par le phosphoramide 274 et la nécrose 275 induite après alkylation des protéines par l’acroléine ont été décrites récemment 81 comme étant des mécanismes par lesquels le cyclophosphamide tue les cellules tumorales. En effet, l’alkylation provoque une modification chimique irréversible de l’ADN et des protéines, la cellule n’étant plus capable de réparer ces dommages meurt par apoptose ou par nécrose. Les études in vitro sur l’action cytotoxique du cyclophosphamide sur les cellules tumorales restent compliquées étant donné la nécessité de l’enzyme pour la biotransformation du cyclophosphamide en ses métabolites actifs. De plus, plusieurs lignées tumorales possèdent de faibles quantités de l’enzyme cytochrome P450 276 qui est un facteur limitant pour l’étude in vitro de la cytotoxicité du cyclophosphamide sur les cellules tumorales. Afin de vérifier si le cyclophosphamide a un effet in vivo sur les cellules tumorales de manière indépendante du système immunitaire, nous proposons de faire des expériences dans des souris dépourvues d’un système immunitaire adaptatif (par exemples : souris RAG -/-, souris nudes, souris SCID) et inné (injection d’anticorps dirigés contre les cellules NK, les cellules granulocytaires GR1+). 2.2 Effet du cyclophosphamide sur le système immunitaire Nos résultats montrent clairement que le cyclophosphamide a également un effet sur le système immunitaire. En effet, d’après nos expériences, le rejet du mastocytome P815 induit par cet agent chimiothérapeutique pourrait dépendre essentiellement des lymphocytes T CD4+. Nous avons également montré que l’injection de cyclophosphamide diminue les pourcentages des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ et des cellules GR1medCD11b+, deux populations cellulaires à fonctions suppressives. Enfin, l’apparition d’une population cellulaire GR1highCD11b+ possédant le marqueur des cellules dendritiques CD11c a été observée dans les zones de nécrose de tumeur P815 après un traitement au cyclophosphamide. 2.2.1 Les cellules suppressives du système immunitaire Les cellules myéloïdes suppressives Nous nous sommes intéressés à une population cellulaire particulière appelée les cellules myéloïdes suppressives (MDSC). Ces cellules expriment les marqueurs GR1 et CD11b et s’accumulent dans la rate de souris porteuses de tumeurs et de patients cancéreux 227. Ces cellules GR1+CD11b+ jouent un rôle important dans l’échappement des tumeurs à l’immunosurveillance grâce à leurs multiples propriétés immunosuppressives (cf point 5.2.3). 82 Dans la rate de souris porteuses de tumeur P815, deux populations distinctes de cellules CD11b+ ont été mises en évidence sur base du niveau d’expression de la molécule membranaire GR1 à savoir les cellules GR1medCD11b+ et les cellules GR1highCD11b+. De manière intéressante, la population cellulaire GR1medCD11b+ qui disparaît 48h après un traitement au cyclophosphamide exprime un taux élevé d’ARN messagers codant pour le TGFβ. Nous ne savons pas comment les cellules GR1medCD11b+ disparaissent après un traitement au cyclophosphamide. Leur disparition pourrait être due à une différenciation des cellules GR1medCD11b+ en cellules effectrices telles que les cellules dendritiques et les macrophages. En effet, en faveur de cette hypothèse, les travaux de Gabrilovich ont montré que des cellules GR1+CD11b+ immatures issues de souris C57BL/6 (CD45.2+) porteuses de tumeurs transférées dans des souris receveuses CD45.1+ et traitées à l’acide trans-rétinoïque se différencient en cellules dendritiques, en macrophages et en granulocytes cinq jours après le transfert adoptif. Par contre, le transfert adoptif de cellules GR1+CD11b+ immatures dans des souris traitées avec un placebo ne se différencient pas et conservent leur phénotype immature 223 . Ce résultat montre qu’un traitement à l’acide trans- rétinoïque induit la différenciation in vivo des cellules GR1+CD11b+ immatures en cellules dendritiques, en macrophages et en granulocytes. Nous proposons de réaliser cette même expérience afin de tester si un traitement au cyclophosphamide peut induire in vivo la différenciation des cellules GR1medCD11b+. L’apoptose de ces cellules pourrait également expliquer leur disparition observée in vivo après un traitement au cyclophosphamide qui est un agent chimique induisant la mort des cellules en division. Des expériences sont nécessaires afin de tester si un traitement au cyclophosphamide peut induire l’apoptose des GR1medCD11b+ à l’aide d’un marquage utilisant l’annexine V et le propidium iodide, deux colorants qui mettent en évidence les cellules apoptotiques. L’expression de l’ARN messager codant pour le TGFβ par les cellules GR1medCD11b+ suggère que ces cellules pourraient être impliquées dans la suppression de la réponse antitumorale. Nous n’avons pas testé l’activité suppressive des cellules GR1medCD11b+ ainsi que la production de TGFβ biologique par ces cellules. Et donc, des ériences exp de coculture in vitro des cellules GR1medCD11b+ en présence de lymphocytes T préalablement activés à l’aide d’un anticorps antiCD3 sont nécessaires pour tester la fonction suppressive des cellules GR1medCD11b+. En effet, l’absence de prolifération des lymphocytes T activés et la présence de TGFβ sous sa forme active dans le surnageant de culture pourraient mettre en évidence la fonction suppressive des cellules GR1medCD11b+. Et une éventuelle restauration de la prolifération des lymphocytes T activés grâce à l’addition d’un anticorps qui neutralise l’effet du TGF β permettrait d’impliquer le TGFβ dans le mécanisme de suppression de la réponse lymphocytaire utilisé par les cellules 83 GR1medCD11b+. Bien que nous n’ayons pas montré la production de TGF β par les cellules GR1medCD11b+, Terabe et al. ont montré, dans leur modèle de fibrosarcome 15-12RM murin, que les cellules GR1+CD11b+ isolées de souris BALB/c porteuses de tumeurs produisent ex vivo deux fois plus de TGFβ que les cellules GR1+CD11b+ issues de souris BALB/c naïves après 6h de culture 60. Le TGFβ produit par les cellules myéloïdes suppressives inhibe la réponse immune par différents mécanismes. Un des mécanismes est l’inhibition de l’activité cytotoxique des CTL qui a été démontrée par Terabe et al. En effet, l’addition de doses croissantes de TGFβ dans le milieu de culture de splénocytes préalablement stimulés pendant une semaine avec le peptide immunodominant P18 (cible majeur des CTL contre les cellules tumorales 15-12RM) supprime l’activité cytotoxique des CTL contre les cellules cibles 60 . Un autre mécanisme est l’induction par le TGFβ des cellules T régulatrices, cellules jouant un rôle important dans la suppression de la réponse antitumorale (voir point suivant). En effet, le TGFβ sécrété par les cellules GR1 + issues de souris BALB/c porteuses de tumeurs MCA26 induit in vitro des cellules T régulatrices CD4+ qui expriment le marqueur Foxp3 dans des expériences de coculture des cellules GR1+ en présence de cellules T228. Les cellules T régulatrices Des rapports scientifiques récents ont montré l’implication des cellules T régulatrices dans la tolérance du système immunitaire vis-à-vis des cellules cancéreuses 277-280 . Par exemple, le transfert adoptif de cellules T régulatrices CD4+CD25+ inhibe les LT CD8+ spécifiques de la tumeur conduisant ainsi à la suppression de la réponse immune mise en place contre la tumeur 217,281,282 . La diminution des pourcentages des lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3+ dans la rate et dans la tumeur P815 après un traitement au cyclophosphamide corrèle avec le rejet de la tumeur P815. L’apoptose des lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3+ induit par le cyclophosphamide pourrait expliquer la diminution du nombre de ces cellules. Le cyclophosphamide pourrait également diminuer l’expression du facteur de transcription Foxp3, marqueur des lymphocytes T régulateurs qui dès lors ne seraient plus détectés par cytométrie de flux et expliqueraient leur faible nombre. Ces deux hypothèses ont été démontrées récemment par Lutsiak et al. 283. Leur travaux montrent qu’un traitement au cyclophosphamide induit l’apoptose et la diminution de la prolifération des cellules T régulatrices CD4+CD25+. En plus de ces effets, un traitement au cyclophosphamide provoque la perte de leur fonction suppressive qui corrèle avec une diminution de l’expression du 84 facteur de transcription Foxp3, facteur important pour la fonction suppressive ainsi que l’expression du récepteur GITR, nécessaire pour induire une voie de signalisation 283. Malheureusement, nous ne savons pas si la diminution du nombre de lymphocytes T régulateurs au sein de la tumeur et de la rate pourrait restaurer la réponse antitumorale. Pourtant, de nombreux rapports ont montré que l’élimination de cellules T régulatrices par un traitement au cyclophosphamide favorise la réponse antitumorale : (1) une étude pionnière a montré que le cyclophosphamide potentialise les réponses immunes en éliminant préférentiellement des cellules suppressives 264 , (2) l’élimination des cellules T régulatrices par un traitement au cyclophosphamide augmente l’effet de l’immunothérapie conduisant au rejet de tumeurs murines 271 , (3) des rapports récents ont montré que les cellules T régulatrices CD4+CD25+ sont sensibles à l’action du cyclophoshamide et que l’élimination de ces cellules permet de restaurer les fonctions effectrices des cellules NK et des cellules T 220 . Des expériences sont nécessaires pour tester la fonction suppressive des cellules T régulatrices issues de souris porteuses de tumeurs P815 traitées au cyclophosphamide dans des expériences de coculture en présence de lymphocytes T CD8+ préalablement activés ainsi que tester l’expression du facteur de transcription Foxp3 et l’expression du récepteur GITR des cellules T régulatrices CD4+CD25+ après un traitement au cyclophosphamide . Différents mécanismes de suppression de la réponse immune par les cellules T régulatrices ont été identifiés, par exemple, la production de cytokines immunosuppressives telles que le TFGβ et l’IL-10 277 , le contact cellule-cellule via l’engagement de molécules à fonction inhibitrice telles que la molécule CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4) et le récepteur GITR sur leur ligand respectif 277,279 . L’apoptose de cellules immunes effectrices est un autre mécanisme de suppression de la réponse immune par les cellules T régulatrices. En effet, des auteurs ont montré que les cellules T régulatrices produisent une protéase, le granzyme B, qui induit la mort des cellules NK et des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène conduisant à la suppression de la réponse antitumorale médiée par ces deux types cellulaires 284 . Un autre mécanisme d’induction de l’apoptose des cellules T effectrices par les cellules T régulatrices a été décrit récemment : la « privation » par les cellules T régulatrices des cytokines nécessaires à la survie et à la prolifération des cellules T CD4+ effectrices, est responsable de l’apoptose de ces dernières et constitue également un des mécanismes de suppression de la réponse immune in vivo 285. 85 2.2.2 Les cellules effectrices du système immunitaire Les cellules GR1highCD11b+CD11c+ Comme nous l’avons discuté précédemment le cyclophosphamide pourrait induire la différenciation des cellules GR1medCD11b+ en cellules dendritiques. high cyclophosphamide induit l’apparition de cellules GR1 Or, un traitement au + CD11b qui expriment la molécule CD11c mais également les molécules nécessaires à la présentation antigénique à savoir les molécules du CMH de classe II ainsi que la molécule CD86 dans la rate de souris traitées et porteuses de tumeurs 48 h après un traitement au cyclophosphamide. Ces cellules GR1highCD11b+CD11c+ ne sont pas des neutrophiles car elles n’expriment pas le marqueur cellulaire 1A8 qui est un marqueur spécifique des neutrophiles. De manière intéressante, ces cellules GR1highCD11b+CD11c+ se localisent préférentiellement dans les zones de nécrose de tumeurs P815 en phase de rejet. Les données apportées par la cytométrie de flux et la microscopie confocale nous laissent penser que ces cellules pourraient être des cellules dendritiques. Leur présence dans les zones de nécrose de tumeur P815 pourrait suggérer que ces cellules jouent un rôle indirecte ou directe dans le rejet de la tumeur après un traitement au cyclophosphamide. En effet, ces cellules GR1highCD11b+CD11c+ pourraient phagocyter les cellules tumorales P815 qui entrent en apoptose sous l’action cytotoxique du cyclophosphamide et initieraient la réponse antitumorale en activant, après présentation de l’antigène tumoral, les cellules T CD4+ puisque nous avons également montré que le rejet du mastocytome dépend essentiellement des LT CD4+ (voir point suivant). Une étude récente montre l’effet bénéfique d’une classe d’agents chimiothérapeutiques dans la mise en place d’une réponse antitumorale : les chercheurs ont observé que certaines drogues, en particulier ceux de la classe des anthracyclines (Doxorubicine, Epirubicine) utilisées en chimiothérapie anticancéreuse activent l’apoptose des cellules tumorales de manière immunogène en permettant l’exposition à la surface des cellules tumorales d’une molécule jouant un rôle clé dans le signal « eat me » (mange moi), la calréticuline 256,286. Celle-ci exposée en surface est reconnue par les récepteurs des cellules dendritiques qui phagocytent les cellules tumorales apoptotiques et peuvent donc initier la réponse immune après présentation de l’antigène tumoral aux lymphocytes T. Ces auteurs ont démontré cela : la vaccination à l’aide de cellules dendritiques qui ont phagocyté des cellules tumorales apoptotiques traitées par la Doxorubicine empêche la croissance de ces même cellules tumorales implantées chez les souris vaccinées 256. 86 La formation de zones de nécrose au sein des tumeurs P815 pourrait également être due à l’action cytotoxique directe des cellules GR1highCD11b+CD11c+ sur les cellules tumorales après un traitement au cyclophosphamide. Ces cellules semblent nous rappeler les cellules dendritiques tueuses productrices d’IFNγ ou IKDC qui jouent unôle r important dans l’immunosurveillance. Ces cellules dendritiques sécrètent de grandes quantités d’IFN γ et sont capables de lyser les cellules tumorales de manière TRAIL dépendant 65,66 . Bien que nous n’ayons pas testé high l’expression de la molécule TRAIL dans nos cellules GR1 CD11b+CD11c+, nous avons montré que les cellules GR1highCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs et traitées au cyclophosphamide expriment 3 fois plus l’ARN messager qui code pour l’IFNγ que les cellules GR1highCD11b+ issues de souris porteuses de tumeurs. L’IFNγ joue ôle un direct r dans l’induction de l’apoptose des cellules tumorales. En effet, une étude récente a montré que l’IFN γ induit l’apoptose des cellules cancéreuses mammaires par l’intermédiaire du facteur de transcription IRF-1 (Interferon Regulatory Factor-1) qui active la voie des caspases 287 . Nous proposons de réaliser des expériences de coculture des cellules GR1highCD11b+CD11c+ purifiées en présence de cellules cibles tumorales P815 afin de tester l’activité cytotoxique de ces cellules. Nous prévoyons également de tester l’expression des molécules TRAIL et FasL ainsi que la production d’IFN γ qui sont des molécules nécessaires pour tuer les cellules tumorales. Les lymphocytes T Une étude précédente réalisée dans notre laboratoire a montré que les LT CD4+ et les LT CD8+ jouent un rôle important dans la réponse antitumorale spontanée contre la tumeur P815. Il a été montré, en effet, que les souris porteuses de tumeurs intrapéritonéales P815 et déficientes en LT CD4+ et/ou CD8+ après administration des anticorps qui éliminent respectivement ces lymphocytes, meurent plus vite que les souris contrôles 288. Nous avons étudié la contribution des LT CD4+ et CD8+ dans le rejet du mastocytome P815 médié par le cyclophosphamide. De manière surprenante, nos résultats préliminaires montrent que le rejet du mastocytome P815 dépend essentiellement des LT CD4+ et non des LT CD8+. Bien que plusieurs travaux aient montré l’importance des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques dans le rejet des tumeurs in vivo 91,289, il semblerait que les LT CD8+ ne jouent pas un rôle majeur dans notre modèle tumoral P815 puisque 9 souris sur 10 déficientes en LT CD8+ traitées au CTX survivent au bout de 50 jours contrairement aux souris déficientes en LT CD4+ traitées au CTX et aux souris porteuses de tumeurs traitées au PBS. Nos résultats sont différents des travaux d’Ibe et al. qui montrent que le rejet de la tumeur J558L après une injection d’une dose de 15 mg/kg de cyclophosphamide dépend 87 des LT CD8+ chez les souris BALB/c 270 . Ce résultat obtenu pourrait s’expliquer par des conditions expérimentales différentes : la dose de cyclophosphamide, le type de tumeur et le nombre de cellules tumorales injectées, la dose d’anticorps et en particulier le clone anti-CD8 utilisé qui est différent du nôtre. La différenciation des cellules T CD4+ en cellules T cytotoxiques pourrait s’expliquer par la présentation des antigènes tumoraux issus des cellules P815 tuées par le cyclophosphamide par les cellules dendritiques. De nombreuses études ont montré l’existence de cellules T CD4+ ayant des propriétés cytotoxiques vis-à-vis des cellules tumorales : par exemples, les LT CD4+ sont capables d’induire l’apoptose des cellules cancéreuses par un mécanisme dépendant de la perforine 290 , d’autres travaux ont montré que les LT CD4+ impliqués dans le rejet in vivo des cellules tumorales murines Mc51.9 produisent de l’IFNγ qui édtruit les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins de la tumeur 291 . Les cellules T CD4+ pourraient également jouer un rôle indirect dans le rejet du mastocytome P815 induit par le cyclophosphamide. En effet, une étude a démontré le rôle « helper » des LT CD4+ dans le rejet in vivo d’une tumeur murine qui est indépendant des LT CD8+ : l’IFNγ produit par les LT CD4+ active les éosinophiles et les macrophages qui produisent du NO au sein de la tumeur conduisant ainsi à la destruction de celleci 291. Les souris traitées au cyclophosphamide et déficientes en LT CD8+ mais pas en LT CD4+ ont des tumeurs palpables de petit volume (le volume moyen est de 125 mm3) qui n’évoluent pas au cours du temps, suggérant un rôle important des LT CD4+ dans le maintien de la tumeur P815 dans une phase d’équilibre. Koebel et al. montrent l’importance du système adaptatif dans le contrôle du processus de croissance des cellules tumorales et le maintien de celles-ci dans une phase d’équilibre 43 . En effet, des souris porteuses de tumeurs en équilibre (c’est-à-dire des tumeurs invisibles à l’œil nu mais palpables) induites par un agent carcinogène après 300 jours développent rapidement des sarcomes après l’administration d’anticorps qui déplètent les LT CD4+/CD8+ ou qui neutralisent soit l’IFNγ soit l’IL-12p40. Par contre, les souris contrôles (n’ayant pas reçu l’administration d’anticorps) ont des tumeurs qui restent stables (restent donc dans une phase d’équilibre) et dont la taille ne dépasse pas 8 mm 43. Nous proposons de réaliser des expériences in vitro afin de tester l’activité cytotoxique des LT CD4+ sur les cellules tumorales P815 : production d’IFNγ, molécules cytotoxiques (perforine, granzymes, FasL). Des expériences in vivo dans des souris déficientes en cellules granulocytaires (souris CD11b DTR) traitées ou non à l’aide d’un anticorps qui déplète les LT CD4+ sont nécessaires pour tester l’activation des cellules CD11b+ par les LT CD4+ ainsi que le rôle direct des cellules CD11b+ dans un modèle de rejet de tumeur induit par le cyclophosphamide. 88 En conclusion, l’ensemble de nos résultats montre que le cyclophosphamide jouerait un double rôle sur le système immunitaire. D’une part, le cyclophosphamide induit l’apoptose des cellules tumorales P815 qui constituerait une source importante d’antigènes tumoraux. La phagocytose des débris cellulaires tumoraux par les cellules dendritiques GR1highCD11b+CD11c+ favoriserait la présentation des antigènes tumoraux aux lymphocytes T CD4+. Ceux-ci seraient activés et joueraient un rôle important dans le rejet du mastocytome P815. cyclophosphamide semble supprimer les cellules GR1 CD4+CD25+Foxp3+ qui pourraient inhiber med la D’autre part, le + CD11b et les lymphocytes T régulateurs réponse antitumorale. Les effets immunomodulateurs du cyclophosphamide sur les différents composants du système immunitaire inné et adaptatif sont multifactoriels et semblent favoriser l’élimination des cellules cancéreuses par les cellules effectrices du système immunitaire. Par conséquent, la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires induits après un traitement au cyclophosphamide pourrait permettre d’identifier les cellules effectrices capables d’éliminer les cellules tumorales et permettre dans l’avenir, d’améliorer les protocoles cliniques de patients cancéreux. 89 Matériel et Méthodes 90 1. Les souris Les souris C57BL/6 et DBA/2 proviennent de Harlan (Horst, The Netherlands). Ces souris sont maintenues dans des conditions stériles (specific pathogen free). Elles sont utilisées à l'âge de 6 à 9 semaines et sont tuées par dislocation cervicale. Les expériences sont réalisées selon les lois et les règlements de l'institution et ont été approuvées par le comité local d’éthique animale. 2. Cellules tumorales et milieux de culture utilisés. Les cellules tumorales P815 aboutissent à la formation d'un mastocytome lorsqu'elles sont injectées par voie sous-cutanée dans des souris DBA/2 naïves. Elles nous ont été fournies par le laboratoire du Professeur T. Boon de l'UCL. Les cellules tumorales L1210 aboutissent à la formation d’un lymphome lorsqu’elles sont injectées par voie sous-cutanée dans des souris DBA/2 naïves. Les cellules tumorales P815 et L1210 sont cultivées dans le milieu RPMI 1640 (Gibco) dans lequel nous avons ajouté de manière stérile du pyruvate sodium (1,1 mM), de la L-glutamine (2,0 mM), de la streptomycine et de la pénicilline (5000 U/ml), une solution d’acides aminés non essentiels (diluée 100x, Invitrogen), du 2-mercaptoéthanol (5 x 10-5 M) ainsi que 10 % de FCS (« Fœtal Calf Serum » provenant de Sigma-Aldrich). Les cellules tumorales EG7-OVA aboutissent à la formation d’un thymome (EL-4) lorsqu’elles sont injectées par voie sous-cutanée dans des souris C57BL/6. Les cellules EG7-OVA ont été transfectées avec le gène complet de l’ovalbumine. Ces cellules tumorales sont cultivées dans du DMEM (Biochrom.AG) auquel sont ajoutés 10 % de FCS (« Fœtal Calf Serum » provenant de Sigma-Aldrich), pyruvate sodium (1,1 mM), de la L-glutamine (2,0 mM), de la streptomycine et de la pénicilline (5000 U/ml), une solution d’acides aminés non essentiels (diluée 100x, Invitrogen), du 2-mercaptoéthanol (5 x 10-5 M) ainsi que du G418 (400µg/ml, PAA Laboratories GmbH). 3. Les solutions, réactifs et anticorps Le milieu PBS (« Phosphate Buffered Saline ») est une solution tampon (pH 7,2) contenant du NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,7 mM, KH2PO4 1,8 mM. Le milieu utilisé pour la purification de cellules par les billes magnétiques (« Magnetic Activated Cell Sorting ») est composé de tampon phosphate (PBS, pH 7,4), de 5 % de BSA (« Bovine Serum Albumin ») et d’EDTA à 5mM. Ce milieu est utilisé dans les expériences de purification de 91 cellules GR1+ ou de cellules CD11b+ parmi les cellules spléniques totales. Le milieu utilisé pour l’analyse au cytomètre de flux (« Fluorescence Activated Cell Sorting ») est composé de tampon phosphate (PBS, pH 7,4), de 0,1% de BSA ainsi que de NaN3 à 0,01%. Le peptide OVA 257-264 (SIINFEKL) provient de la firme Neosystem (Strasbourg, France). Le peptide P1A provient du laboratoire du Pr. Thierry Boon (ICP, UCL). Le lipopolysaccharide (LPS) issu d’Escherichia Coli (sérotype 055:B5) est délivré par Difco laboratories (Detroit, Mi). Le cyclophosphamide monohydrate (Sigma-Aldrich) est soigneusement pesé sous hotte à flux laminaire et mis en solution dans du PBS à une concentration finale de 4mg/200µl de PBS. Cette solution est ensuite filtrée à l’aide d’une seringue montée d’un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,5 µm. Les anticorps reconnaissant des molécules murines utilisées pour le marquage des cellules pour la cytométrie en flux sont : anti-Ly6GC (clone RB6-8C5, eBioscience), anti-CD11b (clone M1/70, eBioscience), anti-CD11c (clone N418, Pharmingen), anti-Ly6C (clone 1A8, Pharmingen), antiCD86 (clone GL-1, Pharmingen), anti-CD80 (clone 16-10A1, Pharmingen), anti-Foxp3 (clone FJK-16s, eBioscience), ainsi que les anticorps suivants qui sont produits dans notre laboratoire : anti-CD4 (clone GK1.5), anti-CD25 (clone PC61), anti-I-Ed (clone 14.4.4, MHC II souche DBA/2) et anti-CD8β (clone H35). Les tétramères P1A couplés à un fluorochrome PE (phycoérythrine) nous ont été gentiment donnés par l’équipe du Pr. Thierry Boon à l’UCL et reconnaissent les LT spécifiques du peptide P1A. 4. Génération in vitro de cellules dendritiques à partir de progéniteurs issus de la moëlle osseuse (BMDC) Les membres postérieurs des souris sont prélevés et disséqués. Les fémurs et les tibias sont récupérés. La moëlle osseuse est extraite par injection de PBS à l’aide d’une seringue montée d’une aiguille. Les cellules sont dissociées, filtrées sur un « voile de mariée » puis centrifugées durant 7 minutes à une vitesse de 1400 tours/minute et mises à la concentration de 1,2 x 106 cellules/puits dans des plaques de 6 puits. Elles sont cultivées à 37°C durant 9 jours dans le milieu de culture RPMI 1640 (Invitrogen) auquel sont ajoutés de manière stérile du GM-CSF (20ng/ml, fourni par le Dr Kris Thielemans, AZ-VUB), du pyruvate sodium (1,1 mM), de la L-glutamine (2,0 mM), de la streptomycine et de la pénicilline (5000 U/ml), une solution d’acides aminés non essentiels (diluée 100x, Invitrogen), du 2-mercaptoéthanol (5 x 10-5 M) ainsi que 10 % de FCS (« Fœtal Calf Serum » provenant de Sigma-Aldrich). Le milieu de culture est remplacé tous les 3 92 jours. Le surnageant de culture est aspiré délicatement à l’aide d’une pipette pasteur afin de ne pas décrocher les cellules, ensuite un ml de milieu frais pour BMDC est ajouté dans le puit. 5. Marquage des cellules pour la cytométrie de flux (FACS) Les cellules spléniques (106 cellules/tube Facs) sont incubées préalablement 5 minutes dans 20 µl de surnageant de culture de l’hybridome 24G2 (produisant un anticorps spécifique des récepteurs FcγRIII) afin de saturer les récepteurs FcγRIII et d’éviter le marquage non spécifique via la partie Fc des récepteurs. Les cellules sont ensuite marquées en surface à l’aide d’anticorps couplés à un fluorochrome à raison de 4 µg d’anticorps/50 µl de milieu FACS pendant 20 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées par addition de 1 ml de milieu FACS et centrifugées pendant 7 minutes à une vitesse de 1200 tours/min à 4°C. Les culots cellulaires sont suspendus dans 200 µl de milieu FACS et les cellules sont analysées par cytométrie de flux. 6. Purification des cellules GR1+ ou CD11b+ à partir de rate. Les rates sont prélevées et les cellules spléniques sont séparées par pression mécanique, filtrées et mises en suspension dans un milieu ne contenant pas de Ca2+ (HBSS rouge). Le protocole de purification des cellules a été soigneusement suivi selon les recommandations de la firme Miltenyi-Biotec. En bref, les cellules sont centrifugées, remises en suspension dans 1ml d'HBSS et incubées 30 min à 4°C en présence d'un anticorps anti-GR1 biotinylé (Miltenyi-Biotec) ou en présence de l’anticorps anti-CD11b directement couplé à des billes magnétiques (MiltenyiBiotec). Les cellules sont ensuite lavées à l’aide de 2 ml de milieu MACS et centrifugées à une vitesse de 1400 tours/minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées en présence de l'anticorps secondaire anti-biotine couplé à des billes magnétiques (Anti-Biotin MicroBeads, MiltenyiBiotec), pour la sélection GR1, pendant 20 min à 4°C. Les cellules sont lavées dans du milieu MACS et centrifugées pendant 7 minutes (1400 tours/minutes). Les cellules sont suspendues dans 3 ml de milieu MACS. Les cellules Gr1+ ou les cellules CD11b+ sont finalement purifiées par un programme de sélection positive sur colonne magnétique par AUTOMACS (Miltenyi Biotec). La fraction positive obtenue est composée à plus de 98% de cellules Gr1+ ou de cellules CD11b+. Les cellules CD11b+ purifiées par AUTOMACS sont marquées à l’aide de l’anticorps anti-GR1 (clone RB6-8C5). Les cellules CD11b+ sont ensuite séparées sur base de l’intensité d’expression de la molécule GR1 par fluorocytométrie en tri-électromagnétique (cell-sorting). Les différentes 93 fractions cellulaires séparées sont lysées dans une solution de TRIzol (Invitrogen) afin de procéder à l’extraction de l’ARN. 7. Traitements in vivo. Implantation des cellules tumorales : Les cellules tumorales P815 (clone PHRT-3 provenant du laboratoire du Pr. Thierry Boon, UCL) et les cellules L1210 sont injectées par voie sous-cutanée à raison de 2 x 106 cellules/100µl de PBS dans le flanc droit de souris DBA/2. Les cellules tumorales EG7-OVA sont injectées par voie sous-cutanée à raison de 5 x 106 cellules/100µl de PBS dans le flanc droit de souris C57BL/6. Protocole d’immunothérapie : Les BMDC sont préalablement maturées à l’aide de 1µg/ml de LPS pendant 4h à 37°C. Les BMDC sont prélevées, lavées, comptées et ensuite incubées durant 1h30 avec le peptide OVA (SIINFKEL, 5ug/ml/107 cellules) à 4°C, ou le peptide P1A (30µg/ml/107 cellules) à 37°C. Elles sont ensuite lavées dans du tampon PBS, comptées et administrées à raison de 3 x 105 cellules/50µl de PBS dans les coussinets plantaires postérieurs de souris porteuses de tumeurs (EG7-OVA ou P815) implantées depuis 5 jours. Les souris sont immunisées à quatre reprises et chaque immunisation est espacée de quatre jours. Traitement au cyclophosphamide : Les souris DBA/2, porteuses de tumeurs P815 préimplantées depuis 17 ou 25 jours sont injectées par voie intrapéritonéale à l’aide d’une solution stérile de cyclophosphamide monohydrate (Sigma-Aldrich) à une concentration de 4 mg de cyclophosphamide/200µl de PBS. Chaque souris reçoit 200 µl soit une dose unique de 4 mg de cyclophosphamide. Expérience de transfert adoptif de cellules Gr1+ : Les cellules Gr1+ sont purifiées à partir de rates de souris porteuses de tumeurs P815 établies depuis 17 jours et traitées au cyclophosphamide après 48h. Les cellules GR1+ sont injectées par voie intraveineuse à raison de 2 x 107 cellules/200µl de PBS dans la queue de souris DBA/2 receveuses et porteuses de tumeurs P815 établies depuis 6 jours. 94 Traitement à l’aide d’anticorps déplétants : Aux jours 7 et 11 après implantation des cellules tumorales P815, les souris sont injectées par voie intrapéritonéale à l’aide d’un anticorps qui déplète les cellules CD4+ (anti-CD4 ou clone GK1.5) ou les cellules CD8+ (anti-CD8 ou clone H35) à raison de 500µg/200µl de PBS. Ces anticorps déplétants proviennent d’ascites et ont été dosés par ELISA. Mesure du volume de la tumeur : Les cellules tumorales implantées par voie sous-cutanée forment après quelques jours une excroissance localisée principalement sous la peau. A l’aide d’un pied à coulisse, nous mesurons les côtés de la tumeur le plus court (l) et le plus long (L). Le volume de la tumeur est calculée selon la formule (L x l x h) /2 et est exprimé en mm3. 8. Extraction d’ARNm et RT-PCR quantitative. L'ARNm total de cellules en culture ou d'organes de souris est extrait à l'aide de TRIzol (Invitrogen) suivant le protocole recommandé par le fabricant. L'ARN extrait est traité à la DNase pendant 15 min à 37Co (composition tampon: Tris 50 mM pH 7,5 ; MgCI2 10mM ; RNaseOUT, Invitrogen, 0,4 U/µl ; DNase I RNase Free, Roche, 0,4 U/µl) afin d'éliminer les éventuelles contaminations par de l'ADN génomique. Après extraction par phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol, la concentration et la pureté de l'ARN purifié sont mesurées par spectrométrie à 260 nm et 280 nm. L'ARN est ensuite rétrotranscrit en ADNc. Pour ce faire, 16 µl d'ARN (0,1 µg/ml) combinés à 4µl d'oligo(dT) (0,5 µg/ml) sont incubés 10 min à 65C°. Ensuite, l'ARN est rétrotranscrit, dans un volume final de 40 µl, pendant 1 heure à 37C° (composition du tampon: first stand buffer, Invitrogen, 1x ; DTT 10 mM ; dNTP 1 mM ; RNaseOUT, Invitrogen, 1,2 U/µl ; M-MLV reverse transcriptase, Invitrogen, 10 U/µl). La réaction de rétrotranscription est arrêtée en incubant les échantillons à 95C° pendant 5 min. Les quantités d'ADNc des différents échantillons sont obtenues par PCR quantitative qui est réalisée à l'aide de l’appareil GeneAmp 5700 (Perkin Elmer). Le mélange qPCR Core Kit for SYBER Green I (Eurogentec, Liège) est utilisé pour amplifier les ADNc, en présence des amorces adéquates. Les quantités d'ADNc dans les différents échantillons sont relativisées par rapport à une référence d'amplification : dans notre cas, il s’agit du gène de ménage codant pour l’ubiquitine. 95 Tableau 1 : Séquences des amorces utilisées en RT-PCR quantitative. Ubiquitine 5’-FCGTCTGAGGGGTGGCTATTA 3’-TAAATTGGGGCAAGTGGCTA iNOS 5’-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT 3’-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG TGFβ 5’-TGACGTCACTGGAGTTGTACGG 3’-GGTTCATGTCATGGATGGTGC IL-10 5’-GTGGAGCAGGTGAAGAGTGAT 3’-CCAAGGAGTTGTTTCCGTTAGC IL-4 5’-TTGTCATCCTGCTCTTCTTTCTC 3’-CTCACTCTCTGTGGTGTTCTTCG IL-12p40 5’-TCAACATCAAGAGCAGTAGC 3’-GGAGAAGTAGGAATGGGGAGT IL-12p35 5’-CCTCAGTTTGGCCAGGGTC 3’-CAGGTTTCGGGACTGGCTAAG IL-23p19 5’-GACCCACAAGGACTCAAGGA 3’-AGGCTCCCCTTTGAAGATGT IFNγ 5’-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA 3’-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG 9. Analyses immunohistochimiques. Préparation des coupes à congélation : Les rates et les tumeurs sont prélevées et déposées dans des cupules contenant un milieu spécial de conservation pour la congélation (KP-cryoblock, Frozen Tissue Medium de la firme Klinipath). Les cupules contenant les prélèvements sont ensuite congelées pendant une nuit à -80°C. Après congélation des prélèvements, des coupes histologiques de 5µm d’épaisseur sont réalisées à l’aide d’un cryostat (maintenu à une température de -20°C) et déposées sur des lames en verres gélatinées. Ces coupes histologiques peuvent être conservées durant des mois à une température de -20°C. Immunohistochimie Les coupes histologiques sont traitées dans un bain de méthanol refroidi à -20°C pendant 5 minutes, traitement qui consiste à « fixer » les coupes histologiques, pour ensuite être lavées dans un bain de PBS. Les coupes histologiques sont ensuite incubées pendant 30 minutes avec 100µl d’une solution contenant 1% de Blocking Reagent (Boehringer) dissout dans du PBS à pH 7,4-7,6 par simple dépôt de cette solution à l’aide d’une pipette sur la coupe. Cette étape importante permet d’éviter les marquages non spécifiques des anticorps sur la coupe par saturation des récepteurs cellulaires Fc. Les lames histologiques sont lavées dans un bain de PBS pendant 2 minutes. 96 Pour la microscopie confocale : Les lames sont incubées pendant une nuit avec 2µg/ml du premier anticorps primaire dilué dans une solution de 1% de Blocking Reagent : anti-CD11c biotinylé (clone N418) à 4°C. Le lendemain, les coupes histologiques sont lavées dans deux bains de PBS successifs pendant 10 minutes. Les lames histologiques sont ensuite incubées à température ambiante et dans l’obscurité pendant 2h avec 1µg/ml d’un anticorps anti-biotine couplé au fluorochrome Alexa 488 (Molecular Probes) dilué également dans une solution de 1% de Blocking Reagent. Le fluorochrome Alexa 488 est excité par un rayonnement laser monochromatique de 488 nm et émet à une longueur d'onde de 520 nm (rouge). Les lames histologiques sont ensuite lavées 10 min. dans deux bains successifs de PBS. Afin d'éviter les réactions non spécifiques avec le deuxième anticorps primaire qui est aussi un anticorps biotinylé, nous avons saturé les biotines non couplées au fluorochrome Alexa 488 en incubant les lames histologiques pendant 10 min. avec une goutte de solution d'avidine (Kit ABC vector, Sigma), suivi d’un lavage des lames histologiques dans du PBS. Ces lames sont ensuite incubées pendant 10 minutes avec une goutte de solution de biotine (Kit ABC vector, Sigma) et lavées dans deux bains de PBS successifs. Le même protocole a été réalisé pour le marquage à l’aide du deuxième anticorps primaire antiGr1 biotinylé (clone RB6-8C5, 2µg/ml). L’anticorps secondaire utilisé est couplé au fluorochrome Alexa 568 provenant de chez Moleculer Probes et a été également dilué 1000x dans une solution à 1% de Blocking Reagent (1µg/ml). Ce fluorochrome est excité par un rayonnement laser monochromatique de 568 nm et émet à une longueur d'onde de 600 nm (vert). Pour parachever les coupes histologiques, des lamelles sont fixées sur les lames histologiques grâce à un milieu de montage (Mouting Medium Dakar). Pour la microscopie optique : Le protocole d’incubation à l’aide des anticorps primaires biotinylés et secondaires est le même que celui de la microscopie confocale. Les anticorps biotinylés utilisés sont l’anti-CD11c (clone N418, 2µg/ml) et l’anti-GR1 (clone RB6-8C5, 2µg/ml). Les anticorps secondaires utilisés sont des anticorps anti-biotine associés soit à une phosphatase alcaline (ABC-AP) soit à une peroxydase (ABC-POD) (Kits ABC Vector, Sigma) dilués 75x dans une solution de 1% de Blocking Reagent. Le protocole de marquage à l’aide de ces anticorps secondaires a été suivi selon les recommandations de la firme. La révélation à l’aide du chromogène dépend de la molécule de couplage utilisée POD ou AP. 97 Pour la POD (révélation de couleur rouge) : incubation des lames histologiques à l’aide de 100µl d’une solution d’AEC (amino ethyle carbazole, Sigma) préparée de la manière suivante : une pastille d’AEC est dissoute dans 2,5 ml de dimethylformaldéhyde, cette solution est portée à 50 ml avec du tampon acétate (pH 5) dans laquelle 20 à 25 µl d’H202 sont ajoutés. Pour la AP (révélation de couleur bleue) : incubation des lames histologiques à l’aide de 100µl d’une solution de chromogène préparée à partir des réactifs provenant du Kit ABC-AP Vector de chez Sigma. Solution préparée selon les recommandations de la firme. L’apparition de la coloration après révélation se fait sous microscope optique et indique l’arrêt de la réaction en plongeant les lames histologiques dans un bain de PBS. Le protocole du montage des lames histologiques est identique à celui de la microscopie confocale. 98 Bibliographie 99 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Ribatti, D. et al. The role of mast cells in tumour angiogenesis. Br J Haematol 115, 514-21 (2001). Norrby, K. Mast cells and angiogenesis. Apmis 110, 355-71 (2002). Levi-Schaffer, F. & Pe'er, J. Mast cells and angiogenesis. Clin Exp Allergy 31, 521-4 (2001). Theoharides, T.C. & Conti, P. Mast cells: the Jekyll and Hyde of tumor growth. Trends Immunol 25, 235-41 (2004). Norrby, K. & Sorbo, J. Heparin enhances angiogenesis by a systemic mode of action. Int J Exp Pathol 73, 147-55 (1992). Sorbo, J., Jakobsson, A. & Norrby, K. Mast-cell histamine is angiogenic through receptors for histamine1 and histamine2. Int J Exp Pathol 75, 43-50 (1994). Meininger, C.J. Mast cells and tumor-associated angiogenesis. Chem Immunol 62, 239-57 (1995). Maryanski, J.L. & Boon, T. 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