Génotypage par MLST des souches de Klebsiella pneumoniae
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Génotypage par MLST des souches de Klebsiella pneumoniae résistantes aux quinolones au CHU Fattouma Bourguiba de Monastir Présenté par: Mariem Nasri, Maha Mastouri, Mahjoub Aouni Wang Minggui Laboratoire de microbiologie CHU-FB de Monastir (LR99ES27) Insitut d’antibiotiques, hôpital Huashan, université Fudan, Shanghai, Chine Introduction Les K. pneumonie Famille :Entérobactéries Pouvoir infectieux: Tractus réspiratoires, Infections urinaires, Septicémies. Elles sont isolés : En milieu communautère En milieu hospitalier Les infection sont d’autant grave lorsque ces bactéries présentent différents phénotypes de résistance aux antibiotiques. Quinolones resistance in K. pneumoniae Plasmid: qnr aac(6’)-ib-cr Qep A Mutations: gyr A, gyr B par E, par C Quel est lé mécanisme de résistance des K.pneumoniae au quinolones ? Mécanisme de résistance aux quinolone • • • Mutations ponctuelles aux niveau des topoisomérases gyrA, gyrB, par E et par C (QRDR) La molécule d’ATB ne connait plus la cible et ne peut plus s’y fixer. Aquisition de plasmide(PMQR) Gènes qnr Gènes aac-Ib-cr Gènes qepA Les gènes qnr Les qnr : se présentent selon plusieurs variétés allélique (qnr A, qnrB,qnrC, qnrD, qnrS) Leurs expressions donnent des proteines qui protègent les topoisomèrèses et ces dernières ne sont plus reconnu par les quinolones Conséquence: résistance par protection de la cible Le gène aac-Ib-cr L’expression de ce gène apporté par un plasmide donne une enzyme capable de dégrader les qinolones. Conséquence: inactivation de la quinolone après sa dégradation Le gène qepA L’expression de ce gène plasmidique donne une protéine qui permet l’expulsion de la molécule quinolone à l’extérieure de la bactérie. Conséquence : l’antibiotique est exclu à l’extérieure de la bactérie par efflux par la pompe qepA. Comment élucider la dissémination et l’épidemiologie des K.pneumoniae résistantes aux quinolone ? Introduction Techniques phénotypiques Atibiotypie et détermination des CMI Techniques moléculaires basées sur le génotypage: PFGE, MLST, RAPD. Objectifs Etude de l’aspect clinique de la dissémination des K.pneumoniae . Décrire les différents phénotypes de résistance aux quinolones MLST des isolats de K. pneumoniae résistantes aux quinolones. Matériel et méthodes 1 Souches isolées: 60 Klebsiella pneumoniae résistantes aux quinolones Période : 2 ans et 8 mois allant du mois d’ octobre 2010 jusqu’au juin 2013. Identification par biotypage: Api 10 S et Api 20 E. Antibiotypie: Antibiogramme conforme aux recommandations du CA-SFM Méthode de diffusion sur gélose MH Les CMI de l’acide nalidixique ont été calculées par méthode de dilution à 8 concentrations allant de 8 µg/ml à 1024 µg/ml. Les antibiotiques testées: NA,NOR, OFX, CIP, AMX, AMC, TIC, IMP, CF, FOX, CTX, CAZ, ATM, GM, AN, TM et SXT. Matériel et méthodes 2 23 souches sélectionnées ,sur la base d’acquisition de PMQR, pour subir la MLST. 7 gènes de ménage ont été étudiés: gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB et tonB. L’amplification par PCR a été réalisé en utilisant des amorces spécifiques pour chaque gène (Diancourt et al) Pour chaque locus toute séquence différente a été désigné par un numéro d ’allèle distinct Pour chaque isolat la combinaison de 7 numéros entiers correspond aux allèles de 7 loci définit le profil allélique ou le séquencotype (ST). Les numéros des ST ont été attribué en se référant à la base de données MLST de K.pneumoniae (www.pasteur.fr/mlst). Résultats et discussion (1) La résistance des entérobactéries aux quinolones est de 20% et les souches de K. pneumoniae occupent la deuxième place après E.coli pendant la période d’étude (28 %) figure . Entérobactéries résistantes aux quinolones C freundii E cloacae K pneumoniae K oxytoca C diversus C koseri P vulgaris 1% 1% 3% 7% 28% 52% 3% 1% 1% 3% E coli Salmonella P rettgeri Résultats et discussion2 Répartition des K pneumoniae selon les types de prélèvements 35 30 25 20 K pneumoniae 15 10 5 0 Urine Pus Sang Catheter Urine (52%) Suppurations (17%) Prélèvements respiratoires (11%) Sang (11%). A trachéale Ponction pleurale Selles Résultats et discussions 3 Répartition des souches de K. pneumoniae selon les services 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Réanimation (23%), Pédiatrie (15%) Consultations externes (15%) Résultats et discussions (4) Pourcentages de résistances K.pneumoniae résistantes aux quinolones Antibiotiques Nombre de souches résistantes % de souches résistantes Amoxcilline 60 100 Amoxcilline + Acide clavulanique 53 87,5 Ticarcilline 60 100 Imipénème 0 0 Céfaloridine 56 93,7 Cefoxitine 60 100 Cefotaxime 51 84,4 Céftazidime 49 81,2 Aztreonam 53 87,5 Gentamicine 39 65,6 Amicacine 17 28,1 Tobramycine 45 75 Bactrim 45 75 CMI de l’acide nalidixique >256µ/mL Détermination de la CMI de l’acide nalidixique: méthode de dilution 8 µg/ml 16 µg/ml 32 µg/ml 64 µg/ml 128 µg/ml 256 µg/ml 512 µg/ml 1024µg/ml Phénotypes de résistances des K pneumoniae aux quinolones Acide nalidixique Norfloxacine Ofloxacine Ciprofloxacine Résistantes Résistantes Résistantes Résistantes 100% 35,8% βLSE Corrélation entre phénotypes de résistance et supports moléculaires probables Phénotype NA OFX CIP Support moléculaire probable 2 mutations gyr A + mutation par C (Merens et al., 2010) I R R R II R S S Mutation gyr A (Merens et al., 2010) R 1 mutation gyr B (Demartin et al., 2011) S Mutation gyr A + mutation parC (Merens et al., 2010) III IV S R R R L’acquisition de βLSE, la résistance aux quinolones et aux aminosides ont été détectées en Tunisie :Hôpital Sahloul de Sousse (Dahmen et al., 2009). Résultats et discussions (6) Liaison entre la résistance aux quinolones et acquisition de BLSE: qnr A et qnr B portés par des plasmides dans des intégrons de type sul 1 portant des gènes codant des céphalosporinases. 1er qnr A1 decrit en 1998 chez K. pneumoniae isolée en Alabama était porté par le plasmide pMG252, en association avec la céphalosporinase FOX5.(Meren et al ., 2010) Liaison entre la résistance aux quinolones et aux aminosides: Association des gènes codant les BLSE et les plasmides codant la résistance aux aminoglycosides et sulfamides (Ex: AAC(6’)-ib)(Paterson et al., 2006). Résultats et discussions (6) Liaison entre la résistance aux quinolones et acquisition de BLSE: qnr A et qnr B portés par des plasmides dans des intégrons de type sul 1 portant des gènes codant des céphalosporinases. 1er qnr A1 decrit en 1998 chez K. pneumoniae isolée en Alabama était porté par le plasmide pMG252, en association avec la céphalosporinase FOX5.(Meren et al ., 2010) Liaison entre la résistance aux quinolones et aux aminosides: Association des gènes codant les BLSE et les plasmides codant la résistance aux aminoglycosides et sulfamides (Ex: AAC(6’)-ib)(Paterson et al., 2006). Séquençotype des K. pneumoniae données par la MLST. Service Séquencotype (ST) Pédiatrie ST4 (n=7) ST 86(n=1) Néphrologie ST 15 (n=4) ST 101 (n=2) Réanimation ST 147 (n=2) ST 101 (n=1) ST 336 (n=1) Chirurgie ST 14 (n=1) Cardiologie ST 307 (n=1) Mosaïque de ST au sain de hopital Caractère communautaire de la dissémination Présence des mes ST dans un seul service Caractère nosocomial de la propagation Le ST4 et le ST 15 présents chez K.pneumoniae ont été découverts en France. Le ST4 était associé à une BLSE et trouvé dans une souche K.pneumoniae isolé chez un Nigerien (6). Le ST101 et le ST147 ont été décrit pour la 1ere fois en Pologne et en Hongrie ensuite propagés à l’échelle mondiale et associée à une miltirésistance [43,44]. Le ST14 a été dejà decrit en Afrique [28]. Les ST86, ST336 et ST307 n’ont jamais été évoqué en Afrique, mais trouvés en France, en Amérique et en Pays-Bas. Le ST4 et le ST 15 présents chez K.pneumoniae ont été découverts en France. Le ST4 était associé à une BLSE et trouvé dans une souche K.pneumoniae isolé chez un Nigerien (Filippa N et al 2013). Le ST101 et le ST147 ont été décrit pour la 1ere fois en Pologne et en Hongrie ensuite propagés à l’échelle mondiale et associée à une miltirésistance (Dzierzanowska D et al 2010, Damjanova I et al 2008) Le ST14 a été dejà décrit en Afrique (Mshana et al 2013). Les ST86, ST336 et ST307 n’ont jamais été évoqué en Afrique, mais trouvés en France, en Amérique et en PaysBas. Conclusions et Perspectives 20 % des entérobactéries isolées aux cours de cette étude sont résistantes aux quinolones Implication des K.pneumoniae résistantes aux quinolones dans des infections hospitalières et communautaires. Elucider les mécanismes moléculaires de résistance aux quinolones (PCR+séquençage , PCR multiplex des gènes qnr) Chercher une association moléculaire entre la résistance aux quinolones, aminosides,sulfamides et βlactamines.
