Stage effectué du 12 avril au 28 mai 2010 sous la responsabilité de

Immeuble « Le Dufy »
1, Place de Turenne
94417 SAINT-MAURICE
Tel : 01.49.76.52.52
Fax : 01.49.76.52.42
Stage effectué
du 12 avril au 28 mai 2010 sous
la responsabilité de
Mme Florence Poty
ANALYSE
MICROBIOLOGIQUE
DE L’EAU
J’ai effectué ce stage au Centre d’Analyses Environnementales situé à Saint-Maurice aussi appelé Laboratoire
central. Sa mission est d’analyser des échantillons d’eau provenant de divers sites de prélèvement.
Mon rôle était d’effectuer différentes analyses sur des échantillons d’eau provenant d’usine de traitement et de
canalisation domestique. Ces analyses ont pour but de vérifier la propreté microbiologique de l’eau c'est-à-dire si
celle-ci ne contient pas de micro-organismes pathogènes pour l’Homme, conformément aux réglementations de
la santé publique.
I did this internship in Centre d’Analyses Environnementales located in Saint-Maurice (94) also called Laboratoire
central. Its mission is to analyze water samples taken from different sites. I had to analyse water samples
from pipeline servant and plant treatment. These tests aim to control the microbiological cleanliness of the
water, in order to determine if it is dangerous to humans, conformly to public health regulations.
Année scolaire 2009/2010
L2 chimie
Marie Méligne
Marie Méligne
Analyse microbiologique de l’eau
2010
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier :
-
Mme Florence POTY, responsable du service technique de microbiologie et de chimie et directrice
adjointe du laboratoire, pour m’avoir accueillie au sein de son service dans le cadre de mon stage.
-
Mme Stéphanie HOUDARD, responsable de l’unité technique de microbiologie ainsi que Mme Sophie
MOREAU, responsable de l’unité technique légionelle pour leur disponibilité et pour m’avoir encadré
tout au long de mon stage.
-
Mme Aurore FAURE et Melle Marie-Ève BERCHERY, pour m’avoir formée en bactériologie et en
DAPI/CTC, ainsi que pour leur aide quotidienne pendant mon stage.
-
Toute l’équipe de production du laboratoire d’analyse pour leur accueil, leurs conseils, leur
disponibilité et leur patience tout au long de mon stage : Isabelle BONANNI, Florian D’ARCO, Sandra
DA SILVA, Virginie DEL, Sophie DELGADO, Fabien GADY, Stéphanie HOUVET, Sébastien JEAN, Antoine
JICQUEL, Benjamin LALOE, Emilie NATALI, Camille NEGRE.
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Marie Méligne
Analyse microbiologique de l’eau
2010
SOMMAIRE
Remerciements ....................................................................................................................................................... 2
Sommaire ................................................................................................................................................................ 3
Glossaire .................................................................................................................................................................. 4
Introduction ............................................................................................................................................................ 5
1)
Présentation du Centre d’Analyses Environnementales (CAE) ............................................................... 5
2)
Activités et organisation du laboratoire de Saint Maurice .................................................................... 6
3)
Le service microbiologie ........................................................................................................................ 6
Matériel et méthode du service de bactériologie ................................................................................................... 7
1)
Matériel utilisé dans le laboratoire de microbiologie ............................................................................ 7
A.
Les consommables et petits équipements ............................................................................................ 7
B.
Appareillage ........................................................................................................................................... 7
2)
Méthode d’analyse des divers échantillons ........................................................................................... 7
A.
Recherche des Entérocoques et des bactéries coliformes (Escherichia coli) par filtration ................... 8
B.
Recherches des micro-organismes revivifiables .................................................................................... 8
C. Recherche et dénombrement des spores de micro-organismes anaérobies sulfito-réducteurs par
filtration sur membrane ................................................................................................................................. 8
Lectures et Repiquages ......................................................................................................................................... 10
1)
Dénombrement des Entérocoques ...................................................................................................... 10
2)
Dénombrement des coliformes et des Escherichia coli ....................................................................... 10
3)
Dénombrement des micro-organismes revivifiable ............................................................................. 10
4)
Dénombrement des spores de micro-organismes anaérobies sulfito-réducteurs ............................... 11
Conclusion ............................................................................................................................................................. 12
Bibliographie ......................................................................................................................................................... 13
1)
Sites internet........................................................................................................................................ 13
2)
Notices techniques .............................................................................................................................. 13
Annexe 1................................................................................................................................................................ 14
Annexe 2................................................................................................................................................................ 17
Annexe 3 : Composition des divers milieux de culture ......................................................................................... 20
Annexe 4 : Composition des divers milieux de repiquage ..................................................................................... 21
Annexe 5 : Schéma simplifié des relations entre différents acteurs du domaine de l’eau d’alimentation ............ 22
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Analyse microbiologique de l’eau
2010
GLOSSAIRE
Anaérobiose : désigne la capacité d'un organisme ou micro-organisme à se développer en l’absence oxygène
AFNOR : Association Française de NORmalisation
AFSSA : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
BEA : Gélose Esculine Azide
CAE : Centre d’Analyses Environnementales
Catalase (positif ou négatif) : enzyme catalysant la dismutation de l’eau oxygénée (peroxyde d’hydrogène)
CEN : Commissions Européen de normalisation
COFRAC : COmité FRançais d’Accréditation
CSHPF : Conseil Supérieur d'Hygiène Publique de France
DASS : Direction des Affaires Sanitaires et Sociales
GIE : Groupement d’Intérêt Economique
Gram (positif ou négatif) : les bactéries à Gram positif sont mises en évidence par une technique de coloration
appelée coloration de Gram, elles apparaissent alors mauves au microscope. La technique de coloration repose
sur les caractéristiques membranaires et de paroi de la bactérie
ISO : International Organization for Standardization
Oxydase (positif ou négatif) : enzyme catalysant la réaction d'oxydo-réduction impliquant une molécule de
dioxygène, qui est réduit en eau H2O ou en peroxyde d'hydrogène.
PCA : Plate Count Agar, milieu ordinaire, sans inhibiteurs, permettant la croissance de l'ensemble des bactéries
PCR : Réaction en chaîne par polymérase (de l'anglais polymerase chain reaction), méthode de biologie
moléculaire d'amplification d'ADN in vitro
TTC : Chlorure de Triphényl Tétrazolium, milieu de culture sélectif utilisé pour le dénombrement des bactéries
coliformes
TSC : Tryptose Sulfite
Slanetz (gélose de) : milieu de culture sélectif utilisé pour le dénombrement des Entérocoques
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Analyse microbiologique de l’eau
2010
INTRODUCTION
L’eau est essentielle à la vie et au bien-être. La quantité moyenne d’eau contenue dans un organisme adulte est
de 65 %. Or le corps humain ne peut la stocker : l’homme doit donc chaque jour subvenir à ses besoins en eau.
C’est pourquoi elle a besoin d’être protégée, traitée et économisée. De plus en raison de son caractère vital,
l’eau consommée doit être de bonne qualité sanitaire afin d’éviter la survenue de certaines pathologies
hydrique.
Actuellement, les principaux risques sanitaires susceptibles d’être engendrés par l’ingestion de l’eau du robinet
sont de deux types :
- Le risque microbiologique
- Le risque chimique
Des laboratoires d’analyses tels que les Centres d’Analyses Environnementales (CAE) de Veolia Environnement
sont là pour procéder à un contrôle complet de l’eau afin d’assurer une bonne qualité et une protection de
l’environnement. Lors de mon stage, je me suis intéressée à ce premier type de risque.
La recherche dans l’eau de tous les micro-organismes potentiellement dangereux s’avère irréaliste, tant pour
des raisons techniques qu’économiques. Ainsi, actuellement, la stratégie de contrôle repose sur la recherche
de bactéries dites « germes témoins de contamination fécale », faciles à détecter, non directement
pathogènes, mais dont la présence laisse supposer l’existence de germes autrement dangereux. Le contrôle de
la conformité de la qualité microbiologique de l’eau porte sur la vérification de l’absence d’Escherichia coli et
d’entérocoques dans un échantillon de 100 millilitres d’eau prélevé dans le cadre du contrôle sanitaire courant.
Par ailleurs, la recherche de spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices telles que les Clostridium, dans
le cadre du contrôle sanitaire renseigne sur l’efficacité des systèmes de filtration.
Les efforts menés par l’ensemble des acteurs (collectivités, responsables de la production, financeurs,
administrations, etc.) ont permis d’améliorer fortement la qualité microbiologique des eaux au cours des
dernières années. Ainsi, la proportion de population ayant été exposée à des eaux non conformes vis-à-vis de la
qualité microbiologique a diminué de moitir depuis 2000 (4,4 % contre 8,8 % en 2006).
1) Présentation du Centre d’Analyses Environnementales (CAE)
Le Centre d’Analyse Environnementales a été créé afin de regrouper les différentes activités analytiques du
groupe Veolia Environnement, leader mondial des services de l’environnement. Il est composé d’un réseau de
sept laboratoires répartis en France. Les laboratoires à Saint-Maurice, à Arras, à Caen, à Florange, à Lyon, à
Rennes et à Toulouse. Il emploie environ 200 collaborateurs et traite environ 200 000 échantillons par an. Le
site de Saint-Maurice (94) se compose du Laboratoire Central, chargé des prestations analytiques de routine,
d’une équipe support (informatique, logistique, achat et administration), ainsi que de deux équipes de
recherche, principalement responsables du perfectionnement des méthodes analytiques existantes et du
développement de techniques innovantes, dans les domaines de la microbiologie et de la chimie.
Les équipes du CAE ont pour mission d’évaluer les besoins, les prélèvements et transports des échantillons, de
l’analyse, de la validation et de la restitution des résultats. Le domaine d’expertise se situe au-delà des eaux
propres et résiduaires, puisqu’il recouvre l’ensemble des domaines de l’environnement : l'air, les déchets et
combustibles et les matériaux.
De plus, le laboratoire central doit s’assurer de la conformité des opérations et propose un accompagnement et
des services complémentaires. Ces prestations font du CAE un pôle d’expertise reconnu de l’analyse
environnementale. Membre du GIE (Groupement d’Intérêt Économique), il est accrédité par le COFRAC (COmité
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Analyse microbiologique de l’eau
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FRançais d’ACcréditation) dans les domaines de la mesure physico-chimique et de la microbiologie des eaux. Il
est également membre des commissions de normalisation en France (AFNOR), en Europe (CEN) et au niveau
international (ISO).
2) Activités et organisation du laboratoire de Saint Maurice
Le laboratoire a pour mission de réaliser des analyses microbiologiques et physico-chimiques pour le contrôle
de l'environnement. Les analyses effectuées se situent dans le domaine plus particulier de la qualité de l'eau,
des boues et des déchets.
Il existe quatre types d'échantillons différents reçus par le CAE qui proviennent de stations de distribution d’eau
potable, de rivières, de forage, ou encore de particulier :
- Eaux propres : eaux destinées à la consommation
- Eaux sales : rejets liquides d'usines, eaux non traitées
- Déchets : résidus solides, déchets ménagers et industriels
- Boues
Le CAE de Saint Maurice comporte trois grands services :
- Chimie minérale (Métaux lourds, Sels minéraux, Phénols, Détergents, Hydrocarbures, dosage d’ions…)
- Microbiologie (test de contamination, virologie, test de toxicité, analyse algologique, épifluorescence,
saveurs, parasitologie…)
- Chimie organique (Micro-polluant, composés phénoliques, solvants, résidus de pesticides…)
3) Le service microbiologie
Le laboratoire d’analyses microbiologiques traite chaque année 80 000 échantillons. Selon la nature des
échantillons et la demande faite par les clients, ils y subiront des analyses différentes. Ce service comprend une
Unité Technique « Microbiologie » (bactériologie, parasitologie, algologie, virologie, bactériophage…) et une
Unité « Legionelle » (méthode par culture et par PCR). Toutes ces analyses constituent un moyen de contrôler et
de garantir la qualité de l’eau pour le consommateur.
Au cours de mon stage, j'ai donc pu évoluer dans le service de microbiologie dont voici l'organigramme :
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Analyse microbiologique de l’eau
2010
MATÉRIEL ET MÉTHODE DU SERVICE DE
BACTÉRIOLOGIE
1) Matériel utilisé dans le laboratoire de microbiologie
Outre le matériel courant de laboratoire, la manipulation en laboratoire de microbiologie doit impérativement
se faire de façon stérile pour éviter toutes sources de contamination extérieures des échantillons. Pour se faire
on utilise donc le matériel suivant :
A. Consommables et petits équipements
Des rampes de filtration et frittés stérilisés à intervalles réguliers (plusieurs fois par jour au bec benzen et une
fois par semaine à l’autoclave) sur lesquelles on ajoute des membranes filtrantes stériles de porosité 0,45 µm,
et des entonnoirs stériles en plastique. Des pinces permettant de saisir les membranes sans les altérer sont,
elles aussi, régulièrement stérilisées à la flamme (Cf Annexe 1, figure 1). Lors des diverses manipulations, on
peut être amené à se servir de pipettes pasteur stériles, de Tubes à essais PYREX gradués de 100 ml et 20 ml, de
Bouchons en caoutchouc siliconé, mais aussi de boîtes de Petri en plastique stérile de 90 mm et de 55 mm de
diamètre, ainsi que des pipettes graduées de capacité 10 ml, 5 ml et 2 mL stériles et à écoulement total.
B. Appareillage
Dans la salle, toutes les manipulations se font soit sous un plafond laminaire, une hotte à flux laminaire ou
encore proche d’une flamme pour assurer la stérilité de l’environnement de l’analyse. (Cf Annexe 1, figure 2)
Sont aussi présents plusieurs bains marie. Un premier bain-marie réglé sur environ 100°C pour fondre les
milieux pendant une heure maximum, et deux autres réglés à (45 ± 1)°C et 50°C pour les maintenir en
surfusion. Un dernier bain-marie, réglé à une température de (75 ± 5)°C, pour la sélection des spores de
bactéries anaérobies sulfito-réductrices de type Clostridium.
Pour permettre à toutes les flores de se développer 4 types d’étuves thermostatées sont présents. Des étuves
réglées à (36 ± 2) °C, d’autres réglées à (22 ± 2) °C, certaines à (44 ± 2) °C, et enfin à (37 ± 2) °C (Cf Annexe 1,
figure 3).
2) Méthode d’analyse des divers échantillons
Pour mener à bien ces recherches bactériennes, le service effectue des analyses sur des échantillons d'eaux
propres qui arrivent au cours de la journée dans des bouteilles en plastiques stériles de 500 mL. Le récipient
utilisé pour le prélèvement contient du thiosulfate de sodium à raison de 10 mg afin de neutraliser un éventuel
oxydant et le chlore. (Cf Annexe 1, figure 4)
Les échantillons sont analysés le jour même ou au plus tard dans les 24 heures suivant le prélèvement pour
limiter l’expansion de la flore bactérienne.
Les bactéries sont, les plus petits organismes unicellulaires connus, douées de métabolisme et capables de
croître ainsi que de se diviser aux dépens de substances nutritives. Le contrôle bactériologique des eaux usées
et distribuées consistent en la recherche des germes indicateurs et germes totaux :
- Bactéries coliformes et Escherichia coli par filtration sur membrane selon la norme NF EN ISO 9308-1
- Entérocoques intestinaux par filtration sur membrane selon la norme NF EN ISO 7899-2
- Micro-organismes revivifiables à 36°C et à 22°C par inclusion selon la norme NF EN ISO 6222
- Spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices par filtration sur membrane selon la norme NF EN
ISO 26471-2
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Analyse microbiologique de l’eau
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A. Recherche des Entérocoques et des bactéries coliformes (Escherichia
coli) par filtration
a. Les entérocoques
Les entérocoques sont des bactéries à Gram positif et à catalase négative qui entraîne notamment des
infections urinaires.
Elles se multiplient en aérobie. Ainsi, la recherche des celles-ci dans un échantillon d’eau passe par les étapes
suivantes :
1. Filtration de 100 mL de l’échantillon d’eau sur membrane au travers d’une membrane filtrante stérile
de porosité 0.45 µm.
2. Dépôt de la membrane sur milieu gélosé sélectif contenant de l’azoture de sodium destiné à inhiber la
croissance des bactéries à Gram négatif (Slanetz). (Cf Annexe 1, figure 5)
3. Incubation pendant (44±4) heures à (36±2) °C.
b. Les bactéries coliformes
Les coliformes sont des bactéries à Gram négatif et oxydase négative. Elles peuvent former des colonies en
aérobiose sur un milieu de culture lactosé sélectif. La plus connue d’entre elles est l’Escherichia coli, qui peut
entraîner gastro-entérites, infections urinaires, méningites, ou septicémies.
La recherche de ces bactéries dans un échantillon d’eau reprend le même mode opératoire que pour les
entérocoques. À l’exception du milieu sélectif utilisé qui est le T.T.C (Chlorure de Triphényl Tétrazolium). De plus,
une seconde boîte avec une membrane supplémentaire est incubée à (44 ± 1)°C pendant (44 ± 4) heures
permettant la recherche des coliformes thermotolérants mais aussi évitant le problème de la flore interférente.
(Cf Annexe 1, figure 6)
Une autre méthode existe pour déterminer la présence de bactérie coliforme, toutefois celle-ci reste
qualitative. Cette détection se fait grâce à des kits, appelés Colilert (détection des coliformes totaux). Ils offrent
la possibilité de suivre la qualité de l’eau en cours de traitement et permettent d’agir plus rapidement, car le
temps d’incubation n’est que de à (24 ± 1) heures. On met en évidence la présence de coliformes par
l’apparition d’une couleur jaune/orangée. En présence de cette couleur, une lecture visuelle sous UV à 365 nm
est réalisée : une fluorescence bleue mettra en évidence la présence d’E. coli. (Cf Annexe 1, figure 7)
B. Recherches des micro-organismes revivifiables
Le principe de la recherche et du dénombrement des micro-organismes revivifiables dans un échantillon d’eau,
repose sur les étapes suivantes :
1. Ensemencement de 1 mL d’échantillon d’eau en boîte de pétri de 90mm de diamètre, le milieu de
culture utilisé est le Plate Count Agar (PCA).
2. Incubation des boîtes à (36±2) °C pendant (44±4) heures et à (22±2) °C pendant (68±4) heures.
Le milieu PCA étant très peu sélectif, on cherche ici à dénombrer le nombre de micro-organismes vivants
présent dans l’échantillon. (Cf Annexe 1, figure 8)
C. Recherche des spores de micro-organismes anaérobies sulfitoréducteurs par filtration sur membrane
Ces micro-organismes sont capables de sporuler, ces spores résistent à un chauffage de 15 minutes à (75±5) °C.
Ils sont capables de se développer à (37±1) °C en (44±4) heures en anaérobiose, sur un milieu gélosé contenant
des sels de fer.
Le principe de la recherche et du dénombrement de ces micro-organismes est proche des autres modes
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Analyse microbiologique de l’eau
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opératoires.
1. On sélectionne les spores bactériennes dans l’échantillon par un chauffage au bain-marie à (75±5) °C
pendant 15 minutes, pour que les cellules végétatives soient détruites.
2. Filtration de ces 100 mL d’échantillon au travers d’une membrane filtrante stérile dont les pores
présentent une dimension de 0.45 μm pour que les spores de bactéries soient retenues à l’intérieur de
la membrane filtrante.
3. Dépôt de la membrane à l’envers sur un milieu de culture spécialement sélectif (gélose Tryptose
sulfite). (Cf Annexe 1, figure 9)
4. L’anaérobiose est créée par une seconde couche de ce milieu sur la membrane.
5. Incubation des boîtes à (37±1) °C pendant (44±4) heures.
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Analyse microbiologique de l’eau
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LECTURES ET REPIQUAGES
1) Dénombrement des Entérocoques
Après 48 heures d’incubation, on dénombre toutes les colonies présentant une couleur rouge caractéristique et
pouvant être limitée à leur centre ou leur périphérie (Cf Annexe 2, figure 1).
Toute membrane présentant ce type de colonie suspecte est transférée sur un milieu de confirmation qui est
une gélose biliée à l’esculine (BEA). Ce milieu permet l’isolation sélectif des Entérocoques, car ils tolèrent
jusqu’à 40 % de bile contrairement à de nombreux autres germes et l’azoture de sodium élimine toutes les
bactéries Gram négatifs.
Après deux heures dans une étuve à (44 ± 1)°C, les colonies confirmées comme entérocoques présentent un
halo noir traduisant l’hydrolyse de l’esculine en esculétine qui se lie avec le fer (Cf Annexe 2, figure 2).
La réglementation française actuelle impose un seuil limite, stipulant qu’aucun entérocoque ne soit présent
dans un échantillon de 100 mL.
2) Dénombrement des coliformes et des Escherichia coli
La lecture des bactéries coliformes peut se faire soit après 24 heures soient 48 heures d’incubation. Ces
bactéries sont identifiables grâce à leur couleur jaune-orange entourée d’un halo jaune sur le milieu. Ce
virement de couleur est dû au virage de l’indicateur coloré, en effet, les coliformes transforment le lactose
présent en acide lactique. (Cf Annexe 2, figure 3)
Les colonies ainsi suspectées sont repiquées par étalement sur du PCA, si elles se sont multipliées après
24heures à (36±2) °C , alors la propriété oxydase – des coliformes sera vérifiée. (Cf Annexe 2, figure 4)
En parallèle un deuxième test est effectué avec un bouillon tryptophane. Après incubation pendant 24 heures à
(44±1) °C, si de l’indole s’est formé, la présence d’un E. coli est confirmé. (Cf Annexe 2, figure 5)
La réglementation française impose que l’eau distribuée ne contienne pas d’Escherichia coli dans 100 ml d’eau.
3) Dénombrement des micro-organismes revivifiable
Ce dénombrement consiste au comptage de micro-organisme, par millilitre d’échantillon, à partir du nombre
de colonies obtenues dans la boîte(s) de Petri, avec un postulat simple ; chaque colonie a été engendrée par un
micro-organisme. (Cf Annexe 2, figure 6)
Lors du dénombrement, toutes les colonies sont comptées, quelle que soit leur taille. Le résultat final est
exprimé en UFC (Unité Formant Colonie) par millilitre.
La réglementation française ne propose pas de seuil limite pour l’eau distribuée. Une eau contenant plus de 300
UFC par millilitre est considérée comme non conforme par le laboratoire.
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Analyse microbiologique de l’eau
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4) Dénombrement des spores de micro-organismes anaérobies
sulfito-réducteurs
2-
Durant l’incubation, il y a réduction du sulfite (SO3 ) de sodium sulfure d’hydrogène (H2S) et donc production
de sulfure de fer se manifestant par un halo noir autour des colonies. Seul ce type de colonie est compté. (Cf
Annexe 2, figure 7)
Si le nombre de colonies est compris entre 1 et 10 comprise, on repiquera toutes les colonies. Tandis que si l’on
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en observe un nombre X supérieur à 10, on repiquera X colonies.
Lors de ce repiquage, on recherche les Clostridium perfringens qui peuvent entraîner des gangrènes.
Deux étalements sont effectués, un premier sur gélose au sang qui permettra d’apprécier l’hémolyse de ces
bactéries. Et un second, sur TTC enrichi en d-cyclosérine, un puissant antibiotique ne laissant pousser que les
clostridium perfringens.
Après incubation à (36±2)°C pendant 24 heures, trois cas peuvent alors se présenter :
1. Culture sur la gélose au sang : les bactéries appartiennent au genre Clostridium . (Cf Annexe 2, figure 8)
2. Aucune culture : les bactéries n’appartiennent pas au genre Clostridium.
3. Culture sur les deux boîtes : les bactéries sont de type Clostridium Perfringens.
Si le résultat est positif sur les deux boîtes et uniquement dans ce cas-là, on procède à un test
complémentaire dit « test RP ». J’ai préféré ne pas faire figurer dans ce rapport le mode opératoire
pour ne pas risquer de décrire un protocole erroné ou incomplet, car il est encore en cours de
rédaction.
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Analyse microbiologique de l’eau
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CONCLUSION
Tout au long de mon stage, j’ai pu me familiariser avec le confronter au travail de laboratoire de microbiologie.
En participant à une des étapes d’une démarche de contrôle qualité contribuant à la préservation d’une denrée
alimentaire précieuse, l’eau.
Durant ces sept semaines de stage, j’ai acquis une expérience professionnelle concrète et élargie mes
connaissances pratiques et théoriques dans le domaine de la microbiologie. Et notamment, le respect des règles
d’hygiènes et de sécurité qui sont indispensables pour le maintien de la stérilité dans le laboratoire.
Mon intégration et le travail en équipe se sont faits naturellement grâce à la disponibilité du personnel
technique et à la bonne ambiance qui règne au sein du laboratoire. La confiance que les techniciens m’ont
accordée dès les premiers jours m’a permis de développer mon sens des responsabilités ainsi que mon esprit
d’initiative.
Cette expérience professionnelle m'a donné envie d'approfondir mes connaissances théoriques, de
perfectionner mes manipulations pratiques, mais aussi de connaître d’autres étapes du contrôle qualité. Ce
stage restera alors comme un excellent aperçu de l'organisation et de la rigueur du travail dans un laboratoire.
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Analyse microbiologique de l’eau
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BIBLIOGRAPHIE
1) Sites internet
 Département des Administrations Sanitaires et Sociales de l'État
« L’eau potable en France » : http://ile-de-france.sante.gouv.fr/sante-publique/environnement-et-sante/eaupotable
«Aspect réglementaire » : http://www.sante-sports.gouv.fr/la-qualite-de-l-eau-potable-en-france-aspectssanitaires-et-reglementaires-septembre-2005.html#doc
 Divers milieux de cultures
http://www2.ac-lyon.fr/enseigne/biotech/microbio/milieux.html
 Journal officiel du 7 novembre 2003
http://www.car-analyse.com/hydro/a170903.htm
 Ministère de l’écologie
Directives : http://www.developpement-durable.gouv.fr/Directive-cadre-EAU.html
 Veolia Environnement, CAE
http://www.veolia.com/fr/solutions/cae/
 Wikipédia
http://fr.wikipedia.org/
2) Notices techniques

S. Moreau, F. Poty, Mode opératoire, « dénombrement des coliformes »,

Laruelle, S. Houdart, Mode opératoire, « dénombrement des entérocoques

Laruelle, S. Houdart, Mode opératoire, « dénombrement des spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices »

Laruelle, S. Houdart, Mode opératoire, « dénombrement des germes revivifiables »
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ANNEXE 1
Figure 1 : Matériels de filtration
Figure 2 : Laboratoire de bactériologie
Figure 3 : Salle des étuves
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Analyse microbiologique de l’eau
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Figure 4 : Flaconnage des échantillons
Figure 5 : Etiquetage des boites d’enterocoques
Figure 6 : Etiquetage des boites de coliformes à 44°C et à 36°C
Figure 7 : Résultats du test Colilert
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Figure 8 : Etiquetage des boites de germes totaux à 22°C et à 36°C
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ANNEXE 2
Figure 1 : Dénombrement des entérocoques après 48h d’incubation
Figure 2 : Repiquage positif d’entérocoque sur BEA
Figure 3 : Dénombrement des coliformes après 24h d’incubation
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Figure 4 : Repiquage positif de coliforme sur PCA
Figure 5 : Identification de E. coli grâce au bouillon tryptophane
Figure 6 : Dénombrement des germes totaux
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Figure 7 : Dénombrement des bactéries type Clostridium
Figure 8 : Décoloration de la gélose au sang par hémolyse
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ANNEXE 3 : COMPOSITION DES DIVERS MILIEUX DE CULTURE
1) Milieu Slanetz
Constituants
Peptones (20g)
Acide de sodium (0,40g)
Glucose (2,0g)
TTC (0,10g)
Hydrogénophosphate de sodium (4,0g)
Agar (10g)
Eau (qsp 1,0L)
Rôle
Source d’azote et d’énergie
Inhibiteur de la croissance des Gram –
Source de carbone et d’énergie
Indicateur de la croissance bactérienne
Source de minéraux
Agent gélifiant
Solvant
2) Milieu TTC (Chlorure de Triphényl Tétrazolium)
Constituants
Peptones (10g)
Extrait de viande (5,0 g)
Extrait de levure (6,0 g)
Lactose (20 g)
Tergitol (710 mg)
TTC (25 mg)
Bleu de Bromothymol (50 mg)
Agar (13 g)
Rôles
Source d'azote et d'énergie
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de carbone et d'énergie
Agent sélectif
Inhibiteur des Bactéries Gram +
Indicateur de pH
Agent gélifiant
3) Milieu PCA
Constituants
Peptones (5,0g)
Extrait de levures (2,5g)
Glucose (1,0g)
Agar (12g)
Eau (qsp 1,0L)
Rôles
Source d’azote et d’énergie
Source de vitamines et facteurs de croissance
Source de carbone et d’énergie
Agent gélifiant
Solvant
4) Milieu TSC (Tryptone, Sulfite, Cyclosérine)
Constituants
Tryptone (15g)
Extrait autolytique de levure (5g)
Peptone papaïnique de soja (5g)
Métabisulfite de sodium (1g)
Citrate de fer ammoniacal (1g)
Agar (15g)
Eau qsp (1L)
Rôle
Source d’azote et d’énergie
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source d’azote et d’énergie
Source de sulfites
Révélateur de la réduction des sulfites en sulfures
Agent gélifiant
phase liquide
20 | P a g e
Marie Méligne
Analyse microbiologique de l’eau
2010
ANNEXE 4 : COMPOSITION DES DIVERS MILIEUX DE
REPIQUAGE
1) Milieu BEA
Constituants
Peptones (20g)
Extrait de levures (5,0g)
Bile de bœuf (10g)
Acide de sodium (0,15g)
Esculine (1,0g)
Citrate de fer III (0,50g)
NaCl (5,0g)
Agar (13g)
Eau (qsp 1,0L)
Rôles
Source d’azote et d’énergie
Source de vitamines et facteurs de croissance
Inhibiteur de croissance des Gram+
Inhibiteur de croissance des GramSource de carbone et d’énergie
Révélateur de production d’esculétine
Source de minéraux/maintient de la pression osmotique
Agent gélifiant
Solvant
2) Milieu PCA
Constituants
Peptones (5,0g)
Extrait de levures (2,5g)
Glucose (1,0g)
Agar (12g)
Eau (qsp 1,0L)
Rôles
Source d’azote et d’energie
Source de vitamines et facteurs de croissance
Source de carbone et d’énergie
Agent gélifiant
Solvant
3) Milieu Gélose au sang
Constituants
Peptones (20g)
Amidon de maïs (1,0g)
Extrait de levure (3,0g)
NaCl (5,0g)
Sang de mouton défibriné (5%)
Agar (13,5g)
Eau (qsp 1,0L)
Rôles
Source d’azote et d’énergie
Source de carbone et d’énergie, détoxifiant
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de minéraux/maintient de la pession osmotique
Mise en évidence du pouvoir hémolytique
Agent gélifiant
Solvant
4) Milieu TTC (Chlorure de Triphényl Tétrazolium)
Constituants
Peptones (10g)
Extrait de viande (5,0 g)
Extrait de levure (6,0 g)
Lactose (20 g)
Tergitol (710 mg)
TTC (25 mg)
D-cyclosérine (0,40g)
Bleu de Bromothymol (50 mg)
Agar (13 g)
Rôles
Source d'azote et d'énergie
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de carbone et d'énergie
Agent sélectif
Inhibiteur des Bactéries Gram +
Antiobiotique : Agent sélectif
Indicateur de pH
Agent gélifiant
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Marie Méligne
Analyse microbiologique de l’eau
2010
ANNEXE 5 : SCHÉMA SIMPLIFIÉ DES RELATIONS ENTRE
DIFFÉRENTS ACTEURS DU DOMAINE DE L’EAU D’ALIMENTATION
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