V-1-2 - microcsb

-1-
INTRODUCTION
La résistance aux agents antimicrobiens, qui était reconnue depuis
plus de 50 ans, continue d’être une source majeure de mortalité, et de
l’augmentation du coût de soins de santé (1).
Au Maroc comme partout dans le monde, la maîtrise de la diffusion
des bactéries multi-résistantes (BMR) est une priorité dans la lutte contre
les infections nosocomiales. Parmi les pathogènes labellisés BMR, les
deux principaux sont représentés par Staphylococcus aureus résistants à la
méticilline (SARM), et par les entérobactéries productrices de bêtalactamases à spectre élargi (EBLSE). Ces dernières ont été décrites pour la
première fois en 1983 (27) et ont causées depuis de nombreuses épidémies
(26).
Les bêta-lactamases à spectre élargi (BLSE) confèrent aux
entérobactéries
des
résistances
aux
monobactames
et
oxyimino-
céphalosporines, mais pas aux céphamycines et carbapénèmes.
Les études génétiques ont montrés que les BLSE dérivaient par
mutation(s) ponctuelles(s) d’anciennes bêta-lactamases de type TEM-1,
TEM-2 et SHV-1 (40) appartenant à la classe A des bêta-lactamases selon
la classification d’AMBLER (31,33). La dénomination des bêta-lactamases
n’obéit à aucune règle précise de nomenclature. En effet, la première
enzyme
dénommée
TEM
a
été
isolée
d’un
malade
appelé
« TEMONIERA » (7). Alors que celle du type SHV correspond à une
propriété biochimique « sulphydryl variable » de cette bêta-lactamase.
Actuellement, environ plus de 150 types de BLSE ont été identifiées
partout dans le monde et chez de nombreuses espèces de la famille des
Enterobacteriaceae et Pseudomonas aeruginosa (17).
-2-
INTRODUCTION
Le but de cette étude est de :
Etudier l’épidémiologie des souches d’entérobactéries productrices
de BLSE .
Comparer les méthodes de mise en évidence des BLSE .
Formuler des recommandations pour la maîtrise de la diffusion de
ces BLSE.
-3-
-4-
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
L’étude de la résistance des bacilles à gram négatif par production de
BLSE aux bêta-lactamines nécessite de connaître les différents groupes de
cette famille d’antibiotiques et les mécanismes de résistance à cette famille
d’antibiotiques.
I-
CLASSIFICATION DES BETA-LACTAMINES :(16,42)
Au cours des années 1980, le nombre de bêta-lactamines naturelles ou
synthétiques a augmenté de façon spectaculaire.
Les composés qui appartiennent à cette famille se caractérisent
par
un squelette commun : le cycle bêta-lactamine ( voir Fig.1 ). C’est à partir
de cette structure de base et de sa structure adjointe que la classification
des bêta-lactamines a été établie.
-5-
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
S
R
CO NH
CH3
CH3
Pénicilline
N
O
COOH
Cycle bêta-lactame
S
R1
NH
N
Céphalosporine
O
CH2 R2
Figure 1 : Structure de base des pénicillines et des
céphalosporines (43)
-6-
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les pénicillines et les céphalosporines se distinguent par la structure
de leur second noyau et de leur (s) chaînes (s) latérale (s). Les bêtalactamines constituent la principale famille d’antibiotiques. Elles
comprennent :
I-1- PENAMES (PENICILLINES)
:
Depuis que Fleming a observé le pouvoir bactéricide du filtrat brut
d’une culture de Penicillium notatum, la molécule de pénicilline a été
purifiée et modifiée, et de nombreuses pénicillines naturelles et
synthétiques ont été isolées ou élaborées. L’utilisation d’une souche
mutante de penicillium chrysogenum dans des conditions particulières de
culture a permis d’améliorer considérablement le rendement de
fabrication et les caractéristiques des pénicillines. Les pénicillines semisynthétiques sont obtenues par synthèse à partir du noyau acide 6aminopenicillanique (A6-AP) (voir Fig.2) (41).
-7-
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 2 : Développement des pénicillines semi- synthétiques
(41)
-8-
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
I-2- DERIVES DE L’ACIDE PENICILLANIQUE
SULFONE :
Les dérivés de l’acide pénicillanique sulfone sont des inhibiteurs de
bêta-lactamases. Ils comprennent le sulbactam et le tazobactam. Ces
inhibiteurs sont commercialisés en association avec une bêta-lactamine à
large spectre pour augmenter le spectre d’action.
Exemple : pipéracilline-tazobactam
ampicilline-sulbactam
I-3- CARBAPENEMES
:
Les carbapénèmes sont représentés par l’imipénème, le méropénème
et le biapénème. Parmi ces antibiotiques, l’imipénème est actuellement le
seul produit d’usage clinique au Maroc. C’est un antibiotique à large
spectre, actif sur Pseudomonas aeruginosa et il présente une grande
stabilité vis-à-vis des BLSE. Il est commercialisé en association avec la
cilastine. Ce dernier composé empêche une inactivation prématurée de
l’imipénème par le rein.
I-4- CLAVAMES
:
Parmi les clavames, l’une des premières substances isolées est
l’acide clavulanique, produite par Streptomyces clavuligerus, dont la
structure de base est le noyau clavame. L’acide clavulanique est un
puissant inhibiteur de différents types de bêta-lactamases, mais il n’a
aucun pouvoir antibactérien. On l’utilise avec les pénicillines à large
-9-
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
spectre, telles l’amoxicilline et la ticarcilline, pour élargir leur spectre
d’action sur les micro-organismes producteurs de bêta-lactamases.
I-5- CEPHEMES (CEPHALOSPORINES)
:
La découverte de la céphalosporine C, produite par un
champignon ; Cephalosporium acremonium, a permis aux chimistes
d’élaborer des dérivés semi-synthétiques.
I-5-1- Céphalosporines de 1
Les
céphalosporines
de
1ère
ère
génération :
génération ont
des
activités
antibactériennes similaires et elles associent les caractéristiques des
pénicillines à large spectre (ampicilline) à celles des méticillines. Elles
sont résistantes à la pénicillinase du Staphylococcus et sensibles aux
céphalosporinases. On distingue : céfalotine, céfalexine, céfaloridine,
céfadroxil, céfazoline, céfaclor, céfacétrile, céfapirine, céfradine.
I-5-2- Céphalosporines de 2ème génération :
Les
céphalosporines
de
2ème
génération ont
une
activité
antibactérienne similaire à celle des composés de la 1ère génération, elles
se distinguent cependant par une activité légèrement moindre sur les
cocci à gram positif et par un spectre élargi à certains bacilles à gram
négatif. On distingue : céfamandole, céfuroxime et céfotiam.
- 10 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
I-5-3- Céphalosporines de 3ème génération :
Les Céphalosporines de 3ème génération ont une activité réduite sur
les cocci à gram positif, mais une activité supérieure sur les bacilles à
gram négatif. Elles sont résistantes aux céphalosporinases. Seule la
céftazidime exerce une activité sur Pseudomonas aeruginosa . On
distingue deux groupes :
C3G du groupe 1 = méthoxy-iminocéphalosporines :
céfotaxime,
céftrixone,
céfopérazone,
céftizoxime,
céfpirome et céfépime.
C3G du groupe 2 = céftazidime.
I-5-4- Céphamycines :
Les Céphamycines sont de nouvelles céphalosporines , élaborées
par semi-synthèse à partir d’une molécule de céphamycine isolée des
produits de fermentation d’une bactérie filamenteuse du genre
streptomyces. Dans cette catégorie on distingue deux antibiotiques qui
sont la céfoxitine et le céfotétan.
I-5-5- Oxacéphèmes :
Les chimistes ont substitués un atome d’oxygène à l’atome de soufre
du cycle dihydrothiazine du noyau céphème pour produire des
céphalosporines avec un spectre d’activité élargie. On les a nommés
oxacéphèmes ou oxacéphalosporines. Le moxalactame
( aussi appelé
lamoxactam ) est le seul composé de ce groupe, il a été retiré du marché
- 11 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
en raison de son effet sur l’hémostase et des risques d’hémorragie qu’il
provoque.
I-6- MONOBACTAMES
:
Le monobactam le plus connu est l’aztréonam produit par
Chromobactérium violaceum . c’est un antibiotique à spectre très étroit.
Il a une bonne stabilité vis-à-vis des bêta-lactamases et n’agit que sur les
bactéries à gram négatif.
- 12 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau I : Nomenclature des bêta-lactamines en fonction
de la structure de leur noyau (43)
- 13 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
II- RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES AUX BETALACTAMINES:
II-1- DEFINITION DE LA RESISTANCE :
Une
souche
est
dite
« résistante»
lorsque
la
concentration
d’antibiotique qu’elle est capable de supporter est notablement plus élevée
que la concentration atteignable in vivo (16).
II-2- MECANISMES DE RESISTANCE AUX BETALACTAMINES :
Les principaux mécanismes de résistances des germes aux
antibiotiques sont de trois ordres (45) :
L’antibiotique ne peut pas atteindre sa cible, soit par imperméabilité
de la paroi (exemple : résistance à l’impénème
d’expression de la porine), soit par un
par défaut
mécanisme d’efflux
( pompage actif de l’antibiotique hors de la cellule bactérienne ).
L’antibiotique ne peut se fixer sur sa cible il peut y avoir une cible
supplémentaire ou une baisse de l’affinité par modification de la
cible.
L’antibiotique peut être inactivé avant d’atteindre sa cible : il s’agit
alors le plus souvent d’un mécanisme enzymatique avec notamment
les bêta-lactamases , et il s’agit dans ce cas d’un mécanisme de
résistance majoritaire universellement répandu à travers de très
nombreux genres bactériens.
- 14 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau II : Mécanismes de résistance acquise des bactéries aux βlactamines (15)
Mécanismes
Bactéries à gram Positif
Bactéries à gram négatif
Production d’une β-lactamase
+
+++
Imperméabilité de la paroi
-
++
Modification des PLP
+++
+
La résistance par production de bêta-lactamases peut être naturelle ou
acquise.
II-2-1- La résistance naturelle (45) :
La résistance naturelle est un caractère propre à une espèce bactérienne
au même titre que tout caractère cultural ou biochimique elle concerne
(presque) 100% des souches de l’espèce concernée et préexiste à
l’introduction de tout antibiotique .
La résistance naturelle est chromosomique, portée par des gènes
d’expression constitutive (la résistance des K. pneumoniae à l’ampicilline)
ou inductible (Enterobacter cloacae et C3G ).
II-2-2- la résistance acquise (45) :
La résistance acquise ne concerne qu’ une fraction des souches elle
nécessite un événement génétique ( mutation ou acquisition de plasmides ) ,
et son niveau augmente à partir de l’utilisation de l’antibiotique. Ainsi
- 15 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
l’antibiotique ne crée pas la résistance à l’échelle de la population
bactérienne, il ne fait que sélectionner un mécanisme de résistance.
II-2-2-1- La résistance chromosomique :
Il s’agit d’une mutation du chromosome bactérien sur un locus
contrôlant la sensibilité à un antibiotique, c’est un événement spontané c'està-dire non provoqué directement par la présence de l’antibiotique, spécifique,
et indépendant n’entraînant que la résistance à un antibiotique ou à une
famille d’antibiotiques.
II-2-2-2- La résistance extra-chromosomique (plasmidique) :
Elle est liée à l’introduction dans la bactérie d’un élément génétique non
chromosomique formée de fragments d’ADN intra-cytoplasmique et appelé
« plasmide de résistance » ou « plasmide R ».
Les « plasmides R » peuvent être transmis par divers mécanismes :
Par transduction : l’ADN du plasmide est inclus dans un
bactériophage et ensuite transmis par celui-ci après lyse bactérienne
à une autre bactérie.
Par transformation : l’ADN libre passe d’une cellule à l’autre et va
altérer le génotype de la cellule réceptrice.
Par conjugaison : elle s’effectue par passage des plasmides à
travers des tubules protéiques provenant de l’extension des pili
d’une bactérie vers l’autre (pili sexuel).
- 16 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Par translocation : il se produit un échange de courtes séquences
d’ADN (transposons) entre deux plasmides, ou entre un plasmide et
une portion d’un chromosome bactérien situé à l’intérieur d’une
cellule bactérienne. Un transposon peut transmettre une résistance
unique ou multiple.
III- CLASSIFICATION DES BETA-LACTAMASES :
Plusieurs classifications des bêta-lactamases ont été proposées.
- 17 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau III : Classification des β-lactamases (15)
BACTERIES A GRAM POSITIF
PLASMIDIQUES
BACTERIES A GRAM NEGATIF
CHROMOSOMIQUES
PLASMIDIQUES
Inductibles
Pénicillinases
( spécifiques)
S. aureus
S. epidermidis
LARGE SPECTRE
LARGE SPECTRE
«Pénicillinases»
«Pénicillinases»
TEM-1 ➔ TEM-22
K. pneumoniae
TEM-1, TEM-2,
SHV-2 ➔ SHV-5
( SHV-1)
OXA-1,2,3,4
K. oxytoca
Levinea
SHV-1
chez toutes les espèces
CEPHALOSPORINASES
CONSTITUTIVES
E. coli
très bas niveau
( Cefuroximases)
chez toutes les Entérobactéries
essentiellement K. pneumoniae
+YOU-1 ET 2, MGH-1, MRH-1
PSE-1, 2, 3, 4
INDUCTIBLES
E. cloacae, E. aerogenes
DEREPRIMEES
à très haut niveau
C. freundii
Citrobacter
Serratia
Enterobacter
M. morganii
Bacteroïdes
SPECTRE ELARGIE
Providencia, P. aeruginosa
P. vulgaris
Céphamycinaese*
( Klebsiella + E. coli)
CMY-1 et 2, MIR-1 ( E. coli)
Providencia
P. aeruginosa
Serratia
*non dérivés de TEM
(E.coli)
- 18 -
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
III-1- CLASSIFICATION DES BETA- LACTAMASES
SELON RICHMOND-SYKES : (31)
Selon Richmond-sykes, il existe cinq types :
Type I : enzymes principalement actives sur les céphalosporines,
inhibées par les isoxazoyl-pénicillines et partiellement par la carbénicilline
mais non inhibées par l’acide clavulanique et le sulbactam. Ces enzymes sont
d’origine chromosomique.
Type II : enzymes actives sur les pénicillines, inhibées par isoxazoylpénicillines et l’acide clavulanique, mais pas par la carbénicilline . Ces
enzymes sont d’origine chromosomique.
Type III : enzymes actives sur les pénicillines et les céphalosporines
de 1ère génération, inhibées par les isoxazoyl-pénicillines, l’acide clavulanique
et le sulbactam ; elles présentent une faible activité sur la carbénicilline. Ces
enzymes sont d’origine plasmidique.
Type IV : enzymes actives sur les pénicillines et les céphalosporines,
résistantes à l’inhibition par les isoxazoyl-pénicillines et la carbénicilline,
inhibées par l’acide clavulanique et le sulbactam . Ces enzymes sont d’origine
chromosomique.
Type V : enzymes actives sur les pénicillines et les céphalosporines,
hydrolysent mieux les isoxazoyl-pénicillines que les céphalosporines et
inhibées par l’acide clavulanique. Ces enzymes sont d’origine plasmidique.
- 19 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau IV : Classification de RICHMOND ET SYKES des βlactamases des bactéries à gram négatif (15)
Médiation Type Classe Inductibilité
Activité
préférentielle
Péni
CSP
Inhibée par
Cloxa
PCMB
Principaux germes
Enterobacter Citrobacter
Chr
Case
Ia
I
-
+++
S
R
Chr
Case
Ib
C
-
+
S
R
E. coli
Chr
Case
Ic
I
-
++
S
R
Proteus vulgaris
Chr
Case
Id
I
-
+
S
R
P. aeruginosa
Chr
Pase
II
C
++
-
S
R
Proteus mirabilis
Pl
Case
III
C
+++
+
S
R
Médiation
plasmidique type
TEM
Chr
Case
IV
C
+
+
R
S
Klebsiella species
Pl
Pase
V
C
++
-
R
S
Médiation
plasmidique type
OXA, PSE
- 20 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
III-2- CLASSIFICATION DES BETA- LACTAMASES
SELON BUSH ET AL.: (8)
Bush a classé les bêta-lactamines en trois groupes:
Groupe1: sont des céphalosporinases à sérine, non inhibées par l’acide
clavulanique. Ces enzymes sont de classe C. Elles inactivent essentiellement
les céphalosporines I et II (l’activité des céphalosporines III et IV est variable
selon le niveau d’expression). Les carbapénèmes restent actifs.
Groupe 2 : sont des bêta-lactamases à sérine, la plupart sont inhibées par
l’acide clavulanique. Ces enzymes sont de classe A et D. Elles inactivent
essentiellement les pénicillines et les céphalosporines ( en fonction du sousgroupe ). Les céphalosporines III et IV, les monobactames et les
carbapénèmes restent actifs.
Groupe 3 : sont des métallo-bêta-lactamases, inhibées par l’EDTA . Ces
enzymes sont de classe B. Elles inactivent des agents stables comme les
carbapénèmes.
III-3- CLASSIFICATION DES BETA- LACTAMASES
SELON AMBLER ET AL. : (31,33)
Ambler a classé les enzymes en trois classes A, B et C selon leur
séquence en acide aminés :
- 21 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les enzymes de classe A : ont une grande importance clinique. Ces
enzymes sont toutes sensibles aux inhibiteurs de bêta-lactamases. Les bêtalactamases de type TEM et SHV appartiennent a cette classe.
Les enzymes de classe B : sont des métallo-enzymes, heureusement peu
fréquentes car elles hydrolysent des agents stables aux bêta-lactamases
comme l’imipénème.
Les enzymes de classe C : sont des bêta-lactamases codées par un gène
chromosomique et dont l’expression peut être inductible ou constitutive , de
bas ou de haut niveau (31). Ces bêta-lactamases sont produites naturellement
chez
Enterobacter
spp,
Serratia
marcescens,
Citrobacter
freundii,
Morganella morganii et Pseudomonas aeruginosa (25,32). Récemment, elles
ont été identifiées comme bêta-lactamases plasmidiques chez Escherichia coli
(6,12,19), Klebsiella pneumoniae (12,19), Proteus mirabilis et Salmonella spp.
(14, 28). La présence de cette bêta-lactamase (AmpC) au niveau de plasmide
favorise la diffusion de la multirésistance entre les micro-organismes (20).
IV-
BETA-LACTAMASES A SPECTRE ELARGI :
IV-1- DEFINITION-HISTORIQUE
:
Les BLSE sont des enzymes à sérine qui agissent par un mécanisme
fondé sur l’attaque du groupement hydroxyle porté par une sérine au fond du
site catalytique. Ces enzymes confèrent des résistances à la plupart des bêtalactamines chez les bactéries à gram (-) (45).
La majorité des BLSE dérive des enzymes TEM ou SHV. Et il existe
maintenant plus de 90 bêta-lactamases de type TEM et plus de 25 bêtalactamases de type SHV. TEM et SHV sont le plus souvent retrouvés chez
- 22 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Esherichia coli et Klebsiella pneumoniae , d’ailleurs la 1ère bêta-lactamase
(TEM-1) a été décrite chez E. Coli à partir d’une hémoculture d’un patient
qui s’appelait TEMONIERA en Grèce, d’où la désignation TEM, mais ceci
n’exclut pas le fait qu’on les retrouve aussi chez Proteus, Providencia et
d’autres genres de la famille des Enterobactériaceae (7).
Si les plus classiques des BLSE appartiennent aux familles TEM et
SHV il en existe aujourd’hui de nouvelles très différentes sur le plan
génétique notamment les CTX-M (45).
D’une manière générale les BLSE dérivant des enzymes TEM-1 TEM-2
et SHV-1 sont inhibés par l’acide clavulanique (à l’exception des souches IRT
inhibitor–résistant Tem) et sont incapables d’hydrolyser les céphamycines
(céfoxitine,céfotétan) et les carbapénèmes (Imipénème). En revanche elles
inactivent les oxyimino-bêta-lactamines et les céphalosporines de 4ème
génération (céfépime, céfpirome). Les souches productrices de ces BLSE sont
habituellement
co-résistantes
aux
aminosides,
tétracyclines,
et
fluoroquinolones (45).
IV-2- FACTEURS LIES A L’EMERGENCE D’ENTEROBACTERIES
PRODUCTRICES DE BLSE :
Le premier facteur qu’on peut souligner concerne l’utilisation accrue
des antibiotiques à large spectre, notamment les céphalosporines de 3ème
génération. De nombreuses études ont été effectuées ces dernières années à ce
propos, et ont montré le rôle prépondérant des antibiotiques lors de
l’émergence des entérobactéries productrices BLSE (3,7,36).
- 23 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
En effet les antibiotiques agissent à plusieurs niveaux ; ils peuvent par
exemple transformer la flore habituelle des patients, favoriser la colonisation
par des bactéries résistantes ou encore sélectionner des souches résistantes et
faciliter leur dissémination, en d’autres termes les antibiotiques exercent une
pression de sélection non négligeable (44), cette pression de sélection est
d’autant plus marquée que la durée d’antibiothérapie est longue ; ainsi une
comparaison entre un groupe de patients porteurs de souches résistantes et un
groupe de patients porteurs de souches sensibles a mis en évidence une
exposition à une antibiothérapie de plus longue durée dans le 1er groupe, de
plus une relation linéaire entre le nombre de jours de traitement avec le
céfotaxime et la probabilité de développer une résistance a été démontré, en
revanche avec la céftazidime ce risque était d’emblée maximum dès le 1er
jour du traitement (3).
Le 2ème
facteur de risque rassemble d’une part le problème des
réservoirs et d’autre part le problème de la transmission.
En matière de
BLSE le patient lui-même représente un réservoir très
important . Le site du portage préférentiel est constitué par le tube digestif qui
a été reconnu comme source majeure de germes producteurs de BLSE chez
les patients colonisés (17), le second réservoir est constitué par le matériel
médical utilisé au sein des hôpitaux, à savoir les sondes urinaires, cathéter, ou
autres dispositifs invasifs (1), et par le personnel soignant (17). Ces deux
réservoirs ont été mentionné aussi comme des facteurs déterminants de la
transmission des BLSE entre malades notamment par manuportage (cas du
personnel) (17).
- 24 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Il faut aussi noter le rôle joué par les réadmissions des patients, leur
transfert entre hôpitaux, et leur circulation entre les services dans la
dissémination des entérobactéries productrices de BLSE.
V- ENTEROBACTERIES :
V-1- DEFINITION : (43)
Dans La famille des Enterobacteriaceae sont regroupés les bacilles à
gram (-) qui sont soit mobiles avec une ciliature péritriche, soit immobiles,
non sporulés ; aérobies et anaérobies facultatifs ; qui cultivent sur des milieux
ordinaires à base d’extrait de viande ; qui fermentent le glucose avec ou sans
production de gaz ; qui possèdent une nitrate-réductase ( réduction
des
nitrates en nitrites) à l’exception de certaines souches d’ Erwinia et quelques
rares mutants ; leurs cultures donnent toujours une réaction négative des
oxydases. Enfin les entérobactéries possèdent une catalase à l’exception des
Shigella dysenteriae du sérotype l.
V-1-1- Habitat :
Le nom d’entérobactéries avait été donné à cette famille parce que
beaucoup des membres qui la composent sont des hôtes du tube digestif. Mais
cette localisation n’est pas exclusive chez l’homme et les animaux, on les
isole du sol et des végétaux qui sont même le gîte habituel de certaines
espèces, tels les Enterobacter agglomerans et les Erwinia.
V-1-2- Morphologie :
Ce sont des bacilles à gram négatif asporulés. Certains genres sont
composés de bactéries toujours immobiles ( Klebsiella, Shigella ), d’autres
- 25 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
sont mobiles par ciliature péritriche. La présence d’une capsule visible au
microscope est habituelle chez les Klebsiella.
V-1-3- Culture :
Les entérobactéries aérobies-anaérobies facultatives se développent
facilement sur milieux nutritifs simples.
Sur milieux gélosés, les colonies d’entérobactéries sont habituellement
lisses, brillantes, de structure homogène (type « smooth » ou S ). Cet aspect
peut évoluer après cultures successives pour donner des colonies à surface
sèche rugueuse ( type « rough » ou R ).
Les colonies des bactéries capsulées telles que les Klebsiella sont
mucoîdes, plus grandes que les colonies S avec une tendance à la confluence.
V-1-4- Structure antigénique :
Chez les entérobactéries on peut distinguer :
Des antigènes de paroi ou antigènes O toujours présents .
Des antigènes flagellaires ou antigènes H.
Des antigènes de surface (capsule ou enveloppe)
V-1-5- Pouvoir pathogène:
Sur le plan de la pathologie humaine, il convient de distinguer :
- 26 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les bactéries pathogènes spécifiques (BPS) que l’on ne
trouve
pas à l’état commensal (en dehors des porteurs sains) et dont la
présence en milieu extérieur n’est qu’un phénomène de transit. Les
maladies qu’elles engendrent sont dues à un défaut d’hygiène et la
contamination se produit soit par contact direct, soit par
l’intermédiaire d’un vecteur (alimentaire ou animal). Citons les
Salmonella, les Shigella et les Yersinia.
Les bactéries pathogènes opportunistes (BPO), elles peuvent
provenir de la flore digestive commensale normalement résidente.
Les infections ont donc un point de départ endogène. Toutefois,
elles se trouvent par excrétion dans la nature à l’état transitoire et si
elles n’engendrent généralement pas d’infections, elles sont
cependant le signe d’une contamination fécale voire de défaut
d’hygiène.
V-2- INFECTIONS ASSOCIEES
:
Les entérobactéries représentent plus de 80% des bacilles à gram négatif
isolés aux laboratoires de microbiologie (24).
V-2-1 Escherchia coli :
E. coli est un germe très courant, trouvé en abondance dans la flore
commensale , en particulier dans le tube digestif.
E. coli cause principalement des infections du tube digestif (gastroentérites), et on distingue 5 pathovars :
- 27 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
E . coli entéropathogène (diarrhées infantiles)
E. coli entérotoxinogène (tourista)
E. coli entéroinvasif (invasion des cellules intestinales)
E.coli entérohémorragique (diarrhées sanglantes)
E.coli entéroadhérant (diarrhées du voyageur).
C’est également le germe préférentiel des infections urinaires (impliqué
dans 80% des infections du tractus urinaire).
E. coli peut aussi coloniser le vagin et générer des méningites néonatales
suite au passage du nouveau-né à travers la voie génital maternelle colonisée.
V-2-2- Klebsiella pneumoniae :
K. pneumoniae est un germe commensal du tube digestif et des voies
aériennes supérieures. C’est aussi un germe opportuniste impliqué dans des
infections nosocomiales, des infections urinaires, des pneumopathies et des
septicémies.
V-2-3- Serratia marcescens :
Longtemps considérée comme un saprophyte, S. marcescens se
comporte
de plus en plus souvent comme un pathogène opportuniste
responsable à l’hôpital, d’infections nosocomiales, urinaires, pulmonaires,
cutanées ou bactériémiques.
- 28 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
V-2-4- Salmonella :
Les samonelles sont des bactéries pathogènes à transmission oro-fécale
elles constituent un vaste groupe de bactéries composé de plus de 2000
sérovars, leur pouvoir pathogène est différent pour les salmonelles majeures
( que l’on ne trouve que chez l’homme) et les salmonelles mineures
( ubiquistes).
Les salmonelles majeures : S. typhi, S. partyphi, sont respectivement
responsables des fièvres typhoïdes et paratyphoïdes.
Les salmonelles mineures : responsables de gastro-entérites (bactéries
entéro-pathogènes invasives). Elles sont impliquées dans 30 à 60 % des
infections alimentaires.
V-2-5- Shigella :
Les shigelles sont des bactéries strictement humaines. Elles sont
responsables de l’historique « dysenterie bacillaire » ( shigella dysenteriae).
Actuellement, elles sont la cause, chez l’adulte, de colites infectieuses et
chez l’enfant, de gastro-entérites sévères avec diarrhée mucopurulente et
sanglante, fièvre et déshydratation.
V-2-6- Enterobacter :
Les souches du genres Enterobacter sont souvent responsables
d’infections nosocomiales . E. cloacae et E. aerogenes peuvent être à
l’origine d’infections urinaires.
- 29 -
ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE
V-2-7- Proteus mirabilis :
C’est un germe commensal du tube digestif de l’homme et des animaux.
En bactériologie médicale, les Proteus sont isolés de différents types
d’infections, notamment au cours d’infections urinaires, respiratoires hautes
ou de bactériémies.
- 30 -
- 31 -
MATERIEL ET METHODES
I- MATERIEL:
I-1- SOUCHES BACTERIENNES
:
Les souches d’entérobactéries productrices de BLSE de notre étude, ont
été isolées de divers prélèvements qui ont été analysés dans le laboratoire de
microbiologie du CHU Ibn Rochd de Casablanca tels que les urines, pus,
hémocultures, sondes urinaires, sécrétions bronchiques…etc.
Ces prélèvements provenaient de malades hospitalisés et aussi de patients
externes.
I-2- PERIODE D’ETUDE
:
Au cours de notre stage au laboratoire de microbiologie du CHU Ibn
Rochd, nous nous sommes intéressés aux souches d’entérobactéries
productrices de BLSE et leurs méthodes de détections.
Cette étude c’est étalée du 1er janvier 2005 au 31 mars 2005.
- 32 -
MATERIEL ET METHODES
I-3- MATERIEL D’ETUDE
:
I-3-1- les milieux utilisés :
milieu Muller-Hinton 2 (MH2, Riomérieux) :
C’est un milieu prêt à emploi commercialisé par Biomérieux, France.
Généralement utilisé pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques et
sulfamides. ( composition : voir annexe).
milieu Mac conkey :
Milieu sélectif pour les bacilles à gram négatif (BGN) par sa teneur en
cristal violet. Il est préparé au laboratoire à partir d’un milieu déshydraté.
milieu Mac conkey + céfotaxime : (voir annexe)
milieu Muller Hinton + cloxacilline : ( voir annexe)
milieu Kligler Hajna :
C’est un milieu également préparé au laboratoire,
milieu complexe
coloré en rouge par le rouge de phénol, et qui permet d’apprécier 3 caractères
métaboliques :
Fermentation du lactose.
Fermentation du glucose et production de gaz.
La production de H2S.
- 33 -
MATERIEL ET METHODES
I-3-2- Les disques d’antibiotique utilisés :
Les disques d’antibiotique sont commercialisés par « oxoid England ».
(les différents disques d’antibiotique avec leur charge figurent en annexe).
I-3-3- Matériel d’identification :
Galerie Api 20E , Biomérieux :
C’est un système d’identification des entérobactéries utilisant 23 tests
biochimiques.
Catalase IDR, Biomérieux .
Oxydase sur disque, Biomérieux.
I-3-4- Exploitation des résultats :
Les résultats ont été saisis sur ordinateur, et l’analyse a été réalisée grâce
à l’utilisation du logiciels : WHONET 5.3 (logiciel de l’OMS).
- 34 -
MATERIEL ET METHODES
II-
METHODES :
II-1- ISOLEMENT DES ENTEROBACTERIES
:
L’isolement a été réalisé par mise en culture des prélèvements sur milieu
gélosé de Mac Conkey, qui par sa teneur en cristal violet laisse pousser les
bacilles à gram négatif, et inhibe les autres bactéries.
II-2- IDENTIFICATION DES ENTEROBACTERIES
:
L’identification est faite sur la base des caractères biochimiques à l’aide
des galeries Api 20 E (Biomérieux). Les micro-tubes sont inoculés avec une
suspension bactérienne ajustée à 0.5 Mac Farland.
Les réactions produites pendant l’incubation (24 h et à 37°C) se
traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’additions des
réactifs ; FeCl3 , réactif de Kovacs.
La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau de lecture, le code
obtenu permet d’avoir une identification en se référant au catalogue
analytique proposé par Biomérieux.
II-3- ANTIBIOGRAMME ET DETECTION DUCARACTERE BLSE
:
Pour chaque souche, un antibiogramme, par la méthode de diffusion en
milieu gélosé (gélose Muller- Hinton2 ) a été réalisé par ensemencement de la
surfaces de la gélose par un écouvillon imbibé d’un inoculum de 0.5 Mac
Farland.
Les antibiotiques utilisés : (voir annexe) .
- 35 -
MATERIEL ET METHODES
L’interprétation des souches (sensibles, intermédiaires ou résistantes) se
fait selon les diamètres critiques recommandés par NCCLS.
Mais avant d’interpréter les résultats, il faut s’assurer que le contrôle de
qualité est correcte. Un contrôle
de qualité a été effectué une fois par
semaine, et il consiste à vérifier que les diamètres obtenus avec les souches de
contrôle figurent à l’intérieur des limites acceptables.
Les souches de contrôle utilisé étaient :
Escherchia coli ATCC 25922.
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
La recherche du phénotype BLSE est réalisée sur l’antibiogramme selon
la technique de synergie décrite par Jarlier et al (7), en plaçant les disques de
CTX (30 µg) et de CAZ (30 µg) à une distance de 20-30 mm ( de centre à
centre) d’un disque d’amoxicilline / acide clavulanique ( 20/10 µg). Ceci
permet de mettre en évidence (après incubation de 24 h à 37°C) une
augmentation très nette du diamètre d’inhibition des disques contenant les
C3 G
en regard du disque contenant l’acide clavulanique / amoxicilline,
prenant ainsi la forme d’un « bouchon de champagne » pour les souches
productrices de BLSE (voir Fig.3).
- 36 -
MATERIEL ET METHODES
II-4- METHODE DES DISQUES COMBINES
:
Cette méthode consiste à placer sur une gélose Mueller-Hinton2
préalablement inoculée avec une suspension bactérienne ajustée à 0.5 Mac
Farland, 2 couples d’antibiotiques ; un disque de CTX en regard d’un disque
de CTX / acide clavulanique à une distance de 25 mm (centre à centre), et un
disque de CAZ en regard d’un disque de CAZ / Acide claulanique (même
distance).
Une augmentation ≥ à 5 mm du diamètre d’inhibition des disques
contenant l’acide clavulanique par rapport à ceux qui n’en contiennent pas, est
en faveur de la présence d’une BLSE (voir Fig.4).
II-5- METHODE A LA CLOXACILLINE
:
La détection de la production d’une BLSE est parfois difficile compte
tenu d’une éventuelle production d’une céphalospoinase à haut niveau, C’est
pourquoi on utilise la méthode à la cloxacilline.
La cloxacilline utilisée ici comme inhibiteur de céphalosporinases, est
incorporée dans la gélose MH2 . Les disques de CAZ et de CTX sont placés à
une distance de 20 mm (de centre à centre) d’un disque contenant la
ticarcilline / acide clavulanique.
Les souches productrices de BLSE présentent une synergie entre les
disques de CTX et /ou CAZ et le disque ticarcilline / acide clavulanique
(voir Fig.5).
- 37 -
MATERIEL ET METHODES
II-6- CAS PARTICULIERS DES PORTAGES
DIGESTIFS :
La recherche des entérobactéries productrices de BLSE dans les selles
des malades hospitalisés a été réalisée par écouvillonnages rectaux mis en
culture sur un milieu sélectif : gélose Mac conkey contenant 1000 Gamma de
CTX. Les germes ayant poussés sur ce milieu
sont considérés comme
potentiellement producteurs de BLSE. La confirmation est faite par le test de
synergie, méthode des disques combinés et la méthode à la cloxacilline.
- 38 -
MATERIEL ET METHODES
Figure 3 : Test de synergie positif (aspect en bouchon de champagne)
Figure 4 : Méthode des disques combinés (test positif)
- 39 -
MATERIEL ET METHODES
Figure 5 :Méthode à la cloxacilline (image de synergie positive)
- 40 -
- 41 -
RESULTATS
Au cours de la période d’étude, 104 souches d’entérobactéries
productrices de BLSE ont été isolées (chez 104 patients) ; les doublons ont été
éliminés lorsqu’il a été isolé, la même espèce BLSE, plus d’une fois chez le
même patient.
92 souches (88.46 %) proviennent de prélèvements cliniques à visées
diagnostic, alors que 12 souches (11.54 % ) ont été isolées chez les patients
pour lesquels une colonisation digestive a été suspectée (portage digestif).
I- REPARTITION DES BLSE DE PORTAGE :
Ce portage digestif de souches d’entérobactéries BLSE a touché
essentiellement 4 services hospitaliers, 2 en particulier : pédiatrie et médecine
(voir Fig.6). La répartition de ces souches montre que ce portage a été
enregistré au cours des mois de janvier et février, mais pas au cours du mois
de mars (voir tableau V).
- 42 -
RESULTATS
Tableau V : Répartition des BLSE de portage digestif :
service
Nombre de
%
Janvier
Février
Mars
souches
Pédiatrie1
6
50
5
1
-
Médecine1
3
25
1
2
-
Chirurgie 2
2
17
-
2
-
Réanimation 6
1
8
-
1
-
Total
12
100
6
6
0
50
45
40
35
30
%
25
20
15
10
5
0
Service
Pédiatrie 1
Médecine 1
Chirurgie 2
Réanimation 6
Figure 6 : Répartition des BLSE de portage digestif selon les services
- 43 -
RESULTATS
II- REPARTITION DES AUTRES BLSE :
II-1- REPARTITION DES GERMES
:
La répartition des micro-organismes est présentée sur la figure 7. On y
note une prédominance des Klebsiella
pneumoniae (28.26 %) et des
Escherichia coli (27.17 %). On trouve néanmoins d’autres espèces
différentes à savoir : Enterobacter cloacae (15.21%), Proteus. miralibis
(6.52%), Citrobacer freundii (5.43%), Providencia stuartii (4.34 %),
Klebsiella oxytoca (3.20%), Serratia marcescens (2.17%), Citrobacter
Koseri (2.16%), Enterobacter spp. (1.08 %), M. morganii (1.08%), Pantoea
agglomerans ( 1.08%), S. liquefaciens ( 1.08), S. odorifera (1.08%).
K. pneumoniae (28,26%)
E. coli (27,17%)
E. cloacae (15,21%)
P. mirabilis (6,52%)
C. freundii (5,43%)
P. stuartii (4,34%)
K. oxytoca (3,20%)
Autres (9,73%)
Figure 7 : Répartition des bactéries selon les espèces.
- 44 -
RESULTATS
II-2- REPARTITION DES BLSE PAR SPECIALITES
:
Parmi nos souches, 43 ont été isolées à partir de prélèvements
provenant des services de soins intensifs, qui représentent environ 47 %,
suivis des services de chirurgie avec un pourcentage de 18 % et de pédiatrie
(16 %). (voir tableau VI et Fig.8)
Tableau VI : Répartition des BLSE par spécialités
Nombre souches
%
janvier
Février
mars
Réanimation
43
46.74
20
10
13
Chirurgie
17
18.48
3
8
6
Pédiatrie
15
16.30
5
8
2
Externe
10
10.87
5
4
1
Médecine
7
7.61
5
-
2
Total
92
100
38
30
24
Ce tableau montre aussi que 38 sur 92 souches (41.30%) ont été isolées
pendant le mois de janvier, 30 sur 92 (32.60% ) pendant le mois de février, et
24 sur 92 souches (26.08 %) pendant le mois de mars.
- 45 -
RESULTATS
50
45
40
35
30
%
25
20
15
10
5
0
S p é c ia lité s
R é a n im a t io n
C h ir u r g ie
P é d ia t r ie
E xterne
M é d e c in e
Figure 8 : Répartition des BLSE par spécialités
II-3- REPARTITION DES BLSE DANS LES ERVICES
DE REANIMATION :
Etant donné que presque la moitié des isolats des souches BLSE
provenait des services de réanimation (46.74%), nous nous sommes intéressés
à la répartition des isolats dans ces services. Et nous avons remarqué que
deux réanimations (réanimation1 et réanimation2) se partageaient plus de 50
% des isolats ; 30.23% pour la réanimation1 et 20.93% pour la réanimation 2.
(Voir tableau VII et Fig.9).
- 46 -
RESULTATS
Tableau VII: Répartition des BLSE dans les services de réanimation
Nombre de
%
janvier
février
mars
souches
Réanimation 1
13
30.23
9
2
2
Réanimation 2
9
20.93
6
1
2
Réanimation 3
7
16.28
1
2
4
Réanimation 4
6
13.95
3
2
1
Réanimation 5
5
11.62
1
1
3
Réanimation 6
3
6.97
-
2
1
35
30
25
20
%
15
10
5
0
Services
Réa 1
Réa 2
Réa 3
Réa 4
Réa 5
Réa 5
Figure 9 :Répartition des BLSE dans les services de réanimation
- 47 -
RESULTATS
II-4- REPARTITION DES BLSE EN FONCTION DE LA NATURE
DES PRELEVEMENTS :
La répartition des prélèvements, présentée par le tableau VIII (Fig.10),
montre une prédominance des atteintes de l’appareil urinaire (46.73%),
suivies de celles de la peau ( 21.73%) et du sang (13.04%).
Tableau VIII : répartition des souches BLSE par prélèvements et par
Spécialités
Prélèvements
Nombre de souches
%
spécialité
Réa.
Méd.
Ext.
Péd.
Chir.
Urines
43
46.73
10
3
10
10
10
Pus
Sang
Bronchique
Cathéter
Liquide pleural
trachéal
20
12
7
7
2
1
21.73
13.04
7.60
7.60
2.17
1.08
10
8
7
6
2
-
3
1
-
-
1
3
1
6
1
-
- 48 -
RESULTATS
50
45
40
35
30
%
25
20
15
10
5
0
Prélèvements
Urines
Pus
Sang
Bronchique
Cathéter
Liquide pleural
Trachéal
Figure 10 : Répartition des souches BLSE selon les prélèvements
- 49 -
RESULTATS
III- GERMES MULTIRESISTANTS :
Le caractère commun entre ces différentes souches est leur résistance
à toutes les bêta-lactamines testées sauf à l’imépénème.
Les différences résident dans leur comportement vis-à-vis des
aminosides et fluoroquinolones. (Tableau IX, Fig.11)
Tableau IX : Pourcentages de résistance de souches BLSE aux
différents antibiotiques testés
Antibiotiques
% de résistance
Amikacine
21.7
Gentamycine
89.8
Netilmicine
77.8
Tobramycine
96.6
Ciprofloxacine
59
Norfloxacine
50
Pipercilline/ tazobactam
70.2
Trimethoprime/ sulfamethoxazole
74.1
- 50 -
RESULTATS
100
90
80
70
60
%
50
40
30
20
10
0
Antibiotiques
TOB
CN
NET
TSU
TZP
CIP
NOR
AK
Figure 11 : Pourcentage de résistance de souches BLSE aux différents
antibiotiques testés
Les pourcentages de résistance vis-à-vis des aminosides s’étendent
de 21.7 % pour l’Amikacine à 96.6% pour la Tobramycine.
Concernant les fluoroquinolones, les valeurs de résistance avoisinent
les 50%, ainsi 50% des souches ont montrées une résistance vis-à-vis de la
norfloxacine, et 59% vis-à-vis de la ciprofloxacine.
- 51 -
RESULTATS
III- METHODES DE MISE EN EVIDENCE DES BLSE :
Sur les 104 souches isolées, détectées comme BLSE (+), 82 (78.8%) ont
pu l’être grâce au test de synergie, 100 (96.2%) grâce à la méthode des
disques combinés, et 96 (92.3%) grâce à la méthode à la cloxacilline.
(tableau X, Fig .12)
Tableau X : comparaison des méthodes de mise en évidence
des BLSE
Méthode
Nombre de souches
BLSE (+)
détectées
%
Nombre de
souches
BLSE(+) non détectées
%
Test de synergie
82
78.8
22
21.2
Méthode des disques combinés
100
96.2
4
3.8
Méthode à la cloxacilline
96
92.3
8
7.7
100
90
80
70
60
% de détection 50
40
30
20
10
0
M éthodes
T est de synergie
M éthode des disques combinés
M éthode à la cloxacilline
Figure 12 : Pourcentages de détection des méthodes de mise en évidence
des BLSE
- 52 -
- 53 -
DISCUSSION
I- EPIDEMIOLOGIE DES ENTEROBACTERIES
PRODUCTRICES DE BLSE :
Les bactéries productrices de BLSE constituent une préoccupation
majeure en milieu hospitalier en raison de leur diffusion épidémique et de
leur multirésistance aux antibiotiques. Les BLSE sont retrouvées chez une
vaste proportion de bacilles à gram négatif, mais les entérobactéries
représentent les germes les plus incriminés (17).
Klebsiella pneumoniae semble être le producteur numéro 1 de BLSE,
suivie d’ E. coli, d’après de nombreuses études (1, 17, 30, 40, 44). Dans notre
série d’étude, K. pneumoniae ne fait pas exception à la règle représentant
28,26% des souches isolées, ensuite viennent E. coli (27,17%), E. cloacae
(15,21%)...
En 2001 en France, K pneumoniae représentait 3% des microorganismes
isolés d’infections nosocomiales. Des épidémies hospitalières de souches
résistantes aux C3G par production de BLSE sont observées depuis le milieu
des années 1980 dans de nombreux pays; les souches classiques de
K. pneumoniae productrices de BLSE sont encore sensibles à l’imipénème.
Cependant, durant l’année 2004, une souche de K. pneumoniae résistante à
toutes les bêta-lactamines, y compris l’imipénème, a été isolée chez 6
patients d’un service de chirurgie en région parisienne (20).
Il faut, cependant, noter que certaines études détrônent K. pneumoniae
de la place qu’elle occupait, et placent E. aerogenes au 1er rang des
entérobactéries productrices de BLSE (22, 27). Ce phénomène a été observé
en France, aux USA et en Espagne (22).
- 54 -
DISCUSSION
Les souches d’entérobactéries productrices de BLSE isolées au cours de
notre étude, sont issues majoritairement des services de réanimation avec un
pourcentage de 46,74%. En effet , les patients hospitalisés au sein des unités
de soins intensifs présentent plus de risques à contracter une BLSE (44), vu la
durée d’hospitalisation (qui est généralement longue), la sévérité de la
maladie, l’usage d’un certain nombre de dispositifs invasifs (sondes
urinaires, cathéters, ventilation, intubation…), et les traitements antibiotiques
multiples notamment avec les céphalosporines à large spectre (1, 44).
Dans la présente étude, le tractus urinaire est à l’origine de 46,73% des
entérobactéries productrices de BLSE isolées. Ceci confirme les résultats
apportés par une étude menée en 1999 dans un hôpital universitaire à Paris
par Lucet et al. Et dans laquelle les infections du tractus urinaire à
entérobactéries productrices de BLSE représentaient 52% (26). Les
principaux facteurs de risque de colonisation, puis d’infections urinaires
nosocomiales, sont la dépendance fonctionnelle et surtout la mise en place
d’une sonde urinaire, qui doit être posée suite à une indication précise, puis
retirée le plus rapidement possible. Le respect de ces indications à côté de la
mise en place de mesures d’isolements et la mise en œuvre de consignes
d’hygiènes, ont permis, d’après une étude menée dans un service de
médecine interne gériatrique, de diminuer de 52% l’incidence des infections
à entérobactéries productrices de BLSE au CHU d’Amiens (21).
Jusqu'à présent, la plupart des études épidémiologiques concernant les
entérobactéries productrices de BLSE se sont intéressées à l’infection plutôt
qu’à la colonisation par ce type de germes. Pourtant, la compréhension des
facteurs de risque de colonisation digestive par les entérobactéries
productrices de BLSE est d’une importance vitale pour plusieurs raisons :
- 55 -
DISCUSSION
Tout d’abord, le tube digestif a été reconnu comme réservoir et
source majeure d’entérobactéries à BLSE chez les patients
colonisés (17).
Et puis, la colonisation a été reconnue comme un élément
précédent l’infection (4).
Donc, le contrôle et l’élimination des réservoirs constitués par les
patients colonisés, permettraient de diminuer la prévalence des infections à
BLSE.
Dans notre étude 12/104 (11,54%) des patients ont été sujets à une
colonisation digestive.
Une étude réalisée au CHU Ibn Rochd de Casablanca, qui s’est
intéressée à la colonisation digestive par les entérobactéries productrices de
BLSE, a montré que la ventilation mécanique, l’emplacement de tubes
nasogastriques, la durée de séjour, ainsi que les traitements antibiotiques
constituent les facteurs de risques les plus associés à la colonisation digestive
par les germes BLSE (29). Paradoxalement, une autre étude a montrée que
cette colonisation est associée seulement à la durée d’hospitalisation , et n’a
aucune relation avec le traitement antimicrobien, et que les mesures visant à
limiter la transmission de ces bactéries pouvaient à elles seules réduire la
prévalence de la colonisation digestive à entérobactéries productrices de
BLSE (4).
- 56 -
DISCUSSION
II- ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES :
Face à l’apparition de nouvelles résistances aux antibiotiques chez les
entérobactéries, l’évaluation de la sensibilité aux antibiotiques est devenue
indispensable.
Les souches isolées dans notre étude sont résistantes à toutes les bêtalactamines utilisées, sauf à l’imipénème avec des niveaux de résistances
différents aux aminosides (Amikacine
Gentamycine
(Ciprofloxacine
89,8%,
Tobramycine
59%, Norfloxacine
21,7%, Netilmicine
96,6%),
aux
77,8%,
fluoroquinolones
50%), et à la Sulfaméthoxazol-
trimethoprime (74,1%).
Cette résistance croisée est due au fait que les plasmides portant les
gènes codant pour les BLSE, pourraient porter également des gènes de
résistance à différents autres antibiotiques
(17, 44).
Cette hypothèse a fait
l’objet de nombreuses études, parmi lesquelles celle menée par Oteo et al.
(1962 souches d’E. coli collectées dans 27 hôpital en Espagne) qui ont pu
montrer que le niveau de résistance aux antibiotiques non bêta-lactamines
était plus important pour les souches productrices de BLSE que pour les
souches
non
productrices (Cotrimoxazol 77,3%
contre
32,9%,
Ciprofloxacine 63,3% contre 17,2% et Gentamycine 16,7% contre 6,3%
respectivement ) (27). Paterson et al. Ont aussi montré, d’après une étude
effectuée dans 18 hôpital et 7 pays, que 18% des souches BLSE étaient
également résistantes à la Ciprofloxacine (35).
L’augmentation de la résistance à ces familles d’antibiotiques limite leur
utilisation en cas d’infections à germes BLSE et la rend problématique. Cette
- 57 -
DISCUSSION
augmentation fait des carbapénèmes ( imipénème et méropénème ) les
antibiotiques de choix dans le traitement de ce genre d’infections (36, 44), du
fait de leur grande sensibilité vis à vis de l’action hydrolytique des BLSE
(44). Actuellement, l’imipénème et l’association bêta-lactamines / inhibiteurs
de bêt-lactamases sont souvent les plus utilisés en milieu hospitalier ; chez
les immunodéprimés, les patients ayant déjà subit un traitement avec des
C3G, et dans les services de réanimation (13) où règne une forte prévalence
d’entérobactéries productrices de BLSE, ce qui constitue un risque de
sélection de germes résistants aux carbapénèmes. C’est d’ailleurs le cas pour
une souche de K.pneumoniae, résistante à toutes les bêta-lactamines y
compris à l’imipénème, qui a été isolée dans un service de chirurgie en
région parisienne (20).
III- METHODES DE MISE EN EVIDENCE DES BLSE :
Depuis leur description en 1983, les entérobactéries productrices de
BLSE ont causé de nombreuses épidémies un peu partout dans le monde (26).
C’est pourquoi la détection de ces BLSE devient une nécessité et doit être
une pratique de routine dans les laboratoires de microbiologie médicale afin
d’éviter les échecs thérapeutiques chez les malades infectés par ces bactéries
productrices de BLSE et limiter leur dissémination.
Dans notre étude nous avons utilisé, pour détecter la production de
BLSE, trois méthodes à savoir : le test de synergie, méthode des disques
combinés, et la méthode à la cloxacilline.
- 58 -
DISCUSSION
III-1- TEST DE SYNERGIE :
Généralement la production de BLSE
est mise en évidence sur
l’antibiogramme par :
Une sensibilité réduite à l’un ou plusieurs des antibiotiques suivants
(44) :
Cefpodoxime,
cefotaxime,
ceftazidime,
ceftriaxone,
ou
aztréonam. Il faut, cependant, noter que le degré de résistance vis à vis
des C3G peut être très variable d’une BLSE à une autre ; c’est à dire
pendant que certaines souches BLSE montrent une franche résistance,
d’autres se montrent intermédiaires ou même sensibles. Ceci peut être
dû en partie à la qualité de l’inoculum, d’après certains investigateurs
(44).
L’aspect
en
« bouchon
de
champagne »
dû
à
un
effet
synergique entre les disques contenant l’acide clavulanique et les
disques de C3G et celui d’aztréonam. Ce test de synergie est l’un des
premiers tests à être décrit par Jarlier et al. (7).
Une résistance associée aux aminosides.
Grâce à ce test, nous avons pu détecter 78,8% des souches BLSE de
notre étude. C’est un test facile à réaliser, non coûteux qui pourrait, ou
devrait, être réalisé en routine dans les laboratoires de microbiologie, mais
dont le désavantage réside dans le fait que le phénomène de synergie peut
passer inaperçu lorsque l’inoculum est trop dilué ou lorsque les disques sont
placés loin les uns des autres (43), mais aussi en cas d’association, chez la
- 59 -
DISCUSSION
même bactérie, d’une BLSE et d’une céphalosporinase (7). Ce qui explique,
probablement, les 21,2% des souches non détectées.
C’est pourquoi certains auteurs suggèrent, afin d’améliorer la sensibilité
du test, la réduction de la distance entre les disques de C3G et le disque
contenant l’acide clavulanique à 20 mm et l’utilisation de céfpodoxime
comme antibiotique de choix, avec alternativement , l’addition de 4 µg/ml
d’acide clavulanique. à la gélose Mueller-Hinton (7). Alors que d’autres
auteurs proposent la distance de 15 mm comme étant la meilleure (44).
Une autre modification du test a été proposée par Pitout et al. (37) ; elle
utilise la combinaison cefepime (30µg) et piperacilline/tazobactam
(100µg/10µg), et a permis de mettre en évidence des souches productrices de
BLSE et de céphalosporinases haut niveau, ainsi que la production de BLSE
chez une E. coli ayant donné un résultat négatif avec la méthode préconisée
par le NCCLS.
III-2- METHODE DES DISQUES COMBINES :
Dans la présente étude nous avons utilisé deux couples de disques
d’antibiotiques : CAZ avec CAZ/acide clavulanique et CTX avec CTX/ acide
clavulanique. Les souches testées étaient celles pour lesquelles le diamètre
d’inhibition de CTX est < ou égale à 22 mm, et à 27 mm pour la CAZ, celles
présentant un phénomène de synergie, et celles ayant une résistance associée
aux aminosides (Conformément à ce qui a été préconisé par le NCCLS).
Un test similaire a été décrit par Jacoby et Han (19), dans lequel 20µg
de sulbactam a été ajouté aux disques contenant l’un des oxyimino-bêta-
- 60 -
DISCUSSION
lactamines, et il a montré qu’un nombre significatif de souches n’a pas pu
être détecté par cette méthode.
Une autre étude a montré que l’utilisation des disques combinant les
C3G et l’acide clavulanique n’est pas une méthode fiable car elle ne permet
pas de différencier les souches produisant des BLSE de celles produisant des
céphalosporinases (AmpC), et de détecter les BLSE chez les souches
produisant à la fois une céphalosporinase AmpC et une BLSE (11).
96,2% des souches de notre étude ont montré un résultat positif avec la
méthode des disques combinés. A titre comparatif, lors d’une étude conduite
en Buenos-aires (Argentine) (40), la combinaison CTX/CTX-clav a permis de
détecter 84% des souches BLSE, la combinaison CAZ/CAZ-clav a permis de
détecter 59%, et la combinaison FEP/FEP-clav , quant à elle,
a permis de
détecter 97% des souches.
III-3- METHODE A LA CLOXACILLINE :
Technique décrite , récemment , sur des souches d’Acinetobacter
baumannï produisant une BLSE de type VEB-1 (38), qui consiste à réaliser
un test de synergie sur un milieu Mueller-Hinton contenant 250 mg/l de
cloxacilline.
Cet
antibiotique
inhibe
partiellement
l’activité
des
céphalosporinases, permettant ainsi aux BLSE de s’exprimer librement.
Pour la détection de nos souches, nous avons utilisé
500 mg/l de
cloxacilline, et contrairement à ce qui était prévu seulement 92,3% des
souches ont été détectées par cette méthode, car l’addition de cloxacilline
était sensée résoudre le problème de la production de céphalosporinases
- 61 -
DISCUSSION
rencontré avec les deux autres méthodes. Ceci nous laisse penser que,
probablement, la concentration en cloxacilline utilisée n’a pas été suffisante
pour inhiber les céphalosporinases et laisser s’exprimer les BLSE. D’autres
causes d’erreurs, d’ordre technique, pourraient expliquer en partie le
pourcentage de souches BLSE non détectées :
o Coulage non horizontal des milieux.
o Epaisseur insuffisante du milieu gélosé.
o Inoculum, trop léger, ou trop lourd.
o Mauvaise application des disques d’antibiotiques à la surface du
milieu gélosé.
o Conditions d’incubation : température, trop basse par suite
d’ouvertures fréquentes et/ou prolongées de l’étuve .
Malgré l’intérêt que peut apporter chacune de ces méthodes pour la
détection et la confirmation de la production des BLSE, aucune d’entre elles
n’a pu détecter de manière absolue toutes les souches productrices de BLSE.
Pour détecter autrement le caractère BLSE, certains auteurs utilisent la
recherche de CMI ( concentration minimale inhibitrice ), suivant la méthode
de microdilution en milieu liquide (4, 9).
Une autre technique facile à mettre en œuvre, mais néanmoins
coûteuse, utilisant des bandelettes E-test, s’est avérée intéressante pour sa
sensibilité à détecter les BLSE (5). Le E-test tire profit des avantages du test
par diffusion ( rapidité et simplicité), et du test par dilution ( obtention d’une
valeur quantitative de la sensibilité ).
- 62 -
DISCUSSION
Un autre test a été décrit par Thomson et Sanders (7), comme étant très
sensible pour la détection des BLSE, à savoir le test tri-dimentionnel, mais il
est techniquement plus compliqué que les autres méthodes et requière des
connaissances particulières pour son interprétation.
En ce qui concerne nos trois méthodes utilisées, nous avons constaté
une certaine complémentarité : la 1ère méthode (test de synergie) est une
technique valable pour les entérobactéries productrices de BLSE non
productrices de céphalosporinases . Sur le même antibiogramme un test
présomptif est à prendre également en considération ; c’est la diminution des
diamètres d’inhibition de la CTX et CAZ (inférieur ou égale à 22 mm et 27
mm respectivement) . Les deux autres méthodes sont complémentaires au
test de synergie dans les situations décrites précédemment .
Donc, d’après notre étude, il s’est avéré obligatoire l’utilisation de
deux techniques afin de pouvoir détecter les souches BLSE qui peuvent
échapper à l’une des deux méthodes.
IV- MAITRISE DE LA DIFFUSION DES BLSE : (11)
La maîtrise de la résistance bactérienne aux antibiotiques, notamment
par production de BLSE est une priorité de santé publique qui nécessite des
actions concertées reposant sur deux axes complémentaires :
•
La prévention de la diffusion de ces bactéries par transmission
croisée.
•
La réduction de la pression de sélection exercée par les
antibiotiques.
- 63 -
DISCUSSION
IV-1- PREVENTION DE LA DIFFUSION PARTRANSMISSION
CROISEE
:
Cette prévention repose sur deux types de mesures :
IV-1-1-
L’identification précoce des patients porteurs :
Elle est primordiale car c’est elle qui permet de mettre en œuvre les
mesures d’isolement et elle comprend :
La détection de la résistance au laboratoire.
La notification rapide et claire par le laboratoire qui permet de faire
connaître les patients porteurs à l’équipe soignante. Cette notification
repose sur le contact personnalisé entre le biologiste et l’équipe
soignante, et la mention du caractère multirésistant de la bactérie sur
la feuille des résultats.
La signalisation des patients porteurs de ce genre de BMR dans le
service d’hospitalisation.
IV-1-2-
L’isolement des patients porteurs :
Il s’agit d’un isolement technique et géographique ; l’isolement
technique vise à instaurer une barrière physique autour d’un patient porteur
pour éviter la dissémination des bactéries multirésistantes. Il repose sur :
• Le lavage antiseptique (hygiénique) des mains après contact avec le
patient, et la désinfection des mains avec une solution hydro- 64 -
DISCUSSION
alcoolique par friction. L’installation d’un lavabo équipé par chambre
est un pré-requis indispensable au respect du lavage des mains.
• Le port de gants à usage unique lors de tous contacts
particulièrement contaminant avec le patient. L’utilisation de gants ne
dispense en aucun cas du lavage des mains après le contact.
• Le port de tablier ou surblouse lors de soins exposant à un large
contact avec le patient.
• L’utilisation de matériel de soins réservé à chaque patient.
Quant à l’isolement géographique, il facilite considérablement
l’application des mesures d’isolement technique. Il se fait en chambre
individuelle ou à défaut en chambre à plusieurs lits regroupant des patients
porteurs du même type de bactéries multirésistantes.
IV-1-3-
Mesures complémentaires :
Elles visent à dépister , et si possible réaliser une décontamination
digestive afin d’éliminer les réservoirs de BLSE.
- 65 -
DISCUSSION
IV-2- REDUCTION DE LA PRESSION DE SELECTION
:
Pour lutter contre la pression de sélection exercée par les antibiotiques,
il est recommandé d’utiliser ces antibiotiques de façon rationnelle en
considérant les points suivants :
•
Préférer l’usage d’associations à celui des monothérapies.
•
Respecter l’emploi de posologies adéquates.
- 66 -
- 67 -
CONCLUSION
La découverte des antibiotiques a constitué un grand pas dans la lutte
contre les maladies infectieuses notamment dans les infections dites
nosocomiales. Mais au moment où les laboratoires pharmaceutiques se
désinvestissent pour la recherche de nouvelles molécules en antibiothérapie,
les bactéries quant à elles, continuent de développer de nouveaux mécanismes
de résistance.
En milieu hospitalier, certaines bactéries sont devenues résistantes à un
ou plusieurs antibiotiques. Ce phénomène affecte surtout les unités de
réanimation où sont hospitalisés les patients les plus sévères et les
établissements de long séjour où sont hébergés les patients atteints de
pathologies chroniques.
Au Maroc, le problème se pose essentiellement pour les entérobactéries
productrices de BLSE qui posent, pratiquement, trois types de problèmes au
monde médical :
Un problème thérapeutique : pour le clinicien qui doit
prescrire
un
antibiotique
efficace,
éviter
les
échecs
thérapeutiques et la sélection de mutants résistants.
Un problème microbiologique : une détection difficile,
nécessitant la mise en œuvre de méthodes spécifiques.
Un problème épidémiologique : pour les équipes de contrôle
de l’infection qui doivent limiter la dissémination de souches
multirésistantes.
C’est dans cette optique que nous avons entrepris d’étudier
l’épidémiologie de 104 souches d’entérobactéries productrices de BLSE,
- 68 -
CONCLUSION
isolées chez 104 patients ( dont 94 hospitalisés et 10 reçus à titre externe ),
et comparer trois méthodes de détection de ce type de germes, à savoir : le test
de synergie, la méthode des disques combinés et la méthode à la cloxacilline.
L’exploitation des résultats a été faite avec le logiciel WHONET 5.3
Au terme de cette étude, les résultats montrent que :
Parmi les souches isolées, K. pneumoniae était la plus fréquente
représentant 28,26%, suivie de E. coli (27,17%) et de E. cloacae
(15,21%)…
Ces souches étaient résistantes à toutes les bêta-lactamines testées, sauf à
l’imipénème, avec des niveaux de résistance différents aux aminosides
(Amikacine 21,7%, Netilmicine 77,8%, Gentamycine 89,8%, Tobramicine
96,6% ), aux fluoroquinolones ( Ciprofloxacine 59%, Norfloxacine 50% )
et à la sulfaméthoxazol-trimethoprime ( 74,1% ). Il demeure donc
nécessaire d’utiliser ces antibiotiques en association (surtout Amikacine,
Norfloxacine et Ciprofloxacine ) afin de préserver leur activité sur les
souches BLSE qui se caractérisent par leur aptitude à la multirésistance, et
constituer une alternative au traitement par l’imipénème qui est
difficilement accessible du fait de son coût.
Concernant nos méthodes de mise en évidence des BLSE :
Le test de synergie ; nous a permis de détecter 78,8% de nos
souches BLSE. C’est un test facile à mettre en œuvre et non
coûteux.
La méthode des disques combinés ; a permis de détecter 96,2%
des souches. Un pourcentage intéressant qui fait de cette
méthode un bon outil pour la mise en évidence des BLSE.
- 69 -
CONCLUSION
Pour ces deux méthodes, on a noté que la production de
céphalosporinases peut être gênante.
La méthode à la cloxacilline ; contrairement à ce qui était prévu
seuls 92,3% des souches a été détecté. L’addition de cloxacilline
était
sensée
résoudre
le
problème
de
production
de
céphalosporinases rencontré avec les deux autres méthodes.
Donc aucune de nos trois méthodes n’a pu détecter de manière absolue
toutes les souches productrices de BLSE. En conclusion, le test de
synergie doit être utilisé en routine sur tous les isolats bactériens au sein
des laboratoires de microbiologie, les cas suspects doivent faire l’objet
d’une confirmation par les deux autres méthodes, vu la complémentarité
qu’a montrée ces dernières avec le test de synergie.
Enfin, et dans le cadre de mesures destinées à limiter l’apparition
d’épidémies intra-hospitalières dues à des souches
d’entérobactéries
productrices de BLSE : le dépistage précoce des infections à germes BLSE, le
contrôle des réservoirs et des voies de transmission par isolement technique et
géographique de patients colonisés ou infectés et le bon usage des
antibiotiques sont à l’évidence des mesures qui permettent la réduction de la
prévalence de ces bactéries multirésistantes. Cependant, leur mise en œuvre
nécessite la prise de conscience collective de ces notions, la coopération de
tous les services et par la formation approfondie des équipes soignantes.
- 70 -
- 71 -
ANNEXE
Tableau XI : Disques d’antibiotiques utilisés pour l’antibiogramme
Antibiotiques ( Oxoîd, England )
Charges ( µg )
Ampicilline ( AMP )
10
Augmentin ( AMC )
20 /10
(Amoxicilline/Acide-clavulanique )
Céfalotine ( CF )
30
Céfotaxime ( CTX )
30
Céftazidime ( CAZ )
30
Imipénème ( IMP )
10
Gentamycine ( CN )
10
Amikacine ( AK )
30
Netilmicine ( NET )
30
Tobramycine ( TOB )
10
Ciprofloxacine ( CIP )
5
Colistine ( CT )
50
Sulfaméthoxazol /trimethoprime ( TSU )
1,25/23,75
Tableau XII : Disques d’antibiotiques utilisés pour les tests de
confirmation
Antibiotiques
Charges (µg )
Céfotaxime (CTX )
10
Céfotaxime/Ac. Clav
30/10
Céftazidime (CAZ )
30
Céftazidime/Ac. Clav
30/10
Piperacilline/Tazobactam
( TZP )
100/10
Ticarcilline/Ac. Clav
( TCC )
75/10
- 72 -
ANNEXE
Milieux de culture :
Milieu MH2 ( Mueller-Hinton ) :
C’est un milieu prêt à usage fourni par le fabriquant ( Biomérieux ).
Généralement utilisé pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques et
sulfamides.
*Composition : - Infusion de bœuf
- Caséine
- Starch
- Agar
300g
1,75g
1,5g
17g
- Eau distillée
1 litre
Milieu Mac-conkey :
Milieu sélectif aux bacilles à gram négatif par sa teneur en cristal
violet.
* Composition : - Bacto-peptone
17g
- Protéose ou polypeptone 3g
- Lactose
10g
- Sels biliaires
1,5g
- NaCl
5g
- Agar
13,5g
- Rouge neutre
0,03g
- Cristal violet
0,001g
- Eau distillée
1litre
- 73 -
ANNEXE
Milieu MH/Cloxacilline :
* Composition : - Cloxacilline (500mg/l)
-Gélose Mueller-Hinton
125µl
250ml
* Préparation : - Faire fondre la gélose MH, ramener à 50°C ,
incorporer la solution mère de cloxacilline dans la gélose,
homogénéiser et couler en boite de pétri.
Milieu Mac-conkey/CTX :
* Composition : - Solution mère de CTX
- Gélose Mac-conkey
30µl
60ml
* Préparation : - Faire fondre la gélose Mac-conkey, ramener à
50°C, incorporer 30µl de la solution mère de CTX
( 1000 Gamma )
dans 60ml de gélose, homogénéiser et couler en boite de pétri.
- 74 -
- 75 -
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