Caron Juliette - EA 7394 USC 1281 ICV
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Devenir des peptides bioactifs issus de la digestion gastro-intestinale des protéines alimentaires Juliette Caron Directeur de thèse : P. Dhulster Encadrants : B. Cudennec, R. Ravallec Université de Lille1, EA 7394, USC 1281 - Institut Charles Viollette – Equipe ProBioGem 19/01/2016 1 Contexte du projet : digestion GI des protéines et prise alimentaire • Tractus gastro-intestinal : système clé de la régulation de la prise alimentaire • Communication cerveau-intestin via hormones et signaux neuronaux • Digestion des protéines : libération d’acides aminés libres et de peptides Interaction avec l’environnement gastro-intestinal • Peptides bioactifs : activité biologique à visée bénéfique pour la santé Recherche de peptides impliqués dans la régulation du métabolisme énergétique Larder and O’Rahilly (2012) 2 Objectifs du projet 1. Identifier les peptides libérés lors de la digestion in vitro GI de l’hémoglobine bovine 2. Mettre en évidence des activités biologiques et identifier les peptides impliqués 3. Comprendre les mécanismes d’action des peptides bioactifs Digestion GI statique in vitro Hémoglobine bovine Hydrolysats gastriques et intestinaux Identification des peptides LC-MS-MS Sécrétion d’hormones satiétogènes CCK, GLP-1 Inhibition de l’activité de l’enzyme DPP-IV Passage d’une barrière de cellules intestinales 3 1. Cartographie peptidique de la digestion de l’hémoglobine Modèle in vitro • Séparation des peptides par techniques chromatographiques : HPLC, FPLC. • Identification des séquences par LC-MS-MS et cartographie du recouvrement de la protéine • Mise en évidence de zones résistantes 0.6 T=37°C 0.4 Bouche 5min pH 6.5 Pepsine 0.2 Abs à 214 nm (mAU) 0.0 0.4 Estomac 2h pH 2.5-3 0.3 0.2 G4 chaine alpha : 131 séquences 0.1 Pancréatine 0.0 0.8 0.6 Intestin 2h pH 7-7.5 0.4 0.2 0.0 20 Sources : Vertsantvoort et al, 2005. 40 60 80 Temps de rétention (min) I4 chaine alpha : 121 séquences Plus de 1000 séquences identifiées en phase intestinale 4 2. Activités biologiques : sécrétion d’hormones intestinales • Cholécystokinine : hormone satiétogène sécrétée principalement au niveau du duodénum Fractionnement par FPLC 180 intestin 160 a 140 a a a estomac CCK, pM 120 100 salive 80 60 b 40 b b b 20 0 700 a a 600 ab bc Fraction FC 1400 400 25 c 300 c 20 Riche en AA aromatiques c 200 15 100 d 10 0 Ctrl 5 mouth 5 PM<1000 Da 1600 Fraction FDE 60 120 30 60 stomach 90 1200 CCK (pM) CCK level, mean fold of control active GLP-1, pM 30 500 1000 800 600 120 intestine 400 Intestin 120min residence time, min 200 0 0 FDE-1FDE-2FDE-3FDE-4FDE-5FDE FC-1 FC-2 FC-3 FC-4 FC-5 FC-6 FC 5 CCK, pM 2. Activités biologiques : hormone intestinale et DPP-IV 100 80 60 b • GLP-1 : hormone incrétine satiétogène rapidement inactivée par l’enzyme DPP-IV b 40 b b 20 0 700 GLP-1 600 intestin a 600 ab 500 mean GLP-1 (pM) bc estomac 400 300 c c c 400 300 200 200 100 100 d 0 0 Ctrl 5 mouth 60 120 30 60 stomach 90 120 intestine residence time, min ContrôleF01 F02 Fractionnements analytiques 60 F03 F04 F05 F06 F07 F08 F09 F10 F11 FBC 80 70 Inhibition DPP-IV % DPP-IV inhibition 60 % DPPIV activity inhibition active GLP-1, pM 500 salive Fraction F4 : potentiel inhibiteur DPP-IV / stimulateur GLP-1 700 a 50 40 30 20 40 20 10 0 0 50 100 150 Digestion time (min) 200 250 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 6 2. Passage de la fraction sur barrière de cellules Caco-2 • Passage de la fraction F4 d’un modèle de barrière intestinale Fraction F4 apical Cellules Caco-2 sur inserts basolatéral Identification LC-MS-MS Protein HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBB_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN HBA_BOVIN Sequence ADKGNV ADKGNVK SAADKGNV SAADKGNVKA DLHAH SDLHAHK SDLHAH DLSHGSAQ KAAVT MNNPK SLDK VAAA VDPVN VGGHAAE YGAE YGAEA HBB_BOVIN HBB_BOVIN ANVST LTAEEK Mass (Da) 602.3024 730.3973 760.3715 959.5035 591.28 806.4035 678.3085 813.3617 488.2958 602.2846 461.24 330.19 542.27 639.2976 438.175 509.2122 490.2387 689.3596 • Plus d’une centaine de séquences peptides présents dans la fraction initiale, une trentaine détectées en basolatéral • Maintien de l’activité DPP-IV des surnageants apical et basolatéral 7 Conclusion générale Protéines alimentaires Tractus GI Hydrolysat intestinal Biodisponible dans le lumen Identification des populations peptidiques Outils analytiques Activités biologiques Tests in vitro, lignées cellullaires Validation in vivo? 8
