Microbiologie EVI 783 - master bgstu bordeaux i
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Microbiologie EVI 783 [email protected] EPOC - UMR 5805 Station Marine d’Arcachon 2 rue Pr Jolyet 33120 Arcachon Secrétariat : 05 56 22 39 12 Rappel – Cf. cours SVi602 = maîtrise de la présence et/ou de l’abondance • Contrôle + • Contrôle – culture, numération, croissance lutte, asepsie, antibiotiques I. Culture, numération, croissance Composition élémentaire moyenne d'une bactérie C 50% de la masse sèche O 23% " N 14% " H 8% " P 3% " S 1% " C129H248O45N31P3S I.1.1 Milieux de culture Composition des milieux de culture Sources C, N, P, S et Energie selon métabolisme Facteurs de croissance selon besoins Sels minéraux, oligo-éléments Eau I.1.1 Milieux de culture Types de milieux de culture Liquide (bouillon) Complexe Complet Sélectif ou ou ou ou solide (gélose) synthétique minimum non sélectif I.1.2 Conditions de culture 0°C 25°C 45°C A a é na ro éro to b lé ie ra nt An a st éro ric bi t e An fa aér cu o lta bie tif ic ro a M • Température Aé r ob ie ér o st ric t ph ile • Oxygène 65°C Psychrophiles Mésophiles Thermophiles Hyperthermophiles • pH (acidophilie) • Lumière (photophilie) • Pression osmotique (barophilie) I.1.3 Notion de culture pure = lignée, clone Population de cellules dérivant d’une seule cellule (sauf groupements type strepto-), génétiquement identiques à celle-ci (aux mutations près) … souche I.1.4 Notion de colonie vue en coupe = amas de cellules de la même souche (sauf contamination) et de substances extracellulaires (EPS) • le volume cellulaire ne représente que 1 à 30% du volume de la colonie vue en plan • une colonie d’E coli de 5mm de diamètre contient environ 108 cellules I.2 Méthodes de dénombrement • Population • Nombre • Biomasse • Densité • Concentration cellulaire I.2.1 Méthode directe Cellules hématimétriques Quadrillage de Thoma : 0,004 10-3 mL I.2.2 Méthode indirecte Mesure de turbidité Densité optique > 650nm (spectrophotomètre) 0,1 unité DO 108 cell / mL (ordre de grandeur !) Trouble visible à l’œil nu 107 cell / mL I0 I I.2.3 Méthode par culture Principe : Après mise en culture sur milieu solide de dilutions connues de l’échantillon, chaque cellule isolée va former une colonie que l’on pourra dénombrer. g amme de dilution ensemencement étalement Impératif : Ne considérer que les boites contenant entre 30 et 300 colonies : incubation comptage des colonies étuve Expression des résultats : UFC : unités formant colonies I.3 Croissance • Croissance vs développement • Croissance individuelle vs croissance démographique • Croissance balancée • Taux de croissance (µ) • Temps de génération (G) I.3 Croissance individuelle vs démographique pourquoi les bact éries sont nulles en m aths ? elles confondent multip t = G ; 1 génération lication et divisio n I.3.1 Courbe de croissance Nombre de cellules en milieu non renouvelé temps déclin phase stationnaire croissance exponentielle latence Nombre de cellules I.3.1 Courbe de croissance en milieu non renouvelé I.3.1.1 Phase de latence Nombre de cellules en milieu non renouvelé déclin phase stationnaire croissance exponentielle latence N0 • Nt = N0, inoculum • Nt constant, minimum • L’activité cellulaire prépare les divisions à venir (croissance non balancée) I.3.1.2 Phase de Croissance exponentielle déclin phase stationnaire croissance exponentielle • µ maximum latence µmax Nombre de cellules en milieu non renouvelé • G minimum • toutes les cellules se divisent • la croissance suit un modèle exponentiel • détermination des optima de la souche I.3.1.3 Phase de croissance stationnaire en milieu non renouvelé déclin phase stationnaire • Nt constant, maximum croissance exponentielle latence Nombre de cellules Nmax • Nt dépend du volume de la culture, de la richesse du milieu,… • Modifications physiologiques (sporulation, GRAM,…) • les cellules qui apparaissent compensent celles qui meurent et s ’autolysent I.3.1.4 Phase de déclin déclin phase stationnaire croissance exponentielle latence dN/dt < 0 Nombre de cellules en milieu non renouvelé • Nt décroît • taux de mortalité • toutes les cellules meurent et s ’autolysent I.3.2 Modèle de croissance exponentielle Quelle est l’évolution au cours du temps du nombre de cellules, Nt, pour une culture inoculée avec N0 = 3 cellules d’une bactérie dont le temps de génération G = 1 h ? construction empirique t (h) Nt 0 1 2 3 N0 = 3 6 12 24 I.3.2 Modèle de croissance exponentielle modélisation mathématique Scissiparité suite géométrique de raison 2 t (h) 0 1 2 3 N0 = 3 6 12 24 n=t/G 0 1 2 3 2n 1 2 4 8 N0 x 2n 3 6 12 24 Nt I.3.2 Modèle de croissance exponentielle modélisation mathématique Nt = N0 2n et n = t /G Nt = N0 2t/G Log Nt = Log N0 + [Log 2 x (t / G)] Si µ = Log 2 / G alors Log Nt = Log N0 + µ t I.3.2 Modèle de croissance exponentielle application Quelle est le taux de croissance (µ) et le temps de génération (G) d’une bactérie dans des conditions expérimentales définies ? Nombre de cellules Log N Logarithme du nombre de cellules en phase exponentielle t temps Détermination de µ Calcul de G I.3.2 Modèle de croissance exponentielle domaine de validité Quelle serait la masse d’E coli obtenue si une culture pure se maintenait pendant 48h en phase de croissance exponentielle? en prenant G = 20 minutes 144 générations soit 2,23 1043 bactéries produites en 48h en prenant 1 bactérie = 10-12 g 2,23 1026 tonnes > 4000 fois la masse du géoïde terrestre ! I.3.2 Modèle de croissance exponentielle quelques valeurs Organisme G Observation Mycobacterium tuberculosis > 15h durée d’«incubation » de la maladie Vibrio cholerae 10mn vitesse d’invasion du tube digestif Saccharomyces cerevisae 1,5h Eucaryote 20d chimiolithotrophes autotrophes anaérobies Anammox bacteria (Planctomycetales) I.3.3 Chémostat Milieu « usagé » + cellules croissance dN / dt = µ N – D N = (µ - D) N Si D = µ alors dN / dt = 0 Avec: D = dilution = débit / volume Nombre de cellules Milieu « neuf » temps
