Dosage plasmatique des précurseurs de l`ACTH lors de

ÉCOLE NATIONALE VETERINAIRE D’ALFORT
Année 2004
Dosage plasmatique des précurseurs de l’ACTH lors de
maladie de Cushing chez le chien : intérêt pour la
détection des adénomes hypophysaires de grande taille
THESE
Pour le
DOCTORAT VETERINAIRE
Présentée et soutenue publiquement devant
LA FACULTE DE MEDECINE DE CRETEIL
Le
par
Nicolas, Pierre Granger
Né le 21 juin 1978 à Champigny sur Marne (Val-de-Marne)
JURY
Président :
Professeur à la Faculté de Médecine de CRETEIL
Membres
Directeur : M. Dan Rosenberg
Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort
Assesseur : Mme Sophie Alcon
Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort
Invitée : Mme Françoise Delisle, Centre de Cancérologie Vétérinaire
Dosage plasmatique des précurseurs de l’ACTH lors de
maladie de Cushing chez le chien : intérêt pour la
détection des adénomes hypophysaires de grande taille
Nom et Prénom : Granger Nicolas
Résumé :
La détection précoce des tumeurs hypophysaires corticotropes de grande taille chez le
chien repose sur l’emploi d’examens d’imagerie car l’expression clinique de ces tumeurs n’est
pas clairement corrélée à leur taille.
Pour accroître la capacité des vétérinaires à dépister des adénomes corticotropes de
grande taille, nous avons développé un nouvel outil biologique : le dosage des précurseurs de
l’hormone adrénocorticotrope (ACTH) dont la pro-opiomélanocortine (POMC), à l’aide d’une
trousse de dosage : OCTEIA POMC. Ce manuscrit retranscrit les différentes étapes de ce
travail expérimental après une présentation des données bibliographiques concernant
l’adénohypophyse et la maladie de Cushing.
La validation de la trousse OCTEIA POMC chez le chien puis son utilisation chez 36
chiens atteints de maladie de Cushing montre une forte corrélation entre la taille des tumeurs
hypophysaires et la concentration en précurseurs de l’ACTH.
Ces résultats permettent une distinction fonctionnelle des tumeurs hypophysaires selon
leur taille et offrent au clinicien une nouvelle étape simple et rapide dans la démarche
diagnostique étiologique des maladies de Cushing.
Mots clés :
Carnivore ; Chien ; Maladie de Cushing ; Tumeur ; Adénome corticotrope;
Hypophyse ; Diagnostic ; Technique immunoenzymatique ;
Pro-opiomelanocortine ;
Hyperadrenocorticisme.
Jury :
Président : Pr.
Directeur : Dr Dan Rosenberg
Assesseur : Dr Sophie Alcon
Invitée : Dr Françoise Delisle
Adresse de l’auteur : Mr Granger Nicolas, 89 rue Condorcet, 94 700 Maisons-Alfort.
Plasma concentrations of adrenocorticotrophic hormone
precursors in dogs with Cushing’s disease : evaluation in
the detetction of large pituitary adenoma
Surname: Granger
Given name: Nicolas
Summary:
It is difficult to predict the size of pituitary corticotroph tumors in dogs with Cushing’s
disease without pituitary imaging techniques because the clinical expression of this tumors is
not clearly correlated with their size.
To increase our capacity in detecting large pituitary corticotroph tumors in dogs, we
develop a new biological test: measurement of plasma adrenocorticotropin hormone (ACTH)
precursors as pro-opiomelanocortin (POMC) with a new kit: OCTEIA POMC. This
manuscript will expose the different steps of this experimental work after a review of the data
concerning the adenohypophysis and pituitary dependent hyperadrenocorticism.
Validation of this kit in dogs and measurement of ACTH precursors in 36 dogs
diagnosed with pituitary corticotroph adenomas of various sizes shows a strong correlation
between tumor size and ACTH precursors concentrations.
Those results lead us to propose a functional distinction between large and small
pituitary tumors and allow to introduce a fast and easy stage for clinician in the etiologic
diagnosis of Cushing’s disease.
Keywords:
Canine; Dog; Cushing’s disease; Tumor; Corticotroph adenoma; Pituitary ;Diagnosis;
Enzyme immunoassay; Pro-opiomelanocortin; Hyperadrenocorticism.
Jury :
President: Pr.
Director: Dr Dan Rosenberg
Assesor: Dr Sophie Alcon
Guest: Dr Françoise Delisle
Author’s address: Mr Granger Nicolas, 89 rue Condorcet, 94 700 Maisons-Alfort.
LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT
Directeur : M. le Professeur COTARD Jean-Pierre
Directeurs honoraires : MM. les Professeurs PARODI André-Laurent, PILET Charles
Professeurs honoraires: MM. BORDET Roger, BUSSIERAS Jean, LE BARS Henri, MILHAUD Guy, ROZIER Jacques, THERET Marcel
DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET PHARMACEUTIQUES (DSBP)
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-UNITE D’ANATOMIE DES ANIMAUX DOMESTIQUES
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Mlle ROBERT Céline, Maître de conférences
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Mme BERNEX Florence, Maître de conférences
Mme CORDONNIER-LEFORT Nathalie, Maître de conférences
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-DISCIPLINE : ETHOLOGIE
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-DISCIPLINE : ANGLAIS
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DEPARTEMENT D’ELEVAGE ET DE PATHOLOGIE DES EQUIDES ET DES CARNIVORES (DEPEC)
Chef du département : M. FAYOLLE Pascal, Professeur - Adjoint : M. POUCHELON Jean-Louis , Professeur
-UNITE DE MEDECINE
M. POUCHELON Jean-Louis, Professeur*
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Mme CHETBOUL Valérie, Professeur
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M. BLOT Stéphane, Maître de conférences
M. MOISSONNIER Pierre, Professeur
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Melle MAUREY Christelle, Maître de conférences contractuel
M. DESBOIS Christophe, Maître de conférences
Mlle RAVARY Bérangère, AERC (rattachée au DPASP)
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-UNITE D’OPHTALMOLOGIE
M. CLERC Bernard, Professeur
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M. CHERMETTE René, Professeur *
Mme GIRAUDET Aude, Professeur contractuel
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(rattaché au DEPEC)
(rattachée au DPASP )
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M. FONTBONNE Alain, Maître de conférences
Melle BLANCHARD Géraldine, Professeur contractuel
M. REMY Dominique, Maître de conférences (rattaché au DPASP)
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DEPARTEMENT DES PRODUCTIONS ANIMALES ET DE LA SANTE PUBLIQUE (DPASP)
Chef du département : M. CERF Olivier, Professeur - Adjoint : M. BOSSE Philippe, Professeur
-UNITE DES MALADIES CONTAGIEUSES
- UNITE DE ZOOTECHNIE, ECONOMIE RURALE
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M. COURREAU Jean-François, Professeur*
M. TOMA Bernard, Professeur
M. BOSSE Philippe, Professeur
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Mme GRIMARD-BALLIF Bénédicte, Professeur
Mme DUFOUR Barbara, Maître de conférences
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M. ARNE Pascal, Maître de conférences
M. PONTER Andrew, Maître de conférences
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M. CARLIER Vincent, Professeur
M. MILLEMANN Yves, Maître de conférences*
M. CERF Olivier, Professeur
Mme BRUGERE-PICOUX Jeanne, Professeur
Mme COLMIN Catherine, Maître de conférences
M.MAILLARD Renaud, Maître de conférences contractuel
M. AUGUSTIN Jean-Christophe, Maître de conférences
M. ADJOU Karim, Maître de conférences
Mme CALAGUE, Professeur d’Education Physique
* Responsable de l’Unité
AERC : Assistant d’Enseignement et de Recherche Contractuel
Juillet 2004
Remerciements
A Monsieur le Professeur de la Faculté de Médecine de Créteil,
Pour nous avoir fait l’honneur d’accepter la présidence de notre jury de thèse,
Hommage respectueux.
A Monsieur Rosenberg,
Maître de Conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort,
Pour sa participation décisive dans l’évolution de mes études au cours de ces
dernières années, notamment par ce travail mais dans bien d‘autres occasions aussi.
Profonds remerciements.
A Madame Delisle, Monsieur Devauchelle et Madame Segond,
Pour leur confiance et l’ensemble des données à la base de ce travail.
Sincères remerciements.
A Madame Alcon,
Maître de Conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort,
Pour avoir eu la gentillesse de corriger ce travail et de participer à notre jury de thèse.
Sincères remerciements.
Aux enseignants que j’ai rencontrés au cours de mes études et qui ont su me
transmettre leurs connaissances quelles que soient mes difficultés. Leur patience et
leur respect envers les élèves sont des qualités d’autant plus précieuses qu’elles
peuvent être rares, sans lesquelles ma formation n’aurait pu être possible.
Si le travail est matériel, les sentiments ne sont pas palpables et ne sauraient être
transmis par l’intermédiaire d’un bien petit texte de science. J’espère transmettre aux
personnes qui me sont proches, jour après jour, plus qu’un ponctuel remerciement pour le
bonheur que j’ai d’être à leur côté.
Table des matières
Table des illustrations
4
Biographie H.W.Cushing
6
Introduction
7
I - Anatomie, développement embryologique, histologie,
physiologie et physiopathologie tumorale de
l’adénohypophyse chez le chien
8
A - Organisation macroscopique de l’adénohypophyse et rapports
topographiques avec les structures adjacentes
8
1 - Organisation macroscopique de l’adénohypophyse
2 - Topographie de l’adénohypophyse
3 - Relations de l’adénohypophyse avec les structures vasculaires et nerveuses
adjacentes
B - Développement embryologique et organisation histologique de
l’adénohypophyse
1 - Du développement embryologique de l’adénohypophyse aux cellules
spécialisées
2 - Organisation histologique de l’adénohypophyse
C - Physiologie des cellules corticotropes adénohypophysaires
8
9
14
16
16
18
21
1 - L’axe corticotrope
21
2 - Un précurseur commun aux hormones corticotropes et mélanotropes : la proopiomélanocortine (POMC)
22
a – Historique
b - Organisation du gène de la POMC
c - Expression basale du gène de la POMC
d - Régulation de l’expression du gène de la POMC
e - Maturation post traductionnelle de la POMC et sécrétion
f - Structure des polypeptides hypophysaires de l’homme et du chien
g - Effets biologiques des peptides dérivés de la POMC
22
22
23
24
27
28
30
-1-
D - Physiopathologie tumorale des cellules corticotropes
adénohypophysaires
1 - Origine, nature et épidémiologie des tumeurs hypophysaires corticotropes
chez le chien
2 - Hypothèses concernant les facteurs impliquées dans la tumorigenèse de
l’hypophyse
3 - Expression et maturation de la POMC au sein des tumeurs corticotropes :
état d’avancement des connaissances chez l’homme
31
31
31
33
II - Maladie de Cushing chez le chien et approches
diagnostiques
34
A - La maladie de Cushing chez le chien
34
1 – Définition
2 - Modifications physiopathologiques
3 - Conséquences cliniques
a - Symptômes liés à l’hypercortisolémie
b - Symptômes nerveux
B - Approches diagnostiques des maladies de Cushing chez le chien
34
34
34
34
35
36
1 - Les dosages RIA (Radio Immunologic Assay) et IRMA (Immuno Radiologic
Measurement Assay)
36
a - Principe des dosages RIA et IRMA
b - Qualité des dosages et impératifs techniques
c - Limites des techniques immunologiques
2 - Tests fonctionnels
3 - Dosage de l’ACTH
4 - Imagerie médicale, détection et caractérisation des macroadénomes
hypophysaires corticotropes
36
38
39
39
40
40
-2-
III - Dosage plasmatique des précurseurs de l’ACTH lors de
maladie de Cushing chez 36 chiens
42
A - Rationnel et objectifs de l’étude
42
B - Résultats de l’étude préliminaire
44
C - Matériel et méthode
49
1 - Critères d’inclusion
2 - Tests endocriniens
3 - Réalisation et conservation des prélèvements
4 - Dosage de l’ACTH plasmatique
5 – Dosage des précurseurs de l’ACTH
6 - Examen TDM
7 - Analyse des données
D – Résultats
1 - Taille des tumeurs hypophysaires
2 - Concentrations plasmatique des précurseurs de l’ACTH et comparaison
avec la taille des tumeurs hypophysaires
3 - Comparaison des concentrations plasmatique des précurseurs de
l’ACTH des 2 groupes de chiens
4 - Capacités de la trousse de dosage OCTEIA POMC
E – Discussion
1 - Mécanismes potentiellement à l’origine des différences de
concentrations en précurseurs de l’ACTH observées chez les chiens
de notre étude
2 - Validité et originalité de notre étude
3 - Pertinence des résultats de notre étude
a - Pertinence clinique des résultats de notre étude
b - Pertinence du dosage des précurseurs de l’ACTH dans notre
étude
c - Avenir de la trousse de dosage OCTEIA POMC
49
49
49
50
50
51
52
52
52
54
55
56
57
57
57
58
58
59
59
-3-
Conclusion
61
Abréviations couramment utilisées dans le manuscrit
62
Références des produits utilisés pour la réalisation
de l’étude expérimentale
63
Annexe 1 :
64
Copie de l’article : « Plasma pro-opiomelanocortin and pro-ACTH and pituitary adenoma size
in dogs with Cushing’s disease », N. Granger, P. de Fornel, P. Devauchelle, S. Segond, F.
Delisle, D. Rosenberg, accepté pour publication (28/07/04) dans : Journal of Veterinary
Internal Medicine (référence: 04-030).
Références bibliographiques
65
-4-
Table des illustrations
Figures
Figure 1 : Vue sagittale de l’hypophyse et de ses connections avec l’hypothalamus.
10
Figure 2 : Reformatage tomodensitométrique (TDM) en 3 dimensions de la boite crânienne
d’un chien de race Beagle sectionnée suivant le plan sagittal.
11
Figure 3 : Coupe transverse du crâne de chien passant par la selle turcique et vue rapprochée
de l’hypophyse et des méninges.
12
Figure 4 : Coupe tomodensitométrique (TDM) axiale du crâne d’un chien sain de race
Yorkshire, passant par le milieu de la selle turcique (région diencéphalique).
13
Figure 5 : Vue ventrale de la vascularisation artérielle de l’hypophyse après retrait de la dure
mère.
15
Figure 6 : Développement de l’adénohypophyse chez les mammifères.
16
Figure 7 : Modèle schématisant la cascade de spécialisation des cellules hypophysaires au
cours de l’embryogenèse.
18
Figure 8 : Agencement des cellules hypophysaires au sein de la pars distalis de
l’adénohypophyse.
20
Figure 9 : Axe corticotrope normal.
21
Figure 10 : Structure du gène de la POMC.
23
Figure 11 : Représentation schématique des facteurs de transcription interagissant avec le
promoteur POMC du rat en conditions basales.
24
Figure 12 : Régulation de l’expression du gène de la POMC par la CRH : exemple de la voie
de l’AMPc et de son action sur le site AP-1 du gène de la POMC.
26
Figure 13 : Clivage de la POMC dans l’hypophyse de l’homme et produits dérivés du clivage
de la POMC après action des pro-hormones convertases PC1 et PC2.
28
Figure 15 : Séquence des 39 acides aminés de l’ACTH du chien et de l’homme. Un seul
acide aminé diffère en position 37.
29
Figure 16 : Séquence d’acides aminés de la partie amino-terminale de la POMC de l’homme
du chien et du porc.
29
-5-
Figure 17 : Séquence d’acides aminés de la partie β-LPH de la POMC de l’homme du chien
et du porc.
30
Figure 18 : Proposition d’un modèle de tumorigenèse de l’hypophyse.
32
Figure 19 a : Dosage par compétition : RIA (Radio Immunologic Assay).
37
Figure 19 b : Dosage direct : IRMA (Immnuno Radiologic Measurement Assay).
38
Figure 20 : Détection de l’ACTH et de précurseurs de l’ACTH par l’IRMA Cis-Bio.
43
Figure 21 : Coupe TDM de l’encéphale au niveau de la fosse pituitaire d’un chien atteint de
maladie de Cushing ; adénome hypophysaire non visible.
44
Figure 22 : Coupe TDM de l’encéphale au niveau de la fosse pituitaire d’un chien atteint de
maladie de Cushing ; microadénome hypophysaire.
45
Figure 23 : Coupe TDM de l’encéphale au niveau de la fosse pituitaire d’un chien atteint de
maladie de Cushing ; macroadénome hypophysaire.
46
Figure 24 : Relation taille des tumeurs hypophysaires / concentration plasmatique en ACTH
et précurseurs de l’ACTH mesurée à l’aide de la trousse de dosage IRMA Cis Bio.
47
Figure 25 : Détermination d’une concentration seuil d’ACTH et de précurseurs de l’ACTH
mesurés à l’aide de la trousse de dosage IRMA Cis Bio pour la détection des macroadénomes
hypophysaires.
48
Figure 26 : Nuage de points présentant la corrélation entre la taille des tumeurs
hypophysaires et la concentration en précurseurs de l’ACTH dans la série des 36 chiens
étudiés et atteints de maladie de Cushing.
54
Figure 27 : Comparaison des concentrations en POMC et / ou pro-ACTH des deux groupes
de chiens.
55
Figure 28 : Courbe ROC obtenue en calculant la sensibilité et la spécificité de la trousse de
dosage OCTEIA POMC à différentes concentrations en précurseurs de l’ACTH.
56
Figure 29 : Logigrame concernant la caractérisation des maladies de Cushing chez le chien,
incluant le dosage de précurseurs de l’ACTH (POMC et / ou pro-ACTH) par le kit OCTEIA
POMC.
60
Tableaux
Tableau 1 : Validation partielle de la trousse de dosage OCTEIA POMC pour son utilisation
avec du plasma canin.
51
Tableau 2 : Concentrations en précurseurs de l’ACTH (POMC et / ou pro-ACTH) (pmol/L),
hauteur des tumeurs hypophysaires (mm) et rapport Ht / Ac (x 10-2 mm-1) dans les 2 groupes
de chiens étudiés.
53
-6-
Hommage à Harvey William Cushing (1869 – 1939)
Né à Cleveland (Etats-Unis) dans une famille de médecins, Harvey William Cushing
fit ses études à l’université d’Harvard et fut nommé assistant au John Hopkins Hospital de
Baltimore. Il voyagea en Europe (Angleterre, France, Italie…) avant de se consacrer
définitivement à la neurochirurgie dont il fut l’un des pionniers. Sa spécialité lui permit
d’explorer le fonctionnement de l’hypophyse chez le chien d’une manière nouvelle, en notant
les conséquences de sa destruction. Il publia ainsi ses observations sur l’hypophysectomie
expérimentale chez le chien en 1910 dans le « Bulletin of the Johns Hopkins Hospital » (21).
Ses conclusions furent essentielles puisqu’il décrivit les symptômes de l’hypopituitarisme
chez le chien (obésité, hypoplasie des organes génitaux, polyurie, glycosurie, œdèmes cutanés
et hypothrichose, tendance à l’hypothermie). Pendant la guerre de 1914-1918, il vint en
France comme volontaire et fut nommé neurochirurgien en chef de l’armée américaine. En
1932, il décrivit les symptômes observés chez 15 patients atteints par un « basophilisme
hypophysaire »*, description visionnaire d’une maladie qui porte désormais son nom.
* : lié à la présence d’une tumeur hypophysaire corticotrope
-7-
Introduction
Chez le chien, le syndrome de Cushing correspond à un ensemble de symptômes et de
modifications biologiques secondaires à un état d’hypercortisolémie chronique. On appelle
maladie de Cushing les syndromes de Cushing secondaires à une sécrétion autonome
d’hormone adrénocorticotrope (ACTH) par un adénome hypophysaire.
La caractérisation précise des maladies de Cushing chez le chien nécessite de
distinguer les adénomes corticotropes de petite taille pour lesquels seul un traitement
hypocortisolémiant est proposé dans le cas le plus général, des adénomes corticotropes de
grande taille nécessitant l’adjonction, au traitement hypocortisolémiant, d’un traitement local
(radiothérapie en général).
L’expression clinique des adénomes corticotropes de grande taille est peu spécifique
en comparaison aux adénomes corticotropes de petite taille. Des examens d’imagerie
médicale (examen tomodensitométrique : TDM ou Imagerie par Résonance Magnétique
nucléaire : IRM) permettent d’apprécier la taille de ces adénomes ; ils restent cependant de
coût élevé et de faible disponibilité, rendant la distinction entre adénomes de petite taille et
adénome de grande taille occasionnelle en médecine vétérinaire.
Pour accroître la capacité des vétérinaires à dépister des adénomes corticotropes de
grande taille chez le chien, nous avons cherché à développer un nouveau dosage biologique
susceptible de servir d’approche alternative à l’emploi des examens d’imagerie.
-8-
I - Anatomie, développement embryologique, histologie,
physiologie
et
physiopathologie
tumorale
de
l’adénohypophyse chez le chien :
L’adénohypophyse est une structure endocrine complexe qui intervient dans des
fonctions aussi diverses que la reproduction, la croissance, l’équilibre du métabolisme, la
réponse au stress et la lactation, en agissant sur des organes cibles tels que les gonades, le
foie, les glandes thyroïdes, les glandes surrénales ou le tissu mammaire. Les protéines qui
contrôlent ces processus physiologiques sont sécrétées par des cellules hypophysaires
spécialisées qui dérivent toutes d’une même origine ectodermique.
A - Organisation macroscopique de l’adénohypophyse et rapports
topographiques avec les structures adjacentes :
Etymologiquement, « hypophyse » signifie « croissance en dessous ». Son appellation
provient de sa position en dessous de l’encéphale (70).
1 - Organisation macroscopique de l’adénohypophyse :
L’hypophyse du chien adulte présente deux parties : l’adénohypophyse et la
neurohypophyse (Figure 1). L’hypophyse est suspendue sous l’hypothalamus par un
prolongement de l’éminence médiane appelé infundibulum (pars proximalis
neurohypophysis). Le troisième ventricule se prolonge dans l’hypophyse pour donner le
recessus neurohypophysis au sein de l’infundibulum. La majeure partie de la neurohypophyse
est constituée par le lobus nervosus (pars distalis neurohypophysis). L’adénohypophyse
repose ventro-latéralement à la neurohypophyse et comprend trois parties. La pars tuberalis
adenohypophysis s’enroule autour de l’éminence médiane. La partie qui juxtapose la
neurohypophyse est appelée pars intermedia adenohypophysis. Enfin, la partie la plus
volumineuse est la pars distalis adenohypophysis.
La taille de l’hypophyse est très variable à la fois d’une race à l’autre mais aussi d’un
individu à l’autre au sein d’une même race. Chez l’adulte médio-céphale, les longueur,
largeur et hauteur de l’hypophyse proposées sont respectivement de 1 cm, 0,7 cm et 0,5 cm
(70).
-9-
2 - Topographie de l’adénohypophyse :
L’hypophyse du chien se situe dans un recessus de l’os basisphénoïde appelé selle
turcique, située à l’aplomb de la région diencéphalique. Cette fosse est limitée crânialement
par le tuberculum sellae, peu marqué chez le chien, et caudalement par le dorsum sellae
(Figure 2). Elle est tapissée par le feuillet externe de la dure mère, dont le feuillet interne
forme un diaphragme autour de la tige hypophysaire. L’hypophyse est entourée par les sinus
caverneux latéralement, contenant des sinus veineux et les artères carotides internes.
Crânialement à l’hypophyse se trouve le sinus sphénoïde, virtuel chez le chien, comblé par de
l’os spongieux. Caudalement passe le sinus intercaverneux (Figure 3 et 4). Dorsalement,
l’hypophyse est recouverte par le troisième ventricule et les noyaux de l’hypothalamus. Ces
noyaux sont séparés en 2 groupes présents dans 2 régions : une région hypothalamique
rostrale et préoptique contenant les noyaux paraventriculaire et supraoptique et une région
hypothalamique intermédiaire ou tubérale plus dorsale contenant les noyaux du tuber (Figure
1).
- 10 -
Figure 1 :
Vue sagittale de l’hypophyse et de ses connections avec l’hypothalamus (modifiée
d’après (57)).
1 : Os sphénoïde
2 : Tuberculum sellae
3 : Dorsum sellae
4 : Fosse hypophysaire
5 : Pars distalis adénohypophysis
6 : Pars tuberalis adénohypophysis
7 : Zone de transition
8 : Cavité hypophysaire
9 : Pars intermedia adenohypophysis
10 : Prolongement du troisième ventricule (recessus neurohypophysis)
11 : Hypothalamus (éminence médiane)
12 : Pars proximalis neurohypophysis (infundibulum)
13 : Pars distalis neurohypophysis (lobus nervosus)
14 : Corps mamillaire
15 : Chiasma optique
16 : Noyau supraoptique de l’hypothalamus (et trajet supraoptico-hypophysaire)
17 : Noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (et trajet paraventriculo-hypophysaire)
18 : Aire hypothalamique dorsale (noyaux infundibulo-tubériens)
- 11 -
Figure 2 :
Reformatage tomodensitométrique (TDM) en 3 dimensions de la boite crânienne d’un
chien de race Beagle sectionnée suivant le plan sagittal (C.A.V.).
DS : Dorsum sellae
PH : processus hamulaire
ST : selle turcique
TS : Ttuberculum sellae
- 12 -
Figure 3 :
Coupe transverse du crâne de chien passant par la selle turcique et vue rapprochée de
l’hypophyse et des méninges (66).
1 = crâne
2 = encéphale
3 = troisième ventricule
4 = dure mère
5 = membrane arachnoïdienne
6 = espace sous-arachnoïdien
7 = pie mère
8 = diaphragma sellae
9 = citerne basale et artère caudale
communicante
10 = sinus caverneux et artère carotide
interne
11 = hypophyse
12 = faisceau nerveux : nerf ophtalmique,
abducens, trochléaire et oculomoteur
13 = os ptérygoïde
14 = os sphénoïde
15 = sinus sphénoïde
- 13 -
Figure 4 :
Coupe tomodensitométrique (TDM) axiale du crâne d’un chien sain de race Yorkshire,
passant par le milieu de la selle turcique (région diencéphalique) (C.A.V.).
1 : crâne
2 : os ptérygoïde
3 : os sphénoïde
4 : encéphale
5 : ventricule latéral droit
6 : troisième ventricule
7 : selle turcique renfermant l’hypophyse
- 14 -
3 - Relations de l’adénohypophyse avec les structures vasculaires et nerveuses
adjacentes :
Les structures hypophysaires et hypothalamiques sont en étroite relation non
seulement de par leur proximité topographique mais surtout par des connexions vasculaires et
nerveuses propres.
L’hypophyse est située au centre du cercle artériel du cerveau. Par conséquent, chez le
chien, elle reçoit une irrigation artérielle multiple, provenant principalement des artères
carotides internes et des artères communicantes rostrales et caudales. Déjà en 1910, Harvey
Cushing avait montré que l’adénohypophyse et la neurohypophyse ont une vascularisation
différente (21).
Le nombre de vaisseaux irriguant l’hypophyse est très variable (Figure 5). Il semble
que la majeure partie de la vascularisation artérielle adénohypophysaire provienne des artères
carotides internes et communicantes rostrales. L’ensemble de ces vaisseaux forme un réseau
d’artérioles centripètes appelées « artères hypophysaires rostrales ». Elles forment un système
porte hypophysaire desservant principalement la pars distalis et tuberalis de
l’adénohypophyse : deux réseaux de capillaires sinusoïdes sont reliés par les veines portes
hypophysaires :
- le premier, proximal, se trouve dans l’éminence médiane,
- le second, distal, se trouve dans l’adénohypophyse.
La pars intermedia est relativement avasculaire.
La neurohypophyse distale reçoit des artérioles provenant des artères communicantes
caudales.
Le drainage veineux de l’hypophyse se fait par l’intermédiaire de petits vaisseaux qui
se déversent dans les sinus veineux qui entourent l’hypophyse.
Les axones des neurones des noyaux hypothalamiques supraoptique et
paraventriculaire vont se terminer au contact du réseau capillaire de la neurohypophyse. Les
axones des neurones des noyaux du tuber vont se terminer au contact des capillaires du
premier réseau du système porte hypophysaire (Figure 1). La pars intermedia est innervée par
des fibres nerveuses provenant du noyau arqué.
- 15 -
1 : artère carotide interne droite
dans le sinus caverneux (non présenté)
1’ : artère carotide interne gauche
2 : artère intercarotide caudale
3 : artère hypophysaire caudale
4 : artère communicante caudale
5 : artère cérébrale moyenne
6 : artère cérébrale rostrale
7 : artère communicante rostrale
8 : artère intercarotide rostrale
9 : artère hypophysaire rostrale
10 : artère cérébrale caudale
11 : artère cérébelleuse rostrale
12 : artère basilaire
13 : nerf optique
14 : nerf oculomoteur
15 : hypophyse
16 : position du dorsum sellae
(non représenté)
Figure 5 :
Vue ventrale de la vascularisation artérielle de l’hypophyse après retrait de la dure
mère (66).
- 16 -
B - Développement embryologique et organisation histologique de
l’adénohypophyse :
1 - Du développement embryologique de l’adénohypophyse aux cellules
spécialisées :
L’hypophyse possède une origine embryologique double :
-
l’adénohypophyse dérive de la poche de Rathke, structure ectodermique de la
cavité buccale,
la neurohypophyse est d’origine neuro-ectodermique et dérive du diencéphale.
La poche de Rathke est une structure rudimentaire qui s’étend d’abord caudalement
puis forme une poche close détachée des structures buccales. Les cellules de la partie ventrale
de la poche prolifèrent et se différentient pour donner naissance à la partie antérieure de
l’hypophyse. La partie intermédiaire provient du développement d’une partie limitée de la
zone dorsale de la poche (Figure 6) (90).
Figure 6 :
Développement de l’adénohypophyse chez les mammifères (90).
AH : adénohypophyse
DIEN : diencéphale
ECB : ectoderme de la cavité buccale
INF : infundibulum
NH : neurohypophyse
PRd : poche de Rathke définitive
PRr : poche de Rathke rudimentaire
pt : pars tuberalis
ST : selle turcique
IIIv : troisième ventricule
- 17 -
Plusieurs types cellulaires se différencient au cours de l’embryogenèse. Cinq types
cellulaires sont ainsi représentés à la fin du développement de l’adénohypophyse : les cellules
somatotropes, lactotropes, gonadotropes, thyréotropes et les cellules dites à POMC. Chacun
de ces types cellulaires est spécialisé.
Au sein de la pas distalis, sont représentées :
-
-
les cellules à POMC qui sécrètent, à partir d’un précurseur commun nommé proopiomelanocortine ou POMC, soit l’hormone adrénocorticotrope (ACTH) et sont
alors qualifiées de cellules corticotropes, soit l’hormone mélano-stimulante (αMSH ou alpha Melano Stimulating Hormone) et sont alors qualifiées de cellules
mélanotropes,
les cellules thyréotropes qui sécrètent la thyréostimuline (TSH ou Thyroïd
Stimulating Hormone),
les cellules gonadotropes qui sécrètent l’hormone folliculo-stimulante (FSH ou
Follicul Stimulating Hormone) et l’hormone lutéinisante (LH ou Luteinizing
Hormone),
les cellules somatotropes qui sécrètent l’hormone de croissance (GH ou Growth
Hormone),
les cellules lactotropes qui sécrètent la prolactine (PRL).
Au sein de la pars intermedia, il a été démontré la présence de cellules à POMC, la
majorité d’entre elles (cellules dites A ) ayant le caractère mélanotrope, alors que les autres
cellules (cellules dites B) expriment le caractère corticotrope (43).
La différentiation des types cellulaires au cours de l’embryogenèse de l’hypophyse,
met en jeux des homéogènes codant pour des facteurs de transcription dont la cascade
d’expression au cours du temps permet d’aboutir à une spécialisation poussée des cellules de
l’adénohypophyse (Figure 7) (57):
1 - Le facteur de transcription le plus précocement exprimé est Rpx (Rathke’s pouch
homeobox). Ptx1 est un facteur de transcription qui lui est synergique et que l’on retrouve en
quantité élevée spécifiquement dans les cellules à POMC à caractère corticotrope. Ptx1
participe au maintien de l’expression du gène de la POMC dans ces cellules corticotropes.
2 - Chez la souris, en l’absence du facteur de transcription Lhx3, on constate que
l’hypophyse ne se développe pas et ne contient alors que des cellules à POMC corticotropes
(95). Lhx3 permet la prolifération de la poche de Rathke. Lhx4 est un facteur de transcription
de la même famille que Lhx3 et permet d’engager les cellules hypophysaires sur une voie plus
poussée de spécialisation.
3 - L’action d’un autre facteur de transcription, Prop-1, dans cette voie de
spécialisation aboutit au développement des cellules gonadotropes.
4 - Prop-1 stimule le facteur Pit-1 qui est essentiel au développement et à la survie des
cellules somatotropes, lactotropes et thyréotropes.
- 18 -
Rpx
POMC
Ptx 1
Lhx3
Lhx4
Prop-1
FSH
LH
Pit-1
TSH
PRL
GH
Figure 7 :
Modèle schématisant la cascade de spécialisation des cellules hypophysaires au cours
de l’embryogenèse. Les cercles représentent les cellules hypophysaires au cours de leur
développement. Les facteurs de transcription qui interviennent dans ce cheminement sont
présentés à côté des flèches (Rpx, Ptx, Lhx3, Lhx4, Pit-1). Chaque type cellulaire spécialisé
est représenté par une étoile (57).
POMC : pro-opiomélanocortine
FSH : hormone folliculo-stimulante
(Follicul Stimulating Hormone)
LH : hormone lutéinisante (Luteinizing
Hormone)
TSH : thyréostimuline (Thyroïd
Stimulating Hormone)
GH : hormone de croissance (Growth
Hormone)
PRL : prolactine
- 19 -
2 - Organisation histologique de l’adénohypophyse :
Les cinq types cellulaires, présentés au cours du paragraphe précédent, forment au sein
de l’adénohypophyse un parenchyme de cellules épithélioïdes agencées en petits groupes et
reliées entre elles par des capillaires sinusoïdes (Figure 8) (26;70). Les techniques classiques
d’histologie permettent de séparer les cellules hypophysaires en trois populations : les cellules
chromophobes ne fixant pas les colorants, les cellules chromophiles acidophiles (fixant les
colorants acides) et les cellules chromophiles basophiles (fixant les colorants basiques et
l’acide périodique ou PAS).
Dans la pars distalis de l’adénohypophyse, il existe trois types cellulaires (26;70) :
-
-
les cellules acidophiles, plus larges que les cellules chromophobes, possèdent un
cytoplasme acidophile granuleux ; elles regroupent les cellules somatotropes et
lactotropes,
les cellules basophiles, plus larges que les cellules acidophiles, possèdent un
cytoplasme riche en granules composés de glycoprotéines (fixation du PAS) ; elles
regroupent les cellules à POMC (cellules corticotropes majoritairement et cellules
mélanotropes), les cellules thyréotropes, folliculotropes et lutéotropes (2),
les cellules chromophobes sans activité sécrétrice.
La pars intermedia comporte majoritairement des cellules chromophobes mais aussi
des cellules basophiles à POMC (corticotropes et mélanotropes). La sécrétion mélanotrope
domine.
La pars tuberalis ne comporte que des cellules chromophobes et n’a pas d’activité
sécrétrice connue.
- 20 -
Figure 8 :
Agencement des cellules hypophysaires au sein de la pars distalis de
l’adénohypophyse (26;70),(2). Sur une coloration au PAS orangé G-hématoxyline
schématisée ici, les cellules acidophiles : A (40 % des cellules) sont colorées en jaune, les
cellules basophiles : B (10 % des cellules) sont colorées en orange et les cellules
chromophobes :
C
(50
%
des
cellules)
ne
sont
pas
colorées.
- 21 -
C - Physiologie des cellules corticotropes adénohypophysaires :
1 - L’axe corticotrope :
Les deux premiers acteurs de l’axe corticotrope sont l’hypothalamus et
l’adénohypophyse. Au sein de l’adénohypophyse, l’axe corticotrope fait intervenir à la fois la
pars distalis et la pars intermedia. En raison des particularités anatomiques propres à ces 2
structures, leur régulation est distincte. Les cellules corticotropes de la pars distalis sont
contrôlées par la CRH sécrétée dans le système vasculaire porte hypophysaire de la pars
distalis par les neurones des noyaux hypothalamiques infundibulo-tubériens. Les cellules de
la pars intermedia qui est peu vascularisée, reçoivent un contrôle dopaminergique et
sérotoninergique par des fibres nerveuses (81).
En conséquence, deux axes de régulation peuvent être distingués sous le terme
générique d’axe corticotrope chez le chien :
- pour la pars distalis de l’adénohypophyse : la CRH stimule la synthèse de
l’ACTH. L’ACTH stimule la synthèse de cortisol par les glandes surrénales. Le
cortisol exerce un rétrocontrôle négatif sur l’ACTH et la CRH. L’ACTH exerce un
rétrocontrôle négatif court sur la CRH (Figure 9) (34;51;84).
- pour la pars intermedia de l’adénohypophyse : la sécrétion d’ACTH et d’α-MSH
est régulée essentiellement via une inhibition dopaminergique et une stimulation βadrénergique (100).
Figure 9 :
Axe corticotrope normal (flèche épaisse : rétrocontrôle négatifs) (84).
PD : pars distalis, PI : pars intermedia.
- 22 -
2 - Un précurseur commun aux hormones corticotropes et mélanotropes : la proopiomélanocortine (POMC) :
a - Historique :
Le concept de pro-hormone a été initié grâce à la découverte de deux protéines dans
les années soixante : la pro-insuline, précurseur de l’insuline découverte par Steiner à Chicago
et les lipoprotéines bêta et gamma, précurseurs de la β-MSH découvertes par Li et Chrétien à
San Francisco (96),(62). C’est en 1967 que Chrétien et Li remarquent que la β-LPH et la γLPH contiennent un peptide déjà connu : la β-MSH. En 1971, Yalow et Berson extraient de
l’ACTH active à partir d’un précurseur de haut poids moléculaire sur une tumeur thymique
humaine responsable d’un syndrome de sécrétion ectopique d’ACTH (110). La parenté entre
ACTH et LPH est alors constatée à l’analyse de leur structure primaire. En 1975, la recherche
d’opiacés hypophysaires permet d’identifier la β-End comme extrémité C-Terminale de la βLPH (18). Enfin, en 1977, on montre qu’une même glycoprotéine de 31 kDa est reconnue à la
fois par des anticorps anti-ACTH et anti-β-LPH : la pro-opiomélanocortine (POMC) (64;88).
b - Organisation du gène de la POMC :
Le gène de la POMC chez l’homme est situé sur le chromosome 2 en p23 et sa
longueur est de 7665 paires de bases (79). Il comporte trois exons séparés par deux introns
(Figure 10). L’exon 1 ne comporte que des séquences non traduites. La traduction de l’exon 2
et 3 génère la formation de la pré-POMC comprenant 267 acides aminés. L’exon 2 comporte
des séquences non traduites et contient ensuite la séquence d’initiation de la traduction
(ATG). Il code pour le peptide signal (26 acides aminés) d’entrée dans le réticulum
endoplasmique ainsi que pour les premiers acides aminés du fragment N-Terminal (NT) (85).
L’exon 3 code pour la presque totalité de la POMC, c’est-à-dire le reste du fragment NT, le
peptide de jonction (JP), l’ACTH et la β-LPH. Le clivage du peptide signal de la pré-POMC
libère la POMC constituée de 241 acides aminés. L’organisation du gène de la POMC est très
conservée dans les différentes espèces et notamment entre l’homme et le chien (72).
- 23 -
Figure 10 :
Structure du gène de la POMC (76). Les régions transduites sont en couleur : vert =
peptide signal d’entrée dans le réticulum endoplasmique, bleu = POMC dont une région rouge
correspondant à l’ACTH ; bp : paire de bases.
c – Expression basale du gène de la POMC :
Le promoteur de la POMC implique 706 paires de base en amont du gène de la POMC
et les 63 premières paires de base de ce gène. Des expériences de transgenèse à l’aide de ce
promoteur minimal on montré que ce transgène est suffisant pour conférer la spécificité
cellulaire et tissulaire de l’expression du gène de la POMC. Il existe au sein du promoteur
POMC trois domaines d’importance (domaine proximal, central et distal) qui régulent
l’expression basale et induite du gène de la POMC (Figure 11). L’activité basale du gène de la
POMC résulte de la contribution de nombreux facteurs de transcription spécifiques ou non des
cellules corticotropes et liés au promoteur POMC. L’activité basale corticotrope spécifique du
gène de la POMC semble impliquer essentiellement la région comprenant les domaines
central et distal où sont situés trois sites essentiels liant les facteurs de transcription suivant :
NeuroD1, Tpit et Pitx1 (Figure 11).
- 24 -
NeuroD1
POMC
Tpit Pitx1
Gène de la POMC
Paires
- 706
0 63
de bases
Domaines : Distal
Central
Proximal
Figure 11 :
Représentation schématique des facteurs de transcription interagissant avec le
promoteur POMC du rat en conditions basales.
d - Régulation de l’expression du gène de la POMC :
La CRH induit l’expression du gène codant pour la POMC dans les cellules
corticotropes et les cellules mélanotropes. L’action de la CRH dans les cellules corticotropes
et mélanotropes de l’adénohypophyse implique un récepteur membranaire à 7 domaines
transmembranaires, le CRHR1. La liaison de la CRH à son récepteur enclenche une cascade
d’événements métaboliques, centrée sur la voie de l’adénosine monophosphate cyclique ou
AMPc et aboutissant à des synthèses protéiques. Ainsi, la liaison de la CRH à son récepteur
active l’adénylate cyclase conduisant à une augmentation de la concentration
intracytoplasmique en AMPc. L’AMPc se lie à la sous unité régulatrice de la protéine kinase
dépendante de l’AMPc ou PKA ce qui induit la dissociation de la sous unité catalytique de la
PKA qui migre dans le noyau de la cellule pour phosphoryler ses protéines cibles (Figure 12).
L’activation de la PKA par la CRH induit également une entrée du calcium exogène via
l’ouverture des canaux calcium dépendants du voltage, promouvant une libération de l’ACTH
contenue dans les vésicules de sécrétion localisées à la membrane plasmatique (60;61).
Plusieurs séquences impliquées dans la réponse à la CRH ont été identifiés au sein du
gène promoteur POMC et constituent la cible des protéines phosphorylées activées par la voie
de l’AMPc. Ces éléments sont :
-
-
le site AP-1, localisé dans l’exon 1 du gène de la POMC, liant le complexe AP-1,
composé par l’hétérodimère c-Fos / c-Jun. La voie de l’AMPc est responsable, avec la
participation d’une voie Ca2+ / calmoduline kinase, de la stimulation de l’expression de cFos via l’activation du facteur de transcription CREB qui agit sur un élément de réponse à
l’AMPc situé sur le promoteur POMC. L’hétérodimère c-Fos / c-Jun fixé au site AP-1
permet la synthèse de la POMC (Figure 12).
un site contenu dans le domaine central de la séquence promotrice POMC et liant une
protéine nommée PCRH-REB1 (POMC CRH Responsive Element Binding protein 1).
le site Nuclear Receptor Response Element (NurRE) localisé dans le domaine distal de la
séquence promotrice POMC et le site NGFI-B-Responsive Element nommé NBRE
localisé dans le domaine proximal de la séquence promotrice POMC.
- 25 -
Les récepteurs Nur* participent à la régulation de l’axe corticotrope en agissant sur les
trois niveaux de cet axe. Lors d’un stress, l’expression de récepteurs Nur est induite dans les
neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus produisant la CRH et pourrait jouer
un rôle dans la régulation de l’expression de la CRH (73;80). Dans les cellules corticotropes
de l’adénohypophyse, l’expression du gène de la POMC par la CRH implique le récepteur
nucléaire Nur77 qui se fixe sur le site NurRE (69;107). Enfin, dans les glandes surrénales,
l’ACTH induit l’expression de Nur77 qui active l’expression d’une enzyme clef de la
stéroïdogenèse, en augmentant ainsi la synthèse des glucocorticoïdes (22;108).
Certaines cytokines telle que la Leukemia Inhibitory Factor (LIF) ont des fonctions
biologiques variées et notamment sur le système endocrine. Le LIF et la CRH agissent en
synergie sur l’expression du gène de la POMC et sur la sécrétion de l’ACTH. Plusieurs
régions du promoteur POMC soutiennent cette synergie. C’est le cas des sites AP-1 et du site
de fixation du facteur de transcription PCRH-REB1.
Les glucocorticoïdes interviennent dans la régulation du gène de la POMC en
réprimant son expression (Figure 9). Les glucocorticoïdes, liposolubles, traversent par
diffusion la membrane plasmatique des cellules. Dans le cytoplasme le récepteur des
glucocorticoïdes est activé par les glucocorticoïdes puis migre dans le noyau où il se lie à des
éléments de réponse spécifique. Un site du domaine proximal du gène promoteur POMC
apparaît impliqué dans la répression de l’expression du gène de la POMC par les
glucocorticoïdes. La liaison du récepteur des glucocorticoïdes à ce site, en association avec
d’autres facteurs de transcription non identifiés, est nécessaire pour réguler les effets des
glucocorticoïdes. Ce site est appelé nGRE (negative glucocorticoid response element) (17).
Un second site de répression des effets de la CRH par les glucocorticoïdes est contenu dans le
site nGRE : il s’agit du site NBRE, cible des récepteurs de la famille Nur, précédemment
présenté. Ce site fixant à la fois des récepteurs de la famille Nur et des récepteurs aux
glucocorticoïdes est le siège d’une compétition qui module l’activité du gène de la POMC,
notamment en présence de glucocorticoïdes. Cette compétition est doublée d’un effet
transcriptionnel des glucocorticoïdes sur la voie NUR. La déxamethasone diminue d’environ
50% l’expression du récepteur nucléaire orphelin Nur77 (83).
* : La famille Nur (Nuclear Receptor) est une famille de récepteurs nucléaires orphelins ainsi
nommés car leur ligand n’a pas été identifié.
- 26 -
CRH
CRHR1
membrane plasmatique
AC
↑AMPc
cytoplasme
C
PKA
R
R
voie Ca2+ /
calmoduline kinase
C
C
P
CREB
CRE
c-Fos
noyau
c-Fos
c-Jun
POMC
AP-1
Figure 12 :
Régulation de l’expression du gène de la POMC par la CRH : exemple de la voie de
l’AMPc et de son action sur le site AP-1 du gène de la POMC.
CRH : corticotropin releasing hormone
CRHR1 : récepteur transmembranaire de la CRH
AC : adényl cyclase
PKA : protéine kinase dépendante de l’AMPc dont la sous unité : C est Catalytique
CREB : facteur de transcription
CRE : site de fixation de CREB dans le gène promoteur POMC
c-Fos et c-Jun : dimères protéiques intranucléaires
AP-1 : site de fixation de c-Fos et c-Jun dans le gène promoteur POMC
- 27 -
e - Maturation post traductionnelle de la POMC et sécrétion :
Lorsque la POMC a atteint la lumière du réticulum endoplasmique, elle suit la voie
intracellulaire de sécrétion des protéines à travers l’appareil de Golgi jusqu’aux granules de
sécrétions dont les produits terminaux sont libérés par exocytose (52). La POMC subit au
cours de ce trajet une succession de clivages protéolytiques et de transformations chimiques
(glycosylation, phosphorylation, amidation…) conduisant aux différents peptides
biologiquement actifs sécrétés par la cellule (figure 13) (85):
-
l’extrémité NT,
le peptide de jonction (JP),
l’ACTH,
la β-LPH.
Dans la séquence primaire de la POMC, tous les peptides biologiquement actifs sont
encadrés de paires d’acides aminés basiques (lysine et / ou arginine) qui sont les sites de
clivage.
Les enzymes responsables de ces clivages ont été récemment identifiées (4;7;106;113).
Il s’agit d’endoprotéases appelées pro-hormones convertases PC1 (aussi appelée PC3) et PC2
(77). Leur expression tissulaire est très particulière puisqu’elles sont retrouvées exclusivement
dans les tissus neuro-endocrines et nerveux. Leur répartition cellulaire et leur spécificité de
clivage expliquent la maturation différentielle de la POMC dans l’hypophyse (figure 13) :
-
dans les cellules de la pars distalis et les cellules B de la pars intermedia, seule la
PC1 est présente et son action limitée sur la POMC permet la production de
l’ACTH et de la β-LPH (13).
dans les cellules A de la pars intermedia, l’action conjuguée de PC1 et PC2
conduit à une protéolyse plus poussée avec libération d’α-MSH (acides aminés 1 à
13 de l’ACTH) et de β-End essentiellement (103).
- 28 -
PC1
PC1
PC2
PC2
Figure 13 :
Clivage de la POMC dans l’hypophyse de l’homme et produits dérivés du clivage de
la POMC après action des pro-hormones convertases PC1 et PC2 (105).
f - Structure des polypeptides hypophysaires de l’homme et du chien :
Les séquences des peptides hypophysaires issus de la maturation de la POMC chez
l’homme et chez le chien sont très proches (Figure 15, 16 et 17) (72).
L’ACTH est composée de 39 acides aminés. Son poids moléculaire est faible : 4500
Da (34). Elle diffère de l’ACTH humaine par l’acide aminé situé en position 37 (Leucine chez
l’homme et Valine chez le chien). L’ACTH humaine peut être divisée en deux parties : une
partie N-terminale (acides aminés 1 à 24), siège de l’activité biologique de la molécule, et une
partie C-terminale (acides aminés 25 à 39), siège de l’activité immunologique de la molécule
(11;49).
La séquence de la β-LPH peut être divisée en trois parties. La partie adjacente à
l’ACTH est très variable. La β-MSH et la β-End ont des séquences homologues.
- 29 -
Séquence
Homme
Chien
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro Val
........................................................................................................................................
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
36 37 38 39
Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
............................................................................................................. Val ............
Figure 15 :
Séquence des 39 acides aminés de l’ACTH du chien et de l’homme. Un seul acide
aminé diffère en position 37 (72).
Acides aminés
Homme
Chien
LESSQCQDLTTESNLLECTRACKPDLSAETPMFPGNGDEQPLTENPRKYVMGHFR
------------------------------A---------------------------VL-----------A--------------------------------
Homme
Chien
WDRFGRRNSSSSGSSGAGQKREDVSAGEDCGPLPEGGPEPRSDGAKPGPREGKR
---------------------------A--QKREE---E-A-----GGRA-----A-----G---G----GEL---LQ-------
Figure 16 :
Séquence d’acides aminés de la partie amino-terminale de la POMC de l’homme et du
chien. Chaque acide aminé est représenté par une lettre. Pour la séquence du chien, seuls les
acides aminés différents des acides aminés de l’homme sont représentés (72).
- 30 -
Acides aminés
Homme
Chien
KRELTGQRLREGDGPDGPAATAQGPGDLENSLLV
AAERRDEGPYR
-------A--------EPAL-----E------AGVAALA------YC—VAEAG------------D------K
Homme
Chien
MEMFRWGSPRRDRRYGGPMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAYK
----------------------------------------S----R------------------------V--------N
Figure 17 :
Séquence d’acides aminés de la partie β-LPH de la POMC de l’homme et du chien.
Chaque acide aminé est représenté par une lettre. Pour la séquence du chien, seuls les acides
aminés différents des acides aminés de l’homme sont représentés (72).
g - Effets biologiques des peptides dérivés de la POMC :
L’ACTH stimule la stéroïdogenèse au sein des zones fasciculée et réticulée du cortex
surrénnalien et participe à la régulation de la zone glomérulée. Elle induit de façon aiguë la
sécrétion de cortisol, d’androgènes et d’aldostérone. La sécrétion d’ACTH est pulsatile au
long du rythme circadien. Il existe chez l’homme un pic de sécrétion d’ACTH avant le réveil,
suivi par une baisse progressive au cours de la journée. Chez le chien, on n’observe pas ce
rythme et la sécrétion d’ACTH est pulsatile tout au long de la journée (34;53;58;78). La
sécrétion d’ACTH est augmentée en réponse à la prise de nourriture (34). Tout type de stress
entraîne par ailleurs une augmentation de la sécrétion d’ACTH (douleur, traumatisme,
hypoxie, hypoglycémie aiguë, chirurgie ou situations pathologiques).
L’ACTH stimule la conversion du cholestérol en pregnénolone et augmente
l’expression de plusieurs enzymes clé de la stéroïdogenèse. L’ACTH est de plus nécessaire à
la bonne trophicité des zones fasciculée et réticulée de la glande surrénale. La stimulation
chronique par l’ACTH provoque une hyperplasie avec augmentation du poids de la glande
(87).
Les autres peptides issus du clivage de la POMC dans les cellules corticotropes et
mélanotropes (figure 13) (le fragment NT, le peptide JP, l’α-MSH, le CLIP, la β-MSH, la γLPH, la β-LPH et la β-End), ont pour la plus part des rôles physiologiques moins clairement
établis. La séquence Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly est responsable de l’activité mélano
stimulante des α-MSH et β-MSH sur les cellules pigmentaires (34). La β-End circulante aurait
un effet analgésique. Elle pourrait aussi participer à la régulation d’autres hormones
hypophysaires et avoir un rôle dans le contrôle nerveux de la respiration chez l’homme (35).
Des concentrations élevées en fragment NT ont été retrouvées en réponse à un stress
hypoglycémique sans que les conséquences de ces élévations aient été caractérisées.
- 31 -
D
Physiopathologie tumorale
adénohypophysaires :
des
cellules
corticotropes
1 - Origine, nature et épidémiologie des tumeurs hypophysaires corticotropes
chez le chien :
Les lésions hypophysaires responsables de maladie de Cushing peuvent être soit des
tumeurs : adénome ou adénocarcinome, soit beaucoup plus rarement des hyperplasies des
cellules corticotropes (16;75;81). Les tumeurs hypophysaires corticotropes malignes ont par
ailleurs un faible pouvoir métastatique. Comme évoqué précédemment, l’ACTH est sécrétée
par les cellules corticotropes du lobe antérieur de l’hypophyse et les cellules B du lobe
intermédiaire de l‘hypophyse. Les tumeurs hypophysaires du chien à l’origine d’un
hypercorticisme peuvent donc provenir à la fois de la pars distalis et de la pars intermedia
de l’hypophyse (81). Les adénomes de la pars distalis sont les plus fréquents. Dans environ
30% des cas, la tumeur provient de la pars intermedia (16). Le type cellulaire majoritairement
rencontré dans les tumeurs hypophysaires est discuté. Anciennement, Harvey Cushing avait
qualifié de « basophilisme hypophysaire » la maladie de Cushing, cette dénomination étant
confirmée par les données de la littérature jusque dans les années soixante. Dans une étude sur
26 chiens de 1967, 77% des chiens avaient une tumeur hypophysaire composée de cellules
chromophobes (16).
Les tumeurs hypophysaires corticotropes chez le chien peuvent être de petite
taille (microscopiques) : on parle de microadénome corticotrope (35). Environ 50 % des
adénomes hypophysaires corticotropes sont inférieurs à 3 millimètres de diamètre (10). Dans
10 à 50 % des cas selon les publications l’adénome hypophysaire est de grande taille et l’on
parle de macroadénome (47;55;75;89).
2 - Hypothèses concernant les facteurs impliquées dans la tumorigenèse de
l’hypophyse :
Deux hypothèses concernant la tumorigenèse de l’adénohypophyse sont classiquement
opposées (1;112) :
1- une altération moléculaire intrinsèque à la cellule corticotrope est envisageable
(8;12;39). Le caractère monoclonal de la plus part des adénomes hypophysaires a conduit à
rechercher une mutation génétique à l’origine du phénotype tumoral sans réel succès. Ce type
d’anomalie a pourtant été retrouvée dans les adénomes hypophysaires sécrétant l’hormone de
croissance (GH), ou une mutation de la protéine Gs d’un récepteur membranaire conduire à
une stimulation permanente de la voie de l’AMPc (8).
2- une altération du contrôle neuro-hormonal des cellules corticotropes, telle une
stimulation excessive des cellules par différents facteurs extrinsèques pourrait être
envisageable. L’hypophyse contient en effet plusieurs facteurs de croissance (1). Une étude
sur une lignée de cellules tumorales murines corticotropes (AtT20) a démontrée que ces
cellules prolifèrent lors d’une stimulation excessive par l’insulin-like growth factor-I,
l’epidermal growth factor et le basic fibroblast growth factor (102). Par contre, une
stimulation persistante par la CRH ne semble pas être une cause du développement des
tumeurs hypophysaires corticotropes (68). Les glucocorticoïdes régulent la prolifération de
nombreux tissus dont les cellules hypophysaires. La perte de la sensibilité aux
- 32 -
glucocorticoïdes par les cellules hypophysaires pourrait être un événement important dans la
formation des tumeurs hypophysaires corticotropes (59). Cette théorie est discutée chez
l’homme (1). Enfin, en ce qui concerne les tumeurs de la pars intermedia, une diminution de
l’inhibition exercée par la dopamine sur le lobe intermédiaire de l’hypophyse pourrait être à
l’origine de la tumorigenèse (1).
Les deux phénomènes sont probablement étroitement liés (65). Ainsi, il est
vraisemblable que la majorité des adénomes hypophysaires soit le résultat d’une
transformation cellulaire initiale puis d’une multiplication sous l’influence de facteurs
hormonaux et de facteurs de croissance (figure 18).
Figure 18 :
Proposition d’un modèle de tumorigenèse de l’hypophyse (1).
- 33 -
3 - Expression et maturation de la POMC au sein des tumeurs corticotropes : état
d’avancement des connaissances chez l’homme :
Chez l’homme, la transcription du gène de la POMC est similaire dans les cellules
tumorales hypophysaires et dans les cellules hypophysaires normales (24;25). Lors de tumeur
neuro-endocrine non hypophysaire (sécrétion ectopique d’ACTH par un carcinome
bronchique par exemple) l’expression du gène de la POMC peut être altérée : on retrouve
alors dans ces cellules des ARN messagers de taille anormale : 1450 nucléotides et 800
nucléotides (24).
Les produits dérivés du clivage de la POMC (NT, JP, ACTH (1-39), β-LPH et γ-LPH,
β-end) sont retrouvés de manière identiques dans les cellules corticotropes saines et tumorales
de l’hypophyse humaine (6). Cependant, la maturation de la POMC dans les cellules
tumorales est parfois altérée, soit à l’occasion d’un déficit en pro-convertases (PC1 et PC2),
soit au contraire par l’action inappropriée de ces enzymes. Lors d’adenome corticotrope
silencieux chez l’homme, un déficit en hormone PC1 a ainsi été mis en évidence (77). Chez
l’homme, des tumeurs pulmonaires agressives et peu différentiées (carcinomes pulmonaires)
sécrètent préférentiellement de la POMC intacte, à cause d’un déficit en hormone PC1 et PC2
(20;86;91). A l’inverse, les tumeurs pulmonaires à malignité réduite (carcinoïdes), très
différenciées, induisent un clivage poussé de la POMC, libérant des peptides de très petite
taille (CLIP par exemple) (103). Chez l’homme, ces anomalies de maturation sont aussi
décrites ponctuellement lors de macroadénome corticotrope (86).
- 34 -
II - Maladie de Cushing chez le chien et approches diagnostiques :
A - La maladie de Cushing chez le chien :
1 - Définition :
L’hypercorticisme spontané ou syndrome de Cushing regroupe l’ensemble des
manifestations cliniques et para-cliniques liées à un état d’hypercortisolémie chronique (34).
Le terme « maladie de Cushing » désigne une des formes du syndrome de Cushing,
dans laquelle l’hypercortisolémie est secondaire à une sécrétion autonome d’ACTH par une
tumeur hypophysaire. Elle représente 80 à 85% des chiens atteints de syndrome de Cushing
(32;34).
2 - Modifications physiopathologiques :
La sécrétion d’ACTH est pulsatile chez le chien (58;78;82). Lors de maladie de
Cushing chez le chien, on observe une augmentation de la fréquence et de l’amplitude des
pics de sécrétion d’ACTH (78). Le rétrocontrôle négatif sur l’hypophyse lié aux
glucocorticoïdes est en partie inefficace. La sécrétion excessive d’ACTH aboutit à une
hyperplasie bilatérale des glandes surrénales.
3 - Conséquences cliniques :
Les symptômes exprimés lors de maladie de Cushing sont liés d’une part à l’état
d’hypercortisolémie chronique (effet systémique que l’on peut également qualifier de
syndrome paranéoplasique eutopique), et d’autre part à la présence de la tumeur hypophysaire
lorsque celle-ci est de grande taille (conséquences locales par effet de masse).
a - Symptômes liès à l’hypercortisolémie :
Microadénomes et macroadénomes hypophysaires ont sur le plan systémique les
mêmes conséquences (déviation du métabolisme vers la glycogénogénèse, la lipolyse et le
catabolisme protéique, actions anti-inflammatoires et immunomodératrices sur différents
organes). Les microadénomes et les macroadénomes hypophysaires ne peuvent donc pas être
distinguées sur la base de leur expression clinique. Comme pour tout syndrome de Cushing,
on rencontre (34) :
-
une polyuro-polydipsie,
une polyphagie,
une modification de la silhouette de l’animal,
une faiblesse musculaire,
des manifestations cutanées (peau fine, alopécie tronculaire bilatérale symétrique
non prurigineuse…),
des troubles de la reproduction.
- 35 -
b - Symptômes nerveux :
L’hypophyse du chien est imparfaitement scellée par la dure-mère dans son
compartiment osseux (Figures 1, 2, 3, 4). En raison de cette particularité anatomique, les
macroadénomes hypophysaires peuvent entraîner une compression de l’hypothalamus, du
thalamus et envahir le troisième ventricule (lésions d’hémorragie, de nécrose ou protrusion),
conduisant ainsi à l’installation d’une hypertension intracrânienne secondaire.
Les symptômes nerveux qui peuvent parfois être rencontrés sont de 2 types : focaux
(déficits visuels, anomalies des nerfs crâniens, tête penchée…) ou généraux et liés à
l’hypertension intracrânienne (altération de la vigilance, convulsions…) (27;55;75;89).
Les premiers symptômes nerveux, correspondant aux lésions focales, c'est-à-dire aux
lésions des noyaux hypothalamiques et thalamiques, sont souvent frustres et d’apparition très
lente. Ces signes sont plus facilement détectés par le propriétaire de l’animal au contact
quotidien de celui-ci et peuvent passer inaperçus dans un premier temps pour le vétérinaire.
On rencontre :
-
-
des troubles du comportement (épisodes de désorientation, perte d’intérêt pour
l’environnement, troubles du sommeil), pouvant évoluer vers un état de stupeur
(atteinte de la portion caudale de l’hypothalamus en interrelation avec la formation
réticulée),
des modifications de l’appétit (anorexie lors d’atteinte du noyau dorso-latéral de
l’hypothalamus ou polyphagie lors d’atteinte du noyau ventro-médial de
l’hypothalamus) ou de la prise de boisson (diabète insipide central lors d’atteinte de la
partie rostrale de l’hypothalamus). Ainsi, une anorexie chez un chien malade et non
traité médicalement ou une polyuro-polydispsie chez un chien traité médicalement et
dont l’hypercorticisme est équilibré devront être des symptômes à considérer comme
évocateurs de la présence d’une tumeur de grande taille.
D’autres symptômes nerveux plus tardifs peuvent être évidents pour le clinicien en
fonction de l’étendue de l’atteinte thalamique (rostrale et / ou caudale) et de l’atteinte
éventuelle des parties crâniales du tronc cérébral. De par la fonction d’intégration et de relais
des voies sensitives et motrices du thalamus, on observe parfois des troubles locomoteurs
(ataxie symétrique ou asymétrique, parésie ou hémiparésie). Des anomalies des nerfs crâniens
peuvent aussi être observées lors de compression du tronc cérébral crânial (strabisme : nerfs
occulomoteur (III), trochléaire (IV) ou abducens (VI), anisocorie : noyaux parasympathiques
et sympathiques du contrôle des pupilles), ou plus rarement lors de compression du chiasma
optique (troubles de la vision) (55). Enfin, lors de compression majeure de l’hypothalamus,
les conséquences d’un dysfonctionnement du système nerveux autonome peuvent être
notables : défaut de thermorégulation, troubles du rythme cardiaque.
Les symptômes nerveux sont présents au moment du diagnostic d’hypercorticisme
dans moins de 20 % des cas. Ils apparaissent entre un à deux mois après le diagnostic
d’hypercorticisme dans 20 à 30 % des cas et plus de six mois après le diagnostic
d’hypercorticisme dans 40 à 60 % des cas (34). Il est indispensable de noter que l’apparition
de symptômes nerveux n’est pas directement reliée à la taille de l’adénome hypophysaire
(55;75;98). Sur une série de 21 chiens atteints de maladie de Cushing et ne présentant pas de
symptômes nerveux, 11 avaient une tumeur hypophysaire dont la taille était comprise entre 3
mm et 13 mm, et visible par un examen d’imagerie par résonance magnétique nucléaire
(IRM) (10). Sur 5 chiens de cette série présentant un examen IRM normal au moment du
- 36 -
diagnostic, 2 ont développé une tumeur visible à l’IRM (6 et 7 mm de diamètre) un an plus
tard, sans pour autant développer des signes cliniques associés (9). A l’inverse, dans une autre
série, parmi 15 chiens atteints de maladie de Cushing et présentant des symptômes nerveux, 1
chien de race Teckel avait une tumeur de 5 mm de diamètre (55). Ces différentes observations
conduisent à penser que la taille de la tumeur hypophysaire n’est pas un indicateur fiable
quant à l’apparition de symptômes nerveux. D’autres facteurs tels que la taille de la boîte
crânienne et donc le format du chien, la vitesse de croissance de la tumeur ou l’œdème qui lui
est associé sont probablement impliqués dans l’apparition des symptômes nerveux (55). Ces
données justifient l’utilisation d’indices relatifs (rapport de la taille réelle de la tumeur à la
taille de la boîte crânienne par exemple) pour évaluer la relation entre la taille des tumeurs et
la gravité des symptômes nerveux (98).
B - Approches diagnostiques des maladies de Cushing chez le chien :
Les premières étapes du diagnostic des maladies de Cushing consistent à mettre en
évidence l’état d’hypercortisolémie chronique puis à en démontrer l’origine hypophysaire.
Pour cela, des techniques basées sur l’immunologie et la biochimie, permettent de mesurer les
concentrations des hormones dans le sang. L’exploration biologique des maladies de Cushing
chez le chien se base sur la mesure de la concentration basale du cortisol et sur la
l’exploration fonctionnelle de l’axe corticotrope (mesure du cortisol lors de tests de freination
ou de stimulation).
Des techniques RIA (Radio Immunologic Assay) et ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) ont d’abord permis de mesurer les concentrations plasmatiques en
cortisol (40;50). D’autres trousses RIA puis IRMA (Immuno Radiologic Measurement Assay)
mesurent les concentrations plasmatiques en ACTH ou précurseurs de l’ACTH. Yallow et
Berson en 1964 ont les premiers validé le dosage de l’ACTH plasmatique chez l’homme par
RIA (5;111). Feldman et son équipe ont ensuite exploité cet outil chez le chien pour
distinguer les chiens présentant une tumeur surrénalienne sécrétante des chiens atteints
d’hypercorticisme d’origine hypophysaire (32;33). Quelques kit de dosage de l’ACTH par
RIA ont ensuite été complètement validés chez le chien à partir de 1985 (45;71;74;82;92).
La dernière étape de la démarche diagnostique des maladies de Cushing chez le chien
nécessite en principe le recours à des techniques d’imagerie (Tomodensitométrie et Imagerie
par Résonance Magnétique) pour caractériser les lésions hypophysaires.
- 37 -
1 - Les dosages RIA (Radio Immunologic Assay) et IRMA (Immuno Radiologic
Measurement Assay) :
a - Principe des dosages RIA et IRMA :
Les principes des dosages RIA et IRMA vont être présentés à l’aide de l’exemple de
l’ACTH.
Ces techniques consistent à utiliser des anticorps monoclonaux spécifiques des
hormones. Trois critères principaux permettent de décrire les principes d’un immunodosage :
-
le type de dosage : direct ou par compétition
le système traceur
les supports utilisés pour les réactions.
Le principe du dosage par RIA de l’ACTH repose sur la compétition entre l’ACTH marquée à
l’Iode 125 (traceur radioactif) et l’ACTH contenue dans les échantillons à doser vis-à-vis d’un
nombre donné et limité d’anticorps anti-ACTH (Figure 19 a) (93). A la fin de la période
d’incubation, la quantité d’ACTH marquée liée à l’anticorps est inversement proportionnelle à
la quantité d’ACTH non marquée présente dans l’échantillon. Les anticorps peuvent être en
solution ou fixés sur un support solide. Ce type de dosage est adapté aux hormones qui ne
possèdent qu’un seul site de fixation de l’anticorps. Citons l’exemple du cortisol, souvent
dosé par RIA.
Les premiers dosages RIA de l’ACTH étaient soumis à plusieurs contraintes. D’une
part la rareté et le coût des antisera et d’autre part les faibles concentrations en ACTH
présentes chez des individus normaux. Ces limites nécessitaient le recours à des techniques
d’extraction et de concentration avant le dosage par RIA, rendant les manipulations longues et
coûteuses. Le développement des techniques IRMA a nettement amélioré les capacités de
dosage de l’ACTH (37).
Le dosage par IRMA, grâce à l’utilisation de deux anticorps dirigés contre des sites
différents et assez éloignés sur la molécule d’ACTH, permettent de reconnaître plus
spécifiquement l’ACTH (Figure 19 b) (93). Cette technique est appelée « sandwich ». Le
premier anticorps, placé sur une phase solide, fixe la totalité de l’hormone à doser. Le
deuxième anticorps, couplé à l’Iode 125 ou à une molécule responsable d’une réaction
colorimétrique (chimie froide), marque les molécules hormonales fixées au premier anticorps.
La quantité d’hormone est proportionnelle à la quantité de traceur radioactif mesurée.
L’IRMA est un dosage direct.
- 38 -
Figure 19 a :
Dosage par compétition : RIA (Radio Immunologic Assay) :
-
les hormones à doser (en noir) sont mélangées à des hormones marquées (en gris et
associées à un cercle)
les hormones sont en excès par rapport aux anticorps (Y), ce qui entraîne une
compétition entre hormones à doser et hormones marquées pour la fixation aux
anticorps
on mesure la quantité d’hormones marquées fixées aux anticorps qui est
inversement proportionnelle à la quantité d’hormones à doser.
Figure 19 b :
Dosage direct : IRMA (Immnuno Radiologic Measurement Assay)
-
les premiers anticorps (Y) sont en excès par rapport aux hormones à doser (en
noir), permettant une fixation directe et totale
les seconds anticorps marqués (crochets associés à un cercle) également en excès,
se fixent sur un autre épitope de l’hormone, réalisant un « sandwich »
on mesure la quantité d’anticorps marqués et fixés, qui est proportionnelle à la
quantité d’hormones à doser.
- 39 -
b - Qualité des dosages et impératifs techniques :
Afin de garantir la qualité des résultats, toutes les techniques de dosage utilisées à des
fins diagnostiques font l’objet d’un enregistrement à l’Agence Du Médicament. Les
principaux critères systématiquement évalués sont :
- la sensibilité ou limite de détection, définie comme étant la plus petite
concentration détectable différente de zéro avec une probabilité de 95%,
- la spécificité,
- la précision (évaluation des variations lors de la répétition des dosages dans des
conditions identiques, d’un jour à l’autre, d’un manipulateur à l’autre, d’un
échantillon à l’autre…),
- l’exactitude : évaluation de la concordance des dosages réalisés sur différentes
dilutions d’un échantillon ; pour les immunodosages, évaluation de l’effet du
sérum ou du plasma du patient sur le dosage.
Malgré ces précautions, des variations importantes peuvent être observées lors du
dosage d’un même échantillon d’un laboratoire à l’autre ou d’une technique à l’autre. Afin de
guider le praticien, le laboratoire associe à chaque résultat les valeurs usuelles du test.
L’ACTH est une hormone très fragile. Elle est rapidement détruite par les enzymes
plasmatiques : sa demi-vie plasmatique est de 2,5 minutes (19;109). Sa demi-vie à
température ordinaire est très courte (de l’ordre de 15 à 25 minutes) (5). La prise en charge
des prélèvements doit donc avoir lieu entre 15 et 90 minutes après le recueil du sang à
température ambiante (45). L’ACTH étant plus stable pour des températures basses, le sang
peut être centrifugé à 4°C. Les tubes utilisés doivent contenir un anticoagulant : l’acide
éthyléne-diamine-tetra-acétique (EDTA). L’héparine interfère avec le dosage en réduisant la
fixation du traceur radioactif (Iode 125) sur les anticorps utilisés dans les kits de dosage (28).
Enfin, le plasma doit être congelé après centrifugation et conservé dans des tubes plastiques
car l’ACTH est adsorbée par les parois de verre (45). Les prélèvements doivent être transmis
au laboratoire en respectant la chaîne du froid. Prélèvements et dosages doivent donc être
réalisés par des équipes entraînées.
c - Limites des techniques immunologiques :
La spécificité des anticorps est parfois insuffisante et il peut exister des réactions
croisées. Il existe pour certaines hormones des formes particulières peu actives parfois
abondantes que certains dosages identifient comme la forme active. Les valeurs du dosage
sont alors surestimées.
Les techniques « sandwich » peuvent sous-estimer de fortes concentrations
d’hormones : dans ce cas, après saturation des premiers anticorps fixés au support, des
molécules hormonales libres persistent dans le milieu réactionnel. Le deuxième anticorps, au
lieu de se fixer exclusivement aux molécules hormonales portées par les premiers anticorps,
se fixe sur des molécules libres, et est éliminé après rinçage. L’activité mesurée n’est alors pas
maximale. A l’extrême, tous les seconds anticorps se fixent séparément à des molécules
hormonales libres et aucune activité n’est mesurée. Ce phénomène est appelé « effet
crochet ». Le dosage de plusieurs dilutions de l’échantillon permet d’identifier cet artefact.
Des phénomènes d’interférence peuvent parfois apparaître lorsque des précurseurs de
la molécule hormonale à doser sont présents dans le milieu. Ils se fixent au premier anticorps,
mais pas au second.
- 40 -
2 - Tests fonctionnels :
Les tests fonctionnels (stimulation de la cortisolémie par l’ACTH ou freination par la
déxaméthasone) confirment l’état d’hypercortisolémie dans la majorité des cas.
Une interprétation attentive des ces tests peut donner au clinicien quelques indices de
la présence d’un macroadénome hypophysaire, mais ces approches restent peu spécifiques et
indirectes. Elles n’ont de valeur qu’à l’échelle d’une population.
Dans une étude comparant la cortisolémie après administration d’ACTH synthétique
chez 43 chiens atteints de maladie de Cushing (23 adénomes de plus de 1 cm et 20 adénomes
inférieurs à 1 cm), il existait une moindre élévation de la cortisolémie chez les chiens
présentant un macroadénome hypophysaire (55).
Environ 25% des tumeurs hypophysaires ne sont pas sensibles aux glucocorticoïdes, et
ne répondent pas au test de freination par la déxaméthasone à dose forte (34). La raison de
cette résistance aux glucocorticoïdes n’est pas connue. Les tumeurs de grande taille de la pars
intermedia seraient moins sensibles aux glucocorticoïdes.
Les résultas de trois études portant sur 8, 13 et 13 chiens présentant tous un
macroadénome hypophysaire corticotrope, donnent des résultats discordants : 82%, 18% et
67% des chiens, respectivement, ne présentaient pas de freination par la déxaméthasone à
dose forte (27;75;89). Deux publications plus récentes ont démontrées une corrélation nette
entre la résistance aux glucocorticoïdes et la taille de l’hypophyse de chiens atteints de
maladie de Cushing (14;59).
3 - Dosage de l’ACTH :
Le dosage de l’ACTH plasmatique constitue un outil direct de caractérisation du
fonctionnement de l’adénohypophyse (34). Ce dosage permet de déterminer l’origine de
l’hypercorticisme dans 75% des cas (34). Barthez et al. ont par ailleurs montré que l’étude
échographique des glandes surrénales constituait un examen aussi fiable dans le diagnostic
des maladies de Cushing chez le chien (3).
Plusieurs études montrent que la concentration plasmatique basale en ACTH est
corrélée à la taille de l’hypophyse (10;55). Cependant, il existe un recouvrement important
entre les valeurs d’ACTH des chiens présentant un microadénome hypophysaire et celles des
chiens présentant un macroadénome hypophysaire. Bertoy et al. comparant 10 chiens atteints
de maladie de Cushing causée par un microadénome à 11 chiens atteints de maladie de
Cushing causée par un macroadénome ont par exemple montré que les valeurs d’ACTH
s’échelonnent pour le premier groupe de 44 à 195 pg/mL et pour le second groupe de 31 à 298
pg/mL (10).
- 41 -
4
Imagerie
médicale,
détection
des macroadénomes hypophysaires corticotropes :
et
caractérisation
Comme rappelé dans ce manuscrit, les macroadénomes corticotropes sont
difficilement discernables de tumeurs hypophysaires de petite taille car leur expression
clinique peut-être similaire. Par ailleurs, il n’existe pas de test biologique permettant de
suspecter directement à l’échelle d’un individu la présence d’un macroadénome hypophysaire
corticotrope. La détection précoce des macroadénomes et leur caractérisation repose donc sur
l’emploi d’examens d’imagerie : examen Tomodensitométrique (TDM) ou Imagerie par
Résonance Magnétique (IRM).
En médecine humaine, la sensibilité du scanner dans la détection des microadénomes
hypophysaires est de 16 à 76% (29). La sensibilité de l’IRM dans cette même indication est de
71 à 100% (29). Cet examen offre un meilleur contraste entre les tissus, ne présente pas
d’artéfacts liés à l’os, et n’expose pas le manipulateur et le patient à un rayonnement ionisant
X. L’IRM renseigne en plus sur les phénomènes d’œdème, d’hémorragie et de nécrose
associés à la présence de la tumeur hypophysaire. Il constitue donc un examen indispensable
au bilan d’extension local de la tumeur dont le traitement chez l’homme est désormais
chirurgical (104).
En médecine vétérinaire, les mesures TDM de l’hypophyse normale montrent que cet
examen à une précision de l’ordre de 4 mm (les mesures de l’hypophyse de 8 chiens sains de
race Beagle donnent les résultats suivants : hauteur : 3,7 mm à 4.8 mm ; largeur : 4,9 mm à
6,3 mm ; longueur : 4 mm à 6 mm (67). Plus disponible et moins coûteux que l’IRM, le
scanner reste le principal outil du diagnostic des tumeurs hypophysaires (30). Dans les cas de
macroadénomes hypophysaires, il permet de visualiser la tumeur et les lésions qu’elle
engendre : compression des structures environnantes, dilatation des ventricules cérébraux
(63). Cependant, 50% des chiens atteints de maladie de Cushing ont un examen TDM de
l’encéphale normal (microadénome sans extension suprasellaire) (34).
Des protocoles TDM permettant une meilleure visualisation des adénomes
hypophysaires de petite taille ont été décrits (101). L’hypophyse, par sa position intermédiaire
vis-à-vis de la barrière hémato-méningée, est facilement soulignée par les produits de
contraste iodés qui diffusent librement du compartiment vasculaire au secteur interstitiel. En
effet, l’acquisition précoce (quelques secondes) d’images TDM après injection d’un produit
de contraste iodé, permet de visualiser séparément la neurohypophyse et l’adénohypophyse.
La diffusion du produit de contraste dans les artères carotides internes des sinus caverneux
permet un marquage précoce de la neurohypophyse (hyperdense) directement irriguée par les
artères communicantes caudales. La diffusion du produit dans le système porte hypophysaire,
plus tardive, permet d’observer ensuite l’adénohypophyse (la neurohypophyse apparaît alors
hypodense). Ainsi, la présence d’un microadénome peut être suspectée par un soulèvement de
la neurohypophyse visible sur des images TDM obtenues quelques secondes après injection
du produit de contraste iodé.
Enfin, l’IRM en médecine vétérinaire permet de mettre en évidence des tumeurs
hypophysaires à partir de 3 mm et offre une meilleure délimitation de la tumeur par rapport
aux tissus périphériques (10;27;54). Elle reste cependant d’emploi relativement restreint de
par la faible disponibilité de l’examen.
- 42 -
III - Dosage plasmatique des précurseurs de l’ACTH lors de
maladie de Cushing chez 36 chiens :
A - Rationnel et objectifs de l’étude :
La détection précoce des adénomes hypophysaires de grande taille revêt une
importance particulière en médecine vétérinaire car le traitement est orienté radicalement
différemment en fonction de la taille de la tumeur hypophysaire. Lors de macroadénome
hypophysaire, l’évolution spontannéeest défavorable à court terme. L’utilisation d’un
traitement par radiothérapie améliore considérablement la moyenne de survie qui devient
alors égale à celle de chiens traités médicalement pour des maladies de Cushing liées à un
microadénome (23). La découverte d’un adénome de petite taille ne rend pas nécessaire le
recours à la radiothérapie, la croissance lente de ces tumeurs préservant les animaux atteints
de l’apparition de symptômes nerveux.
A l’heure actuelle, la distinction entre microadénome et macroadénome hypophysaire
s’effectue sur des critères cliniques (signes nerveux évoquant une atteinte diencéphalique) ou
grâce à l’emploi d’examens d’imagerie médicale : examen TDM ou IRM. Ce dépistage est
donc imparfait puisque :
-
la détection clinique est tardive et inconstante,
la détection par imagerie médicale est coûteuse, peu disponible, et nécessite une
anesthésie générale.
Nous avons donc cherché à développer un nouvel outil diagnostic susceptible de
détecter précocement la présence d’une tumeur hypophysaire de grande taille chez des chiens
atteints de maladie de Cushing.
De nombreux exemples d’altérations de processus de synthèses hormonales ont été
décrits dans le cadre d’affections touchant des tissus endocrines, et notamment lors de
tumeurs caractérisées par un faible niveau de différentiation. Chez l’homme, plusieurs auteurs
ont suggéré que la production de POMC (ou d’autres précurseurs de l’ACTH de haut poids
moléculaire tel que la pro-ACTH) par des tumeurs hypophysaires corticotropes de grande
taille, pouvait être augmentée secondairement à une perte de leur capacité à cliver la POMC
(36;38;42;86). Chez le chien, la possibilité d’une moindre maturation des précurseurs de
l’ACTH par les cellules de tumeurs hypophysaires corticotropes de grande taille a été
supposée suite à la détection de grande quantité d’ACTH dans le plasma de chiens atteints par
ces macroadénomes hypophysaires corticotropes. En effet, il a été proposé que les
concentrations élevées obtenues soient le reflet d’une sécrétion anormale d’ACTH et de
précurseurs de l’ACTH, les techniques RIA peu spécifiques donnant lieu à des réactions
croisées entre ces hormones (14;59).
A partir de cette hypothèse, nous avons utilisé, dans une étude préliminaire réalisée sur
35 chiens atteints de maladie de Cushing, une trousse de dosage de l’ACTH plasmatique
utilisée chez l’homme : l’IRMA Cis-Bio (41). Il est probable en effet que cette trousse de
dosage soit capable de détecter l’ACTH mais aussi un certain nombre de précurseurs de
l’ACTH, en comparaison des tumeurs hypophysaires corticotropes de petite taille (Figure 20).
- 43 -
Cette première approche encourageante mais cependant indirecte a ensuite pu être
complétée grâce à la commercialisation d’une nouvelle trousse de dosage humaine : OCTEIA
POMC a, basée sur l’utilisation d’anticorps reconnaissant les parties γ-MSH et ACTH de la
POMC, et permettant d’accéder directement à la concentration en POMC et pro-ACTH.
Notre étude préliminaire s’est donc articulée avec une étude prospective dont l’objectif
fut la validation de la trousse de dosage humaine (OCTEIA POMC) de la POMC et des
précurseurs de l’ACTH plasmatiques chez le chien et l’évaluation des capacités de cette
trousse de dosage dans la détection et l’exclusion des tumeurs hypophysaires corticotropes de
grande taille chez le chien.
POMC
Précurseur-ACTH
Ac 2
N-terminale Précurseur-ACTH
Ac 2
ACTH
Ac 2
Iode 125
Ac 1
Support
Figure 20 :
Détection de l’ACTH et de précurseurs de l’ACTH par l’IRMA Cis-Bio. Les peptides
(ACTH et certains précurseurs de l’ACTH) peuvent fixer 2 anticorps, alors que des
précurseurs de haut poids moléculaire (POMC par exemple) ne sont pas accessibles aux 2
anticorps.
- 44 -
B - Résultats de l’étude préliminaire :
Trente cinq chiens atteints de maladie de Cushing ont été inclus dans cette étude
préliminaire. La caractérisation des tumeurs hypophysaires des 35 chiens par un rapport entre
la hauteur de la tumeur hypophysaire et l’aire de l’encéphale sur une même coupe TDM (Ht /
Ac) a permis de distinguer 2 lots d’animaux : les chiens présentant une tumeur hypophysaire
non visible ou de petite taille (Ht / Ac < 0,4 x 10-2 mm-1) (Figure 21 et 22) et les chiens
présentant une tumeur hypophysaire de grande taille (Ht / Ac ≥ 0,4 x 10-2 mm-1) (Figure 23).
Figure 21 :
Coupe TDM de l’encéphale au niveau de la fosse pituitaire d’un chien atteint de
maladie de Cushing ; adénome hypophysaire non visible (C.A.V.).
- 45 -
Figure 22 :
Coupe TDM de l’encéphale au niveau de la fosse pituitaire d’un chien atteint de
maladie de Cushing ; microadénome hypophysaire (C.A.V.).
- 46 -
Figure 23 :
Coupe TDM de l’encéphale au niveau de la fosse pituitaire d’un chien atteint de
maladie de Cushing ; macroadénome hypophysaire (C.A.V.).
- 47 -
La moyenne des valeurs d’ACTH et de précurseurs de l’ACTH s’est avérée
statistiquement supérieure pour les animaux présentant des tumeurs hypophysaires de grande
taille. De plus, nous avons identifié une corrélation entre la taille de la tumeur hypophysaire et
la concentration en ACTH et précurseurs de l’ACTH (Figure 24). Un seuil diagnostique (85
pg/mL), susceptible de permettre la distinction entre tumeur de grande taille (Ht / Ac ≥ 0,4 x
10-2 mm-1) et tumeur de petite taille (Ht / Ac < 0,4 x 10-2 mm-1) a été proposé (Figure 25), les
sensibilité et spécificité de ce seuil étant respectivement de 69 % et 86 %.
Le caractère extrêmement encourageant de ces résultats a conduit à envisager la
validation chez le chien d’un dosage de la POMC et l’évaluation prospective de ses
caractéristiques lors de l’exploration des maladies de Cushing dans cette espèce.
2,50
2,00
Rapport
Ht/Ac
(10-2 mm-1)
1,50
1,00
0,50
0,00
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
Log 10 de la concentration en ACTH et précurseurs de l’ACTH
Figure 24 :
Relation entre la taille des tumeurs hypophysaires et la concentration plasmatique en
ACTH et précurseurs de l’ACTH évaluée à l’aide de la trousse de dosage IRMA Cis Bio (41).
- 48 -
3,50
3,00
2,50
2,00
85 pg/mL
1,50
1,00
0,50
Lot A
(Ht/Ac < 0.4 x 10-2),
22 chiens
Lot B
(Ht/Ac ≥ 0.4 x 10-2),
13 chiens
0,00
Figure 25 :
Détermination d’un seuil de détection des macroadénomes : 19 animaux du lot A ont
une concentration en ACTH et précurseurs de l’ACTH inférieure à 85 pg/mL, soit une
spécificité de 86 % ; 9 animaux du lot B ont une concentration en ACTH et précurseurs de
l’ACTH supérieure à 85 pg/mL, soit une sensibilité de 64 %. L’axe des abscisses représente le
logarithme en base 10 de la concentration en ACTH et précurseurs de l’ACTH (41).
- 49 -
C - Matériel et méthode :
1 - Critères d’inclusion :
Les prélèvements sanguins ont été collectés au cours de la période allant de mars 2001
à juillet 2003, à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort. Les critères d’inclusions des animaux
dans l’étude ont été les suivants :
1) des commémoratifs et un examen clinique en faveur d’un hypercorticisme,
2) au moins un test fonctionnel endocrinien (test de stimulation par l’ACTH, n = 35,
ou test de freination par la déxaméthasone à dose faible, n = 6) confirmant le
diagnostic d’hypercorticisme,
3) un taux basal d’ACTH plasmatique normal à augmenté (concentration médiane :
60 pg/mL, valeurs extrêmes : 10 à 109 pg/mL, n = 36) et un examen TDM des
glandes surrénales suggérant un hypercorticisme d’origine hypophysaire (symétrie
des glandes surrénales, généralement hypertrophiées),
4) un examen TDM de l’hypophyse permettant, dans le cas où un adénome était
visible, de caractériser sa taille,
5) aucun traitement au minimum 15 jours avant la réalisation de l’examen TDM et du
prélèvement sanguin.
Trente six chiens ont répondus aux critères d’inclusion, l’âge des chiens allant de 5 à
17 ans (médiane : 10 ans) au moment du diagnostic. Le groupe de chiens comprenait 19
femelles (11 de ces chiennes étaient stérilisées) et 17 mâles (5 de ces mâles étaient castrés).
2 - Tests endocriniens :
Les mesures des concentrations en cortisol plasmatique au cours des tests fonctionnels
ont été réalisées à l’aide d’une trousse de dosage précédemment validée chez le chien b (40).
Les tests de stimulation par l’ACTH (mesure de la concentration en cortisol plasmatique avant
et une heure et demi aprés l’injection IM de 0,25 mg de tétracosactide (Synacthène injectable®
c
)/25 kg de poids vif) et de freination par la déxaméthasone à dose faible (mesure de la
concentration en cortisol plasmatique avant, 4 heures et 8 heures après l’injection IV de 0,01
mg de déxaméthasone phosphate (Soludécadron® d)/ kg de poids vif) ont été réalisés comme
précédemment décrit (31-33;44;46). L’hypercorticisme a été confirmé par la détection de
valeurs de cortisol anormalement élevées après l’injection de tétracosacitde (≥ 500 nmol/L) et
/ ou une freination anormale 8 heures après l’injection de déxaméthasone (≥ 40 nmol/L).
3 - Réalisation et conservation des prélèvements :
Tous les prélèvements sanguins ont été réalisés à la veine jugulaire. Le sang a été
recueilli dans des tubes EDTA réfrigérés puis centrifugés à froid, 4°C, 500 x g, 8 minutes puis
immédiatement placé dans des tubes en plastique et congelés à -20°C jusqu’au moment du
dosage.
- 50 -
4 - Dosage de l’ACTH plasmatique :
Les concentrations plasmatiques basales en ACTH ont été déterminées à l’aide de la
trousse de dosage humaine Immulite 2000 e, récemment validée chez le chien (92). Les
valeurs de référence que nous avons déterminées avec cette trousse s’échelonnent de 6 à 58
pg/mL. Les valeurs d’ACTH supérieures à 10 pg/mL sont considérées compatibles avec un
hypercorticisme d’origine hypophysaire (dans notre laboratoire, les valeurs de la
concentration en ACTH de 35 chiens, différents des chiens de la série présentée dans cette
thèse, s’échelonnaient de 10 à 129 pg/mL ; le diagnostic de maladie de Cushing chez ces
chiens a été établi à partir des résultats de tests hormonaux, d’un examen d’imagerie et d’une
réponse positive au traitement par l’Op’-DDD). Les valeurs d’ACTH inférieures à 5 pg/mL
sont considérées compatibles avec un hypercorticisme d’origine surrénalien (dans notre
laboratoire, les valeurs de la concentration en ACTH de 5 chiens atteints d’hypercorticisme
d’origine surrénalien étaient toutes inférieures à 5 pg/mL ; le diagnostic d’hypercorticisme
d’origine surrénalien chez ces chiens a été établi à partir des résultats de tests hormonaux,
d’un examen d’imagerie, d’une exérèse chirurgicale et de l’analyse histologique de la tumeur
surrénalienne).
5 - Dosage des précurseurs de l’ACTH :
Les concentrations plasmatiques basales en POMC et / ou pro-ACTH ont été
déterminées à l’aide de la trousse de dosage humaine OCTEIA POMC, selon les indications
du fournisseur.
Les données de la littérature et du fournisseur concernant la spécificité de cette trousse
indiquent une réactivité croisée de 100 % entre la POMC et la pro-ACTH. Une réactivité
croisée minime entre la POMC et des peptides plus petits, l’ACTH et l’α-MSH, a été
démontrée : -3,6 % et - 2,2 % respectivement. Seuls des échantillons contenant plus de 1000
pmol/L d’ACTH et d’α-MSH pourraient minorer les valeurs de POMC obtenues avec la
trousse OCTEIA POMC (48;97).
Nous avons validé l’utilisation de la trousse de dosage OCTEIA POMC pour du
plasma canin, selon les procédures associées aux méthodes bioanalytiques (94). Pour cela, du
plasma vierge a été collecté sur 6 chiens sains, 4 heures après l’administration de 1 mg/kg de
déxaméthasone phosphate IV. Ces échantillons ont permis de déterminer l’effet matrice du
plasma canin, la sensibilité, l’exactitude et la linéarité de la trousse de dosage. Une courbe de
calibration a été réalisée avec des échantillons de POMC humaine diluée dans du sérum canin
(7 échantillons dans la gamme des valeurs attendues) et comparée à la courbe de calibration
réalisée à partir de ces mêmes échantillons dilués dans de l’eau distillée. Le pourcentage de
recouvrement des 2 courbes est de 94 %. La sensibilité, définie comme la concentration
moyenne plus 2 écarts types de 5 réplicats de plasma canin vierge, est de 15 pmol/L.
L’exactitude est de 95 % (tableau 1) et la linéarité de 90 % (tableau 1). Les coefficients de
variation intra assay, obtenus à 3 concentrations différentes, sont de 7,5 %, 8 ,8 %, 11,7 %
(tableau 1). Les coefficients de variation inter assay, obtenus à la plus petite limite de
quantification et à 2 autres concentrations, sont de 20,0 %, 14,4 %, 15,0 % (tableau 1).
La courbe standard de la trousse OCTEIA POMC utilisée dans notre série de chiens a
été établie à l’aide de 6 concentrations connues de POMC et d’un zéro. Les absorbances (à
450 nm) des standards de cette courbe s’échelonnent de 0,065 à 1,235, ce qui correspond à
des concentrations en POMC allant de la limite de quantification (prise à 15 pmol/L) à 1051
pmol/L. Tous les échantillons des chiens inclus dans l’étude ont été analysés lors d’un même
essai, le même jour.
- 51 -
Précision
Intra assay*
44 ± 3
156 ± 14
363 ± 43
Linéarité
CV** (n = 5)
7.5%
8.8%
11.7%
Inter assay* CV** (n = 5)
14 ± 3
20.0%
26 ± 4
14.4%
233 ± 35
15.0%
Echantillons
Mesuré
Attendu
A
A/2
A/4
A/8
A/16
Exactitude
393
171
106
40
25
393
197
98
49
25
Echantillons
Mesuré (n = 5)
Attendu
Echantillon 1
Echantillon 2
Echantillon 3
51 ± 8
107 ± 9
236 ± 9
48
105
263
Mesuré
(%)
100
87
108
82
100
/
Attendu
Mesuré
(%)
94
102
90
/
Attendu
Tableau 1 :
Validation partielle de la trousse de dosage OCTEIA POMC pour son utilisation avec
du plasma canin. Les coefficients intra assay ont été calculés à partir de 3 concentrations non
connues mesurées 5 fois chacune au cours d’un même protocole. Les coefficients inter assay
ont été calculés à partir de la plus petite limite de quantification et de 2 concentrations non
connues mesurées 5 fois chacune 5 jours différents. La linéarité a été obtenue en diluant un
échantillon dans de l’eau distillée. L’exactitude a été calculée à partir de 3 concentrations
connues mesurées 5 fois.
* : les résultats sont exprimés en moyenne ± écart type (pmol/L).
** : CV = coefficient de variation.
6 - Examen TDM :
L’anesthésie a été obtenue, après un jeun de 12 heures, par induction au propofol
(Rapinovet® f) à la dose de 6,5 mg/kg IV, et a été maintenue par inhalation d’halothane
(Fluothane® g).
Les images TDM de l’hypophyse ont été obtenues à partir d’un scanner de 4ème
génération (Hispeed CT/e Plus Scanner h), avant et après injection IV d’un bolus de 2 mL/kg
de produit de contraste iodé (Télébrix® 35 i).
Les chiens ont été placés en décubitus sternal. Des plans de coupe transverses de
l’encéphale, de 2 mm d’épaisseur, perpendiculaires au plan du palais osseux et allant du
processus clinoïde rostral au dorsum sellae ont été réalisées. La fenêtre TDM utilisée était de
120 kV et 90,0 mA. Dans les cas où l’hypophyse était très élargie, des coupes
supplémentaires ont été réalisées crânialement ou caudalement pour délimiter complètement
la tumeur.
- 52 -
Pour chaque chien, la plus grande hauteur de la tumeur hypophysaire a été retenue.
L’image utilisée pour mesurer la hauteur de la tumeur hypophysaire a aussi servie à calculer
l’aire du cerveau du chien à l’aide du logiciel eFilm j. De manière à prendre en compte le
format du chien, un rapport entre la hauteur de la tumeur et l’aire du cerveau (Ht / Ac) a été
calculé comme précédemment décrit (59). Lorsque la tumeur hypophysaire n’était pas visible
sur les images TDM (n = 7), la valeur basale de la taille de la tumeur a été fixée à 1 mm.
7 - Analyse des données :
Les données ont été analysées à l’aide du logiciel SAS/STAT® k. La distribution des
données n’étant pas normale, les résultats sont présentés sous forme de médianes, valeurs
extrêmes et nombre de sujets. Les valeurs obtenues dans les différents groupes ont été
comparées par le test de Mann-Whitney. Un coefficient de corrélation de Spearman ( r ) a été
utilisé pour étudier la corrélation entre les variables. Les résultats ont été considérés
significatifs pour des valeurs de P inférieures à 0,05. Un seuil pour la concentration en POMC
et / ou pro-ACTH a été déterminé à partir d’une courbe « receiver operating characteristic »
(ROC).
D - Résultats :
1 - Taille des tumeurs hypophysaires :
Les hauteurs des tumeurs hypophysaires des 36 chiens s’échelonnent de 1 mm à 22
mm (médiane : 4,5 mm) et l’aire du cerveau de 907 mm2 à 2042 mm2 (médiane : 1134 mm2).
Le rapport Ht / Ac s’échelonne de 0,08 x 10-2 mm-1 à 2,09 x 10-2 mm-1 (médiane : 0,32 x 10-2
mm-1).
Deux groupes ont été identifiés selon le rapport Ht / Ac (tableau 2). Le premier groupe
(I) est constitué de 22 chiens présentant des tumeurs hypophysaires de petite taille avec des
rapports Ht / Ac allant de 0,08 x 10-2 mm-1 à 0,38 x 10-2 mm-1 (médiane : 0,20 x 10-2 mm-1).
Le deuxième groupe (II) est constitué de 14 chiens présentant des tumeurs hypophysaires de
grande taille avec des rapports Ht / Ac allant de 0,40 x 10-2 mm-1 à 2,09 x 10-2 mm-1 (médiane
: 0,74 x 10-2 mm-1).
- 53 -
Concentrations en
précurseurs de
l’ACTH (pmol/L)
Hauteur des tumeurs
hypophysaires (mm)
Rapport Ht / Ac
(x 10-2 mm-1)
Groupe I
15
(15 to 108)
2
(1 to 6)
0.20
(0.08 to 0.38)
Groupe II
85
(15 to 1350)
10
(5 to 22)
0.74
(0.40 to 2.09)
P value (comparaison
groupe I et groupe II)
P < 0.0001
P < 0.0001
P < 0.0001
Tableau 2 :
Concentrations en précurseurs de l’ACTH (POMC et / ou pro-ACTH) (pmol/L),
hauteur des tumeurs hypophysaires (mm) et rapport Ht / Ac (x 10-2 mm-1) dans les 2 groupes
de chiens. Groupe I : 22 chiens avec un rapport Ht / Ac < 0,4 x 10-2 mm-1. Groupe II : 14
chiens avec un rapport Ht / Ac ≥ 0,4 x 10-2 mm-1. Les résultats sont exprimés en médianes.
Les valeurs entre parenthèses correspondent aux valeurs extrêmes.
- 54 -
2 – Concentrations plasmatique des précurseurs de l’ACTH et comparaison avec
la taille des tumeurs hypophysaires :
Les concentrations plasmatiques basales de POMC et / ou de pro-ACTH pour les 36
chiens s’échelonnent de 15 à 1350 pmol/L (médiane : 17 pmol/l) (tableau 2). Les
concentrations en POMC et / ou pro-ACTH sont significativement corrélées à la taille des
tumeurs hypophysaires (rapport Ht / Ac) (r = 0,70; n = 36; P < 0,0001) (figure 26).
Figure 26 :
Nuage de points présentant la corrélation entre la taille des tumeurs hypophysaires
(mesurée par la rapport Ht / Ac sur l’axe des ordonnées) et la concentration en précurseurs de
l’ACTH (mesurée par le logarithme de la concentration en POMC et / ou pro-ACTH) dans la
série des 36 chiens étudiés et atteints de maladie de Cushing. Le coefficient de corrélation de
Spearman était de : r = 0,70. La flèche indique les chiens pour lesquels les concentrations en
POMC et / ou pro-ACTH étaient inférieures au seuil de sensibilité de la trousse de dosage
OCTEIA POMC.
- 55 -
3 – Comparaison des concentrations plasmatique des précurseurs de l’ACTH des
2 groupes de chiens :
Les concentrations en POMC et / ou pro-ACTH des chiens du groupe II étaient
significativement supérieures (P < 0,0001) à celles des chiens du groupe I (médiane : 85
pmol/L, valeurs extrêmes : 15–1350 pmol/L pour le groupe 2 et médiane : 15 pmol/L, valeurs
extrêmes : 15–108 pmol/L pour le groupe 1) (figure 27).
Figure 27 :
Comparaison des concentrations en POMC et / ou pro-ACTH des deux groupes de
chiens (les chiens du groupe I sont représentés à gauche par les ronds noirs et les chiens du
groupe II sont représentés à droite par les ronds vides). Les tirets horizontaux représentent les
médianes des concentrations des 2 groupes. Un seuil (ligne pointillée) permettant la détection
des tumeurs ayant un rapport Ht / Ac ≥ 0,4 mm-1 a été identifié à 35 pmol/L. La flèche indique
les chiens pour lesquels les concentrations en POMC et / ou pro-ACTH étaient inférieures au
seuil de sensibilité de la trousse de dosage OCTEIA POMC.
- 56 -
4 - Capacités de la trousse de dosage OCTEIA POMC :
A partir des résultats précédemment présentés, une courbe ROC a été construite
(figure 28), permettant ainsi de définir un seuil séparant les tumeurs hypophysaires ayant un
rapport Ht / Ac supérieur ou égal à 0,40 x 10-2 mm-1 des tumeurs hypophysaires ayant un
rapport Ht / Ac inférieur à 0,40 x 10-2 mm-1 (figure 27). Ce seuil est fixé à 35 pmol/L. Parmis
les chiens du groupe II, un chien a une concentration basale en POMC et / ou pro-ACTH
inférieure à 35 pmol/L (15 pmol/L). Parmis les chiens du groupe I, 3 chiens ont une
concentration basale en POMC et / ou pro-ACTH supérieure à 35 pmol/L (respectivement :
56 pmol/L, 67 pmol/L et 108 pmol/L). La sensibilité du kit est de 93 % (intervalle de
confiance à 95 % : 79 % - 100%) et sa spécificité est de 86 % (intervalle de confiance à 95
% : 73 % - 100%) (figure 28).
Avec le seuil définit ci-dessus, et considérant 2 estimations de la prévalence des
tumeurs hypophysaires de grande taille (rapport Ht / Ac ≥ 0,40 x 10-2 mm-1) dans la
population canine – soit 10 % et 30 % - nous avons calculé les valeurs prédictives positive
(VPP) et négatives (VPN) du kit. Les VPP, c'est-à-dire la capacité du kit à détecter, chez un
chien atteint de maladie de Cushing, une tumeur de rapport Ht / Ac supérieur à 0,40 x 10-2
mm-1 sont de 42 % et 74 % respectivement. Les VPN, c'est-à-dire la capacité du kit à exclure,
chez un chien atteint de maladie de Cushing, une tumeur de rapport Ht / Ac inférieur à 0,40 x
10-2 mm-1 sont de 99 % à 97 % respectivement.
Figure 28 :
Courbe ROC obtenue en calculant la sensibilité et la spécificité de la trousse de dosage
OCTEIA POMC à différentes concentrations en précurseurs de l’ACTH. La meilleure
sensibilité (93 %) et la meilleure spécificité (86 %) sont obtenues pour une concentration seuil
de 35 pmol/L.
- 57 -
E - Discussion :
1 - Mécanismes potentiellement à l’origine des différences de concentrations en
précurseurs de l’ACTH observées chez les chiens de notre étude :
Les cellules hypophysaires corticotropes sont fonctionnellement caractérisées par leur
capacité à sécréter de l’ACTH. L’ACTH est une hormone peptidique jouant un rôle clé dans
la régulation du fonctionnement surrénalien et des sécrétions de cortisol. Elle est issue d’une
molécule de haut poids moléculaire nommée POMC (4;85;113).
L’acquisition d’un phénotype tumoral par la cellule va de paire avec de multiples
changements physiopathologiques tels qu’une augmentation des capacités de prolifération ou
encore une évolution vers un moindre degré de différenciation (altération des capacités de
sécrétion hormonales). Ces changements physiopathologiques sont fréquemment démontrés
lors de l’évolution de tumeurs endocrines malignes, par exemple chez des patients humains
atteints de carcinome des glandes surrénales pour lesquels des quantités anormalement
élevées de précurseurs du cortisol sont dosées dans le plasma (15). Chez l’homme, il a été
démontré l’existence d’adénomes hypophysaires silencieux dérivant de cellules corticotropes.
Ces adénomes différent de tumeurs hypophysaires corticotropes plus différenciées par leur
taille supérieure et la diminution d’une protéine PC1, suggérant une incapacité à cliver la
POMC (56;77;99). Les adénomes hypophysaires associés à la maladie de Cushing présentent,
chez l’homme comme chez le chien, différents degrés de différenciation et de grandes
variabilités de taille, allant du millimètre à plusieurs centimètres (55;99). Dans quelques
études chez l’homme atteint de maladie de Cushing, des taux importants de POMC et / ou de
pro-ACTH ont été retrouvés dans le plasma sanguin, principalement associés à certaines
tumeurs hypophysaires corticotropes agressives (38;86). Dans notre étude, il est probable que
les grandes quantités de POMC et / ou de pro-ACTH dosées dans le plasma des chiens
présentant des tumeurs hypophysaires de grande taille soientt la conséquence de la perte d’une
pro-hormone convertase telle que PC1. Nous n’avons pas réalisé d’étude caractérisant
l’expression dans ces tumeurs de pro-hormones convertases (immunodétection par exemple).
2 - Validité et originalité de notre étude :
Dans notre étude, nous avons validé une trousse (OCTEIA POMC) de quantification
directe des précurseurs de l’ACTH chez le chien, les régions de la POMC reconnues par les
anticorps de la trousse de dosage étant très conservées entre l’homme et le chien. Pour cela,
nous avons commencé par démontrer l’absence d’effet matrice due au plasma canin lors
d’utilisation de la trousse de dosage chez le chien et confirmé ensuite que la précision, la
linéarité et l’exactitude des mesures étaient acceptables. Nous avons par la suite utilisé le test
pour mettre en évidence une corrélation statistique entre les taux circulants de POMC et / ou
de pro-ACTH et la taille des tumeurs hypophysaires de chiens atteints de maladie de Cushing.
A notre connaissance, une telle corrélation n’a jamais été décrite dans la littérature sur un
large échantillon d’individus atteints de maladie de Cushing, quelle que soit l’espèce
concernée (homme, chien, etc…). Ces résultats sont en accord avec les données rapportées
dans une précédente étude par Bosje et al., qui ont analysé de manière indirecte les
concentrations en précurseurs de l’ACTH chez des chiens atteints de maladie de Cushing
(14). Dans cette étude, la concentration en précurseurs de l’ACTH a été approchée par la
différence des résultats de 2 dosages réalisés sur un même échantillon : d’une part les résultats
d’une trousse de dosage capable de reconnaître à la fois l’ACTH et différents précurseurs de
l’ACTH et d’autre part une trousse de dosage reconnaissant spécifiquement l’ACTH. Par cette
approche indirecte, Bosje et al. ont montré que la différence entre les deux tests était
- 58 -
significativement plus importante pour les chiens présentant des tumeurs hypophysaires de
grande taille. Nous sommes allés une étape plus loin en basant notre étude sur un dosage
direct ciblant spécifiquement 2 précurseurs de l’ACTH (la POMC et la pro-ACTH). Dans
notre étude, la caractérisation plus avant des hormones dosées (soit exclusivement la POMC
soit exclusivement la pro-ACTH ou bien les deux hormones) nécessiterait le recours à
l’utilisation de techniques de chromatographie.
3 - Pertinence des résultats de notre étude :
a - Pertinence clinique des résultats de notre étude :
Les tumeurs hypophysaires de grande taille peuvent induire des symptômes nerveux et
sont associées à un mauvais pronostic sans traitement local (89). Un traitement local
(principalement par radiothérapie) des macroadénomes hypophysaires donne par contre de
très bons résultats lorsqu’il est entrepris à temps (23;55;89;98). Il est difficile de séparer les
tumeurs hypophysaires du chien en tumeur de petite taille ou tumeur de grande taille car il
existe de grandes variations de la taille de ces masses. Chez l’homme, la taille des adénomes
est beaucoup moins variable et une limite nette entre petite et grande tumeur a été fixée à 1
cm. Ce seuil n’a pas de justification physiopathologique chez le chien. En effet, de nombreux
chiens avec de tumeurs hypophysaires de diamètre inférieur à 1 cm présentent des symptômes
nerveux alors que d’autres animaux présentant des tumeurs volumineuses ne manifestent pas
ces symptômes nerveux (10;27;55;75). Certains auteurs ont donc proposé l’utilisation de
critères tenant compte de la morphologie des chiens (rapport Ht / Ac), pour évaluer la taille
des adénomes hypophysaires (59). Ce ratio a d’abord été développé pour séparer les
hypophyses anormales (« élargies ») d’hypophyses ne dépassant pas la sella tursica (« non
élargies »), c'est-à-dire ayant un rapport Ht / Ac inférieur à 0,31 x 10-2 mm-1 (59). Comme de
nombreuses tumeurs hypophysaires supra-sellaires peuvent être tolérées sans symptômes
nerveux, nous avons cherché à optimiser le seuil permettant de séparer les animaux à risques
et susceptibles de développer des symptômes nerveux (9;55). A notre connaissance, la plus
petite tumeur hypophysaire ayant entraîné des symptômes nerveux a été décrite chez un teckel
et faisait 5 mm de diamètre (55). D’autre part, nous avons déterminé rétrospectivement sur 10
teckels présentés au C.A.V. pour des examens TDM de l’encéphale, l’aire du cerveau au
niveau de la sella tursica. A partir de ces données, nous en avons déduit un rapport théorique
et égal à 0,4 x 10-2 mm-1 (données non présentées). La mise en évidence d’une différence
fonctionnelle (concentration basale en POMC et / ou pro-ACTH) entre les chiens ayant un
rapport Ht / Ac supérieur à 0,40 x 10-2 mm-1 et les chiens ayant un rapport Ht / Ac inférieur à
0,40 x 10-2 mm-1, renforce l’idée que le seuil choisit est pertinent physiologiquement. Une
étude prospective reste à réaliser pour apprécier les capacités de ce seuil à identifier les
animaux à risques en terme de symptômes nerveux.
Le rapport Ht / Ac n’apporte cependant que des information indirectes sur les volumes
des tumeurs et l’effet de masse occasionné par ces tumeurs. Dans notre étude, un seul chien
du groupe II a une concentration basale en POMC et / ou pro-ACTH de 15 pmol/L, c'est-àdire inférieure à 35 pmol/L. La morphologie de la tumeur hypophysaire de ce chien (forme
conique), diffère de celle des autres chiens (formes ovoïdes). Nous avons calculé le volume
des tumeurs et le volume de l’encéphale de tous les chiens en considérant la tumeur conique
comme un cône et le reste des autres tumeurs comme des ellipsoïdes. Un rapport entre le
volume de la tumeur hypophysaire et le volume du cerveau des chiens a été calculé (Vt / Vc).
Ce rapport est, pour le chien présentant une tumeur conique, dans les limites des rapports
obtenus dans le groupe I. En effet, 3 des chiens du groupe I ont des rapports Vt / Vc
- 59 -
supérieurs à celui du chien avec la tumeur conique et aucun chien du groupe II n’a de rapport
Vt / Vc inférieur à celui du chien avec la tumeur conique (données non présentées).
b - Pertinence du dosage des précurseurs de l’ACTH dans notre étude :
Trois chiens du groupe I, ayant des rapports Ht / Ac de 0,10, 0,20 et 0,36 x 10-2 mm-1,
ont des concentrations en précurseurs de l’ACTH supérieures à 35 pmol/L. Il est peu probable
que des phénomènes d’interférence expliquent les résultats élevés de ces trois chiens car il
n’existe pas de précurseurs de plus grande taille que la POMC ou la pro-ACTH au sein des
cellules corticotropes et susceptibles d’interférer et de majorer artificiellement les
concentrations obtenues avec la trousse de dosage OCTEAI POMC. L’évolution au cours du
temps des tumeurs rencontrées dans notre étude n’est pas connue. Il est donc possible que des
tumeurs peu différenciées et / ou agressives dans des phases précoces de leur développement
et sécrétant de grandes quantité de POMC et / ou de pro-ACTH aient été inclues dans le
groupe I. L’intérêt pronostique de la concentration en POMC et / ou pro-ACTH dans les cas
de tumeurs de petite taille reste à étudier (répétition des dosages des précurseurs de l’ACTH
en parallèle d’examens tomodensitométriques de contrôle par exemple).
Dans notre étude, la corrélation entre la taille des tumeurs hypophysaires et la
concentration en POMC et / ou pro-ACTH est valable aussi bien avec les valeurs brutes de
POMC et / ou de pro-ACTH (données non fournies) qu’avec les valeurs en logarithme de la
POMC et / ou de la pro-ACTH. Le changement de variable utilisé dans notre étude (passage
au logarithme), a été choisit pour prendre en compte d’une part le caractère pulsatile des
sécrétions de POMC et / ou de pro-ACTH, par analogie à l’ACTH (58;78) et d’autre part les
possibles variations liés à l’heure du prélèvement qui n’a pas été la même au cours de la
journée pour les différents chiens de l’étude.
c – Avenir de la trousse de dosage OCTEIA POMC :
L’utilisation plus large de la trousse de dosage OCTEIA POMC nécessite l’étude de la
stabilité des peptides dosés. En effet, il n’existe pas, à notre connaissance, de données sur la
demi-vie biologique et la demi-vie in vitro des peptides que nous avons dosés. Dans le cas où
une bonne stabilité des précurseurs de l’ACTH serait identifiée, une utilisation en pratique
courante de la trousse OCTEIA POMC lors de syndrome de Cushing pourrait être envisagée.
Malgré nos quelques résultats divergents, les données obtenues laissent clairement
supposer que les tumeurs hypophysaires de grande taille et les tumeurs hypophysaires de
petite taille ont une sécrétion corticotrope différente. Nous avons observé une nette différence
entre les deux groupes étudiés et identifié un seuil de concentration en POMC et / ou proACTH à 35 pmol/L, permettant de séparer les 2 groupes. La sensibilité et la spécificité de la
trousse avec ce seuil sont respectivement de 93 % et de 86 %. Corrigé pour une population
plus large, ces valeurs s’étendent de 79 % à 100% pour la sensibilité et de 95 % à 73 % pour
la spécificité. Ces résultats nous conduisent à penser que la trousse de dosage OCTEIA
POMC puisse être utilisé dans la démarche diagnostique de la maladie de Cushing et
notamment avant l’imagerie médicale. En effet, compte tenu de la prévalence des
macroadénomes hypophysaires et des remarquables capacités de la trousse, la forte VPN du
test permet au clinicien, dans le contexte où il n’observe pas de symptômes nerveux,
d’exclure avec confiance un macroadénome hypophysaire lorsque la valeur de POMC et / ou
d’ACTH est inférieure à 35 pmol/L (Figure 29).
- 60 -
Maladie de Cushing (HCH)
Symptômes en faveur
d’un macroadénome
hypophysaire ?
Oui
Non
Concentration en
précurseurs de
l’ACTH
< 35 pmol/L
Examen TDM
ou IRM de
l’hypophyse
≥ 35 pmol/L
Tumeur hypophysaire
de petite taille (Ht / Ac
< 0,4 x 10-2 mm-1)
Tumeur hypophysaire de
grande taille (Ht / Ac ≥
0,4 x 10-2 mm-1)
Si apparition de symptômes ou
de signes biologiques évoquant la
présence d’un macroadénome
hypophysaire
Figure 29 :
Logigrame concernant la caractérisation des maladies de Cushing chez le chien,
incluant le dosage de précurseurs de l’ACTH (POMC et / ou pro-ACTH) par le kit OCTEIA
POMC. Les traits pointillés représentent des étapes que l’on peut anticiper comme rares.
- 61 -
Conclusion
La détection clinique des macroadénomes hypophysaires corticotropes est tardive. Elle
nécessite le recours à des examens complémentaires coûteux et peu disponibles (TDM et / ou
IRM). Les caractéristiques physiologiques des macroadénomes hypophysaires (moindre degré
de différenciation, capacité de prolifération) ont permis d’envisager que ces tumeurs puissent
sécrèter des précurseurs de l’ACTH. La mise en évidence d’une nette corrélation entre la taille
des tumeurs hypophysaires corticotropes (rapport Ht / Ac) et la concentration plasmatique en
POMC et / ou pro-ACTH (obtenue par l’utilisation de la trousse de dosage OCTEIA POMC)
confirme par une méthode directe cette hypothèse, pour la première fois chez le chien (et pour
la première fois au sein d’un grand nombre d’individus quelque soit l’espèce considérée).
L’originalité de ce travail et des résultats qui lui sont associés explique qu’il ait pu être
accepté pour publication par un journal de renommée internationale (Annexe 1). La trousse de
dosage validée dans ce travail peut trouver sa place dans la démarche diagnostique du
clinicien face à un chien atteint de maladie de Cushing, renforçant ou écartant la possibilité
d’un macroadénome hypophysaire.
- 62 -
Abréviations couramment utilisées dans le manuscrit
Les textes en italique utilisent la terminologie : « Nomina Anatomica Veterinaria »
(N.A.V., 1983).
C.A.V. : Centre Anti-cancéreux Vétérinaire, Maisons-Alfort, F.Delisle, P.Devauchelle,
S.Segond.
ACTH : hormone adrénocorticotrope
CLIP : fragment peptidique corticotropine-like du lobe intermédiaire
CRH : hormone de libération de la corticotropine (corticotropin releasing hormone)
Ht / Ac : rapport entre la hauteur de la tumeur hypophysaire et l’aire du cerveau sur une même
coupe TDM
IM : intra-musculaire
IRM : imagerie par résonance magnétique
IV : intra-veineux
JP : peptide de jonction de la POMC
M-Enk : met-enképhaline
NT : fragment N-Terminal de la POMC
PC : pro-hormone convertase
POMC : pro-opiomélanocortine
TDM : tomodensitométrie
β -End : bêta-endorphine
β-LPH : bêta lipoprotéine
γ-LPH : gamma lipoprotéine
β-MSH : hormone de libération de la bêta mélanotropine
α-MSH : hormone de libération de l’alpha mélanotropine
γ-MSH : hormone de libération de la gamma mélanotropine
- 63 -
Références des produits utilisés
pour la réalisation de l’étude expérimentale
a
: OCTEIA POMC, Immunodiagnostic Systems Limited, Boldon, Tyne and Wear, United
Kingdom.
b
: Enzymun-Test cortisol, Roche Diagnostics, Meylan, France.
c
: Synacthène injectable®, tétracosactide, 0.25 mg/mL. Novartis Pharma SA, Rueil-
Malmaison, France.
d
: Soludecadron®, déxaméthasone phosphate, 4 mg/mL. Merck Sharp and Dohme-Chibret,
Paris, France.
e
: Immulite 2000 ACTH, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA.
f
: Rapinovet®, propofol, 1g/100 mL. Schering-Plough Vétérinaire, Levallois-Perret, France.
g
: Fluothane®, halothane. Zeneca Pharma, Cergy, France.
h
: Scanner Hispeed CT/e Plus. General Electric Medical Systems, Milwaukee, WI, USA.
i
: Télébrix® 35, sodium et méglumine ioxitalamate, 350 mg of iodine/mL. Laboratoire
Guerbet, Roissy-Charles-de-Gaulle, France.
j
: eFilm Workstation TM Medical imaging software, Février 2000, version 1.4.1, Merge Film,
Milwaukee, WI, USA.
k
: logiciel SAS/STAT®, version 5.0, SAS Institue Inc., Cary, NC, USA.
- 64 -
Annexe 1
Copie de l’article : « Plasma pro-opiomelanocortin and pro-ACTH and pituitary
adenoma size in dogs with Cushing’s disease », N. Granger, P. de Fornel, P. Devauchelle, S.
Segond, F. Delisle, D. Rosenberg, accepté pour publication (28/07/04) dans : Journal of
Veterinary Internal Medicine (référence: 04-030).
- 65 -
Plasma pro-opiomelanocortin and pro-ACTH and pituitary adenoma size in dogs with
Cushing’s disease
Short title: ACTH precursors and pituitary tumor size
Authors: Nicolas Granger* DVM, Pauline de Fornel* DVM, Patrick Devauchelle** DVM, Sophie Segond**
DVM, Françoise Delisle** DVM and Dan Rosenberg* DVM, PhD.
*: Internal Medicine Unit, National Veterinary School of Alfort, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704,
Maisons-Alfort, France.
**: Veterinary Anticancer Center, 7 avenue du Général de Gaulle, 94700, Maisons-Alfort, France.
Corresponding author (reprint requests): Dan Rosenberg, DVM, PhD, Internal Medicine Unit of the National
Veterinary School of Alfort, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704, Maisons-Alfort, France; [email protected].
Acknowledgments
The authors would like to thank the referring veterinary surgeons of the cases described in this paper.
This work was supported by grants from Intervet Pharma R et D SA, Angers, France and from the Direction
Générale de l’Enseignement et de la Recherche (Ministère de l’Agriculture, de l’Alimentation, de la Pêche et des
Affaires rurales).
- 66 -
Abstract
It is difficult to predict the size of pituitary corticotroph tumors in dogs with Cushing’s disease
(pituitary-dependent hyperadrenocorticism; PDH) without pituitary imaging techniques. The purpose of this
study was to examine the relationship between plasma adrenocorticotropin hormone (ACTH) precursor
concentration and pituitary size in dogs with Cushing’s disease. Plasma concentrations of ACTH precursors
(pro-opiomelanocortin (POMC)/pro-ACTH) and pituitary tumor height/brain area were measured in 36 dogs
with pituitary corticotroph adenomas of various sizes. There was a correlation between tumor size (measured as
the pituitary tumor height/brain area (P/B) ratio) and POMC/pro-ACTH concentration (r = 0.70; P < 0.0001).
Dogs with P/B ratios ≥ 0.40 x 10-2 mm-1 had higher concentrations of ACTH precursors than dogs with P/B
ratios < 0.40 x 10-2 mm-1 (median concentration: 85 pmol/L (range: 15–1350 pmol/L); n = 14 vs 15 pmol/L
(range: 15–108 pmol/L); n = 22, respectively, P < 0.0001). With a threshold of 35 pmol/L of POMC/pro-ACTH
concentration, the estimated sensitivity and specificity of the kit were 93% (95% confidence interval (CI): 79% 100%) and 86% (95% CI: 73% - 100%) respectively.
We interpret these data as indicating that measurement of POMC and pro-ACTH may be of value in the
characterization of tumor size in dogs with Cushing’s disease. Low POMC/pro-ACTH concentrations make it
unlikely that a large pituitary tumor exists in dogs with PDH.
Key words
Canine; Corticotroph tumors; Diagnosis; Enzyme immunoassay; Hyperadrenocorticism.
- 67 -
Hyperadrenocorticism (Cushing’s syndrome) is a common spontaneous endocrinopathy in middle-aged
and geriatric dogs. The condition is pituitary-dependent (designed as pituitary-dependent hyperadrenocorticism)
(PDH) in 80 to 85% of dogs with hyperadrenocorticism, (Feldman 1983b; Feldman & Nelson RW 2004) and is
associated
with
excessive
or
inappropriate
adrenocorticotrophic
hormone
(ACTH)
secretion.
Adrenocorticotropin hormone is secreted by a microscopic tumor (microadenoma) of the pars distalis or the pars
intermedia in most dogs with PDH.(Capen et al. 1967; Peterson et al. 1982) Grossly visible pituitary tumors
(macroadenomas) account for only 10% to 30% of cases of PDH in dogs. (Sarfaty et al. 1988; Nelson et al.
1989) It is difficult to predict pituitary tumor size without computed tomography or magnetic resonance imaging
because the clinical expression of some pituitary macroadenomas may be similar to that of microadenomas
(absence of neurological signs).(Kipperman et al. 1992)
Adrenocorticotropin hormone is derived from the multistep proteolytic action of the prohormone
convertase 1 (PC1) on a high-molecular weight polypeptide precursor known as pro-opiomelanocortin (POMC);
POMC is first processed to pro-ACTH (a polypeptide precursor of ACTH containing particularly ACTH and
gamma-MSH), which is then cleaved to ACTH. (White & Gibson 1998; Benjannet et al. 1991; Zhou et al. 1993;
Raffin-Sanson et al. 2003) The production of POMC (or other ACTH precursors such as pro-ACTH) by large
pituitary tumors has been reported in some human patients, probably due to impaired processing abilities of the
tumor. (Fuller et al. 1984; Hale et al. 1985; Raffin-Sanson et al. 1996; Gibson et al. 1996) To date, in dogs, only
indirect evidence exists for unprocessed POMC secretion by macroadenomas (high plasma ACTH
concentrations are detected in some macroadenomas, }with antibodies displaying potential cross reactivity with
some ACTH precursors).(Kooistra et al. 1997; Bosje et al. 2002)
Pro-opiomelanocortin amino acid sequences of dogs and human are very similar, especially in the
amino-terminal segment of the pro-hormone, containing the gamma-MSH region, and the middle part of the
molecule, containing the ACTH segment.(Mol et al. 1991) A commercial kit for the detection of ACTH
precursors (POMC/pro-ACTH; OCTEIA POMC kita), based on antibodies directed against the human gammaMSH and ACTH regions, was recently developed.
We investigated with the OCTEIA POMC kit the relationship between plasma concentrations of
POMC/pro-ACTH and the size of pituitary tumors in dogs with PDH.
- 68 -
2. Materials and methods
Blood samples were collected prospectively from dogs diagnosed with PDH between March 2001 and
July 2003 at a single center (National Veterinary School of Alfort). The inclusion criteria were: a history and a
physical examination consistent with hyperadrenocorticism; At least one endocrine test result (ACTH
stimulation test, n = 35, or low-dose dexamethasone suppression test, n = 6) corroborating the diagnosis of
hyperadrenocorticism; Unsuppressed basal ACTH plasma concentrations (median concentration: 60 pg/mL,
range: 10 to 109 pg/mL, n = 36) and adrenal contrast-enhanced computed tomography results suggestive of
pituitary-dependent hyperadrenocorticism (symmetry of the two adrenal glands, generally hypertrophied); A
pituitary contrast-enhanced computed tomography, enabling, in case of visualization of the pituitary adenoma,
the measurement of its height; No treatment over the last two weeks before computed tomography and blood
samples.
Thirty-six consecutive dogs met the criteria for inclusion in the study. The dogs were 5 to 17 years old
(median age: 10) at the time of diagnosis. Nineteen dogs were female (11/19 were neutered) and 17 were male
(5/17 were neutered).
Endocrine tests and hormone assays
We determined plasma cortisol concentration during dynamic endocrine tests with a previously
validated kitb for dogs.(Ginel et al. 1998) The ACTH stimulation test and the low-dose dexamethasone
suppression test were performed as previously described. (Hansen BL et al. 1994; Héripret D. 1995; Feldman
1983b; Feldman 1983a; Feldman et al. 1982; Feldman et al. 1977) Hyperadrenocorticism was confirmed by the
detection of exaggerated increases in plasma cortisol concentration after tetracosactidec injection (≥ 500 nmol/L)
or by inadequate 8-hours post-dexamethasoned suppression of plasma cortisol concentration (≥ 40 nmol/L) or by
both.
Blood samples for corticotropic hormone assays were collected from the jugular vein in pre-cooled
EDTA-coated tubes. The samples were immediately centrifuged at 4°C, 500 x g for 8 minutes, and plasma
promptly stored in plastic tubes at -20°C until assay.
- 69 -
We determined basal plasma ACTH concentrations with the human Immulite 2000 ACTH kite, recently
validated for plasma ACTH measurement in dogs.(Scott-Moncrieff et al. 2003) Normal reference range in our
laboratory was 6 to 58 pg/mL. Values were considered to be consistent with PDH when > 10 pg/mL. Values
were considered to be consistent with adrenal tumor hyperadrenocorticism (ATH) when < 5 pg/mL.
We determined plasma POMC/pro-ACTH concentrations with the human OCTEIA POMC kit,
according to manufacturer's instructions. Literature and manufacturer-supplied information concerning the
specificity of the kit indicated equal, 100% cross-reactivity between pro-ACTH and POMC. To date, only minor
cross-reactivity with smaller corticotropic hormones, ACTH and alpha-MSH has been demonstrated (-3.6% and
-2.2% respectively). Thus only samples containing more than 1000 pmol/L of ACTH and alpha-MSH could
reduce measured POMC values by a significant amount.(Stewart et al. 1994; Immunodiagnostic Systems
Limited 2002) We validated the use of the OCTEIA kit for canine plasma samples according to current
procedures associated with bioanalytical analysis.(Shah et al. 2000) Blank canine plasma was collected from six
healthy dogs, four hours after the IV administration of 1 mg dexamethasone phosphate/kg of body weight. These
samples were used to determine canine matrix plasma effect and the sensitivity, accuracy and linearity of the kit.
A calibration curve was plotted with human POMC samples diluted in canine plasma (7 points in the range of
expected concentrations) and compared with the kit calibration curve obtained with human POMC samples
diluted in distilled water (7 points in the range of expected concentrations). The percentage recovery of the two
curves was 94%. Sensitivity, defined as the concentration corresponding to the mean plus two standard
deviations of five replicates of a canine blank plasma sample, was 15 pmol/L. Accuracy, calculated with three
known concentrations measured five times each, was 95% and linearity, assessed by diluting a sample with
distilled water before the assay, was 90% (Table 1). The intra-assay coefficients of variation obtained at 3
different unknown concentrations, measured five times each in a single assay, were 7.5%, 8.8% and 11.7%
respectively (Table 1). The inter-assay coefficients of variation obtained at the lower limit of quantification and
at 2 unknown concentrations, measured five times each on five different days, were 20.0%, 14.4% and 15.0%
respectively (Table 1).
The standard curve for the OCTEIA POMC kit used for the procedure was established with six known
concentrations of POMC and a zero. The absorbance (at 450 nm) of the standards ranged from 0.065 to 1.235,
corresponding to POMC concentrations ranging from levels below the sensitivity of the kit (taken as 15 pmol/L)
to 1051 pmol/L. After kit validation, all the samples from dogs with PDH evaluated during the study were
processed in a single assay.
- 70 -
Computed tomography (CT)
Food was withheld from all dogs for 12 hours prior to CT scan. Anesthesia was induced by IV
administration of 6.5 mg/kg of body weight of propofol (Rapinovet®f) and was maintened with inhaled halothane
(Fluothane®g) and oxygen. The CT scan of the pituitary fossa was performed with a fourth-generation CT
scanner (Hispeed CT/e Plus Scannerh), before and after an IV bolus injection of 2 mL/kg of body weight contrast
medium (Télébrix® 35i). With the dogs in sternal recumbency, transverse sections of the skull were made
perpendicular to the skull base from the rostral clinoid process to the dorsum sellae, using 120.0 kV and 90.0
mA and 2 mm thick consecutive slices. Additional, scans were carried out rostrally and/or caudally to ensure
inclusion of the entire gland in cases of severe enlargement of the pituitary gland.
The height of the pituitary tumor was measured for each dog on the image with the largest cross-section
of the pituitary gland. Adjustments were made for the size of the dog by tracing the edges of the brain on this
image and calculating the enclosed area with eFilm softwarej. From the height of the pituitary tumor and the area
of the brain, the pituitary tumor height/brain area (P/B) ratio was calculated, as previously described.(Kooistra et
al. 1997) If the pituitary tumor was not visible on CT scan images (n = 7), the reference height of the tumor was
considered to be 1 mm.
Data analysis
Data were analyzed using SAS/STAT®k software. Data were not normally distributed and are reported
as a median, range and number of subjects. Values obtained for the various groups, were compared using the
Mann-Whitney rank sum test. A Spearman correlation coefficient (r) was used to access the correlation between
variables. P < 0.05 was considered significant. A threshold for basal POMC/pro-ACTH concentration was
determined from the receiver operating characteristic (ROC) curve.
- 71 -
3. Results
The height of the pituitary tumor in the 36 dogs ranged from 1 mm to 22 mm (median: 4.5 mm) and the
brain surface at pituitary verticality ranged from 907 mm2 to 2042 mm2 (median: 1134 mm2). The P/B ratio
ranged from 0.08 x 10-2 mm-1 to 2.09 x 10-2 mm-1 (median: 0.32 x 10-2 mm-1).
Two groups of dogs were identified on the basis of P/B ratio (Table 2). Group 1 consisted of 22 dogs
with small pituitary tumors with P/B ratios of 0.08 x 10-2 mm-1 to 0.38 x 10-2 mm-1 (median: 0.20 x 10-2 mm-1).
Group 2 consisted of 14 dogs with large pituitary tumors with P/B ratios of 0.40 x 10-2 mm-1 to 2.09 x 10-2 mm-1
(median: 0.74 x 10-2 mm-1).
The plasma concentrations of basal ACTH precursors for the 36 dogs (POMC/pro-ACTH) ranged from
15 to 1350 pmol/L (median: 17 pmol/L) (Table 2). Pro-opiomelanocortin/pro-adrenocorticotropin hormone
concentrations were correlated with pituitary size (P/B ratio) (r = 0.70; n = 36; P < 0.0001) (figure 1). Basal
ACTH precursor concentrations in dogs from group 2 were significantly higher (P < 0.0001) than those in dogs
from group 1 (median: 85 pmol/L, range: 15–1350 pmol/L for group 2 and median: 15 pmol/L, range: 15–108
pmol/L for group 1) (figure 2).
Based on these observations and the ROC curve of the results (figure 3), the threshold for basal plasma
POMC/pro-ACTH concentrations delineating pituitary tumors with a P/B ratio ≥ 0.40 x 10-2 mm-1 from pituitary
tumors with a P/B ratio < 0.40 x 10-2 mm-1 was set at 35 pmol/L (figure 2). Only one dog in group 2 had a basal
plasma POMC/pro-ACTH concentration below 35 pmol/L (concentration of ACTH precursors: 15 pmol/L).
Three dogs in group 1 had a basal POMC/pro-ACTH concentration higher than 35 pmol/L (concentrations of
ACTH precursors: 56, 67 and 108 pmol/L). The plasma samples of all other dogs from group 1 had basal
POMC/pro-ACTH concentrations below 35 pmol/L. Based on these results, the estimated sensitivity of the assay
was 93% (95% confidence interval (CI): 79% - 100%) and its estimated specificity was 86% (95% CI: 73% 100%).
- 72 -
4. Discussion
In this study, we validated a commercial ACTH precursors detection kit (OCTEIA POMC kit), based
on antibodies against regions of POMC that are well conserved between human and dog, to investigate
circulating POMC/pro-ACTH concentrations in dogs with Cushing’s disease associated with pituitary tumors of
various sizes. We then demonstrated a statistically significant correlation between plasma concentrations of
ACTH precursors and pituitary tumor sizes. To our knowledge, no such close correlation has previously been
demonstrated for a large cohort of subjects suffering from Cushing’s disease, regardless of the species studied
(humans, dogs etc.). In humans, silent adenomas derived from corticotroph cells generally differ from the more
differentiated corticotroph adenomas associated with Cushing’s disease in being larger(Kojima et al. 2002) and
showing a strong decrease in PC1 protein, suggesting impairment of POMC processing.(Ohta et al. 2002) The
corticotroph adenomas associated with Cushing’s disease display various degrees of differentiation and are
highly variable in size.(Thorner et al. 1998) In human patients suffering from Cushing’s disease, high circulating
proportions of ACTH precursors have been observed primarily in some large and aggressive pituitary
corticotroph tumors. (Raffin-Sanson et al. 1996; Gibson et al. 1996)
The results of the present study are consistent with those of a previous study that indirectly analyzed the
concentrations of ACTH precursors in dogs with PDH by calculating the differences between the results
obtained with an ACTH assay based on antibodies recognizing both ACTH and various ACTH precursors, and
another assay determining ACTH concentrations specifically.(Bosje et al. 2002) Using this indirect method for
the assessment of ACTH precursors, the difference between the results of the two assays were larger in dogs
with large pituitary tumors than in those with smaller tumors and P/B ratios were significantly correlated with
this indirect measure of ACTH precursors concentration.(Bosje et al. 2002)
- 73 -
We identified, using a direct method of quantification of plasma POMC/pro-ACTH, a significantly
higher plasma concentration of POMC/pro-ACTH in dogs with PDH and a P/B ratio greater than 0.40 x 10-2
mm-1 than in dogs with PDH and a P/B ratio less than 0.40 x 10-2 mm-1. Large tumors (macroadenoma) can
induce neurological signs and are thought to be associated with a shorter life expectancy without specific local
treatment;(Sarfaty et al. 1988) in contrast, local treatment (consisting usually of radiotherapy) of pituitary
macrotumors is generally associated with good results.(Sarfaty et al. 1988; Kipperman et al. 1992; Theon &
Feldman 1998) It is difficult to differentiate clearly between microadenomas and macroadenomas in dogs
because tumor size is much more variable in dogs than in humans, for whom a cut-off point for distinguishing
between microadenomas and macroadenomas has been established (diameter of the tumor: 1 cm). There is
evidence that this 1 cm cut-off point has no pathophysiological relevance in dogs for discriminating between
microadenomas and macroadenomas. For example, many dogs with diameters of their tumors inferior to 1 cm
display nervous system signs whereas others support much larger tumors with no neurological signs. (Nelson et
al. 1989; Kipperman et al. 1992; Bertoy et al. 1995; Duesberg et al. 1995) Such observations have led some
authors to consider criteria related to the morphology of the dog, such as P/B ratio, in the evaluation of adenoma
size. (Kooistra et al. 1997) This P/B ratio was originally developed to discriminate suprasellar (“enlarged”) from
within sella tursica (“not enlarged”) pituitaries with a threshold equal to 0.31 x 10-2 mm-1.(Kooistra et al. 1997)
Since numerous suprasellar pituitary tumors can be tolerated without apparition of neurological
signs,(Kipperman et al. 1992; Bertoy et al. 1996) an optimal threshold for P/B ratio enabling discrimination of
macrotumors associated with a high risk of development of neurological signs from microtumors should be
probably superior to 0.31 x 10-2 mm-1. To our knowledge, the smallest pituitary tumor associated with
neurological signs described in the literature had a diameter of 5 mm and was found in a dachshund.(Kipperman
et al. 1992) We determined retrospectively a mean for transverse brain area above the suprasellar region of 10
dachshunds admitted for brain CT scans (data not shown), and calculated a theoretical P/B ratio for this case
equal to 0.40 x 10-2 mm-1. This value was arbitrarily chosen as a threshold between our two groups of dogs. The
identification, in this study, of a major functional difference between dogs suffering from PDH that had a P/B
ratio greater than 0.40 x 10-2 mm-1 and dogs with PDH that had a P/B ratio less than 0.40 x 10-2 mm-1, in terms of
basal plasma POMC/pro-ACTH concentrations, provides strong evidence that such criteria are physiologically
relevant. The pertinence of this threshold, for the discrimination of dogs with a higher risk of neurological signs,
which may be good candidates for radiotherapy, remains to be prospectively evaluated and compared with the
- 74 -
use of the 0.31 x 10-2 mm-1 cut-off in this indication, or the discrimination between macroadenoma and
microadenoma based on their diameter, greater than 1 cm and less than 1 cm respectively.
The P/B ratio, although useful, provides only partial information about the volume of the tumor and its
space occupying effect consequences. Comparison between tumors using this ratio is based on the assumption
that all tumors and the cranial vault have the same shape. In our study, only one dog with a P/B ratio greater than
0.40 x 10-2 mm-1 had a basal concentration of ACTH precursors below 35 pmol/L (POMC/pro-ACTH
concentration: 15 pmol/L). The shape of the pituitary tumor of this dog differed from that of the other tumors: it
was conical whereas the others were ovoid. We calculated tumors and brain volumes by treating this tumor as a
cone and all the other tumors and the brains as ellipsoids; with this approach, the tumor volume/brain volume
ratio of the dog with the conical tumor was within the range of values of tumor volume/brain volume ratio for
group 1 dogs. Indeed, three dogs of group 1 had higher tumor volume/brain volume ratios than the dog with the
conical tumor and none dogs of the group 2 had lower ratios than the dog with the conical tumor (data not
shown).
Three group 1 dogs, with P/B ratios of 0.10, 0.20 and 0.36 x 10-2 mm-1 respectively, had ACTH
precursor concentrations higher than 35 pmol/L. We did not directly assess the differentiation status of pituitary
tumors. Thus, it is possible that undifferentiated and/or aggressive tumors in the early stages of development that
secreted large amounts of POMC/pro-ACTH were included in group 1, which would account for these high
values. The prognostic value of high plasma concentrations of POMC/pro-ACTH in small corticotroph tumors
has not yet been evaluated.
Despite the results obtained for these few dogs, our data are consistent with different patterns of
corticotropic secretion behavior in small and large pituitary tumors associated with PDH. The measurement of
plasma ACTH precursor concentrations could be used in the general approach to diagnosis of Cushing’s disease
and could have high negative predictive value for concentrations of ACTH precursors below 35 pmol/L,
enabling the clinician to consider highly unlikely the possibility of a large pituitary tumor, with confidence,
before pituitary imaging. However, the overall usefulness to practitioners of the new tool validated here,
allowing the direct determination of POMC/pro-ACTH, requires further characterization in terms of peptide
stability.
- 75 -
Footnotes
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: OCTEIA POMC, Immunodiagnostic Systems Limited, Boldon, Tyne and Wear, United Kingdom (generously
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b
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d
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e
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f
: Rapinovet®, propofol, 1g/100 mL. Schering-Plough Vétérinaire, Levallois-Perret, France.
g
: Fluothane®, halothane. Zeneca Pharma, Cergy, France.
h
: Scanner Hispeed CT/e Plus. General Electric Medical Systems, Milwaukee, WI, USA.
i
: Télébrix® 35, sodium and meglumine ioxitalamate, 350 mg of iodine/mL. Laboratoire Guerbet, Roissy-
Charles-de-Gaulle, France.
j
: eFilm Workstation TM Medical imaging software, February 2000, version 1.4.1, Merge Film, Milwaukee, WI,
USA.
k
: SAS/STAT® software, version 5.0, SAS Institue Inc., Cary, NC, USA.
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- 79 -
Illustrations
Table 1. Partial validation of the OCTEIA POMC kit for use with canine plasma.
Precision
Intra-assay*
44 ± 3
156 ± 14
363 ± 43
Linearity
Sample
A
A/2
A/4
A/8
A/16
Accuracy
Sample
Sample 1
Sample 2
Sample 3
CV** (n = 5)
7.5%
8.8%
11.7%
Inter-assay*
14 ± 3
26 ± 4
233 ± 35
CV** (n = 5)
20.0%
14.4%
15.0%
Measured
(pmol/L)
393
171
106
40
25
Expected
(pmol/L)
393
197
98
49
25
Measured/
Expected (%)
100
87
108
82
100
Measured*
(n = 5)
51 ± 8
107 ± 9
236 ± 9
Expected
(pmol/L)
48
105
263
Measured/
Expected (%)
94
102
90
*: results are expressed as mean ± standard deviation (pmol/L)
**: coefficient of variation
- 80 -
Table 2. Adrenocorticotropin hormone precursor (POMC/pro-ACTH) concentrations (pmol/L), heights of
pituitary tumors (mm) and pituitary/brain (P/B) ratios (x10-2 mm-1) in 2 groups of dogs. Group 1: dogs with P/B
ratio < 0.40 x 10-2 mm-1 and group 2: dogs with P/B ratio ≥ 0.40 x 10-2 mm-1. Medians (ranges).
ACTH precursor
concentrations (pmol/L)
Pituitary tumor heights
(mm)
P/B ratios
(x10-2 mm-1)
Group 1
(n=22)
15
(15 to 108)
2
(1 to 6)
0.20
(0.08 to 0.38)
Group 2
(n=14)
85*
(15 to 1350)
10*
(5 to 22)
0.74*
(0.40 to 2.09)
* P < 0.0001 vs. group 1
- 81 -
Figure 1. Scatter diagram showing the association between pituitary tumor size (y-axis: P/B ratio (x10-2 mm-1))
and concentration of basal plasma ACTH precursors (x-axis: POMC/pro-ACTH concentration (pmol/L)) in 36
dogs diagnosed with PDH; r = 0.70, P < 0.0001. Arrow indicates the dogs (n = 18) characterized by a
concentration of basal POMC/pro-ACTH below the sensitivity of the OCTEIA POMC kit.
- 82 -
Figure 2. Pro-opiomelanocortin/pro-adrenocorticotropin hormone (POMC/pro-ACTH) concentrations were
significantly (P < 0.0001) higher in dogs with a P/B ratio greater than 0.40 x 10-2 mm-1 than in dogs with a P/B
ratio less than 0.40 x 10-2 mm-1. Medians are indicated by gray horizontal lines. A threshold (dashed line) for the
detection of pituitary tumors with a P/B ratio greater than 0.40 x 10-2 mm-1 was identified at 35 pmol/L ACTH
precursors (OCTEIA POMC kit).
- 83 -
Figure 3. Receiver operating characteristic (ROC) curve obtained by calculating the sensitivity and specificity of
the OCTEIA POMC kit at various concentrations, for distinction of dogs with P/B ratios ≥ 0.40 x 10-2 mm-1 and
dogs with P/B ratios < 0.40 x 10-2 mm-1, resulting in the identification of a threshold at 35 pmol/L (arrow). With
this threshold, the sensitivity and specificity of the assay are 93% and 86%, respectively.
- 84 -
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