Entwicklung einer immuno-PCR für den sensitiven Nachweis von

Objectif du projet
Le but de ce travail de diplôme était de développer une méthode d’Immuno-PCR,
basé sur l’interaction entre la biotine et la streptavidine, pour au final être capable
d’analyser avec une grande sensibilité des protéines thérapeutiques qui seront
internalisées afin de tester son éventuel effet sur l’immunogénicité.
Méthodes | Expériences | Résultats
Le principe du test est le suivant : une molécule d’ADN biotinylée est liée à une
molécule de streptavidine à son extrémité 5’, ce complexe se fixe sur la protéine à
analyser qui a été préalablement biotinylé. La protéine modèle utilisée est la BSA
et celle-ci a été immobilisée sur une plaque recouverte de streptavidine : la
détection se fait par qPCR grâce à l’ajout de la molécule d’ADN-steptavidine.
Tout d’abord, la limite de quantification a été déterminée pour l’oligonucléotide
biotinylé libre à l’aide d’une qPCR, étant de 104 molécules/réaction. Ensuite,
différents supports recouverts en streptavidine ont été testés avec l’oligonucléotide
biotinylé afin de trouver lequel était plus aisé à utiliser. Il a été possible de
différencier les diverses concentrations d’oligonucléotides biotinylés avec une
plaque recouverte en streptavidine, mais seulement le 10% de l’oligonucléotide
biotinylé se trouve être lié.
Les résultats d’analyse avec la BSA biotinylée ne sont pas encore convaincants et
des améliorations supplémentaires sont encore nécessaires.
Afin de savoir s’il était possible d’internaliser une protéine avec le protocole qui a
été mis en place, l’EPO recombinante a été internalisée dans des cellules TF-1.
Un signal a pu être détecté grâce à une ELISA, par contre il a été difficile de
quantifier la protéine.
Développement d’une Immuno-PCR pour la
quantification de protéines
Diplômant/e Sara Ramos
Travail de diplôme
| édition 2016 |
Filière
Technologie du Vivant
Domaine d’application
Biotechnologie
Professeur responsable
Schmid Sergio
[email protected]
Partenaire
Zürcher Hochschule für
Angewandte Wissenschaften
(ZHAW)
Rohrer Jack
[email protected]
Schéma de la méthode d’immuno-PCR testée. L’oligonucléotide fixé à la
streptavidine, respectivement à la protéine biotinylée est détecté et quantifié
grâce à la PCR quantitative.