Développement d’une Immuno-PCR pour la quantification de protéines Diplômant/e Sara Ramos Objectif du projet Le but de ce travail de diplôme était de développer une méthode d’Immuno-PCR, basé sur l’interaction entre la biotine et la streptavidine, pour au final être capable d’analyser avec une grande sensibilité des protéines thérapeutiques qui seront internalisées afin de tester son éventuel effet sur l’immunogénicité. Méthodes | Expériences | Résultats Travail de diplôme | édition 2016 | Filière Le principe du test est le suivant : une molécule d’ADN biotinylée est liée à une molécule de streptavidine à son extrémité 5’, ce complexe se fixe sur la protéine à analyser qui a été préalablement biotinylé. La protéine modèle utilisée est la BSA et celle-ci a été immobilisée sur une plaque recouverte de streptavidine : la détection se fait par qPCR grâce à l’ajout de la molécule d’ADN-steptavidine. Tout d’abord, la limite de quantification a été déterminée pour l’oligonucléotide biotinylé libre à l’aide d’une qPCR, étant de 104 molécules/réaction. Ensuite, différents supports recouverts en streptavidine ont été testés avec l’oligonucléotide biotinylé afin de trouver lequel était plus aisé à utiliser. Il a été possible de différencier les diverses concentrations d’oligonucléotides biotinylés avec une plaque recouverte en streptavidine, mais seulement le 10% de l’oligonucléotide biotinylé se trouve être lié. Les résultats d’analyse avec la BSA biotinylée ne sont pas encore convaincants et des améliorations supplémentaires sont encore nécessaires. Afin de savoir s’il était possible d’internaliser une protéine avec le protocole qui a été mis en place, l’EPO recombinante a été internalisée dans des cellules TF-1. Un signal a pu être détecté grâce à une ELISA, par contre il a été difficile de quantifier la protéine. Technologie du Vivant Domaine d’application Biotechnologie Professeur responsable Schmid Sergio [email protected] Partenaire Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften (ZHAW) Rohrer Jack [email protected] Schéma de la méthode d’immuno-PCR testée. L’oligonucléotide fixé à la streptavidine, respectivement à la protéine biotinylée est détecté et quantifié grâce à la PCR quantitative.