INTERACTION DES CELLULES CANCÉREUSES AVEC L

JULIE LAFERRIÈRE
INTERACTION DES CELLULES CANCÉREUSES AVEC
L’ENDOTHÉLIUM VASCULAIRE DANS LE PROCESSUS
MÉTASTATIQUE
Thèse
présentée
à la Faculté des études supérieures
de l’Université Laval
pour l’obtention
du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
Biologie cellulaire et moléculaire
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
JUILLET 2003
© Julie Laferrière, 2003
i
Résumé
Les métastases sont une complication souvent irréversibles et fatales du cancer. L'adhérence et
la migration des cellules cancéreuses sur et à travers l'endothélium vasculaire sont des étapes
critiques du processus métastatique. Nous avons étudié le rôle des molécules d'adhérence,
E-sélectine et intégrines, ainsi que celui de la kinase SAPK2/p38 dans la régulation de
l'adhérence et la migration transendothéliale des cellules HT-29 provenant d’un carcinome du
colon. Le TNFα augmente fortement l'expression de la E-sélectine par les cellules
endothéliales humaine HUVEC. Cet effet est indépendant de l'activation de SAPK2/p38 induit
par le TNFα. L'adhérence des cellules HT-29 sur une monocouche de cellules HUVEC
prétraitées au TNFα dépend de l'expression de la E-sélectine mais est indépendante de
l'activité de SAPK2/p38 des cellules HUVEC et des cellules cancéreuses. Le blocage par des
anticorps spécifiques des intégrines des cellules HT-29 révèle aussi la participation de
l'intégrine β4 dans leur adhérence aux cellules HUVEC activées par le TNFα. L'adhérence par
l’intégrine β4 est impliquée plus tardivement que l’adhérence par la E-sélectine. L'adhérence
des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées mène à l'activation de SAPK2/p38 dans les
cellules cancéreuses. De plus, une protéine chimérique de E-sélectine/Fc induit l'activation
spécifique des kinases SAPK2/p38 et ERK des cellules HT-29. Ceci suggère que l'attachement
des cellules HT-29 à la E-sélectine implique un récepteur fonctionnel et signalétique.
Cependant, la liaison de la E-sélectine aux cellules HT-29 n’a pas conduit à la phosphorylation
de l’intégrine β4, suggérant que ces deux événements ne sont pas liés signalétiquement.
L’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées implique également un facteur
soluble non identifié. Ceci suggère que l’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium
est comparable à celle des lymphocytes, c’est-à-dire qu’elle implique l’utilisation séquentielle
de sélectines, chimiokines et intégrines.
Le blocage de l'augmentation de l'activité de
SAPK2/p38 induite par l’adhérence des cellules HT-29 empêche leur migration
transendothéliale. Nos résultats suggèrent que la régulation de la migration transendothéliale
des cellules cancéreuses implique deux étapes essentielles: une interaction spécifique avec
l'endothélium par l'utilisation séquentielle de molécules d'adhérence, telles que la E-sélectine
et l’intégrine β4, et une augmentation du potentiel migratoire par l'activation médiée par
l’adhérence de la voie SAPK2/p38.
ii
Abstract
Metastasis is a dreadful complication of cancer. Adhesion and migration of tumor cells on and
through the vascular endothelium are critical steps of the metastatic process. We investigated
the roles of the adhesion molecules E-selectin and integrins, as well as the role of the MAP
kinase SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2/p38), in modulating endothelial adhesion
and transendothelial migration of HT-29 colon carcinoma cells. TNFα strongly increases the
expression of E-selectin in human endothelial cells HUVEC. This effect is independent of the
activation of SAPK2/p38 induced by TNFα. Adhesion of HT-29 cells on a monolayer of
HUVEC pre-treated with TNFα is dependent on E-selectin expression but is independent of
SAPK2/p38 activity of both HUVEC and tumor cells. Blocking the integrins from HT-29
cells (α2, α3, α6, αvβ5, β1 and β4) with specific antibodies reveals a role for β4 integrin in
their adhesion to TNFα-treated HUVEC. The sequence of events showed that β4 integrin
adhesion is involved later then E-selectin adhesion. The adhesion of HT-29 cells to TNFαtreated HUVEC leads to the activation of SAPK2/p38 in the tumor cells, as reflected by the
increased phosphorylation of its downstream target, the actin polymerizing factor HSP27.
Moreover, a recombinant E-selectin/Fc chimera induces the specific activation of SAPK2/p38
and ERK (extracellular signal-regulated kinases) in HT-29 cells, suggesting that the binding of
E-selectin to HT-29 cells involves a functional and signaling receptor. However, the binding
of E-selectin to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of β4 integrin suggesting that the
two adhesion events are not signalingly linked. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated
HUVEC also implicates a soluble unidentified factor. This indicates that the adhesion of
cancer cells to the endothelium uses the same sequence as lymphocytes namely, selectins,
chemokines and integrins. Blocking the adhesion-mediated increase of SAPK2/p38 activity of
HT-29 cells inhibits their transendothelial migration. Overall, our results suggest that the
specific regulation of transendothelial migration of tumor cells involves two essential steps: 1)
adhesion to the endothelium by the sequential use of adhesion molecules, such as E-selectin
and β4 integrin, 2) increased motogenic potential through adhesion-mediated activation of the
SAPK2p38 pathway.
iii
Avant-propos
J’ai reporté l’écriture de cette section jusqu’à la toute fin. Elle se veut le point final de cette
aventure qui a été pour moi les études graduées. Je crois qu’il faut une certaine naïveté pour
débuter un doctorat. Cette innocence se perd tranquillement au fil du temps, pour faire place à
la détermination et à l’endurance, les deux composantes nécessaires pour terminer de telles
études. Au cours des années passées à l’Université Laval et au centre de recherche de l’HôtelDieu de Québec (CRHDQ), j’ai eu l’occasion de côtoyer plusieurs personnes qui ont eu sur
moi une influence importante. Je tiens à les remercier ici.
Je commence par mon directeur de recherche, le Dr Jacques Huot. Cet homme a été pour moi
un mentor. C’est un scientifique passionné, toujours motivé par de nouveaux résultats et qui
sait apporter de l’originalité à un projet.
Il m’a permis d’apprendre que pour rester
concurrentiel dans un monde où les moyens sont parfois inégaux entre les différents groupes,
il suffisait d’une approche nouvelle et originale. C’est également un excellent pédagogue et
superviseur. Il m’a offert une grande liberté de pensée tout en étant présent pour me diriger au
quotidien. Il possède surtout de grandes qualités humaines, dont le souci du bien-être de ceux
qui l’entoure. En sa compagnie, j’ai pu cheminer scientifiquement ainsi que personnellement.
Merci Dr Huot!
Dans le laboratoire du Dr Huot, j’ai eu le privilège de développer le projet de recherche qui
fait l’objet de cette thèse. Cette opportunité m’a permis d’apprendre comment débuter un
projet, l’orienter selon les objectifs du laboratoire ainsi que de mettre au point différentes
techniques. Au cours de mon séjour dans cette équipe, j’ai côtoyé plusieurs personnes. Je
tiens ici à remercier particulièrement Simon Rousseau, qui a été pour moi un modèle à suivre;
François Houle, l’assistant de recherche du Dr Huot, qui m’a appris comment travailler dans
un laboratoire ainsi que Laurent Lamalice, un compère de paillasse qui a rendu le quotidien
agréable.
Au cours de mes sept années passées au centre de recherche, j’ai également
rencontrer des gens qui ont transcendé le milieu du travail. Leur présence dans mon entourage
est encore bien vivante; je parle de Genevière Gingras-Breton, d’Olivier Larochelle et de Réna
Deschesnes. Leur présence a été très enrichissante. Également, je ne peux passer sous silence
iv
tous les différents chercheurs, personnel et étudiants que j’ai côtoyés au cours du temps qui
ont permis de rendre le séjour intéressant. Je crois sincèrement que le milieu est tout aussi
important que le travail qu’on y fait.
Évidemment, les études graduées sont rendues possible financièrement grâce à l’aide des
organismes subventionnaires. J’ai reçu des bourses du CRHDQ, du Fonds pour la formation
des Chercheurs et l’Aide à la Recherche-Fond de Recherche en Santé du Québec (FCARFRSQ), du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), et
de la Société de Recherche sur le Cancer Inc (SRC). Je dois également mentionner l’octroi
d’une bourse de congrès de l’Institut National du Cancer du Canada (INCC) et les subventions
des Instituts de Recherches en Santé du Canada (IRSC, anciennement le CRM, le Conseil de
Recherche médical du Canada) ainsi qu’une subvention et son renouvellement de la SRC sur
la base de mes travaux. Ces différentes sources financières m’ont également permis d’aller
présenter mes travaux à différents congrès nationaux et internationaux et ce, à toutes les
années de mes études graduées. Cette expérience m’a permis de mettre en perspectives tous
mes résultats ainsi que de rencontrer des gens fascinants et d’entendre parler de science de
manière inouïe. Je crois que tout étudiant devrait pouvoir aller en congrès au moins une fois
au cours de son doctorat.
La motivation de base pour aller en science était pour moi aussi forte qu’un battement de
coeur. Le soutien constant est venu de mes parents. Ils m’ont appris que les limites que l’on
possède sont celle que l’on s’impose et m’ont offert comme cadeau depuis le berceau la
curiosité, leur support inconditionnel et leur conviction en mon potentiel. Ils m’ont donné des
ailes pour voler. De manière plus large, je suis entouré de gens fiers de moi, qui me donnent
sans cesse l’énergie de continuer. Je pense ici à mon frère André, à mes oncles, tantes,
cousins et cousines qui m’ont tous suivi d’une manière ou d’une autre au cours de cette
aventure. Plus récemment, au cours de mes études graduées s’est également ajoutée une bellefamille, également une source de support importante.
J’ajoute ici aussi mes amies,
particulièrement Mélanie Kavanagh, qui est une complice du baccalauréat et qui termine son
doctorat également cette année, sa présence a été rassurante, agréable et stimulante.
Finalement, l’homme de ma vie, mon conjoint Eric Trottier. C’est le plus beau souvenir du
centre du recherche que je garde avec moi. Eric m’a encouragée, dirigée, stimulée, consolée,
v
félicitée et permis de vivre pleinement cette aventure. Il est ma source de motivation, mon
premier critique et mon réconfort. Si je termine aujourd’hui, c’est qu’il m’a encouragé dans
les doutes et les moments plus difficile et applaudi dans les moments de réussite. Il est une
partie intégrante de tout ce travail.
Voilà, mes travaux tendent à démontrer que le processus métastatique est dynamique et
articulé. J’ai aimé travailler sur mon projet, je souhaite qu’il puisse continuer et que la lecture
de cette thèse soit agréable et stimulante.
À Alice, Pierrette, Maurice et Raymond,
Qui ont donné un visage au cancer
et
À Eric, mon guide dans cette aventure
vii
Table des matières
Résumé........................................................................................................................................ i
Abstract...................................................................................................................................... ii
Avant-propos............................................................................................................................ iii
Table des matières .................................................................................................................. vii
Liste des tableaux...................................................................................................................... x
Liste des figures........................................................................................................................ xi
Liste des abréviations ............................................................................................................ xiii
1
Introduction....................................................................................................................... 2
1.1
Vue d’ensemble .......................................................................................................... 2
1.2
Le processus inflammatoire ........................................................................................ 4
1.2.1
Inflammation et cancer ....................................................................................... 9
1.3
Les cytokines ............................................................................................................ 10
1.3.1
Le facteur de nécrose tumorale, TNF (Tumor-Necrosis Factor) ...................... 12
1.3.2
Chimioattractants / Chimiokines....................................................................... 16
1.4
Les molécules d’adhérence....................................................................................... 20
1.4.1
Les sélectines..................................................................................................... 22
1.4.2
Les intégrines .................................................................................................... 27
1.4.3
Les cadhérines................................................................................................... 31
1.4.4
La superfamille des Immunoglobulines – Molécules d’adhérence cellulaires
(Ig–CAM) .......................................................................................................... 33
1.5
Les voies MAP kinases............................................................................................. 36
1.5.1
ERK (extracellular signal-regulated kinase) .................................................... 41
1.5.2
p38..................................................................................................................... 42
1.6
La migration cellulaire.............................................................................................. 45
1.6.1
Les points focaux d’adhérence et le cytosquelette ............................................ 45
1.6.2
L’invasion.......................................................................................................... 47
1.6.3
La migration transendothéliale......................................................................... 51
1.7
Les métastases .......................................................................................................... 52
1.7.1
Spécificité du processus métastatique............................................................... 53
1.7.2
Approche thérapeutique .................................................................................... 56
1.8
Objectifs du projet de recherche ............................................................................... 59
1.8.1
Aperçu de la thèse ............................................................................................. 60
viii
2
La migration transendothéliale des cellules de carcinome de côlon nécessite
l’expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales et l’activation de
SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2) dans la cellule tumorale. ................... 62
2.1
Résumé ..................................................................................................................... 63
2.2
Article ....................................................................................................................... 64
2.2.1
Summary............................................................................................................ 65
2.2.2
Footnotes........................................................................................................... 65
2.2.3
Introduction....................................................................................................... 66
2.2.4
Experimental procedures .................................................................................. 67
2.2.5
Results ............................................................................................................... 72
2.2.6
Discussion ......................................................................................................... 91
2.2.7
Acknowledgments .............................................................................................. 94
2.2.8
References ......................................................................................................... 94
3
Régulation du processus métastatique par la E-sélectine et SAPK2/p38 ................ 100
3.1
Résumé ................................................................................................................... 101
3.2
Article ..................................................................................................................... 102
3.2.1
Abstract ........................................................................................................... 103
3.2.2
Selectins: classification, structure and binding .............................................. 103
3.2.3
E-Selectin and cell signaling........................................................................... 105
3.2.4
Stress-activated protein kinase-2/p38 (SAPK2/p38)....................................... 107
3.2.5
Joint role of E-selectin and SAPK2/p38 in metastasis.................................... 110
3.2.6
Conclusions and future directions .................................................................. 113
3.2.7
Acknowledgments ............................................................................................ 114
3.2.8
References ....................................................................................................... 116
4
L'adhérence E-sélectine-dépendante des cellules cancéreuses HT-29 aux cellules
endothéliales médie l'adhérence intégrine β4-dépendante des cellules cancéreuses
........................................................................................................................................ 122
4.1
Résumé ................................................................................................................... 123
4.2
Article ..................................................................................................................... 124
4.2.1
Summary.......................................................................................................... 126
4.2.2
Introduction..................................................................................................... 126
4.2.3
Experimental procedures ................................................................................ 128
4.2.4
Results ............................................................................................................. 130
4.2.5
Discussion ....................................................................................................... 138
4.2.6
References ....................................................................................................... 141
5
Résultats complémentaires........................................................................................... 148
5.1
Rôle d’un médiateur soluble d’origine endothéliale dans l’adhérence des cellules
HT-29 aux cellules endothéliales............................................................................ 148
5.2
Identification du ligand de la E-sélectine ............................................................... 151
5.3
Adhérence des cellules HT-29 à des cellules endothéliales d’origine différentes.. 156
ix
6
7
Discussion générale ....................................................................................................... 164
6.1
L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est séquentielle ................. 165
6.2
L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est spécifique.................... 167
6.3
L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est signalétique................. 168
Conclusions et perspectives.......................................................................................... 170
7.1
Conclusions générales ............................................................................................ 170
7.2
Perspectives et orientation future............................................................................ 170
7.2.1
Identification du ligand de la E-sélectine ....................................................... 171
7.2.2
Caractérisation du facteur soluble.................................................................. 171
7.2.3
Caractérisation de la spécificité de l’interaction selon l’origine des cellules
endothéliales et cancéreuses. .......................................................................... 173
7.2.4
Développement d’un modèle d’adhérence en condition de flux ..................... 173
7.3
Applications ............................................................................................................ 174
A
B
Statistiques canadiennes du cancer ............................................................................. 178
A.1
Nomenclature.......................................................................................................... 178
A.2
Métastases selon l’origine du cancer ...................................................................... 179
CV - Curriculum Vitae .................................................................................................. 193
B.1
Publications............................................................................................................. 193
B.2
Communications ..................................................................................................... 194
Bibliographie ......................................................................................................................... 196
x
Liste des tableaux
Tableau 1-1 Les familles de chimiokines et leurs récepteurs............................................... 19
Tableau 1-2 Nomenclature des MAP kinases........................................................................ 37
Tableau 1-3 Nomenclature des MKK .................................................................................... 39
Tableau 1-4 Nomenclature des MAP3K ................................................................................ 39
Tableau 1-5 Gènes suppresseur de métastases...................................................................... 55
Tableau 1-6 Phénotype métastatique de cancer humains .................................................... 56
Tableau 1-7 Approche thérapeutique contre la cascade métastatique ............................... 58
Tableau A-1 Incidence des métastases dans les organes principaux................................. 191
xi
Liste des figures
Figure 1-1 Paradigme du recrutement leucocytaire............................................................... 5
Figure 1-2 Modèle de spécificité d’interaction........................................................................ 8
Figure 1-3 Cibles moléculaires des AINS et des drogues anticancéreuses dans la cellule
cancéreuse du côlon............................................................................................... 11
Figure 1-4 Modèle d’interactions entre cytokines ................................................................ 13
Figure 1-5 Famille des récepteurs d’adhérence .................................................................... 21
Figure 1-6 Les différents hétérodimères d’intégrines et leurs substrats ............................ 29
Figure 1-7 Représentation schématique des sentiers signalétiques induit par VCAM-1.. 35
Figure 1-8 Le coeur du module MAP kinase......................................................................... 38
Figure 1-9 Représentation schématique de la cascade ERK ............................................... 43
Figure 1-10 La migration cellulaire ....................................................................................... 49
Figure 1-11 Plasticité de la migration tumorale.................................................................... 50
Figure 1-12 La cascade métastatique..................................................................................... 54
Figure 2-1 TNFα-induced de novo expression of E-selectin is not mediated by activation
of SAPK2/p38......................................................................................................... 74
Figure 2-2 E-selectin-dependent adhesion of tumor cells to endothelial cells does not
require activation of SAPK2/p38. ........................................................................ 76
Figure 2-3 Dose- and time-dependent activation of SAPK2/p38 induced by TNFα in
HUVEC................................................................................................................... 79
Figure 2-4 Transendothelial migration of HT-29 tumor cells requires E-selectin
expression by endothelial cells and increased SAPK2/p38 activity in the tumor
cells.......................................................................................................................... 81
Figure 2-5 Inducibility of the SAPK2/p38 pathway in HT-29 tumor cells......................... 84
Figure 2-6 E-selectin-mediated adhesion of HT-29 tumor cells to endothelial cells
activates the phosphorylation of HSP27 in the tumor cells. .............................. 86
Figure 2-7 Time-dependent activation of SAPK2/p38 by E-Selectin.................................. 87
Figure 2-8 Migration of HeLa cells through but not adhesion on endothelial cells depends
on SAPK2/p38 activity. ......................................................................................... 90
xii
Figure 3-1 Selectins and their counterreceptors/ligands.................................................... 106
Figure 3-2 The SAPK2/p38 pathway. .................................................................................. 109
Figure 3-3 Activation of SAPK2/p38 by E-selectin and regulation of transedothelial
migration by E-selectin-mediated activation of SAPK2/p38 in cancer cells.. 112
Figure 3-4 A working model to explain the regulation of transendothelial migration of
cancer cells. .......................................................................................................... 115
Figure 4-1 HT-29 cells adhesion to E-selectin/Fc chimera................................................. 133
Figure 4-2 Adhesion of HT-29 cells to by TNFα-activated HUVEC is mediated
sequentially by E-selectin and β4 integrin. ....................................................... 135
Figure 4-3 Time-dependent activation of p38 and ERK induced by the binding of HT-29
cells to E-selectin/Fc. ........................................................................................... 136
Figure 4-4 Binding of E-selectin/Fc to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of
integrin β4. ........................................................................................................... 137
Figure 5-1 Influence du milieu conditionné par un prétraitement au TNF sur l’adhérence
des cellules HT-29................................................................................................ 150
Figure 5-2 Mise en évidence sur les cellules HT-29 d’un candidat potentiel d’un ligand de
la E-sélectine ........................................................................................................ 154
Figure 5-3 L’isolation du candidat comme ligand de la E-sélectine est sensible au calcium
............................................................................................................................... 155
Figure 5-4 Réponse de la kinase p38 de différentes lignées endothéliales à un stress ..... 158
Figure 5-5 Adhérence des cellules HT-29 aux HUVEC et aux HBrMEC ........................ 160
Figure 5-6 La E-sélectine est exprimée uniquement sur les cellules HUVEC.................. 161
Figure 7-1 Chambre de flux parallèle.................................................................................. 175
xiii
Liste des abréviations
GÉNÉRALES
5-FU
5-Fluorouracile
ADN
Acide désoxyribonucléique
AINS
Anti-inflammatoires non-stéroïdiens
AMFR
Autocrine Motility Factor Receptor
AMPc
Adénosine Monophosphate cyclique
AP
Protéine activatrice (Activator Protein)
APC
Adenomatous polyposis coli
ATF-2
Facteur de transcription d'activation-2 (Activation Transcription Factor)
CAM
Molécule d'adhérence cellulaire (Cellular Adhesion Molecule)
CDKs
Kinases dépendantes des cyclines (Cyclin-Dependent Kinases)
COX
Cyclooxygénase
CPT-11
Irinotecan
CRP
Complement Regulatory Protein
DD
Domaine de la mort (Death Domain)
E-cadhérine
Cadhérine de l'épithélium (Epithelilal-cadherin)
EGF
Facteur de croissance épidermique (Epidermal Growth Factor)
EGFR
Récepteur du facteur de croissance épidermal (Epidermal Growth Factor
Receptor)
ERM
Ezrin-Radixin-Moesin
ERK
Kinase régulée par un signal extracellulaire (Extracellular signal-Regulated
Kinase)
ESL-1
Ligand 1 de la E-selectine (E-selectin ligand-1)
FADD
Protéine associée au domaine de la mort de FAS (FAS-Associated Death
Domain)
xiv
FAK
Kinase d'adhérence focale (Focal Adhesion Kinase)
FGF
Facteur de croissance fibroblastique (Fibroblast Growth Factor)
GF
Facteur de croissance ( Growth Factor )
GFP
Protéine fluorescente verte ( Green Fluorescent Protein )
GlyCAM-1
Molécule-1 d'adhérence cellulaire dépendante de la glycosylation
(Glycosylation-dependent Cell Adhesion Molecule-1)
GDP
Guanosine di-phosphate
GTP
Guanosine tri-phosphate
HAPEC
Cellules endothéliales humaines immortalisées de l'appendice
HBrMEC
Cellules endothéliales humaines immortalisées du cerveau
HEV
High Endothelial Venules
HIMEC
Cellules endothéliales humaines immortalisées de l'intestin
HLMEC
Cellules endothéliales humaines immortalisées du poumon
HPLNEC.B3 Cellules endothéliales humaines immortalisées des ganglions lymphatiques
HSkMEC
Cellules endothéliales humaines immortalisées de la peau
HSPs
Protéines de choc thermique (Heat Shock Proteins)
HSpMEC
Cellules endothéliales humaines immortalisées de la rate
HSP27
Protéine de choc thermique 27 (Heat Shock protein of 27 kDa)
HUVEC
Cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical humain (Human
Umbilical Vein Endothelial Cells)
ICAM
Molécule d'adhérence intercellulaire (Intercellular Adhesion Molecule)
IEF/2D
Séparation isoélectrique à deux dimensions (Isoelectric focussing/two
dimension)
IFN
Interféron
IκB
Inhibiteur cytoplasmique de NF-kappa B (Inhibitor kappa B)
IκK
Kinase de IκB (IκB kinase)
IL
Interleukine
xv
ILK
Kinase liée aux intégrines (Integrin-linked kinase)
IRS
Substrat du récepteur de l'insuline (Insulin Receptor Substrate)
JNK
Kinase de la partie N-terminale de la protéine c-Jun (c-Jun N-terminal Kinase)
KSR
Protéine kinase suppresseur de RAS (Kinase suppressor of Ras)
LAD-1
Déficit d'adhérence leucocytaire de type I (Leukocyte Adhesion Deficiency)
LC-MS/MS
Chromatographie Liquide, couplée à la Spectrométrie de Masse
LFA-1
Intégrine αLβ2 (Leucocyte Function Antigen)
LMNH
Les lymphomes malins non hodgkinien
LPS
Lipopolysaccharide
LuECAM
Molécule d'adhérence des cellules endothéliales du poumon (Lung Endothelial
Cell Adhesion Molecule)
MAC-1
Intégrine αMβ2
MAdCAM-1 Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule
MALDI-TOF Désorption-Ionisation au Laser Assistée par Matrice - Temps de Vol (MatrixAssisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight)
MALT
Mucosa Associated Lymphoid Tissue
MAP
Protéine activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein)
MAPK
Protéine-kinase activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein Kinase)
Mapkapk-2/3 MAPK-activated protein kinase 2/3
MAPKK
Protéine-kinase kinase activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein
Kinase Kinase)
MEC
Matrice extra-cellulaire
MEK
MAP/ERK kinase
MKK
MAP kinase kinases
MKKK
MAP kinase kinase kinases
MMPs
Métalloprotéinases de la matrice (Matrix Metallproteinase)
MNK
MAP kinase-interacting kinase
xvi
MSK
mitogen- and stress-activated protein kinase
NF-κB
Facteur nucléaire kappa B (Nuclear factor kappa B)
Oligo
Oligonucléotide
PAF
Fateur activateur des plaquettes (Platelet-activating factor)
PAGE
Électrophorèse en gel de polyacrylamide (Polyacrylamide gel electrophoresis)
PAK
p21-activated protein kinase
PCR
Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction)
pI
Point isoélectrique
P13K
Kinase-3 phosphoinositide (Phosphoinositide 3-Kinase)
p38
Protéine-kinase de 38 kDa
PDGF
Facteur de croissance dérivé des plaquettes (Platelet-derived growth factor)
PKA
Protéine kinase A
PKC
Protéine kinase C
PMN
Polymorphonucléaires
PRAK
p38-regulated/activated kinase
PSGL-1
P-selectin glycoprotein ligand-1
PTB
Domaine d'attachement phosphotyrosine (Phosphotyrosine binding domain)
ROS
Reactive Oxygen Species
SAPK
Protéine-kinase activée par le stress (Stress Activated Protein Kinase)
SAPK2
Protéine-kinase 2 activée par le stress (Stress Activated Protein Kinase-2)
SOS
Facteur d’échange de GTP pour Ras (Son of Sevenless)
TADC
Cellules dendritiques associées aux tumeurs (Tumor-associated dendritic cells)
TAM
Macrophages associés aux tumeurs (Tumor-associated macrophages)
TCF
Facteur de transcription (terneray complex factor)
TGF-β
Facteur de croissance tumorale-béta (Tumor growth factor-β)
xvii
TIL
Lymphocytes associés aux tumeurs (Tumor-infiltrating lymphocyte)
TNF
Facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor)
TNF-α
Facteur de nécrose tumorale alpha (Tumor Necrosis Factor Alpha)
TNFR
Récepteur du facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor Receptor)
TRADD
Protéine associée au domaine de la mort du TNFR (TNFR-Associated Death
Domain)
TRAF
Facteur associé au TNFR (TNFR-Associated Factor)
TRAIL
Ligand inducteur d'apoptose relié au facteur de nécrose tumorale (Tumor
necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand)
uPA
Urokinase Plasminogen Activator
uPAR
Urokinase Plasminogen Activator Receptor
VLA-4
Intégrine α4β1 (Very late antigen)
VCAM-1
Molécule d'adhérence de la cellule vasculaire (Vascular Cell Adhesion
Molecule)
VE-cadhérine Cadhérine spécifique à l'endothélium vasculaire (Vascular endothelial-specific
cadherin)
VEGF
Facteur de croissance endothélial vasculaire (Vascular Endothelial Growth
Factor)
WT
Wild Type
UNITÉS
µ
Micro
Ci
Curie
Da
Dalton
g
Gramme
h
Heure
kb
Kilobase
m
Milli
xviii
M
Molaire
min
Minute
mm
Millimètre
n
Nano
RÉACTIFS ET SUBSTANCES CHIMIQUES
DMEM
Dulbecco's modified Eagle's medium
DMSO
Sulfoxyde de diméthyle
DTT
Dithiothréitol
EBSS
Earle’s balanced salt solution
ECGS
Endothelial cell growth supplement
EDTA
Acide éthylène-diamine tétra acétique (ethylene diamine tetraacetic acid)
EGTA
Acide éthylène glycol-bis-b aminoéthyl éther-N, N, N', N'-tétra acétique
(ethylene glycol tetra acetic acid)
FBS
Sérum fœtal de bovin (Fœtal Bovine Serum)
FBS HI
Sérum foetal de bovin inactivé par la chaleur (Heat inactivated FBS)
FITC
Fluorescein isothiocyanate
HEPES
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HRP
Peroxydase de raifort (Horseradish Peroxidase)
MOPS
Acide propane sulfonique 3-(N-morpholino)
PBS
Tampon phosphate salin (Phosphate buffer salin)
PMSF
Fluorure de phényl-méthyl sulfoxide (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride)
SDS
Dodécyle-sulfate de sodium (Sodium Dodecyl Sulfate)
TRIS
Tris(hydroxyméthyle)aminométhane
Chapitre 1
Introduction
2
1
Introduction
1.1 Vue d’ensemble
Le mot cancer est un mot latin, qui signifie crabe ou écrevisse. Tout comme le crabe qui
représente plusieurs espèces, le cancer comprend près de deux cents maladies différentes,
toutes caractérisées par une croissance incontrôlée de cellules. Ces cellules s’accumulent pour
former une tumeur qui envahit et détruit, par la suite, les tissus normaux avoisinants, d’où la
malignité.
En 2001 au Canada, le cancer était la deuxième cause principale de mortalité.
cependant la première cause de décès prématuré.
Il était
Pour tous les cancers confondus, les
estimations sont qu’une personne sur trois sera atteinte d’un cancer au cours de sa vie et
qu’une personne sur quatre mourra des suites de cette maladie (Source : Société Canadienne
du Cancer). Les principales complications morbides associées au cancer sont la résistance à la
thérapie traditionnelle (chimiothérapie, radiothérapie), ainsi que l’apparition de métastases,
c’est-à-dire de nouvelles tumeurs à distance de la première lésion.
Le processus métastatique implique une série d’étapes consécutives inter-reliées. Pour former
une métastase cliniquement visible, toutes ces étapes doivent être réussies. La tumeur initiale
doit se vasculariser pour dépasser le diamètre critique de 1mm. Après l’invasion du tissu
environnant, les cellules cancéreuses peuvent pénétrer dans les vaisseaux sanguins ou
lymphatiques. Une fois dans ces vaisseaux, les cellules cancéreuses peuvent proliférer à cet
endroit, se détacher et se déplacer avec la circulation. Cette embolie tumorale doit survivre en
circulation pour s’arrêter dans un nouveau lit vasculaire. La cellule cancéreuse doit par la
suite s’attacher à l’endothélium, le traverser, migrer dans l’environnement du nouvel organe
puis proliférer pour former une micrométastase. La micrométastase devra développer un
réseau vasculaire et éviter la réponse immunitaire pour survivre et croître [1].
3
Ce n’est pas toutes les cellules d’une tumeur qui ont le potentiel de former une métastase. En
1889, Stephen Paget observait, suite à l’analyse de plus de 900 rapports d’autopsie, que les
métastases ne se produisaient pas de manière aléatoire.
maintenant célèbre, du « seed and soil ».
Il a alors postulé l’hypothèse,
Cette hypothèse veut que certaines cellules
tumorales (la semence - seed) ont une affinité particulière pour l’environnement de certains
organes (le sol - soil). La croissance d’une métastase est seulement possible lorsque la
semence est compatible avec le sol. Cette idée a survécu à diverses tendances et d’autres
idées. Aujourd’hui, cette hypothèse réside sur trois principes [2]:
1- Les tumeurs sont composées de cellules cancéreuses et de cellules de l’hôte. De plus,
la tumeur est elle-même hétérogène et contient des sous-populations génotypique et
phénotypique de cellules.
2- Le processus métastatique est sélectif pour une cellule qui réussit à franchir toutes les
étapes, de l’invasion initiale à la nouvelle vascularisation.
Ainsi, bien qu’une
métastase puisse avoir une origine clonale, chaque métastase peut être différente.
3- La métastase peut se développer uniquement dans un organe particulier.
L’environnement de cet organe est unique, la métastase en est influencée et elle
interagit avec les mécanismes homéostatiques de cet endroit.
L’avenir de la thérapie contre le cancer et ses métastases n’est pas de cibler uniquement la
cellule tumorale, mais bien les mécanismes locaux qui promeuvent sa progression et sa survie
[2].
Ces mécanismes locaux sous-entendent des contacts étroits entre les cellules tumorales et
l’hôte. Ces contacts sont assurés par les molécules d’adhérence. L’expression et l’affinité de
ces dernières peuvent êtres modifiées au cours de la progression tumorale. Les mécanismes
locaux qui favorisent la croissance et la survie tumorale dépendent également des différents
signaux intracellulaires qui seront générés suite à ces contacts.
Cette thèse porte sur l’étude des mécanismes de l’interaction entre la cellule cancéreuse et la
cellule endothéliale, une étape importante du processus métastatique. Plus précisément, ces
travaux visent, à l’aide de lignées cellulaires humaines en sytème reconstitué, à spécifier les
4
molécules favorisant le contact cellule cancéreuse – cellule endothéliale et à identifier la
signalisation intracellulaire qui en découle.
L’interaction des cellules circulantes avec
l’endothélium est un phénomène connu et étudié dans le processus inflammatoire et le trafic
leucocytaire.
Le processus inflammatoire est un bon modèle de référence et a permis
d’extrapoler l’hypothèse que les cellules cancéreuses usurpent le processus inflammatoire pour
interagir avec l’endothélium. L’originalité de ce travail est de permettre de relier une
signalisation spécifique initiée dans la cellule cancéreuse suite à leur adhérence aux cellules
endothéliales.
1.2 Le processus inflammatoire
L’inflammation est un processus normal de réponse tissulaire à toute agression. Elle est
caractérisée par quatre signes cardinaux : douleur, rougeur, chaleur et œdème. Au niveau
cellulaire, elle se caractérise par une infiltration leucocytaire. Le recrutement leucocytaire est
un paradigme multi-étapes bien documenté.
Une inflammation aiguë est caractérisée par l’expression et la sécrétion de médiateurs
solubles, telles les cytokines. Ces dernières activent l’endothélium qui exprimera différentes
molécules d’adhérence. L’adhérence des leucocytes avec l’endothélium activé se fait en trois
étapes séquentielles. Premièrement les leucocytes sont captés et roulent sur l’endothélium par
l’intermédiaire des sélectines. Par la suite, les leucocytes sont activés par les chimioattractants
relargués par l’endothélium.
Finalement les leucocytes s’arrêtent, adhèrent fortement à
l’endothélium et migrent à travers ce dernier. Ce processus de migration fait intervenir les
intégrines du leucocyte qui se lient à des membres de la superfamille des immunoglobulines
exprimés sur l’endothélium [3, 4]. Ces étapes sont schématisées à la figure 1-1.
5
Figure 1-1 Paradigme du recrutement leucocytaire.
L’entrée des leucocytes dans les tissus est contrôlée par une cascade d’interactions.
L’attachement initial des leucocytes à la surface des cellules endothéliales se fait par
les sélectines, ce qui leur permet de rouler. Par la suite, les leucocytes entreront en
contact avec des facteurs activateurs, tels les chimiokines, présents sur la surface de
l’endothélium. Ceci permet l’activation des intégrines du leucocyte. Les intégrines
activées lieront les membres de la superfamille des immunoglobulines (CAMs – Cell
Adhesion Molecules), ce qui permettra une adhérence ferme, le pré-requis pour une
migration dirigée des leucocytes sur la surface des cellules endothéliales. Adapté de
[5].
6
7
Le processus d’émigration leucocytaire a été décrit pour la première fois en 1889 par
Cohnheim [6]. Cette séquence d’événements a été reconstruite in vitro à l’aide des éléments
purifiés.
Les travaux de Lawrence et Springer [6] ont démontré qu’en présence du
chimiostimulant fMLP, un neutrophile soumis à un flux pouvait rouler et s’immobiliser en
s’attachant fermement sur une bicouche lipidique contentant uniquement la P-sélectine et
ICAM-1. Ces expériences ont permis de reproduire in vitro le recrutement de leucocytes lors
de l’inflammation, et donc de préciser la séquence minimale d’événements moléculaires
impliqués.
Ces travaux ont également permis de démontrer l’importance des résultats
d’adhérence sous un flux circulant versus une adhérence statique. En effet, dans un essai
d’adhérence statique, les neutrophiles activés peuvent s’attacher fortement à la molécule
ICAM-1 par l’intermédiaire de leurs intégrines. Cependant, sous une condition de flux avec
une force de cisaillement comparable à celle que l’on retrouve en circulation dans les veinules
post-capillaires, le neutrophile activé ne parvient pas à s’attacher à ICAM-1. Pour y parvenir,
le neutrophile nécessite la présence de la P-sélectine afin de sortir du flux circulant en roulant
et de pouvoir s’arrêter sur ICAM-1.
Les différentes molécules identifiées par Lawrence et Springer comme étant minimalement
essentielles pour permettre le roulement et l’adhérence des neutrophiles peuvent être
remplacées par différents membres de leurs familles respectives (sélectines, chimiokines et
intégrines) pour apporter une spécificité. En effet, il a été proposé par Springer [4] le modèle
du code de lieux à trois étapes (Three-Step Area Code Model) : la séquence sélectines,
chimioattractants et intégrines. Ce modèle permet d’expliquer l’infiltration leucocytaire à un
site inflammatoire précis ainsi que la recirculation distinctive de différentes sous-classes de
lymphocytes. Ce concept est illustré à la figure 1-2.
8
Figure 1-2 Modèle de spécificité d’interaction.
Les leucocytes utilisent séquentiellement des interactions médiées par les sélectines,
les chimioattractants et par les intégrines. L’utilisation combinatoire des différentes
molécules à chaque étape peut être spécifique pour des sous-populations de
leucocytes. Cette spécificité pour les monocytes et/ou neutrophiles peut être
produite à un site inflammatoire donné. Adapté de [4].
9
1.2.1 Inflammation et cancer
On retrouve plusieurs cellules inflammatoires associées aux tumeurs. Cette observation a été
signalée pour la première fois en 1863 par Rudolf Virchow, qui nota la présence de leucocytes
dans le tissue néoplasique et supposa qu’il existait un lien entre l’inflammation et le cancer
[7]. On retrouve des cellules associées à l’inflammation dans le stroma ainsi que dans la
tumeur.
Ce sont les macrophages associés aux tumeurs (TAM – Tumor-associated
macrophages), les cellules dendritiques associées aux tumeurs (TADC – Tumor-associated
dendritic cells) et les lymphocytes associés aux tumeurs (TIL – Tumor-infiltrating
lymphocyte), principalement des lymphocytes T. L’ensemble de ces cellules contribuent à la
production de cytokines, à la croissance tumorale ainsi qu’à l’immunosuppression associée au
cancer. En effet, une tumeur amène le paradoxe d’une inflammation locale avec un effet antiinflammatoire systémique [7].
L’inflammation est divisée de manière commune en trois phases : l’inflammation aigüe, la
réponse immune et l’inflammation chronique.
La source de l’inflammation est souvent
d’étiologie inconnue, ce qui amène des traitements dont le but est le soulagement de la douleur
et la diminution, ou l’arrêt des processus de dommages tissulaires. Le traitement le plus
commun est l’utilisation des anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS). Les AINS incluent
une variété de molécules, l’aspirine et les salicylates ainsi que d’autres composés comme
l’ibuprofène et le sulindac. Le principal mécanisme d’action est l’inhibition de la biosynthèse
des prostaglandines en bloquant l’enzyme cyclo-oxygénase (COX). Selon l’AINS, l’inhibition
est réversible ou irréversible et elle affecte l’isoforme I et/ou II de la COX. Les effets non
désirés incluent l’ulcération gastrique et des défaillances rénales [8].
Les AINS semblent maintenant impliqués dans la prévention du cancer.
En effet, une
utilisation prolongée des AINS diminue le risque de cancer colorectal [9]. Les mécanismes
responsables cet effet protecteur agiraient à plusieurs niveaux. Les AINS auraient un effet
directement sur la cellule cancéreuse.
La résistance des cellules cancéreuses à la
chimiothérapie est en partie due à la résistance à l’induction de l’apoptose. Les AINS auraient
un effet indépendant de celui sur la COX sur l’induction de l’apoptose dans la cellule
10
cancéreuse (figure 1-3).
Ainsi, on pourrait imaginer une thérapie combinatoire de la
chimiothérapie classique conjuguée aux AINS pour diminuer la croissance tumorale [10].
1.3 Les cytokines
Les cytokines sont des médiateurs solubles sécrétés par une variété de cellules, ayant un effet
autocrine ou paracrine. Elles sont généralement synthétisées rapidement suite à un stimulus.
Les cytokines ont une variété d’effets, allant d’une amplification de la réponse immunitaire, à
l’inflammation, au recrutement cellulaire, au développement lymphoïde en passant par le
SIDA et le cancer. [11, 12]
L’effet des cytokines est transmis par l’intermédiaire de leurs récepteurs spécifiques. Ils
peuvent être séparés en cinq familles [11, 13]:
1- Les récepteurs de l’IL-1. Ceux-ci possèdent une structure typique des membres de la
superfamille des immunoglobulines
2- Les récepteurs de la famille des hématopoïétines. Certains récepteurs de cette famille
ont plusieurs chaînes, tel IL-2R qui est composé des chaînes IL-2R α, β et γ. Un point
intéressant de cette famille est que la chaîne IL-2Rγ est partagée par d’autres
récepteurs, tels les récepteurs de l’IL-4, 7, 9 et 13.
3- Les récepteurs de la famille du TNF [14]. Ces récepteurs partagent une homologie de
structure dans le site d’interaction avec le ligand. Il semble que tous les ligands de
cette famille agissent en trimères. Il en sera question au point 1.3.1.
4- Les récepteurs de l’interféron. Les interférons sont connus pour leur activité antivirale et leur capacité de moduler la réponse immune.
5- Les récepteurs des chimiokines [12]. Ce sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés à des protéines G. Il en sera question au point 1.3.2.
11
Figure 1-3 Cibles moléculaires des AINS et des drogues anticancéreuses dans la
cellule cancéreuse du côlon
Représentation schématique des sentiers activés par les cytokines, les facteurs de
croissance et les ligands de type FAS sur la survie et l’apoptose. Les AINS sont
représentés en rouge et les drogues anti-cancéreuses, en bleu. Adapté de [10]
12
Dans les tissus, on retrouve un réseau inter-reliées de production de cytokines. De manière
individuelle, elles peuvent stimuler, inhiber ou modifier la réponse à d’autres cytokines. Cette
interrelation est illustrée à la figure 1-4. Dans le développement d’une tumeur, elles régulent
l’infiltration leucocytaire, stimulent la néovascularisation et peuvent contribuer au processus
métastatique.
Les cytokines peuvent également influencer la croissance et la survie des
cellules cancéreuses. Cependant, dans certaines conditions, elles peuvent contribuer à la
destruction de la tumeur par la réponse immunitaire. Ces différents effets sont modulés selon
les cytokines exprimées, ce qui peut être modifié dans un contexte cancéreux et ainsi
promouvoir la croissance tumorale [15].
1.3.1 Le facteur de nécrose tumorale, TNF (Tumor-Necrosis Factor)
L’histoire de la découverte du TNF (ou TNFα) est intimement liée à celle de la thérapie du
cancer. En 1868, Brunes avait observé chez certaines personnes atteintes du cancer que les
tumeurs régressaient spontanément suite à une infection bactérienne aiguë. En 1894, William
Colley observe qu’un extrait bactérien peut amener une régression tumorale. En 1944, Shear
et collaborateur isole le LPS (lipopolysaccharide) de bactéries Gram-négative. Le LPS induit
chez la souris une nécrose hémorragique des tumeurs. En 1962, O’Malley transfère du sérum
de souris traités au LPS chez des souris porteuses de tumeurs et observe une nécrose tumorale.
En 1975, c’est l’apparition du terme tumor-necrosis factor par Carswell et collaborateur, qui
ont confirmé l’effet du sérum induit par le LPS sur les tumeurs de souris et ont également
démontré l’effet du sérum induit par le LPS sur la mortalité de cellules cancéreuses en culture.
C’est finalement en 1984 que le groupe de Pennica a rapporté le clonage de l’ADN
complémentaire de la protéine TNF [16].
13
Figure 1-4 Modèle d’interactions entre cytokines
Les cytokines interagissent de manière très contrôlée avec l’environnement. Ici, la
présence ou l’absence de certaines cytokines modifient la régulation de l’angiogénèse.
Par exemple, en présence de IL-12 il y a production d’interféron, qui diminue les
chimiokines ELR (chimiokines CXC possédant le motif ELR avant la première
cystéine) et augmente les chimiokines non-ELR, ce qui inhibe l’angiogénèse. Adapté
de [12]
14
Le TNF est un polypeptide de 17 kDa qui agit sous forme d’homotrimère. Il se présente
comme une protéine trans-membranaire, pouvant agir de façon juxtacrine. Il peut également
être clivé et relargué sous forme soluble. Il possède deux récepteurs, le p55 TNFR (CD120a)
et le p75 TNFR (CD120b). La forme p55 est exprimée de manière ubiquiste et est responsable
de plusieurs aspects de la réponse immunitaire. Au niveau cellulaire, elle entraîne également
l’apoptose et dans l’organisme, elle est responsable de l’induction de changements tels la
fièvre, la perte d’appétit et la cachexie. Le récepteur p75 est exprimé principalement sur les
cellules hématopoïétiques et est activé principalement par le TNF membranaire. Ses effets
semblent plutôt limités et dans la plupart des cas, ses réponses peuvent être induites également
par le récepteur p55 [14, 15].
La liaison du TNF à son récepteur active différents sentiers de signalisation dont la spécificité
est acquise par les différents adaptateurs recrutés au récepteur. On distingue cinq sentiers
émanant de la liaison du TNF à son récepteur [14] :
1- Les sentiers d’induction de mort cellulaire – Le récepteur du TNF possède dans son
domaine cytoplasmique un domaine de mort (DD, Death Domain), une séquence
importante dans l’effet cytotoxique du récepteur. Le domaine DD du TNFR recrute la
protéine adaptatrice TRADD (TNFR-associated death domain), qui par la suite
recrutera des protéines tel FADD (FAS-associated death domain).
Ces dernières
amènent à l’activation des pro-caspase-8 et –10, impliquées dans la réponse
apoptotique [14, 16].
2- La signalisation lipidique – La liaison du TNF à son récepteur conduit à la formation
de différents médiateurs lipidiques. Bien que les effets et les cascades soient moins
décrits que pour le sentier d’apoptose, l’activité des enzymes sphyngomyélinases
(production de céramide) et phospholipases (production d’acide arachidonique) est
augmentée [14].
3- Les sentiers MAP kinases – L’activation des trois sentiers MAP kinase, ERK, JNK et
p38 survient rapidement suite à la liaison du TNF à son récepteur. Ces trois sentiers
sont surtout connus pour leurs effets comme activateurs de facteurs de transcription et
de l’expression génique, principalement de l’expression des gènes reliés à
15
l’inflammation [14]. JNK et p38 seraient aussi impliqués dans l’expression de la Esélectine, une molécule d’adhérence propre aux cellules endothéliales [17].
4- Le sentier NF-κB – Le facteur de transcription NF-κB est composé de deux sousunités, p65 et p50. Son activation est régulée par un inhibiteur cytoplasmique, IκB.
Suite à la liaison du TNF à son récepteur, IκB est phosphorylé par sa kinase IKK (IκB
kinase), ce qui amène sa dégradation par le protéasome. NF-κB transloque par la suite
au noyau pour augmenter l’expression de gènes inflammatoires et immuns [14, 18, 19].
Selon le contexte, ce sentier peut induire des dommages tissulaires avec
l’inflammation, mais il peut également protéger de l’apoptose.
Ces deux effets
opposés suggèrent la prudence si on voulait en faire une cible thérapeutique [20].
5- Les autres cibles signalétiques potentielles – Selon le contexte et le type cellulaire, la
liaison du TNF à son récepteur peut également activer d’autres sentiers. Citons en
exemple la protéine kinase C et le sentier JAK/STAT. L’information disponible sur
leurs effets est cependant plus fragmentaire [14].
L’effet des cytokines est souvent redondant. Plusieurs effets du TNF peuvent être reproduits
par l’IL-1. Cette relation s’expliquerait par la similarité des voies de signalisation utilisées
dans les deux cas. Les deux cytokines utilisent un membre de la famille TRAF (TNFRassociated factor), TRAF6 pour l’IL-1 et TRAF2 pour le TNF.
Ces deux protéines
adaptatrices partagent différentes cibles et peuvent même s’associer, ce qui expliquerait l’effet
synergique du TNF et de l’IL-1 [14].
Selon le contexte cellulaire, le TNF peut entraîner ses effets cytotoxiques par les sentiers de
mort. Les effets inflammatoires du TNF incluent l’activation de cellules hématopoïétique,
l’activation de la cascade de cytokines ainsi que l’activation des cellules endothéliales.
L’activation des cellules endothéliales par le TNF entraine la réorganisation du cytosquelette
d’actine [21] et la modification de la perméabilité de la couche endothéliale par un mécanisme
impliquant une protéine G sensible à la toxine pertussique [22] et une diminution de l’AMPc
[23]. Le TNF a également un effet transcriptionnel. Dans les cellules endothéliales, il induit
l’expression des molécules d’adhérence telles la E- et P-sélectine, ICAM-1 (Intercellular
Adhesion Molecule-1) et VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1) [24-26]. Cependant,
16
les différents niveaux d’induction de ces molécules d’adhérence varient selon l’origine des
cellules endothéliales [24, 26]. Les cellules endothéliales sont hétérogènes quant à la réponse
et la production de cytokines [27].
Dans un contexte cancéreux, le TNF peut être impliqué dans la prolifération et la
transformation cellulaire. Son expression (ou celle de son récepteur) est généralement associé
à un mauvais pronostic. De plus, il amène l’expression de facteurs pro-angiogéniques. L’effet
du TNF est paradoxal, une dose élevée localement détruira les vaisseaux sanguins, mais
lorsqu’il est produit de façon chronique, il contribue au remodelage tissulaire et au
développement du stroma nécessaire à la croissance et l’invasion cancéreuse [15].
La cachexie (une perte de poids massive dans le tissu adipeux et les muscles squelettiques)
apparaît dans les stades avancés de maladies et préférentiellement dans certains types de
cancers, tel ceux du tractus gastro-intestinal. Le TNF serait un médiateur potentiel de la
cachexie. Cependant, les thérapies visant à bloquer la production ou l’action du TNF ont eu
peu de succès dans l’augmentation de la masse corporelle, bien qu’il pourrait y avoir une
augmentation de l’appétit [28].
1.3.2 Chimioattractants / Chimiokines
Les chimiokines sont de petites cytokines (8-14 kDa) ayant une propriété de chimioattractant
[15].
Cependant, le spectre de leur effet biologique est encore plus large.
Elles sont
impliquées dans la réponse inflammatoire, dans le recrutement cellulaire, dans la maturation
du système immunitaire ainsi que dans la réponse immune, dans la croissance tumorale ainsi
que dans les métastases. Certaines chimiokines peuvent être produites exclusivement par un
seul tissu, ou encore être produites par différentes cellules. Il en va de même pour leurs
récepteurs [12].
La plupart des chimiokines ont quatre cystéines caractéristiques et selon l’arrangement des
deux premières, on les regroupe en quatre classes :
17
1- CXC ou chimiokine alpha. Ce groupe se scinde en deux, selon la présence ou non
du motif ELR précédant la première cystéine. Les chimiokines ELR-CXC sont
connues comme des facteurs angiogéniques tandis que les chimiokines non-ELRCXC sont des facteurs angiostatiques qui inhibent l’effet des premières [12]. Les
chimiokines CXC ciblent principalement les neutrophiles [29].
2- CC ou chimiokine bêta. Les chimiokines CC ciblent principalement les monocytes
et les cellules T. Ils sont étudiées entre autres dans les réactions allergiques pour
leur capacité à recruter les éosinophiles, cellules T et monocytes [29].
3- C ou chimiokine gamma. Cette famille de chimiokines ne possède que deux résidus
cystéines conservés, le deuxième et le quatrième. Elle inclut la lymphotactine
(XCL1), un peptide chimiotactique pour les lymphocytes [29].
4- CX3C ou chimiokine delta. Cette famille ne contient qu’un seul membre pour
l’instant, la fractalkine, la seule chimiokine liée à la membrane par une tige
glycosylée semblable aux mucines [29].
Les récepteurs des chimiokines sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires
couplés aux protéines G. Un même récepteur peut avoir plusieurs ligands. Leur appellation
provient de la famille de ligand auquel il est associé, CCR pour les récepteurs liant les
chimiokines CC, CXCR pour les récepteurs liant les chimiokines CXC, XCR pour les
récepteur liant les chimiokines C et CX3CR pour les récepteur liant les chimiokines CX3C
[12].
Les chimiokines peuvent être séparées selon leurs fonctions, celles reliées à l’homéostasie et
celles reliées à l’inflammation. Les chimiokines inflammatoires sont induites suite à un
stimulus pro-inflammatoire ou par des cytokines sur les monocytes, macrophages, cellules
endothéliales, épithéliales ou fibroblastique.
Les chimiokines homéostatiques sont plutôt
caractérisées par une expression spécifique à un tissu ou organe, en absence d’inflammation
[12].
En 1998, suite à une Gordon Conference sur les chimiokines, un comité présidé par le Dr.
Osamu Yochie ont cherché à standardiser l’appellation de ces molécules, en croissance
18
constante. Ces recommandations ont été présentées et acceptées en 1999 à un Keystone
Symposium sur les chimiokines. Ainsi, les ligands possèdent un L après le nom de leur famille
et les récepteurs un R, le tout suivi d’un chiffre. Ces nouvelles appellations se retrouvent au
tableau 1-1.
Les chimiokines ont été associées au cancer pour différentes raisons. Certaines chimiokines
CC ont été identifiées comme déterminants majeurs pour l’infiltration des lymphocytes et des
macrophages dans les carcinomes.
Les chimiokines sont également impliquées dans
l’induction ou l’inhibition de l’angiogénèse, avec comme exemple en promoteur de
l’angiogénèse CXCL8 (IL-8) et en inhibiteur, CXCL10 (IP-10).
Les chimiokines ont
également un rôle dans la promotion tumorale [15]. La première démonstration en importance
de l’implication des chimiokines dans les métastases a été faite par le groupe de Albert Zlotnik
[30]. Ils ont démontré que les cellules cancéreuses du sein, par opposition aux cellules
épithéliales mammaires normales, exprimaient fortement les récepteurs de chimiokines
CXCR4 et CCR7. Les ligands de ces derniers, respectivement CXCL12 (SDF-1α) et CCL21
(6Ckine) sont exprimés normalement dans les organes préférentiels pour des métastases du
cancer du sein. CXCL-12 est exprimé fortement dans les nodules lymphatiques, les poumons,
le foie et la moelle osseuse et est un excellent chimioattractant pour les lymphocytes. CCL21
est exprimé principalement dans les nodules lymphatiques et est impliqué dans le « homing »
des lymphocytes dans les organes lymphoïdes secondaires. De plus, la signalisation induite
par CXCR4 et CCR7 dans la cellule cancéreuse du sein amène une polymérisation d’actine
ainsi qu’une augmentation de la migration. Les mélanomes malins, qui ont un patron de
dissémination métastatique semblable au cancer du sein expriment également CXCR4 et
CCR7. Cependant, il exprime en plus CCR10, qui lie son ligand CCL27 (CTAK), exprimé
dans la peau. L’ensemble de ces résultats suggère que les cellules cancéreuses expriment les
récepteurs des chimiokines de manière non aléatoire et que ceux-ci sont impliqués dans la
détermination de la destination de la dissémination métastatique [30].
19
Tableau 1-1 Les familles de chimiokines et leurs récepteurs
20
Nouvelle nomenclature des chimiokines humaines ainsi que les autres appellations
communément retrouvées dans la littérature. Adapté de [29]
1.4 Les molécules d’adhérence
L’adhérence cellulaire est un processus multiple qui sous-entend i) le contact cellule – matrice,
ii) le contact homotypique cellule – cellule et iii) le contact hétérotypique cellule – cellule. Il
permet le maintien de la structure tridimensionnelle des tissus, la formation de complexe
signalétique ainsi que la morphogenèse. Il existe quatre familles de récepteur d’adhérence :
les intégrines, les cadhérines, la superfamille des immunoglobulines – CAM (Cell Adhesion
Molecule) ainsi que les sélectines. Ils sont représentés schématiquement à la figure 1-5. Il ne
faut pas voir l’adhérence comme un phénomène statique, l’adhérence et la signalisation
intracellulaire sont deux phénomènes intimement liés [31].
Les lymphomes malins non hodgkinien (LMNH) sont un groupe de tumeurs qui originent de
la prolifération de cellules d’origine lymphoïde. Ceux-ci sont caractérisés par une grande
hétérogénéité histopathologique et clinique. Certains sous-groupes présentent une spécificité
quant à leur dispersion [32]. Les lymphomes extra ganglionnaires de type MALT (mucosa
associated lymphoïd tissue) ont une préférence anatomique, tels les lymphomes digestifs, qui
se retrouvent avec une localisation gastrique, souvent accompagnées de localisation
amygdalienne suivies de localisation au grêle [32]. Les récepteurs de l’adhérence présents sur
les lymphocytes normaux sont conservés, en partie, sur leurs homologues de LMNH. Ces
récepteurs d’adhérence contribuent à l’agressivité du lymphome et seraient impliqués dans le
patron de dissémination spécifique à certains tissus de certains sous-types de lymphomes. Par
exemple, l’intégrine α4β7 amène le ciblage des lymphocytes à la muqueuse intestinale par une
interaction avec MAdCAM-1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule), un membre de la
superfamille des immunoglobulines exprimé sur l’endothélium muqueux de l’intestin. On
retrouve l’expression de l’intégrine α4β7 sur la plupart des cas de lymphome B de faible
malignité de type MALT ainsi que sur les lymphomes intestinaux à cellule T [33]. Les
molécules d’adhérence fournissent une piste d’explication pour les sites de dissémination des
lymphomes.
21
Figure 1-5 Famille des récepteurs d’adhérence
Ce schéma présente les différentes familles de molécules d’adhérence. Leurs
structures approximatives, leurs ligands ou contre-récepteur ainsi que certaines
22
protéines liant le cytosquelette sont représentées. INT = milieu intracellulaire et EXT
= milieu extracellulaire. Adapté de [34] et de [35].
1.4.1 Les sélectines
Les sélectines (CD62) sont une famille de trois récepteurs d'adhérence dépendants du calcium
qui regroupent la L -, P- et E-sélectine. La L-sélectine est exprimée constitutivement par les
lymphocytes, tandis que la E-sélectine est exprimée exclusivement par les cellules
endothéliales activées. La P-sélectine se retrouve dans les plaquettes et les cellules
endothéliales où elle est entreposée dans les granules α et les corps de Weibel-Palade
respectivement. La partie extracellulaire de chaque sélectine est constituée de trois domaines
différents; un domaine lectine de type C de 120 acides aminés en N-terminal, un domaine de
type EGF de 35-40 acides aminés et de 2 à 9 courtes répétitions consensus (~60 acides
aminés) qui sont retrouvées dans les protéines régulatrices du complément (CRP). Chez
l’humain, on retrouve 2 répétitions CRP sur la L-sélectine, 6 sur la E-sélectine et 9 sur la Psélectine.
Les sélectines sont ancrées dans la membrane par un court domaine
transmembranaire simple qui est suivi d'une queue cytoplasmique courte de 17 acides aminés
pour la L-sélectine, de 32 pour la E-sélectine et de 35 pour la P-sélectine [5, 35]. Les
sélectines contribuent à l'entrée des leucocytes dans les tissus inflammés, tel que décrit au
point 1.2. Sous un flux circulant, l’adhérence des cellules à une surface ou à d’autres cellules
varie de manière inversement proportionnelle avec l’amplitude de la force de cisaillement
appliquée. Pour les sélectines, il a été démontré qu’un niveau seuil de force de cisaillement est
nécessaire pour favoriser le roulement et l'adhérence des leucocytes par les sélectines [36].
Les sélectines lient des sucres présentés par une molécule porteuse. Cette dernière est connue
comme le ligand (ou contre-récepteur), par opposition à la sélectine qui est le récepteur. Le
ligand peut présenter divers sucres, tel les sialyl-Lewis a et x (SLea et SLex) ou encore d’autres
oligosaccharides fucosylés. La protéine de présentation seule n’a aucune capacité de liaison
par elle-même, elle doit être exprimée dans le contexte cellulaire adéquat avec les enzymes de
glycolysation appropriées pour présenter l’activité liante pour les sélectines [5, 37]. Psgl-1 (Pselectin glycoprotein ligand-1), un ligand partagé pour la P- et la E-sélectine, est une protéine
o-glycosylée transmembranaire qui se trouve sur les cellules lymphoïdes, myéloïdes et sur
23
certaines autres cellules non-hématopoïétique [5, 38]. Une sous-population de MadCAM-1
(Mucosal addressin cell adhesion molecule-1) qui est trouvée sur la surface des cellules
endothéliales des veinules mésentériques est un ligand de la L-sélectine. MadCAM-1 avait été
initialement identifiée comme ligand de l’intégrine α4β7 [5].
1.4.1.1 L-sélectine
Le ligand de la L-sélectine GlyCAM-1 (glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1) est
exprimé sur les cellules endothéliales des HEV (high endothelial venules) afin de permettre le
« homing » des lymphocytes aux nodules lymphatiques. C’est, d’ailleurs, le seul endroit où
les deux autres sélectines ne sont pas impliquées [5].
Dans la réponse immune, la L-sélectine des lymphocytes interagit avec l’endothélium. Elle
est par la suite rapidement clivée et l’ectodomaine est libéré sous forme soluble (le processus
est connu sous le nom de « shedding »). Ainsi, la libération de la L-sélectine, est associée à
l’activation du leucocyte. Cette activation amène rapidement une surexpression à partir des
granules d’entreposage de l’intégrine αMβ2 (CD11b/CD18 ou Mac-1), une intégrine qui lie la
protéine ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) sur les cellules endothéliales [5, 39]. Le
libération de la L-sélectine peut être induite par le peroxyde et les ions superoxydes, par une
diminution de volume du neutrophile ou encore suite à une stimulation par un facteur de
croissance. Ce processus est dépendant de l’activation de la MAP kinase p38, et de ERK dans
le cas d’une stimulation par un facteur de croissance [40-42]. L’agrégation de la L-sélectine
permet directement l’activation du sentier p38 dans le neutrophile, ce qui permet d’en modifier
sa forme, d’activer les intégrines et de relarguer les granules sécrétoires (dégranulation) [39].
24
1.4.1.2 P-sélectine
La P-sélectine possède deux mécanismes de régulation. Le premier implique l’expression de
la P-sélectine entreposée (dans les granules α et les corps de Weibel-Pallade) et le second, une
activation transcriptionnelle du gène. Suite à un traitement à l’histamine, à la thrombine ou à
certains agents pharmacologiques, la P-sélectine est exprimée en quelques minutes à la surface
de l’endothélium (quelques secondes pour les plaquettes). Cette expression est transitoire, car
la molécule est internalisée de 30 à 60 minutes plus tard par endocytose [5]. Un traitement au
LPS ou au TNF amène une synthèse de P-sélectine. Cependant, dans certains cas, telles les
veinules de la peau, on peut retrouver une expression de P-sélectine sans stimulus
inflammatoire [5, 24].
La souris déficiente dans l’expression du gène de la P-sélectine a été produite sans phénotype
notable. Cependant, elle présente une diminution de l’émigration des neutrophiles à des temps
court (1 à 2 heures) dans une péritonite induite chimiquement et une diminution du roulement
des leucocytes [5]. La souris déficiente pour les gènes de la E- et de la P-sélectine (les
sélectines endothéliales) est presque complètement déficiente dans le roulement, l’adhérence
et l’émigration des leucocytes dans les premières 24 heures d’un traitement antigénique [43].
Cependant, une réponse inflammatoire induite par le TNF permet tout de même le roulement
et le recrutement des leucocytes. Il existe donc un roulement indépendant des sélectines [44].
La P-sélectine peut également amener une spécificité dans le recrutement des leucocytes. Les
HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) traitées au TNF recrutent une variété de
leucocytes, principalement par la E-sélectine et VCAM-1. Les HUVEC traitées avec de
l’interleukine-4 (IL-4) recrutent principalement des éosinophiles par la P-sélectine [45]. La Psélectine a également été impliquée dans différentes signalisations, tel que la signalisation
juxtacrine dépendante de PAF (Platelet-activating factor) sur les cellules endothéliales pour
activer l’intégrine β2 des neutrophiles.
Également, le domaine cytoplasmique de la P-
sélectine des plaquettes est rapidement phosphorylé puis déphosphorylé suite à l’activation des
plaquettes [5, 35].
25
1.4.1.3 E-sélectine
La E-sélectine n'est pas exprimée par les cellules endothéliales non activées. Cependant, elle
est rapidement et transitoirement exprimée suite à des stimuli pro-inflammatoires tels que le
TNF, l’IL-1β, la thrombine et le LPS [5, 46]. De manière intéressante, l’hyperglycémie et le
VEGF amène également l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales [47, 48].
L’expression varie selon l’origine des cellules endothéliales [26]. L’expression de la Esélectine est habituellement maximale de 3 à 4 heures suite à la stimulation, pour retourner à
un niveau basal en 16 à 24 heures. Le promoteur de la E-sélectine contient quatre éléments de
régulation : trois sites de liaison à NF-κB et un site ATF (Activating transcription factor).
Lorsque les cellules sont stimulées par le TNF, trois voies convergent sur l'activation du
promoteur du gène de la E-sélectine; la voie NF-κB, les voies des kinases JNK et p38. Ces
deux dernières permettent la phosphorylation des facteurs de transcription c-Jun et ATF2,
menant à l’expression de la E-sélectine [5, 17].
La glycoprotéine ESL-1 (E-selectin ligand-1) est un ligand potentiel pour la E-sélectine qui est
présent sur les cellules myéloïdes et lymphoïdes.
Cette protéine est une variante d'un
récepteur à activité tyrosine kinase pour FGF (Fibroblast Growth Factor) du poulet, ce qui
suggère qu'il puisse être impliqué dans la signalisation suite à la liaison de la E-sélectine. Il
est, d’ailleurs, situé sur les microvillis (interfaces destinées au contact cellule – cellule) des
leucocytes [49-51].
La signalisation impliquant les sélectines est bidirectionnelle, elle provient de la queue
cytoplasmique des sélectines et également de leurs ligands ou contre-récepteurs activés. Elles
ressemblent en ce sens à la signalisation par les éphrines et leurs récepteurs [52]. On retrouve
dans la queue cytoplasmique de 32 acides aminées de la E-sélectine six résidus sérine et deux
résidus tyrosine (acides aminés 603 et 608 – SwissProt annotated protein record: P16581).
L’agrégation de la E-sélectine suite à son engagement avec un ligand sur des leucocytes
adhérés ou encore avec des anticorps amène plusieurs événements signalétiques. La tyrosine
603 est phosphorylée, ce qui permet le recrutement de SHP2 et la formation d'un complexe de
protéines adaptatrices, Shc•Grb2•Sos menant à l'activation de la MAP kinase ERK par
26
l’intermédiaire de Ras•Raf-1•phospho-MEK [53, 54]. L’agrégation de la E-sélectine mène
également à l'association de la E-sélectine avec l'actine et les protéines associées à l’actine,
comme l'α-actinine, la vinculine, la filamine, la paxilline et la kinase FAK (focal adhesion
kinase) [55]. Ces observations peuvent expliquer la modification de la forme des cellules
endothéliales qui est induite suite à l’agrégation de la E-sélectine avec les anticorps
spécifiques [56]. La signalisation induite par la liaison à la E-sélectine a été rapportée pour la
première fois par Soltesz et collaborateurs en 1997. Ces auteurs ont démontré que l'adhérence
des cellules de carcinome HT-29 à une chimère de E-sélectine–IgG augmentait la
phosphorylation sur tyrosine de diverses protéines, dont c-Src [57]. La E-sélectine soluble peut
activer des neutrophiles directement en augmentant la production des espèces réactives de
l’oxygène et en synergie avec le facteur PAF (platelet-activating factor) pour activer
l’intégrine β2. Ces résultats suggèrent une possibilité de contrôle de l’état d’activation du
neutrophile selon le répertoire des molécules d’adhérence impliquées [58]. Les neutrophiles
roulant sur la E-sélectine peuvent également générer un signal passant par les sentiers ERK et
p38 (en absence de stimulus) pour activer l’intégrine β2.
Il est à noter que le signal
d’activation de l’intégrine peut être indépendant des récepteurs couplés aux protéines G
hétérotrimériques (récepteur de chimiokines) [59].
De façon générale, ces études indiquent que l'interaction de la E-sélectine avec son ligand
induit deux signaux différents: un dans les cellules endothéliales et un dans les cellules
adhérantes. Cette signalisation bidirectionnelle règle les interactions secondaires des deux
types de cellules avec des intégrines et mène finalement à former les modifications qui
permettent la transmigration des cellules adhérantes.
La liaison à la E-sélectine joue un rôle important dans l'adhérence des cellules cancéreuses
d’origine épithéliale à l'endothélium [60]. La capacité de la cellule cancéreuse à lier la Esélectine sur les cellules endothéliales est directement proportionnelle à leur potentiel
métastatique [61]. D'ailleurs, la cimétidine, une drogue qui empêche l'expression de la Esélectine (de manière indépendante de son action anti-histaminique sur les récepteurs H2),
bloque l'adhérence des cellules tumorales à l'endothélium et empêche la formation de
métastases [62].
Plus spécifiquement, l’utilisation d’un antisens c-raf pour empêcher
l’expression de E-sélectine au foie diminue les métastases hépatiques provenant d’un
27
carcinome colorectal [63].
L’utilisation d’un autre antisens, dirigé cette fois contre la
fucosyltransférase génératrice du ligand de la E-sélectine dans cellule cancéreuse, diminue
également les métastases hépatiques [64]. De même, l’utilisation d’une forme recombinante
soluble de E-sélectine (E-sélectine–Immunoglobuline) dans un modèle de métastases
pulmonaire d’un carcinome de côlon a permis de diminuer l’adhérence des cellules
cancéreuses et la formation de métastases [65]. Les cellules de carcinome de poumon de
Lewis amènent l'expression de la E-sélectine sur l'endothélium sinusoïdal du foie, augmentant
ainsi leur potentiel métastatique et suggérant que ceci puisse être à la base de la spécificité de
la colonisation hépatique [66, 67]. En clinique, chez l'homme, le niveau de E-sélectine
circulant est associé à des métastases. En particulier, chez les patients avec cancer du sein, il a
été suggéré qu’à un stade avancé, une concentration élevée de E-sélectine soluble dans la
circulation sanguine (sE-sélectine) est associée aux métastases hépatiques [68]. En revanche,
des niveaux sanguins bas de sE-sélectine ont une valeur pronostique forte pour la survie et
l’absence de récidive chez les patients avec cancer du sein à nodule négatif [69].
1.4.2 Les intégrines
Les intégrines sont des glycoprotéines transmembranaires qui servent de récepteur à la matrice
extracellulaire ainsi qu’à d’autres récepteurs (ou contre-récepteurs) d’adhérence sur une
cellule voisine. Les intégrines sont des hétérodimères composés de deux sous-unités, α et β,
liées de manière non-covalente. Il existe au moins 8 sous-unités β et 18 sous-unités α. La
combinaison spécifique des différentes sous-unités α et β donne la spécificité de l’intégrine
pour son substrat [35, 70]. Ces combinaisons sont représentées à la figure 1-6. L’étude des
souris « knock-out » pour différentes sous-unités ont permis de démontrer la spécificité pour
chaque hétérodimères. En effet, chaque inactivation génique a apporté un phénotype distinct.
Il est intéressant de noter que certaines inactivations ont reproduit des maladies humaines, telle
l’inactivation de β2 qui reproduit la maladie immunitaire du déficit d'adhérence leucocytaire
(LAD-1 : Leukocyte Adhesion Deficiency) [71].
28
Les intégrines ne possèdent pas d’activité kinase intrinsèque. Lorsqu’une intégrine s’engage
avec son ligand, elle s’oligomérise (clustering) et recrute différents adaptateurs et kinases
cytoplasmiques. C’est ce qui s’appelle la signalisation « outside-in ». La signalisation de
l’intégrine est intimement liée au cytosquelette. En effet, la réorganisation du cytosquelette
induite par l’engagement des intégrines pourra favoriser l’oligomérisation de celles-ci [72]. La
signalisation induite par la combinaison ligand – intégrine est spécifique pour les protéines
recrutées et l’intégrine impliquée [73]. Par exemple, l’intégrine α2β1 engagée dans une
matrice de collagène, active la MAP kinase p38α, ce qui augmente la transcription du gène de
collagène de type I [74].
L’affinité d’une intégrine se définit comme la force de l’interaction entre l’intégrine et son
ligand. Une augmentation de l’avidité se définit comme une augmentation de la force de
l’adhérence de la cellule, qui peut être induit par une oligomérisation des intégrines plutôt que
par une augmentation d’affinité de celles-ci. L’affinité et l’avidité des intégrines peuvent êtres
modifiés par différents signaux intracellulaire, qui amèneront la liaison de différentes
protéines au domaine cytoplasmique et un changement de conformation de l’intégrine. C’est
la signalisation « inside-out » [70]. Les études sur la structure tridimensionnelle des intégrines
suggèrent qu’à l’état de repos, la portion extracellulaire est repliée avec la « tête » de
l’intégrine près de la membrane. Suite à l’activation, les portions juxta-membranaires des
sous-unités se déplacent, ce qui amène la « tête » de l’intégrine à se redresser et à exposer de
nouveaux épitopes [75].
Les différentes intégrines sont exprimées différentiellement au cours du développement et de
la vie adulte. De plus, certaines conditions physiologiques ou pathologiques peuvent modifier
ce patron d’expression (telle la réparation tissulaire ou le cancer). Il existe un autre niveau de
contrôle, celui des variants d’épissage, autrement connu sous le nom d’isoforme. En effet,
plusieurs sous-unités α et β possèdent des isoformes dans la portion extra- ou intracellulaire.
Ces variants permettraient de moduler l’affinité ou la signalisation d’une intégrine particulière
[76].
29
Figure 1-6 Les différents hétérodimères d’intégrines et leurs substrats
Les intégrines de la famille de β1, β4 et αv lient différentes composantes de la matrice
tels la laminine, la fibronectine, le collagène et la vitronectine. L’intégrine β3 peut lier
en plus certaines composantes sériques, tel le facteur de von Willebrand. La famille
β2 est spécifique aux leucocytes et médie l’adhérence cellule – cellule par
l’intermédiaire des CAMs (Cell Adhesion Molecules). Adapté de [76].
30
Le patron d’expression des intégrines change dans une cellule cancéreuse. Il en va de même
pour l’affinité et l’avidité des intégrines exprimées.
Par exemple, αvβ3 est fortement
exprimée dans le mélanome malin, α6β4 est induite dans les carcinomes thyroïdiens et
l’expression de α5β1 diminue la tumorigénèse de lignées cellulaires. Les intégrines jouent un
rôle dans la migration des cellules cancéreuses (tel que discuté dans la section 1.6) ainsi que
dans leur survie [70]. L’activation de l’intégrine β1 par la matrice amène, chez la cellule
cancéreuse du poumon, une diminution de l’expression de ICAM-1 [77]. Les différentes
familles de molécules d’adhérence sont donc reliées entre elles.
1.4.2.1 L’intégrine bêta 4
L’intégrine β4 est différente des autres sous-unités β.
En effet, elle est exprimée
principalement sur la membrane basale des épithéliums et elle lie la laminine. Son domaine
cytoplasmique d’environ 1000 acides aminés constitue la principale différence. Il contient
deux paires de répétitions fibronectine de type III séparées par un court segment et permet la
liaison des filaments intermédiaires dans les hémidesmosomes.
Dans les cellules en
migration, l’intégrine β4 se dissocie des hémidesmosomes et s’associe à l’actine dans le front
migratoire de la cellule [78].
L’engagement de l’intégrine β4 amène la phosphorylation de son domaine cytoplasmique et
l’activation de différents sentiers. La phosphorylation de la tyrosine 1526, situé dans le
troisième domaine fibronectine de type III, lie le domaine PTB (Phosphotyrosine binding
domain) de Shc [79].
Shc recrute l’adaptateur Grb2 et active le sentier ERK par
l’intermédiaire de Ras et le sentier JNK par l’intermédiaire de Rac, Ras et PI3K [80]. La
phosphorylation de la tyrosine 1494, également situé dans le troisième domaine fibronectine
de type III, mène à l’activation du sentier PI3K (phosphoinositide-3-OH kinase), par
l’intermédiaire de IRS (insulin receptor substrate), une protéine sans activité kinase qui
permet d’organiser des complexes signalétiques [81]. L’activation de PI3K a été démontrée
comme suffisante pour promouvoir la migration de la cellule cancéreuse [82]. L’intégrine
31
α6β4 active le sentier PI3K et promeut l’invasion des carcinomes, en amenant la formation de
lamellipodes [83]. De plus, l’intégrine β4 coopère avec le récepteur à activité tyrosine kinase
ErbB-2, de manière indépendante de son domaine extracellulaire, pour activer le sentier PI3K
et favoriser l’invasion [84]. La formation des lamellipodes et la migration est également
médié par RhoA, qui est activé par l’intégrine β4 par un mécanisme impliquant l’AMPc [85,
86].
L’intégrine β4 est associée à l’agressivité de certaines tumeurs. En effet, son expression est
maintenue ou augmentée dans les carcinomes de la peau, du sein, du rein et du côlon, pour ne
nommer que ces derniers. L’agressivité a été associée à une augmentation du potentiel invasif
et migratoire des cellules, qui serait due à une relocalisation de l’intégrine des
hémidesmosomes vers les lamellipodes [87]. De plus, l’intégrine peut stimuler la survie des
cellules cancéreuses ayant perdu p53 en stimulant le sentier AKT/PKB [88]. L’activation du
sentier AKT/PKB par la tyrosine 1494 de l’intégrine β4 dans un carcinome du sein permet
également d’augmenter la traduction du VEGF, ce qui a un effet autocrine qui stimule la
survie et la progression du carcinome [89].
1.4.3 Les cadhérines
Les cadhérines sont une famille de protéines transmembranaires impliquées dans l’interaction
homotypique cellule–cellule. Classiquement, le domaine extracellulaire est composé de cinq
répétitions en tandem, suivi d’un segment transmembranaire et d’une portion cytoplasmique
d’environ 150 acides aminés. La portion extracellulaire d’une cadhérine interagit en présence
de calcium avec la portion extracellulaire d’une autre cadhérine sur la cellule voisine. Les
cadhérines se localisent au niveau membranaire dans les jonctions adhérentes. La portion
cytoplasmique permet de lier le cytosquelette d’actine par l’intermédiaire des caténines. Les
caténines constituent un groupe de trois protéines, α- β- et γ-caténine (également connue
comme la plakoglobine). La β-caténine lie le domaine cytoplasmique de la cadhérine, l’αcaténine se lie à la β-caténine et lie à son tour directement l’actine et l’α-actinine. La
32
γ-caténine peut parfois remplacer la β-caténine. De plus, l’association entre les cadhérines et
l’actine peut être bloquée par une phosphorylation de la β-caténine [35].
La VE-cadhérine (Vascular endothelial-specific cadherin) est impliquée dans le maintien de
l’intégrité de l’endothélium vasculaire.
La migration transendothéliale des monocytes a
généralement lieu entre les bordures latérales des cellules endothéliales. L’adhérence à une
couche endothéliale et la migration transendothéliale des monocytes sous un flux circulant
défait de manière réversible et localisée les complexes VE-cadhérines [90].
La perte de la E-cadhérine (Epithelilal-cadherin) est associée à une perte de cohésion
tissulaire et un gain d’invasivité. Dans le processus cancéreux, la perte de la E-cadhérine est
associée à un mauvais pronostic et un phénotype métastatique. La perte des caténines peut
amener le même résultat. D’ailleurs la protéine APC (Adenomatous polyposis coli, un gène
suppresseur de tumeur), impliquée dans les cancer colorectaux, interagit normalement avec la
β-caténine libre pour réguler sa dégradation. Lors d’une perte ou d’une mutation de APC, la
β-caténine s’accumule et amène une augmentation de l’expression génique, ce qui agit comme
un oncogène. Ainsi, l’implication des cadhérines-caténines dans la progression tumorale n’est
pas seulement au niveau de l’adhérence et de la migration, mais également au niveau de la
survie et de la croissance néoplasique [91]. La force de l’interaction entre les cadhérines est
suffisante pour empêcher un agrégat cellulaire de se séparer, même en présence d’un flux
circulant de la force de celui présent dans les artères. Ainsi, la perte de la E-cadhérine peut
faciliter la dissémination des cellules cancéreuses d’une tumeur [92].
33
1.4.4 La superfamille des Immunoglobulines – Molécules d’adhérence
cellulaires (Ig–CAM)
Une grande variété de récepteurs cellulaires sont inclus dans cette famille. De manière
générale, les protéines de cette famille possèdent une ou plusieurs copies d’une structure Ig,
une structure compacte avec deux cystéines séparées par 55 à 75 acides aminés arrangés en
deux feuillets β anti-parallèles. Souvent, les membres de cette famille possèdent également
une ou plusieurs copies du domaine de type III de répétition de fibronectine (fibronectin type
III repeat). Ces récepteurs possèdent une portion transmembranaire unique et une portion
cytoplasmique [35].
1.4.4.1 ICAM (Intercellular Adhesion Molecule)
Présentement, cinq membres de la famille ont été identifiés : ICAM-1 (CD54), ICAM-2
(CD102), ICAM-3 (CD50), ICAM-4 et ICAM-5 (telencephalin). ICAM-1 est exprimée par
différentes cellules, dont les cellules endothéliales, les leucocytes et certains carcinomes.
ICAM-1 lie l’intégrine αLβ2 (LFA-1 ou CD11a/CD18) ainsi que αMβ2 (Mac-1 ou
CD11b/CD18) [93]. Divers agonistes pro-inflammatoires (IL-1β, TNF, LPS), le VEGF et le
peroxyde augmente tous l’expression de la molécule [25, 26, 48]. ICAM-1 est impliquée dans
l’adhérence des neutrophiles à l’endothélium, ainsi que dans l’adhérence et la migration des
lymphocytes à travers les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux [59, 94].
34
1.4.4.2 VCAM (Vascular cell adhesion molecule)
La protéine VCAM-1 (CD106) est exprimée sur l’endothélium vasculaire activé par l’IL-1, le
LPS ou le TNF.
Elle permet l’adhérence des monocytes, lymphocytes, basophiles et
éosinophiles à l’endothélium. Les neutrophiles ne peuvent s’y lier, car ils ne possèdent pas le
contre-récepteur de VCAM-1, l’intégrine α4β1 (VLA-4 ou CD49d/CD29) [26, 93].
VCAM-1, tout comme les sélectines, peut être libérée des cellules sous forme soluble. La
forme soluble de VCAM-1, retrouvée dans le plasma des femmes avec cancer du sein, semble
être un marqueur de l’angiogénèse. Sa détection permet de donner un indice sur l’évolution de
l’angiogénèse tumorale du cancer du sein [95].
L’adhérence des leucocytes à l’endothélium par VCAM-1 provoque une structure d’ancrage à
la membrane avec le recrutement des protéines moésine et ezrine (famille des protéines ERM
– Ezrin, Radixin & Moesin – qui régule la dynamique d’actine corticale). Il n’est pas encore
clair comment le domaine cytoplasmique de 19 acides aminés de VCAM-1 peut signaler.
Cependant, l’agrégation de VCAM-1 conduit à l’activation de p38 par l’intermédiaire de Rac,
pour ultimement amener à la modulation de l’intégrité de l’endothélium. Les sentiers activés
suite à l’engagement de VCAM-1 régule ainsi les interactions endothéliales cellule – cellule
pour permettre une migration transendothéliale [96, 97]. Voir le modèle à la figure 1-7.
35
Figure 1-7 Représentation schématique des sentiers signalétiques induit par
VCAM-1
Suite à l’adhérence médiée par les intégrines, il y a agrégation de VCAM-1 et
signalisation par des mécanismes encore inconnus. La signalisation implique
l’activation d’un sentier dépendant de Rac, qui amène la production d’espèces
réactives de l’oxygène (ROS – Reactive Oxygen Species) et l’activation de p38. Le lien
entre p38 et la VE-cadhérine reste à faire. Adapté de [96]
36
1.5 Les voies MAP kinases
Les voies MAP kinases font partie des systèmes de signalisation des cellules eucaryotes les
plus répandus.
Toutes les cellules eucaryotes ont différents sentiers MAP kinases qui
répondent spécifiquement à différents stimuli. Il existe trois familles principales de MAPK, le
sentier ERK (extracellular signal-regulated kinase) et les deux sentiers de stress, les SAPK
(Stress activated protein kinase) JNK (c-jun NH2-terminal kinase) et p38.
Ces sentiers
possèdent diverses appellations, ils sont retrouvés au tableau 1-2.
Les sentiers sont composés par un module MAP kinase. Le module est constitué de trois
kinases successives. Voir figure 1-8. Les MAPKs (Mitogen activated Protein Kinases) sont
des sérines/thréonines kinases qui possèdent un motif Thr-X-Tyr conservé dans la boucle
d’activation du sous-domaine kinase VIII. L’identité du X dans ce motif détermine
l’appartenance à une des familles. Ainsi Thr-Gly-Tyr fait partie des kinases p38, Thr-Glu-Tyr
fait partie des kinases ERK et Thr-Pro-Tyr fait partie des kinases JNK. La MAPK est
phosphorylée par une kinase à double spécificité (thréonine/tyrosine), la MAPK-kinase (MKK
ou MEK pour MAPK/ERK-kinases). Les MKKs possèdent également un motif conservé dans
la boucle d’activation du sous-domaine kinase VIII. Les MKK sont phosphorylées par les
MAPK-kinase-kinase ou MAP3K. Les MAP3K sont pour leur part régulées par une variété
d’activateurs et d’inhibiteurs. Il existe diverses appellations pour les différentes MKK et
MAP3K, dont les plus communes se retrouvent au tableau 1-3 et 1-4.
37
Tableau 1-2 Nomenclature des MAP kinases
Adapté de [98] et de [99]
38
Figure 1-8 Le coeur du module MAP kinase
39
Divers signaux convergent vers le module MAPK-kinase-kinase (MAP3K)∏ MAPKkinase (MKK)∏ MAPK, qui recrutent alors des réponses appropriées. Adapté de [98]
Tableau 1-3 Nomenclature des MKK
Adapté de [98] et de [99]
Tableau 1-4 Nomenclature des MAP3K
Adapté de [98] et de [99]
40
41
Les voies MAP kinases fonctionnent toutes de la même façon et partagent quatre principes
généraux [98] :
1- Les MAPK sont des kinases « proline-dirigées ». Cependant, la sélectivité du substrat
est obtenue grâce à des sites de reconnaissance spécifique à la kinase.
2- Les composantes du module MAPK ne sont pas exclusives à un seul module. Ainsi,
une MKK peut phosphoryler différentes MAPK.
De la même façon, toutes les
composantes d’un module MAPK peuvent être contrôlées par des signaux différents.
3- La spécificité d’un sentier est obtenue avec des protéines d’échafaudage (Scaffold
proteins). Ces dernières peuvent lier et séquestrer certaines composantes du module et
être recrutées par certains types de signaux.
4- Pour activer le module, la régulation des MAP3K implique un recrutement
membranaire, une oligomérisation et une phosphorylation.
Les MAPK peuvent être activés par divers agonistes se liant à des récepteurs à activité
tyrosine kinase, à des récepteurs à sept domaines trans-membranaires couplés aux protéines-G.
Ils peuvent également être activés par les cytokines ainsi que par les stress physiques ou
chimiques. Ils ont des effets sur l’apoptose, la transformation oncogénique, le développement,
l’inflammation, la réponse immune et sur divers autres phénomènes [98, 100]. La réponse à
un stimulus donné pourra varier selon le type et le contexte cellulaire. Les modules ont une
organisation spatiale et temporelle dans la cellule. Cependant, les sentiers MAPKs ne sont ni
rectilignes, ni hermétiques. Ils peuvent interagir avec d’autres sentiers « parallèles », ce qui
est connu sous le nom de cross-talk [101, 102].
1.5.1 ERK (extracellular signal-regulated kinase)
Le sentier ERK est impliqué dans différents phénomènes physiologiques et pathologiques. Il
est présenté à la figure 1-9. Citons que 30% de tous les cancers humains confondus ont une
42
mutation dans Ras (en amont du module ERK). Ce taux monte à 90% dans le cancer
pancréatique et à 50% dans le cancer du côlon. La MAP3K Raf est également mutée dans une
grande variété de cancer et jusqu’à 66% dans les mélanomes malins [103].
Un résultat intéressant a été obtenu par le groupe de Liliana Ossowski [104]. Ils ont démontré
que le ratio d’activité entre ERK et p38 était déterminant pour passer d’un phénotype de
croissance tumorale (ERK>p38) vers un phénotype d’arrêt de croissance, de dormance
tumorale (p38>ERK). Les cellules cancéreuses dormantes sont difficilement identifiables
cliniquement et sont souvent responsables de l’apparition de métastases tardives après une
période d’apparente rémission. Le passage d’un état de croissance vers un état de dormance
implique les récepteurs membranaires (dont uPAR –urokinase plasminogen activator
receptor- et l’intégrine α5β1). Ce passage suppose que l’arrivée dans un nouvel organe
(métastase) peut changer les récepteurs membranaires utilisés et ainsi changer le statut de la
cellule cancéreuse de la croissance vers la dormance.
1.5.2 p38
La kinase p38 est l’équivalent chez la levure S. cerevisiae de la MAPK Hog1, la kinase
sensible à l’osmolarité. L’appellation SAPK2 (Stress activated protein kinase) se rapporte aux
isoformes α et β de la protéine p38. La famille inclut également les kinases p38γ (SAPK3) et
p38δ (SAPK4). La voie p38 est fortement activée par les stress (lumière UV, choc thermique,
stress oxydant, agents chimiothérapeutiques), les cytokines inflammatoires (TNF, IL-1, LPS),
et divers facteur de croissance comme le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) [98,
100, 105]. Les composés pyrinidyl imidazole tels que le SB203580, se lient spécifiquement à
p38 [106]. L’inhibiteur SB203580 fonctionne en compétitionnant avec l’ATP au niveau de
son site de liaison sur la kinase p38, ce qui bloque son activité [107]. L’inhibiteur est,
d’ailleurs, spécifique aux isoformes p38α et p38β [108].
43
Figure 1-9 Représentation schématique de la cascade ERK
Divers signaux convergent vers le module Raf•MEK•ERK. KSR (Kinase suppressor of
Ras) est une protéine d’échafaudage en amont de MEK et qui est nécessaire à
l’activation du module, tout comme MP-1 qui lie préférentiellement MEK1 et ERK1.
ERK phosphoryle diverses protéines qui régulent les protéines du cytosquelette, le
métabolisme, le remodelage de la chromatine et divers facteurs de transcription.
Adapté de [103] et de [99]
44
La MAPK p38 est activée par deux MKKs, soit MKK3 et MKK6. MKK6 active toutes les
isoformes de p38 tandis que MKK3 active les isoformes α, γ et δ. MKK4, qui active la voie de
JNK, active l'isoforme α de p38 [109-112]. Les MAP3K et leurs activateurs sont multiples
avec plusieurs branchements. Pour une synthèse, voir l’article de revue écrit par John M.
Kyriakis & Joseph Avruch [98].
L’activation du sentier p38 mène à l’activation de différentes cibles nucléaires et
cytoplasmiques. Les cibles nucléaires incluent des facteurs de transcription tels ATF-2,
GADD153 et Elk-1, tandis que les cibles cytoplasmiques incluent Mapkapk-2/3 (MAPKactivated protein kinase 2/3) et MNK [98, 100]. L'activation de MAPKAPK2/3 par p38 mène
à la phosphorylation de la petite protéine de stress HSP27, qui module la dynamique d'actine
et amène la formation de fibres de tension [113]. Dans les cellules HeLa, la phosphorylation
de HSP27 peut également résulter de PRAK (p38-regulated/activated kinase), une autre cible
cytoplasmique de p38 [114].
Le sentier p38 est impliqué dans la réponse inflammatoire, dans l’induction de l’expression de
cytokines et de molécules d’adhérence.
Le sentier p38 est également impliqué dans la
régulation de l’apoptose induite, entre autres, par le stress oxydant et les agents
chimiothérapeutiques [115, 116]. Il joue également un rôle, de concert avec la kinase FAK,
dans la migration des cellules endothéliales induite par le VEGF, une étape importante de
l’angiogénèse [105, 117]. Dans la progression tumorale, l’invasion des tissus est un processus
qui implique la production de protéase, afin de dégrader la matrice environnante. Parmi ces
protéases, l’uPA (urokinase plasminogen activator), une sérine protéase, ainsi que son
récepteur, uPAR, sont associés à la progression tumorale. Dans le cancer du sein, l’activité
basale de p38 est élevée et est corrélée avec le caractère invasif des cellules. De plus, p38α est
impliquée dans la stabilisation des ARNm de uPA et uPAR, deux molécules associées à un
mauvais pronostic [118]. Le même groupe a démontré que l’activité basale plus élevée de p38
était associée à la liaison de l’intégrine αv à la vitronectine et ce, seulement dans des cellules
malignes [119].
45
1.6 La migration cellulaire
L’analyse de la migration cellulaire donnera des résultats différents selon l’environnement
dans lequel elle est étudiée. En effet, l’invasion d’une cellule dans un tissu environnant et la
migration transendothéliale d’un leucocyte soumis à un flux sont deux phénomènes ayant des
contraintes différentes et donc, des mécanismes qui peuvent varier.
1.6.1 Les points focaux d’adhérence et le cytosquelette
L’interaction d’une cellule avec sa matrice environnante se fait par les différents récepteurs
d’adhérence exprimés à la membrane. On y retrouve, entre autres, les intégrines pour lier la
matrice extracellulaire (MEC) [70, 120], CD44 (une famille de molécules liant les
hyaluronanes, qui est impliqué dans l’adhérence, la migration et les métastases [121]), ainsi
que des protéases, telles certaines MMPs (matrix metallproteinase) [122]. L’interaction avec
la matrice se fait de manière organisée, c’est-à-dire que les récepteurs se regroupent en points
focaux d’adhérence, où les différents récepteurs permettent de faire le lien entre la MEC et le
cytosquelette [123]. De plus, les points focaux d’adhérence sont des structures dynamiques,
signalétiques et sensibles aux modifications de l’environnement.
En commencant par l’extérieur de la cellule, les points focaux d’adhérence débutent par la
liaison et l’oligomérisation des intégrines spécifique à une composante de la MEC. Par
exemple, l’intégrine α5β1 lie la fibronectine, αvβ3, la vitronectine, α6β1 et α6β4 la laminine.
Ces intégrines recrutent diverses molécules pour faire le lien avec le cytosquelette d’actine.
Ce sont les protéines de la plaque d’adhérence. On y retrouve, entre autres, la vinculine, la
taline, la paxilline et l’α-actinine. L’affinité, le recrutement, la localisation des intégrines et
des protéines de la plaque d’adhérence peuvent être modifiés par phosphorylation. En ce sens,
les points focaux d’adhérence contiennent diverses kinases, dont FAK, Src, ILK (Integrinlinked kinase), PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase) et les membres de la famille des petites
46
GTPases Rho. Les points focaux d’adhérence assurent la liaison au cytosquelette d’actine.
On y retrouve donc, aussi, les filaments d’actine ainsi que certaines protéines qui en régulent
la structure et l’organisation. Ces protéines incluent des protéines de coiffe, de polymérisation
et de branchement de l’actine [35, 123-127].
La présence de nombreux points focaux d’adhérence permet d’organiser les réseaux d’actine
en fibre de tension. Ces dernières sont des structures rigides, associées à la contractilité de la
cellule. De manière opposée, l’actine corticale est composée d’un réseau dynamique qui
permet la formation de structures telles les filipodes et lamellipodes. Les points focaux
d’adhérence se font et se défont constamment dans une cellule. Ces deux processus se
produisent de manière contrôlée et dirigée. Il en va de même pour l’actine et ses différentes
structures.
Plus une cellule est attachée fortement avec de nombreux points focaux
d’adhérence, moins elle défait ses contacts et migre. Inversement, moins une cellule est
attachée fortement, plus facilement elle pourra se détacher et migrer, jusqu’au point ou ses
points focaux d’adhérence seront trop faibles et peu nombreux pour supporter une adhérence
forte et ainsi, une migration [120, 124, 128]. Cette relation entre la vitesse de migration et la
force de l’adhérence est exprimé par une courbe en forme de cloche, décrite par Palecek et
collaborateurs [129].
1.6.1.1 FAK (Focal Adhesion Kinase)
À l’origine, la kinase FAK a été identifiée comme un substrat tyrosine phosphorylé dans des
cellules transformées avec l’oncogène v-src. Son caractère essentiel a été démontré par les
travaux qui ont rapporté que l’inactivation du gène dans une souris, fak -/-, est létale au stade
embryonnaire.
FAK est impliquée dans la signalisation découlant de l’adhérence des
intégrines. Elle est impliquée dans diverses cascades de signalisation menant, entre autres,
vers l’adhérence et la migration [130].
Les travaux du groupe de Schlaepfer [131] ont démontré que FAK assure le lien physique
entre certaines intégrines et les récepteurs de l’EGF (epithelial growth factor) et du PDGF
47
(Platelet-derived growth factor). Ainsi, elle permet d’intégrer les signaux du PDGF ou de
l’EGF et des intégrines pour promouvoir la migration.
La kinase devient un noeud
signalétique dans le « cross-talk » entre les facteurs de croissance et les intégrines.
FAK est également surexprimée, tôt, dans la progression de certains cancer [130].
1.6.2 L’invasion
La première revue intégrée sur les mécanismes moléculaires de la migration a été publiée en
1996 par Lauffenburger et Horwitz [132]. Les différentes études qui ont porté sur la migration
des cellules cancéreuses, semblent indiquer que les mêmes étapes ont été conservées, c’est-àdire :
1- La protrusion d’un bord de la cellule : La cellule se polarise, l’actine corticale se
polymérise et projette la membrane vers l’avant. C’est l’apparition des filipodes et le
début de la signalisation.
2- Formation des points focaux d’adhérence et des interactions cellule – matrice : Les
intégrines reconnaissent les ligands dans la MEC et s’oligomérisent. Elles recrutent
alors les protéines de la plaque d’adhérence, les kinases et les protéines liant l’actine.
Finalement l’actine s’y lie, ce qui forme un point d’ancrage du cytosquelette.
3- Le recrutement des protéases : Les sites d’interaction avec la MEC amènent le
recrutement de protéases, telles les MMPs. Ces dernières sont activées et clivent la
matrice environnante, en exposant de nouveaux sites et en libérant l’espace pour la
migration [122]. (Cette étape n’était pas décrite pour la migration en deux dimensions
par Lauffenburger)
4- Contraction de la cellule : La myosine génère la force de contraction sur les fibres
d’actines polymérisées, ce qui permet d’avancer l’arrière de la cellule.
48
5- Détachement de l’arrière de la cellule : Les points focaux d’adhérence se défont à
l’arrière de la cellule et les différentes composantes sont recyclées vers le bord
avançant de la cellule.
Ces étapes sont schématisées à la figure 1-10
Une cellule cancéreuse pour devenir invasive, doit généralement perdre ou acquérir des
caractéristiques. Par exemple, la perte de la E-cadhérine dans un épithélium va amener une
transition épithélio-mésanchymateuse. Cette transition modifie le phénotype de la cellule vers
des caractéristiques mésenchymales, moins structurés et plus mobiles [133]. La cellule pourra
alors migrer tel que décrit ci-haut. Il existe également un autre type de migration, la migration
de type amibe. Dans ce type de migration, les points focaux d’adhérence sont peu nombreux
et il n’y a pas de fibre de tension d’actine. La migration est permise par l’actine corticale.
Celle-ci permet à la cellule de se déformer rapidement avec une succession de protrusions et
contractions de la membrane tout en créant que de faibles interactions avec le substrat. Ce
type de migration est utilisé par les leucocytes et les cellules de certains types de cancers, tels
les lymphomes [124].
Une des particularité de la migration des cellules cancéreuses est leur plasticité. En effet, elles
peuvent s’adapter à un nouvel environnement ou à une nouvelle contrainte, en modifiant le
type de migration utilisée. Cette caractéristique leur fournit un mécanisme d’évitement à
diverses thérapies qui viserait une étape en particulier de la migration.
L’utilisation de
drogues pour inhiber les protéases, le blocage des intégrines ou des cadhérines, en empêchant
un type de migration, peut amener ces transitions, bien qu’elles peuvent survenir de manière
spontanée [124].
La plasticité dans les mécanismes de migration est illustrée à la figure 1-11. On y retrouve en
plus de la migration des cellules isolées, la migration collective. C’est-à-dire qu’un amas de
cellule, ou un feuillet, peut utiliser les même mécanismes de migration pour envahir un tissu,
sans avoir à disséminer des cellules isolées.
49
Figure 1-10 La migration cellulaire
Représentation schématique des différentes étapes de la migration d’une cellule dans
une matrice en trois dimensions. Tiré de [124]. Reprinted and translated by permission
from Nature Reviews Cancer [124] copyright (2003) Macmillan Magazines Ltd.
50
Figure 1-11 Plasticité de la migration tumorale
Les cellules cancéreuses adaptent leur mode de migration selon les modifications
qu’elles subissent. Ainsi, la perte de l’interaction cellule-cellule tend vers une
migration de type mésenchymale, tandis que la perte d’intégrines ou de protéases
amène une migration de type amibe. Tiré de [124]. Reprinted and translated by
permission from Nature Reviews Cancer [124] copyright (2003) Macmillan Magazines Ltd.
51
1.6.3 La migration transendothéliale
La particularité de la migration transendothéliale tient à deux facteurs. Premièrement, le
leucocyte ou la cellule cancéreuse qui migre doit composer avec le flux circulant (une
contrainte absente des tissus) et interagir avec une cellule différente (la cellule endothéliale).
C’est pourquoi les molécules d’adhérence qui permettent un contact hétérotypique cellule –
cellule sont impliquées dans ce type de migration. Deuxièmement, l’endothélium vasculaire
doit se modifier de manière temporaire, afin de retrouver et de conserver son intégrité suite à
la migration.
La migration du leucocyte sur la cellule endothéliale utilise des étapes similaire à la migration
mésenchymateuse.
Une fois la cellule adhérée et sortie du flux circulant, elle devient
polarisée, elle forme des points focaux d’adhérence puis rétracte le pôle arrière [134]. Les
deux principales différences tiennent en l’absence du rôle des protéases pour dégrader la
matrice et aux mécanismes d’activation des intégrines, qui peuvent être activées par les
chimiokines et les sélectines. De plus, des travaux sur la migration transendothéliale des
monocytes ont démontré l’implication de l’intégrine αvβ3 pour
moduler l’affinité de
l’adhérence de l’intégrine αLβ2 à ICAM-1. Ainsi on peut observer une communication entre
les deux intégrines [135].
Le contact des monocytes sur les cellules endothéliales modifie de manière transitoire les
cellules endothéliales. En plus de défaire le complexe VE-cadhérine [90], les monocytes
amènent une diminution transitoire de l’activité de FAK ainsi que des modifications du
cytosquelette dans la cellule endothéliale [136]. Ainsi, la cellule endothéliale peut modifier
son organisation pour faciliter la migration transendothéliale.
52
1.7 Les métastases
L’étude des métastases a connu deux courants majeurs. Le premier a découlé de l’hypothèse
de Paget, proposé en 1889, sur la spécificité des métastases selon l’organe rencontré. Le
deuxième courant a été proposé en 1929 par James Ewing.
Celui-ci a supposé que la
dissémination métastatique était seulement due à des facteurs mécaniques, résultant de la
structure anatomique des vaisseaux sanguins. À partir des années 1970, des données ont
commencé à s’accumuler pour démontrer la sélectivité des métastases. De nos jours, ces deux
courants se rencontrent, principalement par les observations de Leonard Weiss [2]. En effet,
les métastases régionales peuvent s’expliquer par le drainage lymphatique dans les nodules
environnant la tumeur, mais certaines métastases dans des organes éloignés s’expliquent par la
permissivité de ce milieu pour la croissance des cellules métastatiques.
L’apparition d’une métastase dépend d’une série d’étapes consécutives inter-reliées. Toutes
ces étapes doivent être réussies pour avoir la formation d’une métastase. Ces dernières sont
schématisées à la figure 1-12.
Une étape alternative a été décrite pour la cascade métastatique au poumon. En effet, les
travaux de Al-Mehdi et collaborateurs ont démontré que les cellules cancéreuses peuvent
croître localement dans le vaisseau sanguin, sans extravasation. Ainsi, de manière précoce, la
micrométastase se retrouve dans le vaisseau sanguin et non dans le stroma pulmonaire [137] .
La formation des métastases est en fait un processus très inefficace. Très peu de cellules qui
quittent la tumeur primaire arriveront à former une métastase cliniquement visible. Parmi ces
étapes, surtout les dernières sont limitantes et sont responsables de cette inefficacité. En effet,
les cellules circulantes vont pratiquement toutes s’arrêter dans le premier lit vasculaire qu’elles
rencontreront. La grosseur de la cellule cancéreuse par rapport à celle des capillaires est
souvent suffisante pour permettre l’arrêt et l’extravasation dans un nouvel organe. Une fois
implantées dans le nouvel environnement, certaines cellules vont mourir, d’autres proliférer
jusqu’à induire l’angiogénèse donnant naissance à une tumeur volumineuse.
Certaines
cellules cancéreuses vont rester dans un état de latence. Ces cellules dormantes (ou solitaires)
53
sont insensibles à la chimiothérapie traditionnelle qui vise les cellules à division rapide. Elles
sont responsables de l’apparition de métastases tardives (quelques mois ou années après la
tumeur primaire) [138].
De manière similaire aux gènes suppresseurs de tumeurs, il existe des gènes suppresseurs de
métastases. Ils sont énumérés au tableau 1-5. Ces derniers se caractérisent par une diminution
d’expression dans les cellules métastatiques par rapport aux cellules tumorales non
métastatiques. Une fois réintroduit dans une lignée tumorale, la formation de métastases in
vivo est réduite, sans toutefois réduire la tumorogénicité [139]. Contrairement aux gènes
suppresseurs de tumeurs qui sont souvent reliés au cycle cellulaire (par exemple Rb), les gènes
suppresseurs de métastases sont plutôt reliés aux sentiers de signalisation. Il est intéressant de
remarquer que les trois sentiers MAP kinases, ERK, JNK et p38, sont touchés par les gènes
suppresseurs de métastases.
1.7.1 Spécificité du processus métastatique
Malgré les étapes communes de la progression métastatique, chaque type de cancer aura une
stratégie différente pour y parvenir.
Ainsi, les protéases utilisées pour l’invasion et
l’intravasation peuvent différer pour le cancer du poumon et celui du côlon. De la même
façon, chaque étape du processus métastatique peut avoir une spécificité selon le type de
tumeur et l’organe visé. Ainsi, les chimiokines et leurs récepteurs permettent de cibler le
cancer du sein aux nodules lymphatiques et au poumon [30] et la E-sélectine permet de cibler
le cancer du côlon au foie [67]. Le tableau 1-6 compile les différents phénotypes observés
chez des cancer humains, l’intérêt serait de pouvoir utiliser ces caractéristiques afin de
caractériser le potentiel métastatique de manière pronostique.
Les sites de métastases varient selon l’origine du cancer.
informations pour 16 différents cancers humains.
L’annexe A regroupe ces
54
Figure 1-12 La cascade métastatique
Les étapes de la progression métastatique. a) La tumeur se forme localement. b) Les
cellules deviennent invasives, elles traversent la membrane basale et migrent. Les
cellules entrent dans la circulation par c) l’intermédiaire du système lymphatique ou
d) directement dans le système sanguin. e) Les cellules survivent en circulation
s’arrêtent et entrent dans un nouvel organe. Les deux dernières étapes sont parfois
appelées la colonisation métastatique, f) les cellules isolées survivent dans le nouvel
55
organe et g) commencent à croître et se vascularisent pour former une métastase
visible. Adapté de [139]
Tableau 1-5 Gènes suppresseur de métastases
Adapté de [139].
56
Tableau 1-6 Phénotype métastatique de cancer humains
↑ = surexpression, ↓ = répression, — = aucun changement. Adapté de [140]
1.7.2 Approche thérapeutique
Trois raisons expliquent la complexité de traitement du cancer et de ses métastases.
Premièrement, les tumeurs, bien que d’origine clonale, deviennent rapidement hétérogènes.
Elles deviennent composées de sous-populations de cellules avec des potentiels prolifératifs,
angiogéniques, invasifs et métastatiques différents. Deuxièmement, bien que la métastase peut
être également d’origine clonale, l’instabilité génétique amène rapidement de nouvelles souspopulations hétérogènes.
Finalement, l’efficacité de la métastase dépend des multiples
interactions des cellules cancéreuses avec l’environnement. La cellule métastatique peut
s’adapter et être modifiée par les réponses homéostatiques spécifiques d’un organe [141].
Les traitements traditionnel du cancer, c’est-à-dire la chirurgie, l’irradiation et la
chimiothérapie, ont peu d’effets sur les métastases.
La fenêtre thérapeutique pour le
traitement des métastases peut être ciblée sur toutes les étapes du processus métastatique. Le
tableau 1-7 situe différents traitement par rapport à l’étape du processus métastatique qu’ils
peuvent inhiber.
Faute de pouvoir traiter la métastase avant sa formation, l’intérêt est peut-être de le traiter
comme une maladie chronique et de l’empêcher de proliférer. [142]
57
58
Tableau 1-7 Approche thérapeutique contre la cascade métastatique
Abréviations : A, adhérence; D, dégradation (de la matrice); M, migration; R,
récepteur de facteur de croissance; C, chirurgie; IR, irradiation, CH, chimiothérapie
Adapté de [143].
59
1.8 Objectifs du projet de recherche
Le but de ce travail de doctorat est de caractériser le rôle des interactions cellule cancéreuses –
cellules endothéliales dans le processus métastatique. Principalement, ce projet de recherche a
été élaboré à partir de trois observations. Premièrement, les travaux de Read et collaborateur
[17] impliquait la kinase p38 dans le contrôle de l’expression de la E-sélectine.
Deuxièmement, la liaison à la E-sélectine a été liée à l’adhérence des cellules cancéreuses à
l’endothélium [60, 144, 145]. La capacité de lier la E-sélectine corrélait avec le potentiel
métastatique de cellules cancéreuses du côlon [61]. Finalement, les travaux de Soltesz et
collaborateur [57] laissait sous-entendre une signalisation dans la cellule cancéreuse par
l’intermédiaire de la liaison à la E-sélectine. À partir de ces résultats, les objectifs suivants ont
été fixés :
1- Vérifier le rôle de la kinase p38 dans l’expression de la E-sélectine.
2- Étudier les molécules médiant l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules
endothéliales, avec comme modèle de cellules endothéliales humaines, les HUVEC
(Human Umbilical Vein Endothelial Cell).
3- Vérifier l’implication et la sélectivité de la E-sélectine dans l’adhérence des cellules
cancéreuses aux HUVEC.
4- Déterminer le rôle de la kinase p38 dans l’adhérence des cellules cancéreuses aux
HUVEC et préciser son implication dans la migration transendothéliale.
60
1.8.1 Aperçu de la thèse
Les premiers résultats ont démontré que le sentier p38 n’est pas essentiel à l’expression de la
E-sélectine, cependant, la liaison à la E-sélectine active le sentier p38 dans la cellule
cancéreuse et cette activation est nécessaire pour la migration transendothéliale des cellules
cancéreuses. Cet article représente le chapitre 2 de la thèse.
Ces premiers résultats permettaient de lier l’activation de la cellule cancéreuse par l’adhérence
à la E-sélectine au sentier p38 et à la migration. J’ai écrit une revue à ce sujet, qui se trouve au
chapitre 3.
Par la suite, nous avons vérifié l’implication des intégrines dans l’adhérence des cellules
cancéreuses HT-29 aux HUVEC. C’est ainsi que nous avons démontré que l’intégrine β4 est
impliquée dans l’adhérence aux cellules endothéliales activées. De plus, nous démontrons
qu’il existe un lien entre la liaison à la E-sélectine et l’intégrine β4. Ces travaux sont
présentés dans le chapitre 4.
Le chapitre 5 présente des résultats complémentaires, qui n’ont pas encore fait l’objet de
publications.
On y retrouve entre autres des résultats préliminaires sur le ligand de la
E-sélectine ainsi que sur la spécificité d’adhérence des cellules HT-29 sur des lignées
endothéliales de diverses origines.
Le chapitre 6 fait état d’une discussion générale et conclusion sur l’ensemble de ces résultats.
Il ouvre également sur l’implication clinique potentiel de ces résultats.
L’annexe A présente une compilation des différents sites métastatiques chez l’humain
accompagnée des statistiques canadienne sur le cancer en 2003. L’annexe B présente les
résumés que j’ai présentés aux différents congrès auquel j’ai participé durant ma formation
ainsi que ma contribution dans un autre article scientifique du laboratoire.
Les chapitres 2, 3 et 4 ont leur propre bibliographie en fin de chapitre. Pour ce qui est des
chapitres 1, 5, 6, 7 et les annexes, la bibliographie complète se trouve à la fin de la thèse.
Chapitre 2
L’adhérence par la E-sélectine et l’activation de la
kinase p38 dans la migration
62
2
La migration transendothéliale des cellules de
carcinome de côlon nécessite l’expression de la Esélectine par les cellules endothéliales et l’activation de
SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2) dans la
cellule tumorale.
Ce chapitre fait l’objet d’une publication dans la revue The Journal of Biological Chemistry
(276 (36), pp.33762-33772, 2001) et constitue la version finale telle que publiée dans ce
journal. Ce travail est reproduit ici avec la permission du journal. Cet article a été écrit avec
mes travaux. J’ai effectué l’ensemble des figures à l’exception de la figure 2-4b ainsi que la
version finale de la figure 2-6a à 2-6d qui a été effectuée par le second auteur. J’ai également
contribué à son écriture. Les auteurs 3 & 4 (de Virginia Commonwealth University) nous ont
fournis les cellules utilisées dans la figure 2-8.
63
2.1 Résumé
L'adhérence et la migration des cellules tumorales sur et à travers l'endothélium vasculaire
sont des étapes critiques de l'invasion métastatique. Nous avons étudié les rôles de la Esélectine et de la kinase SAPK2/p38 dans la modulation de l'adhérence et de la migration
transendothéliale des cellules de carcinome HT-29. Le TNFα a fortement augmenté
l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine
(HUVEC). Cet effet s’est avéré indépendant de l'activation de SAPK2/p38 induite par le
TNFα. L'adhérence des cellules HT-29 sur une monocouche de HUVEC traitée préalablement
avec du TNFα s’est aussi démontrée dépendante de l'expression de la E-sélectine mais
indépendante de l'activité SAPK2/p38 des HUVEC et des cellules tumorales. L'adhérence des
cellules HT-29 aux HUVEC exprimant la E-sélectine a mené à l'activation de SAPK2/p38
dans les cellules tumorales tel que reflété par la phosphorylation augmenté du facteur de
polymérisation d'actine HSP27 par la kinase MAPKAP k2/3, une cible directe de SAPK2/p38.
D'ailleurs, une protéine chimérique de E-sélectine/Fc a rapidement augmenté l'activation de
SAPK2/p38 dans les cellules HT-29. Le blocage de l’activité de SAPK2/p38 des cellules HT29 par le SB203580 ou en exprimant une forme dominante négative de SAPK2/p38 a empêché
leur migration transendothéliale. De même, les cellules HeLa exprimant stablement un mutant
kinase-inactif de SAPK2/p38 ont montré une capacité diminuée de traverser une couche de
HUVEC. De façon générale, nos résultats suggèrent que le contrôle de la migration
transendothéliale des cellules tumorales implique deux étapes essentielles: l’adhérence à
l'endothélium par des molécules d'adhérence, telle la E-sélectine, et un potentiel motogénique
accru suite à l'activation, médiée par l’adhérence, de la voie SAPK2/p38.
64
2.2 Article
Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by
endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the
tumor cells
Julie Laferrière1, François Houle1, Mohiuddin M. Taher2, Kristoffer Valerie2, and
Jacques Huot1
From
1
Le Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de
Québec, Québec G1R-2J6, Canada and 2 Department of Radiation Oncology, Massey Cancer
Center, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia 23298-0058
This work was supported by Canadian Institutes of Health Research Grant MT15402, the
Cancer Research Society Inc., and United States Public Health Grant PHS CA53199.
Julie Laferrière holds studentships from FRSQ/FCAR-CRSNG and The Cancer Research
Society Inc.
To whom correspondence should be addressed: Centre de Recherche en Cancérologie de
l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, 11 Côte du Palais, Québec, G1R 2J6, Canada.
Tel.: 418-691-5553; Fax: 418-691-5439; E-mail: [email protected]
RUNNING TITLE: E-selectin adhesion and SAPK2/p38 activation in metastasis
65
2.2.1 Summary
Adhesion and migration of tumor cells on and through the vascular endothelium are critical
steps of the metastatic invasion. We investigated the roles of E-selectin and of stress-activated
protein kinase-2 (SAPK2/p38) in modulating endothelial adhesion and transendothelial
migration of HT-29 colon carcinoma cells. Tumor necrosis factor (TNFα) strongly increased
the expression of E-selectin in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). This effect
was independent of the activation of SAPK2/p38 induced by TNFα. Adhesion of HT-29 cells
on a monolayer of HUVEC pretreated with TNFα was dependent on E-selectin expression but
was independent of SAPK2/p38 activity of both HUVEC and tumor cells. The adhesion of
HT-29 cells to E-selectin-expressing HUVEC led to the activation of SAPK2/p38 in the tumor
cells as reflected by the increased phosphorylation of the actin-polymerizing factor HSP27 by
mitogen-activated protein kinase 2/3, a direct target of SAPK2/p38. Moreover, a recombinant
E-selectin/Fc chimera quickly increased the activation of SAPK2/p38 in HT-29 cells.
Blocking the increased activity of SAPK2/p38 of HT-29 cells by SB203580 or by expressing a
dominant negative form of SAPK2/p38 inhibited their transendothelial migration. Similarly,
HeLa cells stably expressing a kinase-inactive mutant of SAPK2/p38 showed a decreased
capacity to cross a layer of HUVEC. Overall, our results suggest that the regulation of
transendothelial migration of tumor cells involves two essential steps as follows: adhesion to
the endothelium through adhesion molecules, such as E-selectin, and increased motogenic
potential through adhesion-mediated activation of the SAPK2/p38 pathway.
2.2.2 Footnotes
The abbreviations used are:
ICAM, intercellular adhesion molecule; ATF2, activating
transcription factor-2; FAK, focal adhesion kinase; HSP, heat shock protein; HUVEC, human
umbilical vein endothelial cells; JNK, Jun-N-terminal kinase; MAP kinase, mitogen activated
protein kinase; MAPKAP K2, MAP kinase-activated protein kinase 2; SAPK, stress-activated
66
protein kinase; TNFα, tumor necrosis factor α; VEGF, vascular endothelial growth factor;
GST, glutathione S-transferase; MOPS, 4-morpholinopropanesulfonic acid; FBS, fetal bovine
serum; PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride; PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis;
IEF, isoelectric focusing.
2.2.3 Introduction
Circulating tumor cells attach to adhesive endothelial molecules, and these interactions are
pivotal during the metastatic process. E-selectin, whose expression is induced by cytokines
and growth factors released by tumor cells, promotes the endothelial adhesion of tumor cells
from various origins, and this correlates with metastatic dissemination of tumor cells, e.g. to
liver, lung and bones (1-4). The ability of colon tumor cell clones to bind E-selectin on
endothelial cells is even directly proportional to their metastatic potential (5). Moreover,
inhibiting the expression of E-selectin with drugs such as cimetidine prevents metastasis (6).
Metastatic colonization also correlates with the expression of other types of endothelial
adhesion molecules such as P-selectin and ICAM (7-12). Futhermore, the metastatic potential
is associated with the circulating levels of soluble endothelial adhesion molecules shed by
activated endothelial cells of cancer patients (13-17). The increased metastatic potential
associated with adhesion of tumor cells to the endothelium might result from two distinctive
processes as follows: local intravascular proliferation of the attached tumor cells or
extravasation of these cells following their transendothelial migration into the sub-vascular
tissues (18,19). In both cases, the underlying biochemical mechanisms remain ill-defined.
Stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38), a member of the MAP kinase cascade family,
transduces the signals generated by stress and growth factors (20-22). Like other MAP kinase
signaling pathways, the SAPK2/p38 pathway consists of the MAP kinase module, the MAP
kinase itself (SAPK2/p38), the MAP kinase kinases (e.g. MKK3, MKK4 and MKK6) and the
MAP kinase kinase kinases (e.g. ASK1 and TAK1) (23,24). Activation of SAPK2/p38 is
involved in the synthesis of pro-inflammatory cytokines and activates a number of
67
transcription factors such as MEF2C, ELK-1 and ATF-2 (25-28).
It also regulates the
activation of cytoplasmic kinases such as MAPKAP kinases 2/3 (29-33) which leads to
phosphorylation of the actin-polymerizing factor HSP27. In endothelial cells, a cell type that
expresses high levels of HSP27, SAPK2/p38-mediated phosphorylation of HSP27 triggers
actin polymerization and reorganization into stress fibers in response to oxidative stress and
VEGF (21,22,34). In the case of VEGF, activation of SAPK2/p38, downstream of VEGFR2,
is accompanied by an HSP90-dependent tyrosine phosphorylation of FAK, a key protein
kinase involved in the assembly of focal adhesions. SAPK2/38-mediated actin polymerization
with FAK-dependent assembly of focal adhesions allow the actin reorganization required for
cell migration in various cellular systems (20,22,35-38).
In the present study, we show that E-selectin mediates adhesion of colon carcinoma HT-29
cells to endothelial cells. This contributes to activate the SAPK2/p38 pathway in the tumor
cells and enhances their motogenic potential and transendothelial migration.
2.2.4 Experimental procedures
Materials--[γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) and Na51Cr (200-500mCi/mg) were purchased from
Dupont and Amersham Pharmacia Biotech, respectively.
TNFα and SB203580 were
purchased from Calbiochem. Calcein-AM was obtained from Molecular Probes (Eugene,
OR), cycloheximide was from Sigma, and Tfx-50 was from Promega (Madison, WI).
Recombinant HSP27 was purified from Escherichia coli transformed with a plasmid
containing the coding sequence for Chinese hamster HSP27 (39). Myc-tagged human HSP27
and LT-tagged-MAPKAP K2 plasmids were obtained from Dr. Jacques Landry (Laval
University). pCMV-flag-p38 (Ala, Gly, Phe) was a gift from Dr. Roger Davis (University of
Massachusetts). Recombinant human E-selectin/Fc chimera was obtained from R&D Systems
(Minneapolis, MN). pEGFP-C1 was purchased from Clonetech (Palo Alto, CA). Chemicals
for electrophoresis were obtained from Bio-Rad and Fisher.
68
Antibodies--Anti-MAPKAP K 2/3 is a polyclonal antibody raised in the rabbit after injecting a
glutathione S-transferase (GST) fusion protein containing the 223 C-terminal amino acids of
Chinese hamster MAPKAP kinase-2 (33). Anti-E-selectin (Brig-E4 and BBA26) antibodies
are mouse monoclonal antibodies that were purchased from R&D Systems and Chemicon
(Temicula, CA) respectively. Anti-human TNFα neutralizing antibody was purchased from
R&D Systems. Mouse IgG1κ was obtained from Sigma. Myc was detected with the
monoclonal antibody 9E10 (40). The phospho-p38/SAPK2 antibody is a rabbit polyclonal
antibody purchased from New England Biolabs (Beverly, MA).
Cells--Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated by collagenase
digestion of umbilical veins from undamaged sections of fresh cords (34).
Briefly, the
umbilical vein was cannulated, washed with Earle’s balanced salt solution, and perfused for 10
min with collagenase (1 mg/ml) in Earle’s balanced salt solution at 37oC. After perfusion, the
detached cells were collected, and the vein was washed with medium 199 and the wash-off
pooled with the perfusate. The cells were washed by centrifugation and plated on gelatincoated 75 cm2 culture dishes in medium 199 containing 20% heat-inactivated fetal bovine
serum (FBS), endothelial cell growth supplement (60 µg/ml), glutamine, heparin and
antibiotics. Replicated cultures were obtained by trypsinization and were used at passages ≤ 5.
The identity of HUVEC as endothelial cells was confirmed by their polygonal morphology
and by detecting their immunoreactivity for factor VIII-related antigens. HT-29 human colon
carcinoma cells were obtained from ATCC (Manassas, MD). They were cultivated in McCoy
5A medium supplemented with 10% fetal bovine serum. HL-60 cells, obtained from ATCC,
were cultivated in RPMI 1640 medium supplemented with 20% heat-inactivated FBS. HeLa
cells stably transfected with a plasmid containing a kinase-inactive mutant of SAPK2/p38α
(p38(AGF)/HeLa) and the parental HIVCat/HeLa cells (HeLa) were maintained in Dulbecco’s
modified Eagle’s medium supplemented with 10% FBS and appropriate selection drugs (G418
and hygromycin B) (41, 42). Cultures were kept at 37oC in a humidified atmosphere
containing 5% CO2.
Transfection-- HT-29 cells were plated 24 h before lipofection (1.3 x 106 cells/25cm2 flasks or
1.106/60-mm petri dishes) and incubated, for 2 h in the absence of serum, with 6.3 or 8.15
µg/dish of plasmids (pCMV-flag-p38 AGF, Myc-tagged human HSP27, LT-tagged-MAPKAP
69
K2, pEGFP-C1) and Tfx-50TM at a ratio of 3:1. The incubation medium was then changed
with fresh medium, and treatments were applied 24 h post-transfection.
Immunoprecipitation--After treatments, cells were scraped and extracted in lysis buffer
containing 20 mM MOPS pH 7.0, 10% glycerol, 80 mM β−glycerophosphate, 5 mM EGTA,
0.5 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 5 mM Na4P2O7, 50 mM NaF, 1% Triton X-100, 1 mM
benzamidine, 1 mM dithiothreitol, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). The
extracts were vortexed and centrifuged at 17,000 x g for 12 min at 4oC. The clarified
supernatants were stored at -80oC. The further steps were carried out at 4oC. The clarified
supernatant was diluted 4 times in buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 mM
EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 1 mM Na3VO4, 1% Triton, 1 mM PMSF). Undiluted
antibodies were added in limiting concentrations, and the mixtures were incubated for 1 h.
Ten µl of protein A Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) 50% v/v in buffer I were
added, and the mixtures were incubated for 30 min. Samples were centrifuged for 15 sec and
washed 3 times with 300 µl of buffer I. Immunoprecipitates were directly used for the kinase
assays.
Kinase assays--SAPK2/p38 activation was measured by assessing the activity of its substrate
MAPKAP K2. The activity of immunoprecipitated MAPKAP K2 was measured using
recombinant HSP27 (34). The assays were carried out in 20 µl of kinase buffer K: 100 µM
ATP, 3 µCi of [γ32P] ATP (3000 Ci/mmole), 40 mM p-nitrophenyl phosphate, 20 mM MOPS,
pH 7, 10% glycerol, 15 mM MgCl2, 0.05% Triton X-100, 1 mM dithiothreitol, 1 mM
leupeptin, and 0.1 mM PMSF. The kinase activity was assayed for 30 min at 30oC and was
stopped by the addition of 10 µl SDS-PAGE loading buffer. In the case of SAPK1/JNK
activity, the cell extract was adsorbed on GST-Jun beads, and the kinase was tested using the
same GST-N-terminal Jun as substrate (34). Briefly, the GST-Jun fusion proteins bound to
glutathione-Sepharose beads were incubated for 30 min at 4oC with the extracts in buffer I.
The beads were then pelleted, washed with I buffer and incubated for 30 min at 30oC with 3
µCi [γ-32P]-ATP (3000 Ci/mmol) in kinase buffer K containing 10 mM MgCl2. The
phosphorylated GST-Jun was boiled in SDS sample buffer to stop the reaction. The activity of
the various kinases was quantified by measuring the incorporation of radioactivity into the
70
specific substrate after SDS-PAGE.
Kinase activities were evaluated by measuring
incorporation of the radioactivity into the specific substrates after resolution by SDS-PAGE
and quantification using liquid scintillation counting or by PhosphorImager (Molecular
Dynamics). In certain experiments, SAPK2/p38 activity was evaluated by Western blotting
using an antibody that recognizes the phosphorylated form of SAPK2/p38 (New England
Biolabs).
Phosphorylation of HSP27--HT-29 cells co-transfected with Myc-tagged HSP27, and
LT-tagged MAPKAP K2 plasmids were trypsinized, put in suspension and then left to adhere
to plastic only (Petri dish), to control HUVEC or to HUVEC-expressing E-selectin following
exposure to TNFα in the presence or not of a neutralizing anti-TNFα antibody. After 30 min,
adhering cells were extracted in IEF buffer, and protein were fractionated by IEF and
transferred onto nitrocellulose as described previously (34). After blotting Myc-tagged HSP27
isoforms A-D were revealed with the monoclonal anti-Myc antibody 9E10 and an ECL
detection kit (Amersham Pharmacia Biotech). The proportion of each of the isoforms has
been quantified after normalization for the same amount of HSP27/sample.
Adhesion assays--HUVEC were plated on gelatin-coated slides and left to grow to confluence
for 24-48 hours. HT-29 cells, HL-60 cells and HeLa cells were labeled for 30 min at 37ºC
with calcein. Labeled cells were left to adhere to the endothelial layer for 30 min at 37ºC.
The endothelial layer was washed twice with phosphate-buffered saline, and the attached cells
were quantified by measuring the fluorescence emission using a fluorometer.
Transendothelial cell migration assay-- Cell migration was assayed using a modified Boyden
chamber assay. HUVEC (150, 000) were grown to confluence (48 h) on an 5.0 µm pore size
gelatinized polycarbonate membrane separating the two compartments of a 6.5 mm migration
chamber (Transwell Costar). HUVEC were treated or not with 10 ng/ml TNFα for 90 min.
Thereafter, culture media were changed for fresh media and cells incubated for an additional
2.5h. Tumor cells in suspension were labeled for 1.5h with 100 µCi
51
Cr/106 cells and then
added in migration buffer (medium 199, 10 mM HEPES pH 7.4, 1.0 mM MgCl2, 0.5% bovine
serum albumin) on the monolayer of HUVEC, previously washed with the same buffer. After
4.5h, cells on the upper face of the membrane were scraped using a cotton swab. The number
71
of tumor cells that have migrated to the lower face of the filter was counted by detaching the
membrane and counting the radioactivity.
In some experiments, HT-29 cells were not radiolabeled. After migration, cells on the upper
face of the membrane were scraped using a cotton swab and cells on the lower face were fixed
with 3.7% formaldehyde and stained with Mayer’s hematoxylin solution. The number of cells
on the lower face of the filter was counted in five fields under X 100 magnification. HT-29
cell number has been determined after correction for the background of HUVEC (<10% of
total number of counted cells).
Confocal fluorescence microscopy--Confocal microscopy was used for immunofluorescent
visualization of F-actin, E-selectin and ICAM (33). The cells were plated on gelatin-coated
LabTek dishes. After treatment, they were fixed with 3.7% formaldehyde and permeabilized
with 0.1% saponin in phosphate buffered saline, pH 7.5.
F-actin was detected using
fluorescein isothiocyanate-conjugated phalloidin (33.3 µg/ml) diluted 1:50 in phosphate
buffer. Brig-E4 monoclonal antibody was used to detect E-selectin. The antigen-antibody
complexes were detected with biotin-labeled anti–mouse IgG and were revealed with TexasRed conjugated streptavidin. The cells were examined as reported previously by confocal
microscopy with a Bio-Rad MRC-1024 imaging system mounted on a Nikon Diaphot-TDM
equipped with a X 60 objective lens with a 1.4 numerical aperture (34).
Statistical analysis--Data are mean +/- S.D.
Statistical analysis was done by using the
appropriate Student t test. p< 0.05 was considered as significant.
72
2.2.5 Results
E-Selectin-dependent adhesion of tumor cells to endothelial cells is independent of
SAPK2/p38 activity – In primary cultures of HUVEC, TNFα induced a strong activation of
the expression of endothelial adhesion proteins that include E-selectin and ICAM (Figures 21a to 2-1d and data not shown). This induction was maximal after 4 h and required de novo
protein synthesis being inhibited by cycloheximide (Figure 2-1e and 2-1f). As illustrated in
figures 2-2a to 2-2c, the expression of E-selectin correlated with an increased adhesion of
both colon carcinoma HT-29 cells and HL-60 leukemia cells to a monolayer of HUVEC.
After 30 min, the number of HT-29 cells that adhered to HUVEC-expressing E-selectin,
following activation with TNFα, was 5-fold higher than when adhering to inactivated HUVEC.
Similarly, HT-29 cells quickly adhered to immobilized recombinant human E-selectin/Fc
chimera (data not shown).
An anti-E-selectin neutralizing antibody, but not a matched
isotype antibody, decreased the adhesion of both cancer cell types to the activated endothelium
(Figures 2-2a to 2-2c). Cycloheximide also inhibited the adhesion of HT-29 cells, which is
consistent with the fact that adhesion required de novo E-selectin synthesis (Figure 2-2a).
These results indicate that E-selectin expression is a major determinant in the adhesion of
tumor cells to endothelial cells.
73
74
Figure 2-1 TNFα-induced de novo expression of E-selectin is not mediated by
activation of SAPK2/p38.
HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated (A and B) or were pretreated for 60 min with 100 µM cycloheximide (E and F) or with 5 µM SB203580 (G
and H). Then TNFα (10 ng/ml) was added for 90 min to C to H. Thereafter, culture
media were changed for fresh media alone (A to D) or fresh media containing 100 µM
cycloheximide (E and F) or 5 µM SB203580 (G and H) and cells were incubated for an
additional 2.5h. After treatments, cells were processed for actin staining using
fluorescein isothiocyanate-conjugated phalloidin (A, C, E, G) or E-selectin detection
with monoclonal antibody Brig-E4 complexed with a biotin-labeled anti-mouse IgG
and revealed with Texas Red-conjugated streptavidin (B, D, F, H). Cells were then
examined by confocal microscopy.
75
76
Figure 2-2 E-selectin-dependent adhesion of tumor cells to endothelial cells does
not require activation of SAPK2/p38.
A and B, HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated or were treated
for 90 min with 10 ng/ml TNFα. Thereafter, culture media were changed for fresh
media, and cells were incubated for an additional 2.5h in the presence or absence of
increasing concentrations of an anti-E-selectin neutralizing antibody (BBA26, last 60
min), of a matched isotype antibody (last 60 min), of 5 µM SB203580 (last 30 min) or
of 100 µM cycloheximide (1h prior to TNFα treatment). HT-29 cells labelled with
calcein-AM were then added to the endothelial layer and left to adhere for 30 min at
37˚C. After washing, fluorescence was quantified to measure the number of adherent
cells. C, HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated or were treated
for 90 min with 10 ng/ml TNFα. Thereafter, culture media were changed for fresh
media and cells were incubated for an additional 2.5h in the presence or absence of an
anti-E-selectin neutralizing antibody (last 60 min) or with a matched isotype antibody
(last 60 min). HL-60 cells labeled with calcein-AM were then added on the HUVEC
layer and left to adhere for 30 min at 37˚C. After washing, fluorescence was
quantified to determine the number of adherent HL-60 cells. Data points represent
the mean + SD. p was determined by the Student’s t test. *: p< 0.0125 and †: p <0.0005.
mAb, monoclonal antibody.
77
TNFα also induced in HUVEC, a marked time- and dose-dependent stimulation of
SAPK2/p38 that is characterized by an increased activity of MAPKAP K2/3, a direct
physiological target of SAPK2/p38 (21). Maximal stimulation was obtained after 10 min
exposure to concentrations of TNFα equal to or higher than 5 ng/ml (Figure 2-3a and 2-3b).
The pyridinylimidazole derivative SB203580, in concentrations of 1-5 µM, completely
inhibited the TNFα-induced increase in SAPK2/p38 activity as reflected by the inhibition of
MAPKAP K2/3 activation in cells exposed to TNFα (Figure 2-3c). In contrast, SB203580
had no effect on the activity of SAPK1/JNK that was co-activated with SAPK2/p38 in the
presence of TNFα (Figure 2-3d).
Inhibiting the TNFα-induced increase in SAPK2/p38
activity by SB203580 did not impair the expression of E-selectin which suggested that
activation of SAPK2/p38 was not required for the expression of this adhesion molecule
(Figure 2-1g and 2-1h). Accordingly, blocking the SAPK2/p38 activity of HUVEC with
SB203580 did not inhibit the adhesion of HT-29 cells to HUVEC (Figures 2-2a). Overall,
these results indicate that activation of SAPK2/p38 is not necessary for the expression of Eselectin by endothelial cells nor for the adhesion of tumor cells to endothelial cells.
E-Selectin expression by endothelial cells and activation of SAPK2/p38 in the tumor cells
are both required for the transendothelial migration of tumor cells – E-selectin-dependent
adhesion of leukocytes to the endothelium is a prerequisite to their transendothelial migration
during the inflammatory process (43). We thus verified whether E-selectin-mediated adhesion
was required for the migration of tumor cells across an endothelial layer separating the upper
and lower compartments of a Boyden-modified chamber. HT-29 cells have by themselves a
very low motogenic potential, being unable to traverse a polycarbonate membrane, even
following the addition of FBS in the lower chamber (data not shown). However, HT-29 cells
migrated across an endothelial layer of HUVEC, and this migration was enhanced by
pretreating HUVEC with TNFα (Figure 2-4a). This increase in cell migration was reduced
down to control levels by pretreating HUVEC with the anti-E-selectin antibody indicating the
requirement of E-selectin expression and E-selectin-dependent adhesion for HT-29 cell
migration across an endothelial cell layer (Figure 2-4a).
78
79
Figure 2-3 Dose- and time-dependent activation of SAPK2/p38 induced by TNFα in
HUVEC
HUVEC were treated for 15 min with increasing concentrations of TNFα (A) or for
various periods with 10 ng/ml TNFα (B). C, HUVEC were pretreated for 1h with
vehicle (DMSO 0.25%) or with 5 µM SB203580 before administration of 10 ng/ml
TNFα for 15 min. After treatments, samples were extracted and SAPK2/p38 activity
was evaluated in immunocomplex assays by measuring the activity of MAPKAP K2,
using a specific anti-MAPKAP K2 antibody and rHSP27 as substrate. Results are
expressed as the ratio of kinase activity of stimulated cells over the activity of
unstimulated cells. Representative results from three experiments are shown. D,
HUVEC were pretreated for 1h with vehicle (DMSO 0.25%) or with 5 µM SB203580
before administration of 25 ng/ml TNFα for 15 min. After treatments, samples were
extracted and were adsorbed on GST-c-Jun beads, and the kinase activity was tested
using the same GST-N-terminal Jun as substrate. Results are expressed as the ratio of
kinase activity of stimulated cells over the activity of unstimulated cells.
80
81
Figure 2-4 Transendothelial migration of HT-29 tumor cells requires E-selectin
expression by endothelial cells and increased SAPK2/p38 activity in the tumor
cells.
HUVEC were grown to confluency for 48 h on a 5-µm pore size polycarbonate
membrane in Boyden-modified chambers. HUVEC were treated or not with 10
ng/ml TNFα for 90 min. Thereafter, culture media were changed for fresh media and
cells incubated for an additional 2.5h. A, HUVEC were treated or not for the last 60
min with an anti-E-selectin neutralizing antibody. HT-29 cells pretreated for 30 min
with 5 µM SB203580 or with the vehicle (DMSO 0.1%) were then added on the
endothelial layer and left to migrate for 4.5h at 37˚C. B, HT-29 cells were transiently
transfected with the indicated amount of pCMV-flag-p38 AGF cDNA for 24h before
being harvested and added to the layer of HUVEC and then left to migrate for 4.5h.
Results are expressed as the ratio of the number of HT-29 cells that have crossed the
activated endothelial layer over the number of HT-29 cells that have crossed the
unstimulated endothelial layer. A, data points represent the mean + SD. p was
determined by the Student’s t test, n = 3-6 from two different experiments. B, data
points represent the means from duplicates, and results are representative from two
different experiments.
82
We recently reported that activation of SAPK2/p38, by leading to the phosphorylation of the
actin polymerizing factor HSP27, is importantly involved in transducing the motogenic signal
elicited by VEGF in endothelial cells (20,22). Moreover, SAPK2/p38 was highly reactive in
HT-29 cells being activated by cytokines, such as TNFα, that are associated with the
neoplastic process. SB203580 inhibited this increased SAPK2/p38 activity in response to
TNFα (Figure 2-5). From these observations, we hypothesized that E-selectin-mediated
adhesion could activate the SAPK2/p38-HSP27 pathway in the tumor cells and that this could
trigger their transendothelial migration.
We
then
examined
whether
SAPK2/p38/HSP27 pathway.
E-selectin-mediated
adhesion
could
activate
the
HT-29 cells were transiently transfected with Myc-tagged
human HSP27 and LT-tagged MAPKAP K2 and then were put in suspension and added to
plastic only (Petri dish), to control HUVEC or to HUVEC-expressing E-selectin following
activation with TNFα.
Thirty minutes after adhesion, cell extracts were prepared from
adhering cells and phosphorylation of HSP27 was evaluated by IEF electrophoresis to separate
the
four
major
isoforms
of
HSP27,
A-D,
that
represent
unphosphorylated,
monophosphorylated, biphosphorylated and triphosphorylated variants of the protein. Results
showed that adhesion of HT-29 cells to HUVEC-expressing E-selectin was associated with a
3.5-fold increase in the proportion of phosphorylated C form in comparison with the
proportion of C form found in HT-29 cells that have adhered to plastic or to untreated HUVEC
(Figure 2-6a and 2-6d). This was associated with a proportional significant decrease in the
amount of the unphosphorylated A form in the HT29 cells adhering to E-selectin-expressing
HUVEC (Figure 2-6b).
Phosphorylated B form was present in any of the adhering
conditions, but its proportion did not vary (Figure 2-6c). Expression of E-selectin in HUVEC
has been induced by pre-treating the cells for 90 min with 10 ng/ml TNFα followed by a
medium change and a further 2h30 incubation in fresh medium. Hence, it is possible that a
fraction of TNFα exogenously added to HUVEC to trigger synthesis of E-selectin remained
bound to HUVEC or in solution in the fresh culture medium at the time of adding HT-29 cells
to activated HUVEC. Since TNFα activated SAPK2/p38 in HT-29 cells (Figure 2-5), we thus
considered the eventuality that residual TNFα contributed to increase the phosphorylation of
HSP27 in the adherent HT-29 cells.
To exclude this possibility, enzyme-linked
immunosorbent assays (Quantikine from R&D Systems) were performed to detect TNFα
83
bound to HUVEC as well as remaining in the fresh culture medium. We found that only trace
amounts of TNFα (4.2 pg/5x105 cells) were associated with HUVEC whereas 0.25 ng/ml were
found in the fresh culture medium. In both cases, these concentrations were below the
minimal concentration of TNFα (0.5 µg/ml) that was required to activate SAPK2/p38 in HT29 cells. We thus concluded that was unlikely that residual TNFα was involved in activating
SAPK2/p38 in HT-29 cells adhering to HUVEC. Accordingly, addition of a neutralizing antiTNFα, in concentration (0.5 µg/ml) that totally inhibited the activation of SAPK2/p38 by 1
ng/ml TNFα, did not impair the increased phosphorylation of HSP27 in HT-29 adhering to
HUVEC (Figure 2-6e and f).
These results support the hypothesis that the E-selectin-
dependent adhesion of HT-29 tumor cells to endothelial cells activates the SAPK2/p38-HSP27
pathway in the tumor cells. In fact, the activity of SAPK2/p38 of HT-29 cells was quickly
increased by adhesion of the cells to immobilized recombinant human E-selectin/Fc chimera
(data not shown). Reciprocally, addition of recombinant human E-selectin/Fc chimera, in
concentration (1 µg/ml) that increased adhesion of HT-29 by 10-fold in comparison to bovine
serum albumin controls, activated in these cells the SAPK2/38 in a time-dependent manner
with a peak of activation of 6.5-fold after 5 min (Figure 2-7 and data not shown). Together,
these findings indicate that E-selectin did not only mediate the adhesion of HT-29 cells to
HUVEC but that it could also act as agonistic ligand that activated the SAPK2/p38-HSP27
motogenic pathway in the tumor cells.
84
Figure 2-5 Inducibility of the SAPK2/p38 pathway in HT-29 tumor cells.
HT-29 cells were pretreated for 30 min with the vehicle (DMSO) or with 5 µM
SB203580 before the administration of 20 ng/ml TNFα for 15 minutes. After
treatments, samples were extracted and SAPK2/p38 activity was evaluated in
immunocomplex assays by measuring the activity of MAPKAP K2 using a specific
anti-MAPKAP K2 antibody and rHSP27 as substrate. Results are expressed as the
ratio of kinase activity of stimulated cells over the activity of unstimulated cells. n=2.
Representative results from 2 experiments are shown.
85
86
Figure 2-6 E-selectin-mediated adhesion of HT-29 tumor cells to endothelial cells
activates the phosphorylation of HSP27 in the tumor cells.
HUVEC were grown to confluency and treated or not with 10 ng/ml TNFα for 90
min. Thereafter, culture media were changed for fresh media, and HUVEC were
incubated for an additional 2.5h. HT-29 cells, transiently transfected with Myc-tagged
human HSP27 and LT-tagged MAPKAP K2, were put in suspension in HUVEC
media, and then were added to free Petri dishes only (Plastic), to a layer of inactivated
HUVEC (HUVEC) or to a layer of TNFα-activated HUVEC (HUVEC/TNF). HT-29
cells were left to adhere for 30 min. Then adherent cells were lysed in IEF buffer, and
proteins were fractionated by IEF.
The proteins were then transferred on
nitrocellulose membrane, and Myc-tagged HSP27 was revealed by Western blotting
using the anti-Myc monoclonal antibody 9E10. Representative IEF blots of triplicate
samples are shown in A. B-D show the quantitative variation in the proportion of the
A(unphosphorylated), B (monophosphorylated) and C (biphosphorylated) isoforms
of HSP27, respectively. The proportion of each isoforms has been quantified after
normalization for the same amount of HSP27/sample. E, HUVEC were grown to
confluency and treated with 10 ng/ml TNFα for 90 min. Thereafter, culture media
were changed for fresh media and HUVEC were incubated for an additional 1.5h.
Then, 0.5 µg/ml of an anti-TNFα neutralizing antibody (goat IgG) or 0.5 µg/ml of an
irrelevant antibody (goat IgG anti-rabbit) were added for 1 h prior to the addition of
transfected HT-29 cells. The extracts were then processed for HSP27 phosphorylation
as in A.
F, HUVEC were pretreated for 1 h with 0.5 µg/ml of an anti-TNFα
neutralizing antibody (goat IgG) or with 0.5 µg/ml of an irrelevant antibody (goat
IgG anti-rabbit) before the addition of 1.0 ng/ml of TNFα for 10 min. SAPK2/p38
activity was determined by Western blotting using a phospho-p38 antibody (PY-p38).
Data point represent the mean + SD. p values were determined by the Student’s t
test.
87
Figure 2-7 Time-dependent activation of SAPK2/p38 by E-Selectin.
HT-29 cells were grown for 24 hours and then treated for various periods with 1
µg/ml of recombinant human E-selectin/Fc chimera. Thereafter, SAPK2/p38 activity
was determined by Western blotting using a phospho-p38 antibody (PY-p38).
88
Impairing E-selectin-mediated activation of SAPK2p38 and HSP27 phosphorylation of HT-29
cells with SB203580 (Figures 2-4a and data not shown) or by expressing a dominant negative
form of SAPK2/p38 inhibited their migration across activated HUVEC (Figures 2-4b). This
supports the hypothesis that E-selectin-mediated activation of the SAPK2/p38-HSP27
pathway in HT-29 cells is determinantly involved in triggering the transendothelial migration
of these cells. The role of SAPK2/p38 as a motogenic pathway in tumor cells was further
supported by the finding that HeLa cells stably expressing a kinase-inactive mutant form of
SAPK2/p38 had a lower capacity than the parental cells to migrate across a monolayer of
HUVEC (Figure 2-8a and 2-8b). Intriguingly, the adhesion of both types of HeLa cells was
not increased when added to HUVEC stimulated with TNFα (Figure 2-8c). These findings
confirmed the results of figure 2-1a that SAPK2/p38 was not involved in mediating adhesion
of cancer cells to HUVEC and they indicated that, conversely to HT-29 cells, adhesion of
HeLa cells to HUVEC did not require the expression of E-selectin or of other adhesion
molecules that depend on TNFα exposure.
This raises the interesting possibility that
activation of SAPK2/p38 of the cancer cells may be a common motogenic event that involves
different types of adhesive interactions that may differ from tumor cells to tumor cells and
from endothelial cells from different origins.
89
90
Figure 2-8 Migration of HeLa cells through but not adhesion on endothelial cells
depends on SAPK2/p38 activity.
A, Parental HeLa (HIVCat/HeLa) cells and HeLa cells expressing kinase-inactive
mutant of SAPK2/p38 (p38 (AGF)/HeLa) were treated or not for with TNFα, as
indicated. Thereafter, SAPK2/p38 activity was determined by Western blotting using
a phospho-p38 antibody (PY-p38) or by measuring the activity of its substrate
MAPKAP K2 in immunocomplexes using a specific anti-MAPKAP K2 antibody and
rHSP27 as substrate. B, HUVEC were grown to confluency for 48 h on a 5-µm pore
size polycarbonate membrane in Boyden-modified chambers. Parental HeLa
(HIVCat/HeLa) cells and HeLa cells expressing kinase-inactive mutant of
SAPK2/p38 (p38 (AGF)/HeLa) were then added on the endothelial layer and left to
migrate for 4.5h at 37˚C. Results are expressed as the number of HeLa cells that have
crossed the endothelial layer. C, HUVEC plated on gelatin-coated slides were left
untreated or were treated for 90 min with 10 ng/ml TNFα. Thereafter, culture media
were changed for fresh media, and cells were incubated for an additional 2.5h. HT-29
and parental HeLa (HIVCat/HeLa) cells or HeLa cells expressing a kinase-inactive
mutant of SAPK2/p38 (p38 AGF/HeLa) were labeled with calcein-AM and added to
a monolayer of unstimulated or TNFα-stimulated HUVEC. Cells were left for
adhesion during 30 min at 37˚C, washed twice, and then fluorescence was quantified.
The number of HT-29 cells and HeLa cells were determined using standard curves.
Data points represent the mean + SD. p was determined by the Student’s t test. *: p<
0.0125 and †: p <0.0005.
91
2.2.6 Discussion
Adhesion of circulating tumor cells to vascular endothelium and their subsequent
transendothelial migration are two important steps associated with extravasation of tumor cells
and metastatic spreading. Here, we obtained results which suggest that E-selectin adhesion of
tumor cells to endothelial cells contributes to activate the motogenic SAPK2/p38 pathway in
the tumor cells, which triggers their transendothelial migration.
E-selectin is not expressed in unstimulated endothelial cells. However, its expression is
quickly and transiently turned on following activation of endothelial cells with TNFα. The
induction of E-selectin expression results from the transcriptional activation of the E-selectin
gene. Three pathways converge on the activation of the E-selectin gene promoter following
stimulation of endothelial cells with TNFα, the NF-κB pathway, and the SAPK1/JNK and
SAPK2/p38 MAP kinase pathways. Both the SAPK1/JNK and SAPK2/p38 pathways mediate
increases in E-selectin gene promoter activity through activation of the transcription factors
ATF2 and c-Jun (44). Activation of the NF-ΚB and SAPK1/JNK pathways are required for
full activation of the E-selectin gene (44). In contrast, the SAPK2/p38-mediated activation of
the E-selectin gene is ancillary and dispensable for full expression of the protein since we
found that inhibiting SAPK2/p38 with SB203580 did not inhibit the expression of E-selectin.
This suggests that activation of ATF2 and c-Jun by JNK can rescue the inhibition that results
from exposure of cells to SB203580.
The best characterized physiological role for selectins is their involvement in the adhesion of
leukocytes to activated endothelial cells during the inflammatory process (45). This adhesion
is the first step that underlies the transendothelial migration of leukocytes to the inflammatory
sites and to the subsequent destruction of the invading pathogens. Numerous studies have also
implicated endothelial adhesion molecules and especially E-selectin in adhesion of carcinoma
cells to vascular endothelial cells (2). The necessity of E-selectin expression for the adhesion
of tumor cells from solid (HT-29) and hematological tumors (HL-60) is supported by our
observation that pretreating endothelial cells with an anti-E-selectin neutralizing antibody, but
not a matched isotype antibody, inhibited in a dose-dependent manner the adhesion of both
92
tumor cell lines to HUVEC. The binding of tumor cells to endothelial cells is clinically
significant, being associated with metastasis. Notably, the ability of colon tumor cell clones to
bind E-selectin expressed by activated endothelial cells is directly proportional to their
metastatic potential (5). Moreover, drugs like cimetidine which inhibit the expression of Eselectin, prevents metastasis (6).
Two mechanisms may underlie the metastatic development in response to adhesion of tumor
cells to the endothelium as follows: intravascular proliferation of attached tumor cells or
extravasation of these cells (18,19). In the latter case, this implicates numerous factors that
may work separately or in combination. This implies among others that circulating tumor cells
have a higher intrinsic motogenic potential, that they respond to circulating motogenic signals,
or that contact of tumor cells with endothelial cells activates the motogenic potential of the
tumor cells. A major conclusion of our study is to provide evidence that E-selectin-mediated
adhesion of HT-29 tumor cells to HUVEC increased the activity of the motogenic SAPK2/p38
pathway of the tumor cells enabling their transendothelial migration. Two lines of evidence
support this conclusion. First, addition of HT-29 cells to HUVEC-expressing E-selectin led to
an increased phosphorylation of HSP27, as indicated by the significant enhanced amount of
HSP27-phosphorylated C form in the HT-29 cells that adhered to TNFα-treated HUVEC in
comparison to those that adhered only to plastic or to untreated HUVEC. HSP27 is an
actin-polymerizing factor whose phosphorylation downstream of the SAPK2/p38 pathway
(34) contributes with FAK phosphorylation to induce the actin reorganization that is required
for cell migration (20,46-48). Second, inhibiting SAPK2/p38 activity and phosphorylation of
HSP27 of HT-29 cells with SB203580 or with an inactive kinase mutant of SAPK2/p38
resulted in an inhibition of the transendothelial migration of the tumor cells.
The finding that recombinant human E-selectin/Fc chimera activates SAPK2/p38 indicates
that E-selectin acts as an agonist that binds to counter-receptors at the surface of tumor cells to
initiate a cascade of events leading to SAPK2/p38 activation. The tumor cells binding to Eselectin involves oligosaccharides such as sialyl Lewis a and x presented by counter-receptors
for E-selectin (49).
Binding of E-selectin to these receptors initiates signaling events
involving tyrosine phosphorylation of various proteins (50). One such potential E-selectin
receptor on HT-29 cells might be E-selectin ligand-1, a member of the fibroblast growth factor
93
tyrosine kinase receptor family that is expressed by various tumor cell lines including myeloid
cells. SAPK2/p38 is strongly activated by VEGF binding to VEGFR2, another tyrosine kinase
receptor (20,22). E-selectin ligand-1 is thus possibly implicated as a counter-receptor
responsible for binding of E-selectin and for transmitting the signal that triggers activation of
SAPK2/p38. The capacity of selectins to activate SAPK2/p38 has recently been reported in a
study that showed that clustering of L-selectin in neutrophils activates SAPK2/p38, which
triggers neutrophil degranulation (51). It remains possible that a secondary adhesion molecule
could contribute with E-selectin to trigger adhesion-mediated signaling to SAPK2/p38. In this
context, the role of ICAM that is co-expressed with E-selectin in endothelial cells activated by
TNFα remains to be investigated. Integrins are importantly involved in transducing signals
initiated by cell-cell adhesion (52). For example, tumor cell-bound α4 integrin strengthens
adhesion of tumor cells to the endothelium and promotes transendothelial migration (53).
Moreover, activation of SAPK2/p38 by adhesion of osteosarcoma cells onto collagen is
mediated by α2ß1 integrin (54). Thus, integrins may act jointly with selectins to regulate the
SAPK2/p38 mediated motogenic signal elicited in tumor cells when they adhere to endothelial
cells.
Interestingly, adhesion of HeLa cells to HUVEC is not markedly increased following
treatment of endothelial cells with TNFα suggesting that E-selectin does not have a major role
in the process. Nevertheless, transendothelial migration of Hela cells also required
SAPK2/p38 activity since HeLa cells stably expressing a kinase-inactive mutant of
SAPK2/p38 showed a decreased capacity to cross the endothelial layer compared to the
parental cells. These observations suggest the following: first, activation of SAPK2/p38 might
be a common mechanism that triggers transendothelial migration of tumor cells following
their adhesion to the endothelium, and second, that different endothelial adhesive molecules
may contribute to activate this pathway.
Endothelial adhesive molecules differ between
endothelial cells from different origins, and the specificity of the cancer cell-endothelial cell
interactions may well constitute the basis for the organ specificity of metastatic colonization.
Notably, hepatic colonization by metastatic cells requires the expression of E-selectin by liver
sinusoidal endothelial cells, whereas pulmonary metastasis rather requires the expression of
the lung endothelial cell adhesion molecule, LuECAM (3,55).
94
In summary, we have shown here that transendothelial migration of tumor cells requires the
expression of endothelial adhesion molecules such as E-selectin which are necessary to enable
tumor cells to adhere to the endothelium adhesion and which contribute to activate the
motogenic pathway SAPK2/p38-HSP27 in the tumor cells. This might represent a pivotal and
insidious paracrine mechanism of metastatic spreading since tumor cells may activate the
expression of E-selectin (3).
2.2.7 Acknowledgments
We thank Dr. Jacques Landry, Steve Charette and Herman Lambert for providing Myc-tagged
HSP27 construct and Dr. Roger J. Davis for giving pCMV-flag-p38 (Ala, Gly, Phe).
2.2.8 References
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Chapitre 3
E-sélectine et p38 dans les métastases
100
3
Régulation du processus métastatique par la Esélectine et SAPK2/p38
Ce chapitre fait l’objet d’une publication dans la revue Annals of New York Academy of
Science (973, pp.562-572, 2002) et constitue la version finale telle que publiée dans ce journal.
Ce travail est reproduit avec la permission du journal (Copyright 2002 New York Acadmy of
sciences, U.S.A.). Cet article de revue a été écrit dans le cadre d’un congrès : « Cell signaling,
transcription and translation as therapeutic targets », qui a eu lieu au Luxembourg en
janvier/février 2002. J’ai présenté une affiche à ce congrès. J’ai structuré et écrit la première
version de cet article ainsi que contribué à la version finale. J’ai également fait toutes les
figures.
101
3.1 Résumé
La formation des métastases est une complication redoutable du cancer qui est associée à un
mauvais pronostique. Plusieurs observations cliniques et résultats expérimentaux indiquent
que le processus métastatique est non aléatoire et implique un série d’événements multiples
qui peuvent tous être visés par la thérapie. Ceci inclut l'angiogénèse du néoplasme primaire, le
dégagement des cellules malignes de ce néoplasme, l’entrée des cellules cancéreuses dans la
circulation sanguine, l'interaction des cellules cancéreuses avec les cellules endothéliales
vasculaires dans les organes éloignés, la croissance des cellules cancéreuses localement dans
les vaisseaux sanguin ou d'une manière distale après extravasation. Notre hypothèse de travail
est que les cellules cancéreuses métastatiques parasitent les mécanismes de l'inflammation
pour émigrer efficacement dans les organes éloignés. Ceci implique, entre autres, un rôle
important des interactions adhésives spécifiques des cellules cancéreuses avec les cellules
endothéliales vasculaires ainsi que l'activation des voies migratrices dans les cellules
cancéreuses. Nous passons en revue ici les rôles joués par la molécule d’adhérence
endothéliale E-sélectine et de la voie kinase SAPK2/p38 des cellules cancéreuses pour
moduler la migration transendothéliale des cellules cancéreuses.
102
3.2 Article
Running title : Laferrière et al.: E-Selectin and SAPK2/p38 in metastasis
Regulation of the metastatic process by E-selectin and stress-activated protein kinase-2 /
p38
Julie Laferrière, François Houle and Jacques Huot
Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, Québec,
G1R 2J6, Canada
Address for correspondence: Jacques Huot, Centre de Recherche en Cancérologie de
l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, 9 rue McMahon, Québec, Québec, G1R 2J6,
Canada.
Voice:
418-525-4444,
extension
5553;
fax:
418-691-5439
e-mail:
[email protected]
Key words : E-selectin; selectins; metastasis; liver metastasis; SAPK2/p38; MAPK;
migration; endothelial cells; colon cancer; breast cancer; integrins; adhesive molecules
103
3.2.1 Abstract
The formation of metastasis is a dreadful complication of cancer that is associated with a poor
prognostis. Several clinical observations and experimental findings indicate that the metastatic
process is nonrandom and involves a sequence of multistep events that may all be targeted for
therapy. This includes angiogenesis of the primary neoplasm, release of malignant cells from
this neoplasm, entry of cancer cells into the blood circulation, interaction of cancer cells with
vascular endothelial cells in distant organs, and growth of blood-borne cancer cells locally in
the vessels or distally following extravasation. Our working hypothesis is that metastatic
cancer cells exploit the mechanisms of the inflammation process to succesfully migrate into
distant organs. This implies a pivotal role for specific adhesive interactions between cancer
cells and vascular endothelial cells and activation of migratory pathways in the cancer cells.
We review here the roles played by the endothelial adhesive molecule E-selectin and of the
motogenic stress-activated
protein kinase-2 (SAPK2/p38) pathway of cancer cells in
modulating transendothelial migration of cancer cells.
3.2.2 Selectins: classification, structure and binding
The selectins are a family of three calcium-dependent adhesion receptors that regroup L-, Pand E-selectin. L-selectin is expressed constitutively by lymphocytes, whereas E-selectin is
expressed exclusively by activated endothelial cells. P-selectin is found in platelets and
endothelial cells, where it is stored in α−granules and Weibel-Palade bodies, respectively. The
extracellular portion of each selectin is composed of three different domains; a C-type lectin
domain of 120 amino acids in the amino-terminal, an epidermal growth factor (EGF)-type
domain of 30-40 amino acids, and 2-9 short consensus repeats (~60 amino acids) that are
found in complement regulatory proteins (CRP). The selectins are anchored in the membrane
through a single helicoidal transmembrane domain that is followed by a short cytoplasmic tail
(1,2). The selectins contribute importantly to the entry of leukocytes into inflamed tissues.
104
Initial tethering of leukocytes to the endothelium is mediated by selectins and is followed by
their rolling on the endothelial layer. The rolling leukocytes sense chemokines on the surface
of the endothelium, an event which activates their integrins and trigger firmer adhesion and
subsequent transendothelial migration to the inflammatory site (2-4). A treshold level of fluid
shear stress is necessary to promote rolling and adhesion of leukocytes through selectins (5).
E-selectin is not expressed in non-activated endothelial cells. However, it is quickly and
transiently expressed following a challenge by proinflammatory stimuli such as tumor necrosis
factor-α (
F-α), interleukin-1β, thrombin and bacterial lipopolysaccharide (LPS) (2,6,7).
Intriguingly, hyperglycemia also turns on the expression of E-selectin by endothelial cells (8).
Maximal E-selectin mRNA levels are usually found within 3 to 4 h of exposure to appropriate
stimuli (6,9). Three pathways converge on the activation of the E-selectin gene promoter
following stimulation of endothelial cells with TNF-α: the NF-κB pathway, the SAPK1/JNK
pathway and the SAPK2/p38 MAP kinase pathway. Both the SAPK1/JNK and SAPK2/p38
pathways mediate increases in E-selectin gene promoter activity through activation of the
transcription factors c-Jun and ATF2 (10). The SAPK2/p38-mediated activation of the Eselectin gene is ancillary and dispensable for full expression of the protein (11). Of note, the
endothelial selectins may be expressed differentially in blood vessels from different tissues.
For example, LPS and TNF-α strongly induce the expression of P-selectin on endothelial cells
of the leptomeninges, but at a weaker level on some blood vessels of the brain parenchyma
(9).
The selectins bind to various carbohydrates such as sialyl-Lewis a and x (SLea and SLex) or
other fucosylated oligosacccharides that are presented by a scaffold protein and possibly a
lipid carrier molecule on the adhering cells (2,12,13). This macromolecular scaffolding
complex, known as selectin ligand or counterreceptor, is essential for binding. The sialylLewis sugars alone have only a weak affinity for selectins, whereas the presenter proteins have
no binding capacity by themselves. The sugar-protein complex of binding contributes to the
specificity of interactions since the binding affinity of a given sugar for a given selectin varies
depending on the presenter proteins. P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), a shared
ligand for both P- and E-selectins, is a transmembrane o-glycosylated protein that is found on
leukocytes and lymphoid cells (14). Glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1
105
(GlyCAM-1) and CD34 are two mucin-like potential ligands for L-selectin that are both
presented by endothelial cells. GlyCAM-1 expressed on high endothelial venules (HEVs)
allows homing of lymphocytes to lymph nodes. Mucosal addressin cell adhesion molecule-1
(MadCam-1) is another L-selectin ligand that is found on the surface of endothelial cells from
mesenteric venules (2). The glycoprotein E-selectin ligand-1 (ESL-1) is a potential ligand for
E-selectin that is present on neutrophil and myeloid leukemia cells (15,16). This protein is a
variant of a tyrosine kinase receptor for FGF, which suggests that it may be involved in
transducing signal elicited from its binding with E-selectin (Figure 3-1).
3.2.3 E-Selectin and cell signaling
Signaling involving the selectins is bidirectional in that sense that it originates from the
cytoplasmic tail of the selectins and also from their activated counterreceptors or ligands.
Several studies showed that the cytoplasmic tail of the selectins mediates signaling. In
neutrophils, the cross-linking of L-selectin primes degranulation, in a process that requires the
activation of the SAPK2/p38 MAPkinase (17). Similarly, cross-linking of E-selectin initiates
in endothelial cells the tyrosine phosphorylation of tyrosine 603, which allows the recruitment
of SHP2 and then the building up of an adapter protein complex that leads to actvation of ERK
(18). Moreover, adhesion of leukocytes in IL1-ß-activated endothelial cells induces the
clustering of E-selectin, which leads in these cells to the association with actin and actinassociated proteins such as α-actinin, vinculin, filamin, paxillin and focal adhesion kinase
(FAK) (19). These observations may explain the modification of endothelial cell shape that is
induced by cross-linking of E-selectin with specific antibodies (20). Signaling from E-selectin
ligands has been initially reported in 1997 by Soltesz et al., who showed that the adhesion of
colon carcinoma HT-29 cells to an E-selectin-IgG chimera increased the tyrosine
phosphorylation of various proteins including c-Src (21). As discussed below, we found that
the binding to E-selectin increases the activity of SAPK2/p38 in HT-29 cells (11).
Interestingly, the activation of neutrophils that results from tethering to E-selectin acts in
synergy with platelet-activating factor (PAF) to transduce the signals that activate integrin β2
from the neutrophils and to prolong PAF-induced calcium mobilization (22).
106
Figure 3-1 Selectins and their counterreceptors/ligands.
The extracellular portion of selectins is composed of a terminal C-type lectin domain
that binds to counterreceptors or ligands on adhering cells. The lectin domain is
followed by a single EGF-type repeat and various numbers of consensus repeats
found in complement regulatory proteins (CRP). The selectins have single
transmembrane region and a short cytoplasmic tail. The selectin ligands on adhering
cells consist of a scaffolding complex that contains various carbohydrates such as
sialyl-Lewis a and x or other fucosylated oligosaccahrides that are presented by
carrier proteins and possibly lipid molecules. The best-known selectin ligands are
GlyCAM-1 (glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1) for L-selectin, ESL-1
(E-selectin ligand-1) for E-selectin and PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1) for
E- and P-selectin.
107
Overall, these studies indicate that interaction of E-selectin with its counterreceptors/ligands
induces two different signals: one in the endothelial cells and one in the adhering cells. This
bidirectional signaling regulates the secondary interactions of both types of cells with integrins
and ultimately leads to shape modifications that allow transmigration of the adhering cells.
3.2.4 Stress-activated protein kinase-2/p38 (SAPK2/p38)
Stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) refers to the α and β isoforms of the p38
mitogen-activated protein kinase (MAPK) that also comprise SAPK3 (p38γ) and SAPK4
(p38δ) (23). The SAPK2/p38 pathway is strongly activated by stressful stimuli (UV light, heat
shock, oxidative stress, chemotherapeutic agents), inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1,
LPS), and vascular endothelial growth factor (VEGF) (11,23-25).
SAPK2/p38 is
characterized by its dual-phosphorylation site on a TGY motif in the loop 12 linker between
kinase subdomains VII and VIII (26,27). Compounds such as the pyrinidyl imidazole
inhibitors SB203580 and SB202190 specifically bind to the ATP-binding site of SAPK2/38,
which inhibits its kinase activity (28). Like other members of the MAP kinase family, the
SAPK2/p38 pathway consists of membrane receptors or sensors that are connected, through
adapter proteins, to small GTPases that are upstream of MAPK kinase kinases (MAPKKKs),
MAPK kinases (MAPKKs) and the MAPK itself. MKK3 and MKK6 are two dual-activity
kinases (MAPKK) that are specific activators of SAPK2/p38. MKK6 activates all isoforms of
SAPK2/p38, whereas MKK3 activates the α, γ and δ isoforms. MKK4, which activates the
SAPK1/JNK pathway, activates the p38α isoform (26,27,29,30). The MAPKKKs are less
characterized, while the small GTPases vary according to cell types and may involve Rac and
cdc42 (23). Stimulation of SAPK2/p38 culminates in the activation of both nuclear and
cytoplasmic targets (Figure 3-2).
Major nuclear targets of SAPK2/p38 include the
transcription factors ATF-2, GADD153, and Elk-1 (23), whereas MAPKAPK-2/3 (mitogenactivated protein kinase-activated protein kinase 2/3) is the better known of its cytoplasmic
targets. Activation of MAPKAPK2/3 by SAPK2/p38 leads to the phosphorylation of the small
heat shock protein HSP27, which triggers actin polymerization and remodeling into stress
108
fibers (31,32). In HeLa cells, phosphorylation of HSP27 may also result from PRAK, another
target of SAPK2/p38 (33).
The SAPK2/p38 pathway is implicated in conveying signals that trigger the induction of a
variety of responses in many different types of cells. In particular, the inflammatory response
is tightly associated with the activation of SAPK2/p38. It leads to induction of proinflamatory
cytokines such as TNF-α and interleukins by macrophages, induction of adhesive molecules
(E-selectin) on endothelial cells, induction of the respiratory burst, and up-regulation of β2
integrins in neutrophils ((10,24,34,35). SAPK2/p38 is also importantly involved in regulating
apoptosis to oxidative stress, chemotherapeutic agents and heat shock (36-38). Apart from its
role in regulating the inflammatory response and apoptosis, SAPK2/p38 plays direct roles in
cancer and metastasis. For example, endogenous SAPK2/p38 activity is elevated in invasive
breast cancer cells. This contributes to promote the stability of urokinase plasminogen
activator (uPA) and its receptor (uPAR) mRNA, which leads to overproduction of uPA and
uPAR, both essential for tumor cell invasion and metastasis (39). Interestingly, αv integrin is
tightly associated with this SAPK2/p38-mediated invasive phenotype since antibody against
αv integrin inhibits both the activation of SAPK2/p38 and the synthesis of uPA (40). Of note,
increased actin polymerization generated through activation of SAPK2/p38 by VEGF
contributes with FAK-mediated assembly/deassembly of focal adhesions to initiate the actin
remodeling required to drive endothelial cell migration, an essential step of angiogenesis
(25,41).
109
Figure 3-2 The SAPK2/p38 pathway.
Like other members of the MAP kinase family, the SAPK2/p38 pathway is composed
of the MAP kinase module that comprises the MAP kinase (SAPK2/p38), the MAP
kinase kinases (MKK3/MKK6) and the MAP kinase kinase kinases (PAK). The
module is connected to membrane receptors or stress sensors by means of adapter
proteins and small GTPases. Activation of SAPK2/p38 leads to the phosphorylation
of various transcription factors and also of MAPKAP kinase 2. Then activated
MAPKAP kinase 2 phosphorylates the actin polymerizing factor HSP27.
110
3.2.5 Joint role of E-selectin and SAPK2/p38 in metastasis
E-Selectin played a major role in the adhesion of epithelial cancer cells to the endothelium
(42). The ability of cancer cell clones to bind E-selectin on endothelial cells is even directly
proportional to their metastatic potential (43). Moreover, drugs such as cimetidine, which
inhibits the expression of E-selectin, blocks the adhesion of tumor cells to the endothelium and
prevents metastasis (44). Similarly, interfering with the binding of colon carcinoma cells to the
endothelium, by using an E-selectin-immunoglobulin, blocks the retention of these cells in the
lung and impairs the formation of lung metastasis (45). Interestingly, Lewis lung carcinoma
cells trigger the expression of E-selectin by liver sinusoidal endothelium, increasing their
metastatic potential, and suggesting that this may underlie specificity for hepatic colonization
(46,47). In humans, the circulating levels of E-selectin are associated with clinical metastasis.
In particular, in patients with breast cancer, it has been suggested that, at advanced stages,
high concentrations of circulating soluble E-selectin (sE-selectin) are associated with liver
metastasis (48). In contrast, low levels of circulating sE-selectin are associated with a strong
prognostic value for overall and disease-free survival in patients with node-negative breast
cancer (49). Of note, metastatic colonization also correlates with the expression of other types
of endothelial adhesive molecules such as P-selectin and ICAM (50-55). The increased
metastatic potential associated with adhesion of tumor cells to the endothelium might result
from two distinctive processes: local intravascular proliferation of the attached tumor cells or
extravasation of these cells following their transendothelial migration into the subvascular
tissues (56,57). In both cases, the underlying biochemical mechanisms remain ill defined.
111
112
Figure 3-3 Activation of SAPK2/p38 by E-selectin and regulation of transedothelial
migration by E-selectin-mediated activation of SAPK2/p38 in cancer cells.
(A) Colon carcinoma HT-29 cells were grown for 24 h and then treated for various
periods with 1 µg/ml of recombinant human E-Selectin/Fc chimera. Thereafter,
SAPK2/p38 activity was determined by Western blotting using a phospho-p38
antibody (PY-p38). (B) HUVECs were grown to confluency for 48 h on a 5-µm pore
size polycarbonate membrane in Boyden-modified chambers. HUVECs were treated
or not with 10 ng/ml TNF-α for 90 min. Thereafter, culture media were changed for
fresh media and cells incubated for an additional 2.5h. HUVECs were treated or not
for the last 60 min with an anti-E-selectin-neutralizing antibody. HT-29 cells
pretreated for 30 min with 5 µM SB203580 or with the vehicle (DMSO 0.1%) were then
added on the endothelial layer and left to migrate for 4.5h at 37˚C. (Reprinted from
Laferrière et al. (11) with permission.)
113
We recently obtained ground-breaking findings concerning the way by which E-selectin may
trigger metastasis. We found that the ligation of a recombinant human E-Selectin/Fc chimera
to metastatic colon carcinoma HT-29 cells induced a rapid activation of the SAPK2/p38
pathway (Figure 3-3a). In turn, this activation is necessary to trigger transendothelial
migration since pretreatment of the cancer cells with the SAPK2/p38 inhibitor SB203580
(Figure 3-3b) or with p38AGF, a dominant-negative form of p38α, inhibits the migration of
HT-29 cells across a layer of endothelial cells that express E-selectin following exposure to
TNF-α (11). This clearly shows that the insidious usage of the E-selectin interaction can be
instrumental in metastasis by activating motogenic pathways in cancer cells, thereby
increasing their invasive potential. Interestingly, adhesion of HeLa cells to human umbilical
vein endothelial cells (HUVECs) is not markedly increased following treatment of endothelial
cells with TNF-α. This suggests that E-selectin lacks a major role in the adhesion of HeLa
cells. Nevertheless, transendothelial migration of Hela cells also requires SAPK2/p38 activity,
since HeLa cells stably expressing a kinase-inactive mutant of SAPK2/p38 has a lower
capacity to cross the endothelial layer compared to the parental cells. These observations
suggest, first, that activation of SAPK2/p38 may be a common mechanism that triggers
transendothelial migration of tumor cells following their adhesion to the endothelium and
second, that different endothelial adhesive molecules may contribute to activate this pathway.
Endothelial adhesive molecules differ between endothelial cells from different origins, and the
specificity of the cancer cell - endothelial cell interactions may well constitute the basis for the
organ specificity of metastatic colonization. Notably hepatic colonization by Lewis lung
mestastatic cells requires the expression of E-selectin by liver sinusoidal endothelial cells,
whereas pulmonary metastasis requires the expression of the lung endothelial cell adhesion
molecule (LuECAM) (47,58).
3.2.6 Conclusions and future directions
Our findings indicate that the E-selectin interaction with its counterreceptors/ligands is not
only an adhesive interaction but that it is also an important signaling event. We suggest that it
is the first step in a sequence of events that lead to the successful transendothelial migration of
the tumor cells (Figure 3-4). Several questions remain to be answered. For example, it
114
remains to determined whether binding of E-selectin to cancer cells involves the activation of
other motogenic pathways that should complement the role of SAPK2/p38. In this context, the
phosphoinositide-3 kinase (PI-3K) pathway that is associated with cell migration and with
ovarian tumor metastasis is a plausible candidate (59). It remains also to clarify the role of
other molecules, such as integrins β1 and β4 that are implicated in mediating the adhesion of
cancer cells to the endothelium (60,61). Chemokines and their receptors have a critical role in
determining the metastatic destination of tumor cells as indicated by the implication of
CXCL12/CXCR4 in allowing breast cancer cells to form metastases in lymph nodes and lungs
(62). Accordingly, it should also be interesting to undertand the interaction between the Eselectin ligand and the receptors for chemokine. In this context, the expression of E-selectin by
bone marrow endothelial cells facilitates the mediated homing by chemokine stromal derived
factor-1 (SDF-1) of CD34+ cells to the bone marrow (63). The understanding of the molecular
events that result from the cancer cell interaction with the endothelium can lead to
identification of specific targets for therapy. In particular, identifying the E-selectin ligand on
cancer cells will help in the design of agents that will inhibit transendothelial migration from
its inception.
3.2.7 Acknowledgments
This work was supported by grant from the Cancer Research Society. Julie Laferrière holds
studentships from the FRSQ/FCAR and the Cancer Research Society.
115
Figure 3-4 A working model to explain the regulation of transendothelial migration
of cancer cells.
Cancer cells first adhere to endothelial cells through interactions involving
endothelial adhesive molecules such as E-selectin and their counterreceptors or
ligands on the cancer cells. This initiates, in the cancer cells, the activation of
motogenic pathways such as SAPK2/p38, which triggers the transendothelial
migration of the cancer, cells enabling them to form secondary neoplasms. Other
adhesive interactions involving the integrins are also possibly involved in the
process. Intriguingly, binding of E-selectin to its ligand activates E-selectin itself. In
turn, this elicits signals in endothelial cells that are possibly involved in inducing
changes in endothelial cell shape that facilitate the passage of the cancer cells.
116
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Chapitre 4
Adhérence par la E-sélectine et l’intégrine β4
122
4
L'adhérence E-sélectine-dépendante des cellules
cancéreuses HT-29 aux cellules endothéliales médie
l'adhérence intégrine β4-dépendante des cellules
cancéreuses
Ce chapitre fait l’objet d’un manuscrit en préparation pour soumission au cours de l’automne
2003. Cet article a été écrit avec mes travaux. Le deuxième auteur a contribué à la figure 4.
J’ai structuré et écrit le document.
123
4.1 Résumé
L’adhérence des cellules de carcinome du colon HT-29 aux cellules endothéliales HUVEC
(human umbilical vein endothelial cells) activées par le TNFα se fait par l'interaction
spécifique à la E-sélectine. Cette interaction active, dans les cellules cancéreuses, la MAP
kinase SAPK2/p38, qui mène à leur migration transendothéliale (Laferrière et al.,
J.Biol.Chem. 276, 33762, 2001). Nous avons regardé l’implication de la E-sélectine dans
l’adhérence médiée par les intégrines. Sur les cellules HT-29, le blocage de différentes
intégrines (α2, α3, α6, αvβ5, β1 et β4), à l’aide d’anticorps spécifiques, montre que
l'intégrine β4 joue un rôle dans l’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées .
L'adhérence dépendante de l’intégrine β4 est maximale après 30 minutes, tandis que
l'adhérence dépendante de la E-sélectine est maximale après 15 minutes. Ceci suggère une
séquence d’événements reliés entre l'adhérence par la E-sélectine et celle par l’intégrine β4
des cellules cancéreuses aux cellules endothéliales. La liaison des cellules HT-29 à une
protéine chimérique de E-sélectine/Fc active les deux MAP kinases SAPK2/p38 et ERK. Nous
concluons que l'adhérence des cellules de carcinome du côlon HT-29 aux cellules
endothéliales activées par le TNFα est médiée initialement par l'interaction de la E-sélectine
suivie de l’interaction de l’intégrine β4 à leurs récepteurs respectifs sur les cellules
endothéliales. Ces deux évènements sont séquentiels mais semblent non dépendants au point
de vue signalisation.
124
4.2 Article
Adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to endothelial cells requires sequential events
involving E-selectin and integrin β4
Julie Laferrière, François Houle and Jacques Huot
Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, Québec,
G1R 2J6, Canada
Address for correspondence: Jacques Huot, Centre de Recherche en Cancérologie de
l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, 9 rue McMahon, Québec, Québec, G1R 2J6,
Canada.
Voice:
418-525-4444,
extension
5553;
fax:
418-691-5439
E-mail:
[email protected]
This work was supported by a grant from the Cancer Research Society. Julie Laferrière holds
studentships from the FRSQ/FCAR and the Cancer Research Society.
KEYWORDS: E-selectin, integrin β4; adhesion; SAPK2/p38; ERK
125
126
4.2.1 Summary
HT-29 colon carcinoma cells attach to TNFα-activated human umbilical vein endothelial cells
(HUVECs) by the specific binding to E-selectin. This interaction activates, in the cancer cells,
the mitogen activated protein (MAP) kinase SAPK2/p38, which leads to their transendothelial
migration (Laferrière et al., J.Biol.Chem. 276, 33762, 2001). In this study, we investigated the
role of E-selectin in activating integrins to strengthen adhesion and to regulate integrinmediated events. Blocking the integrins (α2, α3, α6, αvβ5, β1 and β4) from HT-29 cells with
specific antibodies reveals a role for β4 integrin in their adhesion to TNFα-treated HUVECs.
The β4 integrin-dependent adhesion was maximal after 30 minutes, whereas the-E-selectindependent adhesion was maximal after 15 minutes. This suggested an interrelated sequence of
signaling events between E-selectin and β4-mediated adhesion of cancer cells to endothelial
cells. The binding of HT-29 cells to a recombinant E-selectin/Fc chimera activated both the
SAPK2/p38 and the extracellular signal regulated kinase (ERK) MAP kinases. However, the
binding of E-selectin is not associated with an increased phosphorylation of integrin β4. We
conclude that the adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to the activated endothelial cells is
mediated initially by the binding of E-selectin to its receptor on carcinoma cells and then by
the binding of β4 integrin to its receptor on endothelial cells. Both events are sequential but
appear to be signalingly independent.
4.2.2 Introduction
Metastasis is a specific process that implies the successful completion of several steps [1].
One of them, the interaction of cancer cells with the endothelium, is mediated by adhesion
molecules, such as those used by leucocytes during inflammation [2]. The sequence of events
that underlies the interaction of leucocytes with endothelial cells is well characterized and has
been described as the "multistep paradigm". It involves the sequential participation of
127
selectins, chemokines and integrins [3]. Selectins are a family of lectin-like carbohydrate
binding proteins that consist of three members, L-, P- and E-selectin [4]. E-selectin, whose
expression by endothelial cells is induced by cytokines and growth factor, promotes the
adhesion of epithelial cancer cell lines to the endothelium [4-6]. The ability of colon tumor
cell to bind E-selectin is even directly proportional to their metastatic potential [7]. Moreover,
inhibiting the expression of E-selectin with drugs such as cimetidine or with a c-raf antisens
oligonucleotide prevents metastasis [8, 9]. The binding of colon carcinoma cells to E-selectin
increases the tyrosine phosphorylation of several proteins [10-12]. It also leads to activation
of the SAPK2/p38 mitogen activated protein (MAP) kinase [13]. Interestingly, the rolling of
neutrophils on E-selectin, under shear stress but in the absence of chemotactic stimulation,
also activates SAPK2/p38, which leads to cell arrest via β2 integrin on ICAM-1 [14].
Integrins are a family of adhesion receptors that mediates the adhesion of cells with the
extracellular matrix or other cells. Integrins are composed of an heterodimer of an α and β
subunit, non-covalently associated. Each distinct pair of α and β subunits binds to a specific
set of ligands to mediate various cellular effects [15]. The intracellular domain of the α and β
subunits is short (generally less than fifty amino acids) and is actively involved in cell
signaling, namely to the actin cytoskeleton [16]. The β4 integrin is different from other β
subunits. With a cytoplasmic domain of about 1000 amino acids, β4 is implicated in the
binding to intermediate filaments in hemidesmosomes. Upon cell activation by chemotactic
agents, β4 quickly translocates in the lamellipodia of migrating cells and becomes associated
with cortical F-actin [17]. Furthermore, the expression of α6β4 integrin is associated with
tumor aggressiveness and is implicated in the invasive phenotype of carcinoma [18]. The
α6β4 integrin leads to activation of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI-3K), which
promotes the formation of lamellae and the invasion of carcinoma cells [19]. Interestingly, the
activation of PI-3K and promotion of invasion can be independent of the extracellular domain
of β4 integrin [20].
The kinase SAPK2/p38 is a member of the MAP kinase cascade family that transduces signals
generated by stress and growth factors [21, 22]. It regulates the activation of transcription
factors such as ATF2 and of cytoplasmic kinases such as MAPKAP kinases 2/3, a kinase that
128
phosphorylates the actin-polymerizing factor HSP27 [23]. In endothelial cells, a cell type that
expresses high levels of HSP27, SAPK2/p38-mediated phosphorylation of HSP27 triggers
actin polymerization and reorganization into stress fibers in response to oxidative stress and
VEGF [22, 24]. The activation of SAPK2/p38 also leads to migration of endothelial cells in
response to VEGF and to the transendothelial migration of cancer cells [13, 22, 25]. The ERK
kinase transduces signals generated mainly by growth factors. It targets transcription factors
(Elk-1, ETS), kinases (S6 kinase, MLCK) and cytoskeletal proteins (paxillin, tropomyosin-1)
[26, 27]. It is implicated in growth, survival and invasion of cancer cells [28, 29]. There is an
intense crosstalk between the ERK and SAPK2/p38 kinase pathways, the activity of one
influencing that of the other [30-32]. Notably, the ratio of the ERK and SAPK2/p38 activities
can be predictive of cell proliferation (ERK>p38) or dormancy (p38>ERK) of tumor cells
[33].
In the present study, we investigated the signaling interaction between E-selectin binding and
β4 integrin in HT-29 cells. We show that the binding of E-selectin to HT-29 cells triggers the
activation of SAPK2/p38 and ERK. The E-selectin mediated adhesion is a prerequisite to β4
mediated adhesion of HT-29 cells to endothelial cells.
4.2.3 Experimental procedures
Materials–TNFα was purchased from Calbiochem (San Diego, CA). Calcein-AM was
obtained from Molecular Probes (Eugene, OR) and recombinant human E-selectin/Fc chimera
was obtained from R&D Systems (Minneapolis, MN). Chemicals for electrophoresis were
obtained from Bio-Rad and Fisher.
Antibodies–Anti-E-selectin (BBA26) antibody is a mouse monoclonal antibody that was
purchased from Chemicon (Temicula, CA).
The various anti-integrin antibodies were
purchased from Chemicon. Mouse IgG1κ was obtained from Sigma. The anti phospho-p38
and phospho-ERK antibodies are rabbit polyclonal and mouse monoclonal antibodies
respectively that were purchased from New England Biolabs (Beverly, MA).
129
Cells–Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated by collagenase
digestion of umbilical veins from undamaged sections of fresh cords. Briefly, the umbilical
vein was cannulated, washed with Earle’s balanced salt solution and perfused for 10 min with
collagenase (1 mg/ml) in Earle’s balanced salt solution at 37oC. After perfusion, the detached
cells were collected, the vein was washed with medium 199 and the wash-off pooled with the
perfusate. The cells were washed by centrifugation and plated on gelatin-coated 75 cm2
culture dishes in medium 199 containing 20% heat-inactivated fetal bovine serum, endothelial
cell growth supplement (60 µg/ml), glutamine, heparin and antibiotics. Replicated cultures
were obtained by trypsinization and were used at passages ≤ 5. The identity of HUVEC as
endothelial cells was confirmed by their polygonal morphology and by detecting their
immunoreactivity for factor VIII-related antigens. HT-29 human colon carcinoma cells were
obtained from ATCC (Manassas, MD).
They were cultivated in McCoy 5A medium
supplemented with 10% fetal bovine serum. Cultures were kept at 37oC in a humidified
atmosphere containing 5% CO2.
Kinase assays–SAPK2/p38 and ERK activation were evaluated by Western blotting
(following the manufacturer’s protocol) using an antibody that recognizes the phosphorylated
form of the kinases (New England Biolabs).
In vivo phosphorylation–HT-29 cells plated in 35mm Petri dishes were incubated in PO4 free
medium for 1 h prior to be labeled with H3[32P]O4 (60-200 µCi/ml) for 90 min. Cells were
treated and then were lysed for immunoprecipitation in 75 µl of buffer B (150 mM NaCl, 50
mM Tris-HCl pH 7.5, 1% Triton X-100, 0.1% sodium deoxycholate, 2 mM EDTA, 2 mM
EGTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM leupeptin, 50 µg/ml pepstatin, and 1 mM phenylmethylsulfonyl
fluoride). Samples were diluted three times and precleared with 10 µl of a 50% v/v Protein-G
sepharose suspension for 15 min with shaking on ice. Supernatants were incubated on for 90
min with 8 µl of anti-β4 antibody and then 10 µl of 50% v/v Protein-G Sepharose (Amersham
Pharmacia Biotech) were added and incubation was extend for 30 min on ice with shaking.
Antibody-antigen complexes were washed four times with B buffer after then SDS-PAGE
loading buffer was added. Proteins were separated through SDS-PAGE and the gel was dried
or transferred onto nitrocellulose for Western blotting using anti-integrin β4 antibody.
130
Adhesion assays to HUVEC–HUVEC were plated on gelatin-coated slides and left to grow to
confluence for 24 h. HT-29 cells were labeled for 30 min at 37oC with calcein-AM. Labeled
cells were left to adhere to the endothelial layer for 15 or 30 min at 37oC. The endothelial
layer was washed twice with phosphate-buffered saline and the attached cells were quantified
by measuring the fluorescence emission using a fluorometer. The actual number of adhering
cells was calculated from a standard curve.
Adhesion assays to matrix–Proteins were absorbed to 96 well plates 1h at 37oC or overnight
at 4oC (prior to 1h at 37oC) with 50 µl of matrix solution at the appropriate concentration.
The wells were then blocked with 1% bovine serum albumin in phosphate-buffered saline for
at least 20 min. HT-29 cells were then added in complete media and left to adhere for 30 min
at 37oC (105 cells/well in 100 µl). When used, antibodies were preincubated for 20 min with
the cells in suspension prior to the adhesion. Wells were then washed twice with media to
remove non-adherent cells. The cells were then fixed for 30 min with 1% glutaraldehyde in
phosphate-buffered saline and colored with 0.1% violet crystal for 15 min. The wells were
then washed extensively with water and solubilized in 1% SDS. Optical density was then read
at 550 nm.
Statistical analysis–Data are mean +/- S.D, as indicated in the text.
4.2.4 Results
Sequential E-selectin– and integrin β4–dependent adhesion of tumor cells to endothelial
cells – In primary cultures of HUVEC, TNFα induces a strong activation of the expression of
E-selectin, which leads to an increased adhesion of HT-29 cancer cells to HUVEC [13]. In
fact, HT-29 cells directly adhere to a chimeric form of E-selectin/Fc coated in plastic wells.
The adhesion is dose-dependent and is inhibited by a specific anti-E-selectin antibody (Figure
4-1). In contrast, they do not adhere to BSA or to plastic. This confirms that E-selectin is a
major determinant of cancer cell adhesion. The expression of E-selectin is also importantly
131
involved in the adhesion and rolling of leucocytes on the endothelium during the inflammatory
processes [4]. In that case, the E-selectin-mediated adhesion is followed by a longer term
adhesion that involves integrins. We investigated here whether the integrins expressed by HT29 cells also participate in their adhesion to HUVEC.
The integrins expressed by HT-29 cells have been identified as α2, α3, α6, αv, β1, β4 and β5
[34]. To determine the role of these integrins in the adhesion of HT-29 cells to endothelial
cells, we pre-treated calcein-labelled HT-29 cells in suspension with anti-integrin blocking
antibodies and then left the cells to adhere for 15 to 30 min to TNFα-activated HUVEC
expressing E-selectin. We found that the 30 minutes-, but not the 15 minutes-, adhesion of
HT-29 cells to endothelial cells was impaired by the anti β4 integrin blocking antibody.
However, none of the other anti-integrin antibodies had any influence on the adhesion of HT29 cells (Figure 4-2A). This underscores a critical role for integrin β4 of HT-29 cells in their
adhesion to endothelial cells expressing E-selectin. In accordance, HT-29 cells strongly
adhere to laminin, a typical extracellular matrix that bind to β4 integrin (Figure 4-1).
Interestingly, blocking E-selectin with an anti-E-selectin antibody inhibits the adhesion of HT29 cells as early as within 15 minutes of adhesion to TNFα-treated HUVEC (Figure 4-2B).
Hence, both E-selectin from endothelial cells and integrin β4 from HT-29 tumor cells are
sequentially implicated in mediating their mutual adhesive interactions. This raised the
questions as to whether or not the E-selectin and β4-mediated adhesions are separated or
linked events.
E-selectin- and integrin β4-dependent adhesions of cancer cells to endothelial cells are
sequential but signalingly independent –The binding of E-selectin to HT-29 cells induces a
time-dependent stimulation of SAPK2/p38 ([13] and Figure 4-3). In turn, this increases the
migratory potential of HT-29 cells enabling their transendothelial migration [13]. We verified
here whether the E-selectin binding to HT-29 also induced the activation of the two other
MAP kinases, ERK and JNK, with the aim of identifying the downstream events associated
with the activation. HT-29 cells was added to wells coated with E-selectin/Fc in concentration
(5µg/ml) that induced maximal adhesion and then MAP kinase activation was assayed by
using antibody that specifically recognized the phosphorylated/activated form of the kinases.
132
We found that E-selectin binding to HT-29 cells resulted in a time-dependent activation of
both ERK and SAPK2/p38. The maximal activation of ERK occurs after 60 min in contrast of
10 min in the case of SAPK2/p38 (Figure 4-3). Intriguingly, JNK was not activated by Eselectin, neither was the focal adhesion kinase FAK (data not shown), which suggested a
specificity in the signaling pathways activated by the binding of E-selectin to its ligand.
Interestingly, the activation of ERK occurs simultaneously to β4-mediated maximal adhesion
of HT-29 cells to HUVEC. Since ERK is known to be activated following tyrosine
phosphorylation of β4 on residue Y1526 [17], this raised the possibility that the binding of Eselectin activates ERK via inducing the tyrosine phosphorylation of integrin β4. Alternatively,
since β4 integrin is known to be activated by phosphorylation [35], the concordance between
the peaks of ERK activation and β4-mediated adhesion suggested that E-selectin-induced
activation of ERK could be involved in the phosphorylation of integrin β4. We thus
ascertained whether integrin β4 was phosphorylated following in vivo labeling in the presence
of H3[32P]04 in response to E-selectin and whether this occurs specifically on tyrosine residues.
Results showed that E-selectin did not induce the tyrosine phopshorylation of integrin β4
following probing with two different antiphosphotyrosine antibodies nor did it induce
phosphorylation following incubation with labeled [32P] (Figure 4A and 4B). In contrast,
exposure of cells to sodium vanadate, a classical inducer of tyrosine phosphorylation of
integrin β4 [35], resulted, in both cases, in a marked phosphorylation of β4. These results
suggest that E-selectin binding to its ligand on the cancer cells does not lead to
phosphorylation of integrin β4. In corollary, the results support the hypothesis that the Eselectin-and integrin β4-mediated adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to endothelial
cells are two sequential but signalingly independent events.
133
Figure 4-1 HT-29 cells adhesion to E-selectin/Fc chimera.
HT-29 cells were left to adhere for 30 minutes to different concentration of matrices in
the presence or not of 25 µg/ml blocking E-selectin antibody or a matching isotype.
Data points represent the mean + SD.
134
135
Figure 4-2 Adhesion of HT-29 cells to by TNFα-activated HUVEC is mediated
sequentially by E-selectin and β4 integrin.
In A and B, HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated or were
treated for 90 min with 10 ng/ml TNFα. Thereafter, culture media were washed and
changed for fresh media and cells were incubated for an additional 2h30 with
function blocking integrin antibodies for the last 20 minutes (A) or in the presence or
not of an anti-E-selectin neutralizing antibody or with a matched isotype antibody
(last 60 min) (B). HT-29 cells labelled with Calcein AM were incubated (A) or not (B)
for 30 min at 37°C with function blocking integrin antibodies and then added to the
endothelial layer and left to adhere for 15 or 30 min at 37°C. After washing,
fluorescence was quantified to measure the number of adherent cells. Data points
represent the mean ± SD. Representative of 2 different experiments
136
Figure 4-3 Time-dependent activation of p38 and ERK induced by the binding of
HT-29 cells to E-selectin/Fc.
HT-29 cells were put in suspension for 75 minutes and then left to adhere to a Petri
dish coated with 5µg/ml of E-selectin/Fc. Non-adherent cells were washed away
and adherent cells were then extracted and the kinase activity was assessed by
Western blotting. To control the maximal induction of the kinases, adherent cells
were treated or not with 10 mM H2O2 for 45 minutes.
137
Figure 4-4 Binding of E-selectin/Fc to HT-29 cells does not lead to phosphorylation
of integrin β4.
A, HT-29 cells were untreated (control) or treated with E-selectin/Fc for 30 minutes
or with Vanadate.
β4 integrin was immunoprecipitated and tyrosinephosphorylation assessed by Western blotting with a specific phospho-tyrosine
antibody. B, Cells were incubated for 1 h in phosphate free medium prior to their
labeling for 90 minutes with H3 [32P]O4. The cells were then left untreated (control) or
treated with E-selectine/Fc for 30 min or Vanadate. After treatment, cells were lysed
and β4 integrin was immunoprecipitated. Incorporation of 32P into β4 containing
band is indicated
138
4.2.5 Discussion
Metastasis depends on the successful completion of several distinct processes. One of them,
the interaction of cancer cells with endothelial cells, is mediated by specific adhesion
molecules [2]. Here, we obtained evidence that the adhesive interactions between cancer cells
and endothelial cells are sequential and involved interrelated signaling cascades. Specifically,
HT-29 colon carcinoma cells adhere to HUVEC by sequential interactions involving Eselectin and β4 integrin. The E-selectin binding to HT-29 cells activates the MAP kinases
ERK within the same time frame (30-60 min) as the β4-dependent adhesion of HT-29 cells to
HUVEC. However, the binding of E-selectin did not lead to phosphorylation of β4 integrin,
which suggests that the activation of ERK by E-selectin is not upstream or downstream of β4.
The binding of E-selectin to HT-29 cells also induces the activation of SAPK2/p38, which, as
we previously shown, increases their migratory potential [13].
The necessity of E-selectin expression for the adhesion of tumor cells HT-29 is supported by
the observation that pre-treating endothelial cells with an anti-E-selectin neutralizing antibody,
but not a matched isotype antibody, inhibited the adhesion of the tumor cells to HUVEC. This
is also supported by the findings that HT-29 cells directly adhere to E-selectin when added to
wells coated with a chimeric form of recombinant E-selectin/Fc. Here again, the adhesion is
inhibited by an anti-E-selectin antibody but not by an irrelevant matched isotype antibody.
Interestingly, we found that the adhesion of HT-29 cells increased with the concentration of Eselectin being maximal at 5µg/ml. Moreover, it was time-dependent being maximal after 15
minutes of adhesion to HUVEC. Several studies have shown that the E-selectin-mediated
adhesion of neutrophils to endothelial cells was followed by a stronger adhesion involving
integrins [14, 36]. Moreover, the binding of LS174T colon carcinoma to HUVEC under
physiological flow conditions requires the binding of E-selectin and integrins [37]. Along
these lines, we found that the adhesion of HT-29 cells required the participation of integrin β4
from HT-29 cells. This is supported by the findings that HT-29 cells directly adhere to
laminin, the typical matrix protein that binds to β4, and also by the fact that treating HT-29
cells with an anti-β4 blocking antibody inhibits the adhesion of HT-29 cells to HUVEC.
139
Interestingly, the dependence on β4 is selective since none of the antibodies directed against
the other integrins expressed by HT-29 inhibited their adhesion to HUVEC.
The ability of colon tumor cell clones to bind E-selectin expressed by activated endothelial
cells is directly proportional to their metastatic potential [7]. Moreover, drugs like cimetidine
which inhibit the expression of E-selectin prevents metastasis [8]. The adhesion of HT-29 cells
by the binding to E-selectin and β4 integrin occurs on TNFα-activated endothelium. This is
important since cancer cell lines that metastasize to the liver, once they enter the hepatic
circulation release TNFα and induces the expression of E-selectin on sinusoidal endothelium
[38]. Analogously, pro-inflammatory mediators stimulate the cancer cells to release soluble
mediators that increases the expression of E-selection and of other cell adhesion molecules on
endothelial cells [39].
These results suggest that the cancer cells, through paracrine
mechanisms, promote their own adhesion and migration in providing an appropriate
environment.
The selectins bind to various carbohydrate such as sialyl-Lewis a and x (SLea and SLex) or
other fucosylated oligosacccharides that are presented by a scaffold protein and possibly a
lipid carrier molecule on the adhering cells [40]. This macromolecular scaffolding complex,
known as selectin ligand or counter-receptor, is essential for binding. The sialyl-Lewis sugars
alone have only a weak affinity for selectins whereas the presenter proteins have no binding
capacity by themselves. The sugar-protein complex of binding contributes to the specificity of
interactions since the binding affinity of a given sugar for a given selectin varies depending on
the presenter proteins. Here, we found that binding of E-selectin to HT-29 cells resulted in the
activation of the MAP kinases ERK and SAPK2/p38. Moreover, the binding of E-selectin on
cancer cells induced, in HT-29 cells and T84 colon carcinoma cells, an increased tyrosine
phosphorylation of several proteins [10, 12].
In T84 the binding of E-selectin is also
associated with intracellular calcium mobilization, cytoskeleton reorganization, collagenase
secretion and increased motile behavior [11, 12]. Overall, these findings suggest that the Eselectin receptor on colon cancer cells is a tyrosine kinase receptor or a kinase-associated
receptor. In that sense, the glycoprotein ESL-1 (E-selectin ligand-1), a potential ligand for Eselectin on neutrophil and myeloid leukemia cells is a variant of a tyrosine kinase receptor for
FGF [41]. However, by mass spectra analysis we did not found any evidence that ESL-1 was a
140
receptor for E-selectin on HT-29 cells (data not shown). Hence, E-selectin ligand on HT-29
cells remains to be identified.
Several studies also point out to the determinant role played by integrin β4 (α6β4) in
conferring a metastatic phenotype [18]. In particular, the β4 integrin is importantly implicated
in cancer invasiveness [17].
Upon cell activation by chemotactic growth factors, β4 is
phosphorylated on both tyrosine and serine/threonine resisdues and quickly translocates from
hemidesmosomes to filopodia and lamellae conferring an invasive phenotype by promoting
cell migration [19, 42, 43]. Intriguingly, expression of β4 is insufficient alone to confer
metastasis [44]. Notably, the signalling properties of α6β4 are influenced by its association
with Erb2 receptor [20]. A major contribution of our study is to have shown that the binding
of E-selectin is a pre-requesite for the β4-dependent adhesion. The β4-dependent adhesion
coincides with the maximal activation of ERK, which suggested the possibility of signaling
link between both events. However, the binding of E-selectin/Fc to HT-29 cells was not
associated with phosphorylation of β4, which renders unlikely the fact that the E-selectin
ligand is directly signaling to β4, neither through ERK nor through other pathways. We thus
conclude that the E-selectin- and β4-dependent adhesions are sequential but not signalingly
associated. However, the possibility of an indirect cross-talk involving chemokines generated
by endothelial cells upon binding of HT-29 cells remains to be ascertain. Little is known
concerning the β4 ligand or counter-receptor on endothelial cells. Recently, mouse lung
endothelial Ca2+-activated chloride channel protein mCLCA1 has been shown to bind β4
integrin, which leads to activation of focal adhesion kinase (FAK) and downstream signaling
to extracellular signal-regulated kinase (ERK) in the cancer cells [45]. The β4 ligand on
HUVEC thus remains to be identified. Its characterization should yield determinant
information since this β4 counter-receptor may be involved non-only in the activation of β4
itself but it may also be implicated in generating signals in the endothelial cells.
In summary, we have shown here that the E-selectin interaction of cancer cells on endothelial
cells promotes the β4 integrin adhesion. This constitutes the first demonstration that cancer
cells attach to the endothelium by the sequential binding of selectins and integrins and that
these events may be linked by signaling pathways. This supports the idea that metastatic
141
cancer cells my use the multistep paradigm of the inflammatory process, [3], to mediate the
selective homing of most types of metastasis. Chemokines and their receptors are implicated
in the metastatic specificty of tumor cells [46]. Whether or not chemokines have a role to play
in the E-selectin-mediated adhesion of cancer cells remains to be demonstrated.
4.2.6 References
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Chapitre 5
Autres résultats
148
5
Résultats complémentaires
Ce chapitre comprend différents résultats ne faisant pas partie des articles publiés, présentés
dans les chapitres précédents. Les résultats qui y sont rapportés ouvrent néanmoins le projet
sur d’importantes perspectives nouvelles. Certaines de ces perspectives conduisent à des
projets de recherche distincts qui sont déjà poursuivis ou le seront par d’autres étudiants. Le
chapitre est séparé en trois sections : 1) des résultats qui démontrent que l’adhérence des
cellules HT-29 aux cellules HUVEC implique un facteur soluble, 2) une identification
préliminaire du ligand possible de la E-sélectine sur les cellules HT-29, 3) des résultats
d’adhérence des cellules HT-29 sur des lignées endothéliales humaines de différentes origines.
5.1 Rôle d’un médiateur soluble d’origine endothéliale dans
l’adhérence des cellules HT-29 aux cellules endothéliales
Dans le chapitre 2, les résultats montrent que les cellules HT-29 s’attachent aux cellules
HUVEC activées par le TNF par l’intermédiaire de la E-sélectine, que les cellules HL-60
utilisent partiellement la E-sélectine, alors que les cellules HeLa ne l’utilisent pas du tout
(figure 2-2 et 2-8). Le chapitre 4 a démontré l’implication de l’intégrine β4 dans l’adhérence
des cellules HT-29 aux HUVEC activées par le TNF (figure 4-2). Ce résultat a amené
l’hypothèse que l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules endothéliales utilisait les
mêmes étapes que celle des lymphocytes [4], soit la séquence sélectines, chimiokines solubles
et intégrines. L’hypothèse est d’ailleurs renforcée par un résultat préliminaire obtenu en
étudiant l’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC et qui suggère l’implication d’un
médiateur soluble produit par les cellules endothéliales activées.
L’activation des cellules HUVEC se fait par un prétraitement au TNF. Cette activation amène
l’expression de la E-sélectine. Cette expression est maximale quatre heures après le début du
traitement au TNF.
Le présence du TNF n’est pas requise durant les quatre heures
149
d’activation pour obtenir une expression maximale de la E-sélectine.
En effet, un
prétraitement minimal de 1h30 au TNF suffi pour amener l’expression maximale de la Esélectine quatre heures après le début du traitement.
Afin d’identifier l’effet d’un médiateur produit par les cellules endothéliales, le milieu
conditionné par le prétraitement au TNF a été enlevé avant l’ajout des cellules HT-29 à
l’endothélium pour différents temps. Comme on peut observer à la figure 5-1, le fait d’enlever
le milieu conditionné (cercle bleu plein) plutôt que de laisser le milieu présent (carré rouge
plein (TNF 4 heures), triangle vert plein (TNF 1h30)), diminue l’adhérence des cellules HT29, à tous les temps observés. Ces données suggèrent que l’augmentation d’adhérence n’est
pas due au TNF lui-même, mais bien à ses effets, c’est-à-dire aux molécules d’adhérence
exprimées (telle la E-sélectine) et à un possible médiateur sécrété. Ce médiateur pourrait être
synthétisé de novo par les cellules endothéliales.
En effet, l’adhérence est diminuée en
changeant le milieu conditionné par les cellules HUVEC traitées durant 4h avec le TNF, alors
qu’une adhérence maximale est obtenue après un changement de milieu effectué à 1h30 de
traitement au TNF suivi d’une période de 2h30 avant l’ajout des cellules cancéreuses.
L’implication d’un médiateur soluble pourrait être confirmée par des expériences d’adhérence
effectuées en utilisant un milieu conditionné sans TNF et en présence ou en absence d’un
inhibiteur de synthèse protéique, telle la cycloheximide. Si le facteur soluble permet d’activer
directement les intégrines des cellules cancéreuses, alors une adhérence avec un milieu
conditionné devrait donner une adhérence maximale. De plus, si la synthèse est de novo, un
prétraitement avec la cycloheximide avant le traitement au TNF, devrait inhiber l’effet du
milieu conditionné, suggérant ainsi le relargage d’une protéine membranaire ou entreposée
dans des granules. Ce facteur soluble devrait être par la suite isolé pour identification et
vérification de son effet sur l’adhérence des cellules cancéreuses à un endothélium activé ou
non.
150
Figure 5-1 Influence du milieu conditionné par un prétraitement au TNF sur
l’adhérence des cellules HT-29
Les cellules HT-29 ont été laissées à adhérer pour le temps indiqué en abscisse. Les
différents prétraitements cités en légende ont été faits aux cellules endothéliales avant
l’ajout des cellules HT-29. La durée totale du prétraitement était de 4 heures. Les
cellules endothéliales ont été traitées (motif plein) ou non (motif vide) avec 10 µg/ml
de TNFα. Dans une situation (∆ plein et vide), le milieu a été changé après 1h30 de
traitement pour un milieu frais durant les 2h30 précédant l’ajout des cellules HT-29.
Dans un autre situation (O plein et vide), le milieu a été changé après 4 heures de
traitement pour du milieu frais, juste avant l’ajout des cellules HT-29. Pour le détail
du protocole d’adhérence, voir les sections 2.2.4 et 4.2.3. Ce résultat provient de la
compilation de quatre expériences différentes, toutes en triplicat pour chaque point.
Chaque temps d’adhérence a été reproduit au moins à deux occasions.
151
À noter que les résultats précédents ont été obtenus seulement avec l’adhérence des cellules
HT-29 sur des cellules HUVEC activées au TNF. Ils serait intéressant de comparer ce résultat
avec l’adhérence des cellules HL-60, qui ont également une adhérence augmentée sur
l’endothélium activé.
De plus, le TNF a des effets similaire à l’interleukine-1 pour
l’expression de diverses molécules d’adhérence [26, 146]. Il serait intéressant de vérifier si
l’interleukine-1 induit la production de ce facteur soluble, afin de cerner si cette production est
spécifique au prétraitement par le TNF, ou si d’autres cytokines peuvent également le
produire.
Bien que ces résultats suggèrent un rôle pour un facteur soluble relargué par l’endothélium, il
n’est pas à négliger que in vivo, les cytokines comme le TNF et l’IL1α peuvent également
activer les cellules cancéreuses. Il a d’ailleurs été démontré que les cellules cancéreuses, suite
à un traitement par différents facteurs pro-inflammatoires, relarguent des facteurs solubles qui
amènent une expression des molécules d’adhérence sur l’endothélium [147]. La possibilité
d’un rôle joué par un facteur libéré par les cellules cancéreuses doit donc aussi être envisagée.
5.2 Identification du ligand de la E-sélectine
L’activation des MAP kinases ERK et SAPK2/p38 par la liaison de la E-sélectine aux cellules
HT-29, nous a amené à supposer la présence sur ces cellules d’un récepteur de la E-sélectine à
activité kinase intrinsèque ou associé. Cette observation répond en fait au premier critère d’un
récepteur biologique fonctionnel, soit celui que la liaison se doit d’être associée à un effet
biologique. En effet, les critères pour définir un « vrai » ligand de la E-sélectine pourrait se
définir comme suit [148]:
1- Le ligand se doit d’être exprimé au bon endroit au bon moment. Dans notre
modèle de métastase, cela veut dire qu’il doit être présent sur la surface de la
cellule cancéreuse lors de sa circulation sanguine.
152
2- Le blocage du ligand, ou son absence, doit inhiber son effet. Ainsi, dans les
cellules HT-29, le blocage du ligand devrait bloquer l’activation des kinases ERK
et p38.
3- Le ligand doit être spécifique à la sélectine. Les sucres seuls, qui sont nécessaires à
la liaison, possèdent une faible affinité pour les sélectines. C’est leur présentation
particulière sur une protéine définie qui permet la génération de ligand de haute
affinité. En ce sens, il est important de se souvenir que le ligand recherché peut être
une protéine connue qui est modifiée de manière nouvelle dans la cellule
cancéreuse, de sorte à devenir un ligand pour la E-sélectine. De manière similaire,
PSGL-1 est exprimé sur différents leucocytes. Cependant, il ne permet pas la
liaison à la P-sélectine sur tous ces types cellulaires. De plus, sur le neutrophile,
seulement environ 20% de PSGL-1 exprimé peut lier de manière efficace la Psélectine [148].
Pour la liaison à la E-sélectine quelques ligands peuvent satisfaire ces caractéristiques. ESL-1
(E-selectin ligand 1) est spécifique à la E-sélectine, il est exprimé sur les microvilli et permet
l’adhérence des cellules circulantes [5, 50, 51]. Les deux autres ligands de haute affinité
identifiés sont PSGL-1 et la L-sélectine sur les neutrophiles humains [5]. Sur les cellules
progénitrices hématopoïétiques (CD34+) et non sur leurs consœurs matures, la protéine CD44
a été identifiée comme un ligand N-glycosylé de la E-sélectine. Ce ligand permet le roulement
et l’adhérence aux cellules de la microvasculature de la moelle osseuse qui expriment la
E-sélectine de manière constitutive [149].
L’addition des structures oligosaccharidiques sur la protéine présentatrice peut se réaliser par
N-glycosylation, c’est-à-dire par des liaisons N-glycosidiques entre le groupement
carboxamide de l’asparagine et un groupement hydroxy de la chaîne oligosaccharidique. On
observe également, quoi que plus rarement, de la O-glycosylation entre le groupement
hydroxy de la thréonine ou de la sérine et un groupement hydroxy de la chaîne
oligosaccharidique. Afin de vérifier la glycosylation du candidat isolé sur les cellules HT-29,
il serait possible de traiter les cellules ou les extraits avec l’enzyme N-glycosidase F pour
enlever la N-glycosylation [149]. De plus, un traitement à la trypsine peut enlever toutes les
153
glycoprotéines et l’utilisation de combinaison de différents inhibiteurs et enzymes peut
spécifier la nature de la glycosylation du ligand de la E-sélectine sur les cellules HT-29 [150].
Afin d’identifier le ligand ou contre-récepteur de la E-sélectine, une approche d’isolation par
affinité a été utilisée, principalement basée sur les travaux du groupe de D.Vestweber pour
l’identification de ESL-1 [50]. Les premiers résultats ont été obtenus en essayant d’éluer le
récepteur de l’appât, soit une chimère de E-sélectine/Fc. Comme la E-sélectine/Fc était
également partiellement éluée, j’ai plutôt opté pour une isolation sur gel à deux dimensions.
Cette méthode a permis d’isoler un candidat, d’un poids moléculaire approximatif de plus de
116 kDa, et un point isoélectrique (pI) acide, près de 3 (figure 5-2). L’analyse de ce candidat
par spectre de masse (MALDI-TOF) a révélé qu’il ne correspondait pas à ESL-1 ni d’ailleurs à
aucune autre protéine connue.
Par la suite, j’ai affiné ma méthode d’isolation. Afin de s’assurer de la spécificité de la liaison
à la E-sélectine, les isolations ont été faites en présence de calcium ou d’EDTA, un agent
chélateur de calcium. Cette approche a été choisie parce que les sélectines lient leur ligand de
manière calcium-dépendante. Dans ces conditions, la liaison de la E-sélectine à son ligand
devrait diminuer, ou même disparaître en présence d’EDTA. De plus, afin d’affiner la
migration des candidats potentiels, les bandes ont été équilibrées, après la focalisation
isoélectrique (IEF – première dimension) et avant la migration dans la deuxième dimension
(SDS-PAGE), en présence d’agent réducteur (β-mercaptoéthanol et iodoacétamide). Cette
dernière isolation est visible à la figure 5-3. Le candidat a été envoyé pour analyse par LCMS/MS. L’identification n’a pas révélé de récepteurs connus de la E-sélectine. Par ailleurs,
l’analyse a révélé la présence d’un peptide appartenant à une protéine membre des récepteurs
d’adhérence de la famille des gamma cadhérines.
154
Figure 5-2 Mise en évidence sur les cellules HT-29 d’un candidat potentiel d’un
ligand de la E-sélectine
Les cellules ont été lysées dans un tampon composé de 3% CHAPS, 50 mM TrisHCl
pH7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mg/ml ovalbumine et 1 mM PMSF; puis
centrifugées 10 min à 10 000 g à 4°C. Le surnageant a été recueilli et passé une
première fois sur des billes de protéine-A Sépharose, puis centrifugé. Par la suite, le
surnageant a été incubé avec la E-sélectine/Fc préalablement adsorbée sur des billes
de protéine-A Sépharose, durant 4 h à 4°C avec agitation sur glace. Les billes ont été
lavées 3 fois dans 0.05% Triton X-100, 50 mM TrisHCl pH 8.5, 400 mM NaCl et 1 mM
CaCl2; puis 2 fois dans 0.05% Triton X-100, 50 mM TrisHCl pH 8.5 et 150 mM NaCl.
Les billes ont été par la suite extraite pour la première migration (IEF) sur des bandes
de pH 3-10, dans une solution de 7 M urée, 4% CHAPS, 0.5% tampon IPG et 20 mM
DTT. Les bandes ont par la suite migré sur un gel de 7.5% acrylamide, coloré par la
suite au nitrate d’argent. Un extrait du gel se trouve en A et B. A ne contient pas
d’extrait cellulaire, par opposition à B, ou le candidat a été encerclé.
155
Figure 5-3 L’isolation du candidat comme ligand de la E-sélectine est sensible au
calcium
Les extraits ont été fait de la même façon qu’à la figure 5-2, à la différence que dans le
gel B, le tampon de lyse contenait 1 mM CaCl2, alors que dans le gel A, le tampon de
lyse contenait à la place 2 mM EDTA. Il en était de même dans le premier milieu de
lavage. Les bandes d’IEF ont été équilibrée dans 5% de β-mercaptoéthanol et 250 mg
d’iodoacétamide par 10 ml de tampon d’équilibration avant la migration dans la
deuxième dimension sur un gel de 7.5% acrylamide, qui a été coloré au nitrate
d’argent. Le candidat est identifié par une flèche rouge.
156
D’autres approches pourraient être envisagées pour identifier le ligand de la E-sélectine sur les
cellules HT-29. En gardant l’approche par isolation d’affinité, il serait possible d’utiliser des
extraits membranaires plutôt que des extraits totaux, augmentant ainsi nos chances d’isoler de
manière abondante un candidat. Déjà des études en ce sens sont d’ailleurs amorcées dans le
laboratoire. Elles pourraient confirmer, entre autres, l’implication du candidat membre de la
famille des cadhérines. Une autre approche serait de chercher à identifier la kinase la plus
précocement associée à la liaison à la E-sélectine. Les cellules HT-29 pourraient être traitées
avec de la E-sélectine puis fractionnées, pour identifier une protéine phosphorylée de manière
différentielle (augmentation ou diminution de la phosphorylation dans le temps) suite au
traitement à la E-sélectine. Cette approche aurait l’avantage de pouvoir identifier d’autres
cibles signalétiques de la liaison de la E-sélectine à son ligand (autre que les kinases
SAPK2/p38 et ERK). De plus, pour vérifier la spécificité de liaison à la E-sélectine, un
prétraitement avec des enzymes ou des inhibiteurs de la glycosylation comme la tunicamycine
pourrait être une étape intéressante. Tel que mentionné précédemment, l’identification du
ligand de la E-sélectine que j’ai amorcée fait présentement l’objet d’un projet de maîtrise dans
le laboratoire.
5.3 Adhérence des cellules HT-29 à des cellules endothéliales
d’origine différentes
Tous les résultats précédents ont été obtenus avec les cellules endothéliales de la veine du
cordon ombilical (HUVEC).
Ces cellules sont largement utilisées comme modèle
expérimental en raison de leur facilité d’obtention et de la possibilité d’utiliser du matériel
humain non transformé. Cependant, plusieurs des propriétés des cellules endothéliales varient
selon leur origine [26]. En ce sens, il est bien connu que les molécules d’adhérence exprimées
par les cellules endothéliales varient avec leur origine tissulaire.
Cette variation est
sous-jacente au homing bien connu des leucocytes. Il y a donc un intérêt majeur à vérifier si
les interactions d’adhérence cellules cancéreuses à l’endothélium varient avec l’origine des
157
cellules endothéliales. Cela pourrait, en effet, être à la base de l’envahissement métastatique
sélectif à un organe donné.
J’ai donc entrepris une série d’expérience en ce sens en vérifiant l’adhérence des cellules
HT-29 à des cellules endothéliales humaines immortalisées provenant de différents organes.
Ces cellules nous ont été fournies par le Dre Claudine Kieda, d’Orléans (France). Les lignées
testées originent de l’intestin (HIMEC), du cerveau (HBrMEC), de l’appendice (HAPEC), des
poumons (HLMEC), des ganglions lymphatiques (HPLNEC.B3), de la peau (HSkMEC) et de
la rate (HSpMEC). De manière générale, ces différentes lignées endothéliales présentes des
cellules plus petites que les HUVEC et sont très sensibles aux stress de culture cellulaire. Une
dilution trop grande est mortelle et la décongélation est particulièrement difficile pour les
cellules de l’intestin (HIMEC).
Dans un premier temps, j’ai démontré que toutes ces lignées sont sensibles, quoiqu’à des
niveaux différents, au TNF et au H2O2, puisque ces deux agents y induisent l’activation de la
kinase p38 (figure 5-4).
Par la suite, en compagnie de Sophie Guay, un étudiante d’été sous ma supervision, nous
avons vérifié l’adhérence des cellules HT-29 sur les différentes lignées endothéliales
prétraitées ou non au TNF. Nous avons aussi vérifié si le TNF induit l’expression de la
E-sélectine par ces cellules endothéliales. Dans l’ensemble les données obtenues avec les
différentes lignées indiquent que le TNF n’induit pas l’expression de E-sélectine. De plus,
nous avons observé que, dépendamment des lignées endothéliales, l’adhérence des cellules
HT-29 se fait de façon dépendante ou non du TNF. À titre d’exemple je présente ici seulement
les résultats obtenus avec la lignée de cellules endothéliales du cerveau (HBrMEC). Dans ce
cas, l’adhérence des cellules HT-29 aux HBrMEC n’est pas modulée par un pré-traitement au
TNF, par opposition aux cellules HUVEC. De plus, l’adhérence est toujours maximale,
comparée aux cellules HUVEC (figure 5-5).
158
Figure 5-4 Réponse de la kinase p38 de différentes lignées endothéliales à un stress
Les différentes lignées ont été stimulées avec 100 µM, 10 min de peroxyde ou avec 10
µg/mL de TNF pour 10 min. Les extraits ont été séparés par SDS-PAGE et l’activité
kinase évaluée à l’aide d’un anticorps spécifique antiphospho-p38 (NEB). HIMEC=
cellules endothéliales de l’intestin, HBrMEC= cellules endothéliales du cerveau,
HAPEC= cellules endothéliales de l’appendice, HLMEC= cellules endothéliales des
poumons, HPLNEC.B3= cellules endothéliales des ganglions lymphatiques,
HSkMEC= cellules endothéliales de la peau, HSpMEC= cellules endothéliales de la
rate, HUVEC= cellules endothéliales du cordon ombilical et HT-29= cellules de
carcinome de côlon.
159
Les données de la figure 5-6 montre bien que la E-sélectine n’est pas exprimée sur les cellules
endothéliales de cerveau (figure 5-6). Ce résultat était inattendu. En effet, des études sur les
cellules endothéliales de microvaisseaux de cerveaux humains ont démontré l’expression de la
E-sélectine et son implication dans l’adhérence des lymphocytes [94]. Cependant, certains
travaux ont démontré une diminution de l’expression des molécules d’adhérence avec les
passages des cellules endothéliales [146].
L’intérêt de l’ensemble des expériences d’adhérence des cellules HT-29 aux différentes
lignées de cellules endothéliales utilisées, est que les résultats sont en accord avec le principe
que l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules endothéliales peut solliciter différentes
molécules d’adhérence endothéliales.
En corollaire, ces données sont compatibles avec
l’hypothèse du seed and soil.
On doit, cependant, questionner l’effet de l’immortalisation des cellules endothéliales sur
l’expression des molécules d’adhérence.
En effet, l’utilisation des cellules endothéliales
immortalisées n’est peut-être pas tout à fait représentatif des cellules endothéliales de
différents organes. Il est difficile de cerner si l’effet observé est dû à l’origine des cellules ou
au procédé d’immortalisation. De plus, un autre facteur ayant pu influencer le phénotype est
l’origine vasculaire des cellules. En effet, les HUVEC proviennent d’une veine, tandis que les
cellules fournies par le Dre Kieda sont d’origine microvasculaire, c’est-à-dire un phénotype de
capillaire. Ces vaisseaux sont soumis à des contraintes différentes, la force de flux varie, les
composantes du vaisseaux peuvent varier (une media – des cellules musculaires lisses – dans
les vaisseaux de gros calibre versus des péricytes pour les capillaires). L’utilisation de modèle
animaux avec système isolé peut devenir une alternative intéressante pour étudier la spécificité
de l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules endothéliales de différents organes et de
différentes origines vasculaires.
160
Figure 5-5 Adhérence des cellules HT-29 aux HUVEC et aux HBrMEC
Les différentes cellules endothéliales ont ont été traitées ou non avec 10 µg/ml de
TNFα. La durée totale du prétraitement était de 4 h. Dans certains cas, le milieu a été
changé après 1.5h de traitement pour un milieu frais durant les 2.5h restantes avant
d’ajouter des cellules HT-29 à adhérer. Les cellules HT-29 ont été laissées à adhérer
pendant 30 min. Pour le détail du protocole d’adhérence, voir les sections 2.2.4 et
4.2.3. Ce résultat est représentatif de trois expériences, n=3.
161
Figure 5-6 La E-sélectine est exprimée uniquement sur les cellules HUVEC
Pour le détail du protocole d’immunofluorescence, voir la section 2.2.4. Observation
sur un microscope Eclipse TE 300 avec un objectif 40X. Les images ont été prises à
l’aide d’une caméra Micromax.
162
Chapitre 6
Discussion
164
6
Discussion générale
Les métastases sont une complication morbide du cancer.
Elles sont le résultat d’une
séquence d’événements où toutes les étapes doivent être franchies avec succès. La tumeur
doit croître et se vasculariser pour survivre. Certaines cellules tumorales peuvent se détacher
pour entrer dans la circulation sanguine. Ces dernières s’arrêteront dans un nouvel organe
pour y entrer, survivre et croître de nouveau [2]. Le succès d’une métastase ne dépend pas
seulement du potentiel de la cellule cancéreuse, mais aussi de toutes les interactions qui seront
créées avec l’environnement de l’hôte. Ainsi, l’approche thérapeutique doit non seulement
viser la cellule cancéreuse, mais également tous les mécanismes de l’hôte qui favorisent la
réussite d’une métastase [141].
Il est possible de faire des parallèles entre les différentes étapes du processus métastatique et
deux processus normaux, soit l’invasion lymphocytaire et la réparation tissulaire. En effet, la
progression d’une tumeur fait appel à plusieurs processus caractéristiques à la réparation
tissulaire, tel que la production de facteur de croissance par le stroma activé, l’induction de
l’angiogénèse, l’infiltration de cellules immunitaires et la génération de protéases [151]. Un
parallèle similaire existe pour l’adhérence à l’endothélium et la migration des leucocytes vers
une zone inflammée. Les molécules d’adhérence utilisées pour l’interaction des leucocytes
avec l’endothélium le sont également pour l’interaction des cellules cancéreuses avec
l’endothélium [91]. Les travaux de cette thèse ont été basés sur cette hypothèse, c’est-à-dire
que les cellules cancéreuses usurpent les mécanismes inflammatoires pour interagir avec
l’endothélium.
Mes travaux ont démontré que les cellules HT-29 d’un carcinome de côlon interagissent
spécifiquement avec les cellules endothéliales HUVEC, activées par le TNF, par
l’intermédiaire de la E-sélectine puis par l’intégrine β4. De plus, cette interaction permet
d’activer différents sentiers, dont celui de la MAP kinase p38, ce qui conduit à leur migration
transendothéliale.
165
6.1 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est
séquentielle
Dans le modèle inflammatoire, les leucocytes interagissent avec l’endothélium par
l’intermédiaire des sélectines, puis une chimiokine active les intégrines du leucocyte pour
qu’il s’attache fermement à l’endothélium.
Cette séquence, sélectines, chimiokines et
intégrines, est connue comme le paradigme multi-étapes du recrutement leucocytaire [4]. Mon
hypothèse voulait que l’adhérence des cellules cancéreuses HT-29 aux cellules endothéliales
HUVEC utilisait ces mêmes étapes.
Les résultats d’adhérence impliquant la E-sélectine
(chapitre 2, figure 2-2), plus tardivement l’intégrine β4 (chapitre 4, figure 4-2) et un facteur
soluble (chapitre 5, figure 5-1), suggèrent fortement que les cellules cancéreuses adhèrent en
suivant ce paradigme.
Cependant, il existe des différences importantes entre l’adhérence des leucocytes dans le
modèle inflammatoire et l’adhérence des cellules cancéreuses. Kitayama et collaborateurs ont
comparé l’adhérence à la E-sélectine de cellules du cancer du côlon à celle de
polymorphonucléaires (PMN) sous des conditions de flux circulant [152]. Le roulement sur la
E-sélectine était moindre avec les cellules cancéreuses qu’avec les PMN.
Cependant,
contrairement aux PMN qui nécessitent l’implication des intégrines pour adhérer fermement,
les cellules cancéreuses du côlon colo201, peuvent s’attacher uniquement par la E-sélectine en
présence de flux. Cette lignée présentait une particularité quand à un ligand de la E-sélectine,
le groupement syalil-Lewis-x (sLex). Ce dernier était exprimé de manière régionale, par
plaque, sur la membrane par opposition à un expression uniforme pour le PMN [152]. Les
travaux de Burdick et collaborateurs ont également démontré des particularités pour la liaison
à la E-sélectine de cellules cancéreuses soumises à un flux circulant [150]. Les cellules de
l’adénocarcinome du côlon LS174T se lient aux cellules HUVEC sous un flux circulant par
l’intermédiaire de ligands de la E-sélectine ainsi que par certaines intégrines. Deux résultats
sont à retenir de cette étude.
Dans la cellule cancéreuse, plusieurs ligands médient
l’interaction avec la E-sélectine, des glycoprotéines (par opposition au glycolipides) syalilés
(sLex et di-sLex) et un ligand non-sialylé. La E-sélectine possède donc plusieurs partenaires
possibles. Dans la cellule endothéliale, une différence importante est apparue par rapport au
166
devenir de la E-sélectine. Après 2 minutes d’adhérence des LS174T sous le flux circulant, la
E-sélectine est internalisée dans les compartiments lysosomiaux [150], comparativement aux
cellules HL-60 (lignée leucocytaire provenant d’une leucémie [153]) qui avait induit une
agglomération de la E-sélectine après 10 minutes d’adhérence statique [55]. Ce résultat peut
s’expliquer de deux manières. Premièrement, l’adhérence à la E-sélectine est différente pour
les cellules cancéreuses versus les cellules d’origine leucocytaires. Deuxièmement, la force de
cisaillement pourrait modifier la durée de l’interaction. Considérant l’importance du flux pour
les résultats d’adhérence versus un résultat statique [6], la force de cisaillement a sûrement un
rôle important à jouer.
La séquence sélectines, chimiokines et intégrines implique l’expression de ces dernières par
les cellules endothéliales. De manière intéressante, la présence de stimuli pro-inflammatoires
sur les cellules cancéreuses amène la production de facteurs solubles qui augmentent
l’expression des molécules d’adhérences sur les cellules endothéliales. Les stimuli proinflammatoire, tel le LPS, le TNFα et l’IL-1β, ne sont pas équivalents dans leur effet [147].
Dans des modèles de leucémies aiguës, la co-culture de cellules leucémiques avec des cellules
endothéliales amène l’expression, par les cellules leucémiques, de cytokines, dont le TNF et
l’IL-1.
Ces cytokines activent les cellules endothéliales, augmentent l’expression de
molécules d’adhérences dont la E-sélectine, ICAM-1 et VCAM-1 et augmentent l’adhérence
des leucocytes à l’endothélium. Les leucocytes créent donc les conditions propices à leurs
adhérence [154]. Cette induction de molécule d’adhérence est même spécifique au tropisme
métastatique. Ainsi, les cellules du carcinome du poumon H59 qui métastasient au foie,
induisent une expression de TNF ainsi qu’une augmentation de l’expression de la E-sélectine
sur les cellules endothéliales sinusoïdales suite à leur entrée dans cet organe. Les cellules du
carcinome du poumon M-27 qui ne font pas spontanément de métastases au foie, n’ont pas cet
effet inducteur de cytokines et de E-sélectine [66].
167
6.2 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est
spécifique
L’interaction des cellules cancéreuses avec les cellules endothéliales varie selon l’identité de
chacune. En effet, mes résultats permettent de conclure qu’une spécificité d’adhérence est
obtenue par l’intermédiaire des molécules d’adhérence, et que ces dernières varient selon
l’origine de la cellule cancéreuses et de la cellule endothéliale. Ainsi, la spécificité des
molécules exprimées par les cellules cancéreuses permettent, ou non, l’interaction avec la Esélectine exprimée par les cellules HUVEC activées par le TNF.
Les cellules HT-29
s’attachent entièrement par l’intermédiaire de la E-sélectine, les cellules HL-60 utilisent
partiellement la E-sélectine et les cellules HeLa ne l’utilisent pas du tout (figure 2-2 et 2-8).
De plus, seul certaines molécules d’adhérence exprimée par les cellules cancéreuses
permettent l’interaction avec les cellules endothéliales. Ainsi, parmi toutes les intégrines
exprimées par les cellules HT-29, seule l’intégrine β4 est impliquée dans l’adhérence des
cellules HT-29 aux HUVEC activées par le TNF (figure 4-2).
L’intégrine β4 existe sous cinq isoformes différentes, β4A, β4B, β4C, β4D et β4E.
L’isoforme A est la plus courante [76]. Dans la maturation des cellules de l’intestin dans l’axe
crypte – villosité, il y a deux variantes de l’isoforme β4A et ils ont des fonctionnalités
différentes [155]. Ainsi, au delà des variations entre les types de cancer pour l’expression des
molécules d’adhérence, un même type cellulaire peut modifier son patron d’expression de
molécules d’adhérence. C’est ainsi que la migration transendothéliale des cellules HL-60,
différenciées, se fait par l’intermédiaire de la E-sélectine [156].
De la même façon qu’une spécificité est acquise par l’identité de la cellule cancéreuse,
l’origine des cellules endothéliales modifie l’adhérence. Les résultats obtenus avec les lignées
endothéliales de diverses origines suggèrent une différence d’adhérence des cellules
cancéreuses selon l’origine de la cellule endothéliale (figure 5-5) ainsi qu’une différence au
niveau de l’expression de molécule d’adhérence, dont la E-sélectine (figure 5-6). Une étude
comparant le phénotype de sept lignées endothéliales établies avec trois lignées endothéliales
primaires (dont les HUVEC) a démontré plusieurs différences quant à l’expression de
168
molécule de surface et à la réponse de situmli pro-inflammatoire. Entre autres, certaines
lignées perdaient l’expression de la E-sélectine en réponse au TNF [157]. L’ensemble de ces
résultats vont dans le sens de l’hypothèse du seed and soil, à savoir que les métastases sont
intimement liées à des interactions d’adhérence spécifiques entre la cellule cancéreuse (seed)
et la cellule endothéliale (soil). En corollaire, les résultats soutiennent la possibilité que la
sélectivité de colonisation métastatique dépend de la spécificité de ces interactions et des
conditions locales telle l’inflammation, reproduite dans notre modèle par l’ajout de TNF.
6.3 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est
signalétique.
Un des résultats important de cette thèse est la démonstration de l’existence d’une cascade de
signalisation menant à un effet biologique suite à la liaison de la E-sélectine aux cellules HT29, c’est-à-dire l’activation du sentier kinase p38 menant à la migration transendothéliale
(chapitre 2 ou [158]). Ce résultat permet de voir l’interaction entre les cellules cancéreuses et
endothéliales comme une cascade d’interactions physique-chimiques (les molécules
d’adhérence) menant à divers événements signalétiques. La signalisation par la liaison de la
E-sélectine est maintenant démontré dans d’autres contexte cancéreux. L’adhérence à la Esélectine des cellules du côlon T84 induit différents phénotypes, dont la migration et
l’invasion et induit d’autre cascades signalétiques, entre autres par l’intermédiaire du calcium
[159, 160].
Le ligand de la E-sélectine sur les cellules HT-29 reste à identifier. Il est important de noter
que bien des molécules peuvent lier la sélectine, cela n’en fait pas des ligands pour autant, le
ligand doit être associé à une fonction [148]. Il en va de même pour le rôle de l’intégrine β4.
La démonstration de son ligand sur la cellule endothéliale ainsi que la signalisation induite
dans la cellule cancéreuse reste à démontrer. Des études sont d’ailleurs en cours dans le
laboratoire pour identifier ces deux ligands.
Chapitre 7
Conclusions
170
7
Conclusions et perspectives
7.1 Conclusions générales
L’objectif de cette thèse était de caractériser les interactions entre les cellules cancéreuses et
les cellules endothéliales dans le processus métastatique. Les résultats ont démontré que
l’interaction se fait par l’intermédiaire des molécules d’adhérence spécifiques dont la nature
dépend de l’origine de la cellule cancéreuse et de la cellule endothéliale. De plus, pour la
première fois, la liaison de la E-sélectine à son récepteur sur les cellules HT-29 a été
démontrée comme un événement signalétique menant vers une fonction biologique, la
migration transendothéliale. Ceci suggère que les interactions entre les molécules d’adhérence
peuvent être signalétiques de manière bidirectionnelle, engendrant des signaux dans la cellule
cancéreuse ainsi que dans la cellule endothéliale. Surtout, cette signalisation bidirectionnelle
donne un avantage sélectif en favorisant la réussite de la métastase. L’activation de la cellule
cancéreuse augmente sa migration transendothéliale (chapitre 2), tandis que l’activation de la
cellule endothéliale modifie sa perméabilité, ce qui favorise le passage de la cellule cancéreuse
[90, 96].
7.2 Perspectives et orientation future
Les résultats de cette thèse ouvrent de nouvelles perspectives quant à l’étude de l’interaction
des cellules cancéreuses avec les cellules endothéliales. Quatre avenues pourraient être
approfondies :
1- L’identification du ligand de la E-sélectine.
2- La caractérisation du facteur soluble.
171
3- La caractérisation de la spécificité de l’interaction selon l’origine des cellules
endothéliales et cancéreuses.
4- Développement d’un modèle d’adhérence en condition de flux.
7.2.1 Identification du ligand de la E-sélectine
Un résultat important présenté dans cette thèse est la présence d’un récepteur à activité kinase
intrinsèque, ou associée, comme ligand de la E-sélectine. L’identification de ce ligand sera
important afin de caractériser le couplage moléculaire liant le récepteur aux sentiers p38 et
ERK.
Elle sera aussi importante afin de confirmer sa présence sur d’autres lignées
cancéreuses utilisant la liaison à la E-sélectine et pourra potentiellement servir comme
marqueur d’agressivité dans les tumeurs. De plus, son état de glycosylation ainsi que sa
distribution cellulaire serait intéressante à connaître, afin de pleinement caractériser ce ligand.
7.2.2 Caractérisation du facteur soluble
L’identité de ce facteur soluble peut être multiple. Il peut s’agir d’un médiateur lipidique,
d’une protéine présente dans des granules de sécrétion ou de chimiokines par exemple.
Les chimiokines produites par les cellules endothéliales suite à une stimulation par le TNF
sont assez diverses. Citons la production de CCL2 (MCP-1), CXCL8 (IL-8), CXCL5 (ENA78), CXCL1 (Groα), CXCL7 (NAP-2), CXCL6 (GCP-2) et CX3CL1 (fractalkine) [161]. De
manière intéressante, la production de CCL2 en réponse au TNFα dépend du sentier
SAPK2/p38 [162]. La pertinence d’identifier une chimiokine associée à l’adhérence à la Esélectine dans l’adhérence d’une cellule cancéreuse du côlon à l’endothélium provient du fait
que de telles associations ont déjà été rapportées dans d’autres types d’interactions cellules –
172
cellules. L’adhérence et la migration transendothéliale à travers les cellules endothéliales de la
moelle osseuse est associée à la E-sélectine ainsi qu’à CXCL12 (SDF-1). Les mégacaryocytes
matures [163] et les cellules CD34+ [164] utilisent ce système pour migrer à la moelle
osseuse. D’ailleurs, les cellules CD34+ adhèrent grâce aux intégrines α4β1 (VLA-4) et αLβ2
(LFA-1) par l’intermédiaire de CXCL12 [165]. Dans le même sens, les lymphocytes migrent
sélectivement à la peau par l’intermédiaire de la E-sélectine qui interagit avec le CLA
(cutaneous lymphocyte antigen).
Les patients atteint de dermatite atopique recrutent les
lymphocytes Th2 par l’intermédiaire de la E-sélectine/CLA et de CCL22, dont le ligand CCR4
est exprimé sur les lymphocytes [166]. Dans les cas de dermatite atopique et de psoriasis
vulgaris, il y a une corrélation entre les niveau sérique de CCL27 (CTAK; cutaneous T cellattracting chemokine) et de E-sélectine soluble chez ces patients [167].
Sur le plan expérimental, différentes approches pourraient être utilisées pour aborder la
caractérisation d’un facteur soluble. Un nouvel inhibiteur chimique, le APC0576, permet de
bloquer l’activité transcriptionnelle de NF-κB, activité responsable de l’induction de
chimiokines en réponse à des cytokines pro-inflammatoire sur les cellules endothéliales [168].
Cet outil, ou tout autre inhibiteur spécifique de cette voie, pourrait être utile afin d’étudier
l’adhérence des cellules cancéreuses HT-29 sur les cellules endothéliales traitées au TNF.
L’expression du récepteur des chimiokines CCR6 sur les cellules cancéreuses, a été associée,
chez l’humain, aux métastases hépatiques [169]. Il serait donc intéressant de vérifier si le
ligand de CCR6, c’est-à-dire CCL20 (MIP-3α/LARC), est exprimé par les cellules
endothéliales suite à un traitement au TNF. De manière analogue, l’effet possible d’une
chimiokine pourrait être étudiée à l’aide de la toxine pertussique sur les cellules cancéreuses
[163, 166].
En effet, la toxine pertussique permet de bloquer le signal provenant des
récepteurs couplés aux protéines G, plus précisément de la sous-unitée Gi. Ainsi, si un
prétraitement à la toxine pertussique diminue l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules
endothéliales, on pourra imaginer l’effet d’un récepteur des chimiokines.
173
7.2.3 Caractérisation de la spécificité de l’interaction selon l’origine des
cellules endothéliales et cancéreuses.
Afin de vérifier la spécificité de l’interaction entre les cellules cancéreuses et endothéliales,
deux approches pourraient être utilisées. Premièrement, le modèle d’adhérence in vitro peut
permettre de comparer les interactions entre différents types de cellules cancéreuses à
l’endothélium.
Comme la spécificité d’interaction semble associée à plus d’un facteur
(sélectine, chimiokine et intégrines), l’intérêt serait de trouver la séquence utilisée pour chaque
lignée cancéreuse. Deuxièmement, les mêmes cellules cancéreuses pourraient être injectées
dans une souris afin d’étudier le rôle de ces mêmes molécules in vivo. Par exemple, suite à
une injection splénique, les cellules HT-29 forment des métastases dans le foie de souris
immunodéficientes (nu/nu) par l’intermédiaire de la E-sélectine [64, 170]. Le même modèle
de métastases pourrait être utilisé pour vérifier l’implication de l’intégrine β4 dans l’adhérence
des cellules HT-29 in vivo, confirmant ainsi les résultats d’adhérence statique. En comparant
l’utilisation de la E-sélectine et de l’intégrine β4 pour différentes lignées de cancer du côlon,
on pourrait généraliser l’implication de ces deux molécules dans les métastases du cancer du
côlon au foie. On peut même imaginer que l’utilisation d’une certaine combinaison des
molécules d’adhérence serait en corrélation avec le potentiel métastatique de ces différentes
lignées.
7.2.4 Développement d’un modèle d’adhérence en condition de flux
L’ensemble des résultats d’adhérence et de migration ont été obtenus avec un modèle statique.
Ces techniques avaient l’avantage d’être relativement simples d’utilisation et de pouvoir
étudier différents facteurs séparément (adhérence courte, migration, adhérence à des matrices).
Cependant, afin de pouvoir se rapprocher de la réalité clinique, c’est-à-dire de la cellule
cancéreuse qui est en circulation et doit sortir du flux sanguin pour s’attacher à l’endothélium,
il serait important de valider tous ces résultats en présence d’un flux circulant. Entre autres,
174
les cellules cancéreuses HT-29 présentent des caractéristiques différentes d’adhérence aux
matrices selon la présence ou l’absence de flux circulant [171]. Pour étudier l’adhérence en
présence de flux, le principal modèle in vitro disponible est l’utilisation d’une chambre de flux
parallèle, dont l’arrangement est montré à la figure 7-1. Cette chambre permet d’étudier
l’interaction de cellules circulantes avec une matrice, des protéines recombinantes ou avec une
couche de cellules endothéliales [6, 150, 171]. La chambre de flux pourrait aussi permettre
d’étudier la migration transendothéliale dans un contexte plus près du in vivo et de valider les
données obtenues en chambre de Boyden [172].
7.3 Applications
La littérature tend à démontrer que la E-sélectine peut être un promoteur et un marqueur de
métastase hépatique [62-64, 66-68, 173]. D’ailleurs, la E-sélectine soluble est plus élevée lors
de présence de métastases et pourrait être utilisée cliniquement comme marqueur d’évolution
d’une tumeur [68, 69]. Pour ce qui est de l’intégrine β4, bien que seule elle ne soit pas
suffisante pour promouvoir les métastases [174], elle pourrait, néanmoins, être utilisée en
combinaison avec la E-sélectine comme marqueur pronostique. De plus, une fois les ligands
de la E-sélectine et de l’intégrine β4 connus, elles pourront être ciblées thérapeutiquement afin
de bloquer l’étape d’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium dans le processus
métastatique. L’avenir du traitement des métastases est dans le traitement spécifique de cellesci.
Mes travaux démontrant des différences d’adhérence selon l’origine de la cellule
cancéreuse et l’origine de la cellule endothéliale. L’objectif serait de personnaliser les cibles
thérapeutiques selon l’origine du cancer et son phénotype
175
Figure 7-1 Chambre de flux parallèle
La chambre de flux est schématisée la tête en bas. Une vitre forme le bas de la
chambre de flux parallèle et peut présenter une matrice ou des cellules endothéliales.
Le montage est installé sur un microscope inversé, équipé d’une caméra vidéo. La
176
suspension cellulaire est amenée à la chambre à l’aide d’une pompe-seringue. Adapté
de [6]
Par ailleurs, sachant que la présence d’agent pro-inflammatoire peut promouvoir l’expression
de la E-sélectine, et potentiellement de facteurs solubles, l’inflammation devient une cible
thérapeutique intéressante dans le cancer. Comme la réponse inflammatoire a une phase aiguë
qui devient chronique, il pourrait être intéressant de traiter ces deux phases différemment.
Ainsi, un traitement aigu ciblant un excès de TNFα par l’intermédiaire de l’Infliximab (un
anticorps qui lie le TNFα membranaire ou soluble) et l’Etanercept (un récepteur imposteur
« decoy receptor », une portion de TNFR2 ou p75), peut diminuer les effets secondaires et
ainsi empêcher l’établissement de la cascade de cytokines et des effets associés [175]. De
manière plus, fine, on peut imaginer moduler la réponse inflammatoire plutôt que de la
bloquer systématiquement. On pourrait, par exemple, utiliser la réponse de l’hôte contre la
tumeur [176] et diminuer efficacement le risque de métastases.
ANNEXE A
Statistiques canadiennes du cancer
178
A Statistiques canadiennes du cancer
Ces informations proviennent de deux sources :
1- Le document « Statistiques Canadiennes sur le Cancer 2003 », disponible sur internet à
www.cancer.ca. Il est produit en collaboration par la Société Canadienne du Cancer,
l’Institut National du Cancer du Canada, Statistique Canada, les registres du cancer des
provinces et des territoires et par Santé Canada. Ce document contient les données
réelles pour l’incidence du cancer en 1998 et pour la mortalité associée au cancer en
1999. Il contient également des estimés de ces même valeurs pour l’année 2003.
2- Les informations disponible par le « Service d’information sur le cancer » de la Société
canadienne du cancer, entres autres dans l’Encyclopédie canadienne du cancer
(ECCMD), disponible par internet à www.cancer.ca ou par téléphone au 1-888-9393333.
A.1 Nomenclature
En clinique, les tumeurs sont classées selon le système TNM. Ce système a été développé par
l’AJCC (American Joint Committee on Cancer) pour décrire l’étendue d’une tumeur. La lettre
T décrit la tumeur (tumor), sa taille et sa localisation. La lettre N indique si les nodules
lymphatiques (lymph node) environnant la tumeur ont été atteints. Finalement, la lettre M
indique s’il y a présence de métastases (metastasis) à un autre endroit de l’organisme ou non.
Ce ne sont pas toutes les tumeurs qui métastasient systématiquement vers un organe
particulier. Certaines tumeurs ont des comportements plutôt prévisible et utilisent le plus
souvent le même moyen de propagation. Ainsi, une tumeur peut se propager par :
1- Envahissement local des tissus environnants. La tumeur, en croissant, s’étend dans les
tissus environnants.
179
2- Dissémination lymphatique.
Les cellules cancéreuses entrent dans la circulation
lymphatique par les ganglions environnant la tumeur.
3- Dissémination hématogène. Les cellules cancéreuses traversent la paroi endothéliale et
circulent dans l’organisme par la circulation sanguine.
4- Dissémination à distance (métastase).
Parfois le chemin emprunté par la cellule
cancéreuse est incertain, mais le résultat est une métastase dans un organe particulier.
Pour ce qui est des statistiques, un chiffre intéressant est le ratio entre le nombre de décès et le
nombre de nouveaux cas. Ce ratio permet de séparer les différents cancers selon trois groupes.
Le premier groupe, avec un ratio égal ou inférieur à 30%, présente un pronostic très favorable,
il inclus des cancers tels que celui du sein, de la prostate, le mélanome et le cancer de la
vessie. Le second groupe, avec des ratio supérieur à 30% mais inférieur à 50%, présente un
pronostic passable et inclus des cancer comme les lymphomes non hodgkiniens, le cancer
colorectal, le cancer du rein et du larynx. Finalement, le dernier groupe avec des ratio
supérieur à 50% ont un pronostic sombre et inclus le cancer du poumon, du pancréas, de
l’ovaire, de l’encéphale et les leucémies. Ainsi, de manière absolue, les cancers les plus
fréquents sont le cancer du sein et de la prostate, mais celui causant le plus de décès est le
cancer du poumon.
A.2 Métastases selon l’origine du cancer
Les tableaux suivants présentent de l’information sur les métastases pour 16 cancers d’origines
différentes, par ordre alphabétique. On y retrouve également de l’information sur le moyen de
propagation privilégié ainsi que les statistiques pour l’année 2003, lorsque disponibles.
180
Cancer du cerveau et de la moelle épinière, chez l’adulte
Site de métastases pour
Envahissement local
Le cerveau est un site de métastases pour les cancers du
sein, du poumon, du rein, du côlon, les mélanomes, etc.
L’encéphale peut aussi être un site d’extension des
tumeurs nasales.
Les cellules cancéreuses peuvent se disséminer dans le
système nerveux central (SNC) par la voie du liquide
céphalorachidien (LCR), mais elles s'étendent rarement
à l'extérieur des méninges.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 1998 pour le cancer du cerveau, il y avait :
2400 Nouveaux cas, 1600 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.66
Cancer du col de l’utérus
Envahissement local
Dissémination
lymphatique
Ce type de cancer tend à
envahir plus profondément
le col et les tissus à
proximité comme la partie
supérieure du vagin, la
vulve et d’autres régions
de l’utérus. Il peut
s’étendre également à
l’abdomen.
Peut envahir le système
lymphatique, les ganglions
lymphatiques du bassin, de
l’abdomen, de l’aorte et du
cou.
Dissémination
hématogène
Par la circulation
sanguine, les métastases
peuvent s’étendre
jusqu’aux uretères, à la
vessie, au rectum, à
l’abdomen.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
1400 Nouveaux cas, 420 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.31
Métastases
(dissémination à
distance)
On retrouve des
métastases dans les
poumons, le foie, les os et
le cerveau.
181
Cancer colorectal
Envahissement local
Dissémination
lymphatique
Dissémination
hématogène
Métastases
(dissémination à
distance)
Lorsque les cellules
cancéreuses traversent la
paroi intestinale, elles
peuvent s'installer dans le
gras périrectal ou dans les
parois du bassin. Les
cellules peuvent également
se propager à la prostate,
au vagin, à la vessie, aux
uretères, au pancréas, au
foie, à la région
rétropéritonéale ou à
l'épiploon. D'autres
segments de l'intestin
peuvent aussi être atteints,
que ce soit dans le gros
intestin ou l'intestin grêle,
s'ils se situent assez près
de la tumeur
Le risque d'atteinte
métastatique des ganglions
lymphatiques augmente
selon le degré de
différenciation de la
tumeur : lorsque la tumeur
est indolente, l'atteinte des
ganglions lymphatiques ne
touche que 30 % des
patients, tandis que chez
environ 80 % d'entre eux,
le système lymphatique
sera atteint si la tumeur est
agressive.
Le foie est le foyer de
métastases le plus fréquent
lorsque les cellules
cancéreuses ont pénétré
dans le courant sanguin.
Le poumon vient au
second rang. Le cancer du
côlon se propage rarement
à d'autres organes par le
sang sans avoir avant tout
atteint le foie ou les
poumons. Dans bon
nombre de cas, le foie est
le seul organe touché.
L'implantation des cellules
cancéreuses peut se
produire le long de la
muqueuse interne de
l'intestin (espace
intraluminal), des cellules
peuvent aussi atteindre la
surface externe de
l'intestin (séreuse) vers
laquelle les cellules qui se
sont détachées de la
tumeur se sont dirigées.
Elles s'installent sur
n'importe quelle surface de
la cavité abdominale
(métastases péritonéales
ou implants). Cela peut se
produire peu importe si la
circulation sanguine ou le
système lymphatique ont
été atteints.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
18000 Nouveaux cas, 8300 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.46
182
Cancer de l’estomac
Envahissement local
Dans le cancer de l’estomac, il y a
extension directe à travers la paroi
de l'estomac vers les organes
adjacents et par voie
transcoelomique (vers la cavité
péritonéale, ou abdominale).
Dissémination lymphatique
Métastases (dissémination à
distance)
Plusieurs ganglions lymphatiques
peuvent être atteints : dans les
ganglions situés près de l'estomac,
près du foie et de la rate (dans
l'abdomen) et même plus loin, soit
du côté gauche du cou, au-dessus de
la clavicule (ganglion de Troisier)
ou à l'aisselle gauche (ganglion
d'Irish). L'envahissement
ganglionnaire se manifeste
habituellement au début de la
maladie.
On peut retrouver des métastases à
l’oesophage, à la muqueuse de la
cavité abdominale (cavité
péritonéale) et épiploon, à l’intestin
grêle (duodénum), au pancréas, au
côlon, aux ovaires, au rectum, à la
rate, au tissu sous-cutané (tissu
adipeux) autour de l'ombilic
(nombril), au rein, à la glande
surrénale, au poumon, aux os et au
cerveau dans des cas rares.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
2800 Nouveaux cas, 1900 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.69
Cancer du foie
Envahissement local
Dissémination lymphatique
Le cancer du foie peut se développer Le cancer du foie a tendance à
dans une région et, éventuellement, envahir les ganglions lymphatiques
s'étendre partout dans le foie, ou il
environnants
peut se développer dans différentes
parties du foie au même moment.
Environ 50 % des cancers primitifs
du foie ne se propagent pas à
l'extérieur du foie.
Métastases (dissémination à
distance)
Le cancer du foie a tendance à
envahir le diaphragme, les poumons
(environ 20 % de l'étendue
extrahépatique va aux poumons), les
tissus avoisinants, les veines
hépatique et porte, les os, le
cerveau, ou les sites variés partout
dans le reste de la cavité abdominale
(spécialement l'estomac et les
glandes surrénales).
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 1998 pour le cancer du foie et du passage biliaire, il y avait :
2010 Nouveaux cas, 1780 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.89
183
Leucémie - adulte
Dissémination lymphatique
Dissémination hématogène
Métastases (dissémination à
distance)
Les cellules leucémiques peuvent
également se disséminer dans le
système lymphatique et atteindre les
ganglions lymphatiques.
Comme la leucémie est un cancer du
sang, elle peut se propager dans
toutes les parties du corps où le sang
circule.
Les cellules leucémiques peuvent se
propager dans la moelle osseuse (la
moelle osseuse et le sang sont les
sites de récidive habituels), les
ganglions lymphatiques, la rate, le
foie, les méninges et les testicules
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
3600 Nouveaux cas, 2200 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.61
Cancer des os
Site de métastases pour
Les cancers qui se disséminent
habituellement dans les os
comprennent les cancers du sein, de
la prostate et des poumons.
Dissémination hématogène
les cellules cancéreuses peuvent
entrer dans la circulation sanguine
tôt dans l'évolution de la maladie,
pour se déposer dans les poumons.
La dissémination hématogène des
cellules cancéreuses vers d'autres os
donne lieu à des foyers de métastase
secondaire.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 1998, il y avait :
282 Nouveaux cas, 132 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.47
Métastases (dissémination à
distance)
Les métastases discontinues sont des
tumeurs disséminées à partir de la
tumeur primitive sur le même os,
mais séparées par quelques
centimètre de tissu sain.
184
Cancer de l’ovaire
Envahissement
local
Dissémination
lymphatique
Dissémination
hématogène
Métastases (dissémination
à distance)
Parmi les structures
qui peuvent être
touchées figurent
l'ovaire du côté
opposé (s'il n'est pas
déjà atteint), l'utérus,
les trompes de
Fallope, la vessie, le
rectum et le péritoine
de la cavité
pelvienne.
La dissémination peut
s'effectuer par voie
lymphatique, même au
stade précoce du cancer
ovarien. Si certains
vaisseaux lymphatiques
sont obstrués par les
tumeurs secondaires, en
particulier les vaisseaux
situés sous le diaphragme
et autour du sternum, ils
ne peuvent plus drainer le
liquide péritonéal, qui
s'accumule alors dans la
cavité abdominale. Cette
situation est appelée
ascite.
Le cancer ovarien peut se
propager par voie
hématogène, ou sanguine,
bien que rarement.
L'envahissement des
vaisseaux sanguins par les
cellules tumorales
entraîne habituellement
des métastases
pulmonaires, hépatiques
ou cérébrales.
La dissémination s'effectue
souvent par essaimage
péritonéal. Les cellules
cancéreuses se détachent de la
tumeur et flottent dans les cavités
pelvienne et abdominale, pour se
déposer et former des métastases
sur pratiquement n'importe quel
organe. Les tumeurs secondaires
se forment le plus souvent sur les
épiploons (replis péritonéaux qui
attachent les viscères entre eux),
la surface des intestins, l'utérus,
la vessie et le péritoine. En
circulant, le liquide péritonéal
transporte les cellules
cancéreuses jusqu'au
diaphragme, ce qui explique la
fréquence des tumeurs
secondaires sous cette structure.
Transportées par le liquide
péritonéal, les cellules
cancéreuses peuvent également
traverser le diaphragme, atteindre
les poumons et causer
l'accumulation de liquide autour
de ceux-ci (épanchement
pleural).
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
2600 Nouveaux cas, 1550 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.61
185
Cancer du pancréas
Envahissement local
Le cancer du pancréas
peut envahir les nerfs ou
les tissus voisins, comme
les canaux biliaires ou le
duodénum.
Dissémination
lymphatique
Dissémination
hématogène
Métastases
(dissémination à
distance)
Il peut se disséminer dans
les ganglions
lymphatiques.
Il peut se disséminer dans
les vaisseaux sanguins
loco-régionaux.
La métastase à distance
peut viser le foie, le
diaphragme, les poumons,
la plèvre, le côlon,
l'intestin grêle, la rate, le
péritoine, les reins, les
glandes surrénales et les
os.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
3300 Nouveaux cas, 3200 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.99
Cancer de la peau - mélanome
Dissémination lymphatique
Dissémination hématogène
Métastases (dissémination à
distance)
Les mélanomes peuvent s'étendre à
tout le corps à travers le système
lymphatique.
Les mélanomes peuvent s'étendre à
tout le corps à travers le sang.
Les sites de métastases les plus
communs sont le cerveau, la moelle
épinière, les ganglions
lymphatiques, les poumons et le
foie.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 pour le mélanome il y aura :
3900 Nouveaux cas, 840 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.22
186
Cancer du poumon
Envahissement local
Dissémination
lymphatique
Dissémination
hématogène
Métastases
(dissémination à
distance)
La propagation locale peut
se produire si la tumeur
traverse la plèvre viscérale
(enveloppe externe du
poumon) pour envahir la
paroi thoracique ou le
diaphragme. Si la tumeur
est située au milieu de la
poitrine, elle peut toucher
directement les ganglions
lymphatiques hilaires
également situés au milieu
de la poitrine.
Le type de cellule
cancéreuse et le siège de la
tumeur dans les poumons
détermine le trajet
emprunté par les cellules
dans le système
lymphatique. Les
ganglions lymphatiques
les plus souvent touchés
par cette migration sont
situés dans le hile, le
médiastin et autour de la
trachée. Cependant, les
conduits lymphatiques
sus-claviculaires,
cervicaux et abdominaux
peuvent eux aussi devenir
des voies de
dissémination.
Le cancer du poumon peut
donner lieu à des
métastases étendues quand
les cellules cancéreuses se
disséminent dans la
circulation sanguine.
Quand les cellules
tumorales passent dans le
sang circulant dans les
poumons, elles peuvent
être transportées dans les
vaisseaux pulmonaires
jusqu'au cœur et de là,
partout dans l'organisme.
Le cancer du poumon à
petites cellules peut se
disséminer dans
virtuellement n'importe
quel organe du corps, mais
les métastases se trouvent
plus souvent dans les os, le
foie, le système nerveux
central, les ganglions
lymphatiques, la plèvre,
les tissus sous-cutanés et
les surrénales.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
21100 Nouveaux cas, 18800 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.89
Le cancer du poumon non
à petites cellules peut
s'étendre directement à la
plèvre, à la paroi
thoracique, au diaphragme
et aux ganglions
lymphatiques, tandis que
les cellules cancéreuses
disséminées par voie
sanguine s'installent
souvent dans les os, le
foie, les surrénales, le
cœur (péricarde) et le
cerveau.
187
Cancer de la prostate
Envahissement local
Dissémination lymphatique
Le cancer de la prostate peut se
propager aux ganglions
lymphatiques situés dans la région
immédiate ou aux ganglions plus
éloignés dans la région pelvienne,
D'autres tumeurs pourront percer la comme les ganglions sacrés, les
ganglions iliaques externes et les
paroi de la prostate et se propager
localement - envahissant le tissu des ganglions lombaires. Lorsque le
cancer atteint les ganglions
régions avoisinantes, comme les
lymphatiques, il peut continuer à se
vésicules séminales, les structures
disséminer aux os, particulièrement
de soutien, la vessie et l'urètre. Le
rectum est séparé de la prostate par à la colonne vertébrale, les hanches,
les côtes, les jambes et les bras.
une membrane résistante (le fascia
de Denonviller) qui le protège d'un
envahissement par le cancer.
Certaines tumeurs peuvent demeurer
limitées à la prostate en se
développant vers l'intérieur et en
bloquant l'urètre.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
18800 Nouveaux cas, 4200 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.22
Dissémination hématogène
Le cancer de la prostate peut aussi
se propager par voie sanguine vers
des organes situés à distance,
comme les poumons, le foie et les
reins.
188
Cancer du rein
Envahissement local
Dissémination
lymphatique
Dissémination
hématogène
Métastases
(dissémination à
distance)
L'hypernéphrome tend à
envahir l'intérieur du rein.
Il peut s'étendre à la veine
rénale et, parfois, à la
veine cave. Il peut
également franchir la
capsule rénale et envahir
la graisse périrénale
(couche de graisse qui
enveloppe le rein). Enfin,
il peut toucher des
structures voisines comme
les glandes surrénales.
Les cellules tumorales
peuvent également envahir
les ganglions
lymphatiques abdominaux
qui drainent le rein.
L'hypernéphrome a ceci de
particulier qu'il tend à se
propager d'abord par voie
sanguine plutôt que par
voie lymphatique. Les
cellules cancéreuses sont
en effet transportées par
les vaisseaux sanguins qui
traversent la tumeur, puis
par la veine rénale, la
veine cave inférieure ou
ces deux vaisseaux. Les
cellules cancéreuses
peuvent ainsi atteindre les
poumons, le foie et les os.
L'hypernéphrome s'est
disséminé chez environ 25
à 30 % des patients au
moment du diagnostic.
Dans 1 à 3 % de ces cas, il
n'aura donné lieu qu'à une
seule métastase,
habituellement dans le
poumon.
Les métastases siègent le
plus souvent dans les
poumons, ganglions
lymphatiques, foie, os,
tissus mous, cerveau ou
système nerveux central et
rein controlatéral (l'autre
rein)
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
4100 Nouveaux cas, 1450 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.36
Cancer du sein
Envahissement local
Métastases (dissémination à distance)
Le cancer qui réapparaît dans les tissus environnants,
comme la paroi thoracique, les ganglions lymphatiques
sus-claviculaires ou la région du cou, est appelé
envahissement régional. La récidive se manifestera le
plus probablement au niveau de la cicatrice de
l’incision chirurgicale initiale ou près de celle-ci.
On parle d’un cancer du sein métastatique lorsque le
cancer se dissémine jusqu’à un autre organe comme les
os, le poumon, le foie ou le cerveau
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :
21200 Nouveaux cas, 5300 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.25
189
Cancer de l’utérus
Envahissement
Dissémination
Dissémination
Métastases
local
lymphatique
hématogène
(dissémination à
distance)
L'extension directe aux
organes et aux tissus
entourant l'utérus peut
se produire lorsque les
cellules cancéreuses ont
traversé la paroi utérine.
Elles peuvent atteindre
la vessie, le rectum, le
vagin, les trompes de
Fallope ou les ovaires
ou bien les deux.
Les cellules cancéreuses qui
se développent dans la partie
supérieure de l'utérus (fond
de l'utérus) ont tendance à se
propager vers les vaisseaux
qui drainent la région, et
éventuellement se diriger
jusqu'aux ganglions
lymphatiques entourant
l'aorte située dans la partie
supérieure de l'abdomen
(ganglions para-aortiques) ou
logés dans le cou et près de
la clavicule (ganglions susclaviculaires). Quant aux
cellules cancéreuses qui se
développent dans la partie
médiane ou inférieure de
l'utérus, elles circulent à
travers les vaisseaux
lymphatiques qui se dirigent
vers les ganglions
lymphatiques pelviens.
Un cancer de l'utérus
peut également se
propager par le courant
sanguin jusqu'à des
emplacements
éloignés. Les organes
cibles sont le poumon,
le foie, le cerveau et les
os.
Il arrive souvent que la
propagation des cellules
cancéreuses se produise
également par essaimage
péritonéal, c'est-à-dire que la
tumeur libère ces cellules qui
flottent dans les cavités
pelvienne et abdominale,
évoluant ainsi en métastases
sur presque chaque organe
auxquelles elles se fixent. Les
emplacements de prédilection
des métastases sont la couche
graisseuse qui protège les
organes du bassin et de
l'abdomen (épiploon), la
surface de l'intestin, la vessie
et le péritoine. Le liquide
péritonéal repousse les
cellules malignes jusqu'au
diaphragme ainsi qu'en
dessous de cette cloison, ce
qui explique pourquoi cette
région est un autre lieu
commun de formation de
métastases.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 1998, il y avait pour le corps de l’utérus :
3700 Nouveaux cas, 700 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.19
190
Cancer de la vessie
Envahissement local
Dissémination lymphatique
Dissémination hématogène
Les tumeurs se répandent
localement,en traversant la paroi
vésicale et en s'infiltrant directement
dans les tissus graisseux adjacents
(région périvésicale), dans les
structures proches comme la
prostate, le vagin, le côlon sigmoïde,
le rectum, l'utérus et l'os pelvien.
Selon sa localisation, la tumeur peut
aussi obstruer les uretères, le col
vésical et l'urètre prostatique.
Les tumeurs de la vessie peuvent
atteindre localement les ganglions
lymphatiques de la région pelvienne
et, plus haut, ceux de l'abdomen.
Les cellules cancéreuses peuvent
être véhiculées par la circulation
sanguine et envahir les poumons, les
os et le foie.
Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003, il y aura :
5000 Nouveaux cas, 1100 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.31
On peut remarquer que parmi tous ces cancers, les sites préférentiels de métastases qui
reviennent fréquemment sont les os, les poumons, le foie et le cerveau. La fréquence pour
chacun de ces sites varient selon l’origine du cancer, comme le montre le tableau A-1.
191
Tableau A-1 Incidence des métastases dans les organes principaux
Selon les autopsies rapportées dans la littérature, incidence des métastases en
pourcentage de tous les cas. Adapté de [177], page 101.
ANNEXE B
Curriculum Vitae
193
B CV - Curriculum Vitae
Dans cette section, on retrouve la liste de mes publications et communications présentées au
cours de mes études graduées. Les publications ont fait l’objet de chapitres de cette thèse (2 à
4), à l’exception de la publication dans Cell Stress & Chaperones 2003. J’ai contribué à cet
article en parallèle de mon projet.
B.1 Publications
Laferrière, J, Houle, F, Taher, M.M, Valerie, K, Huot, J. Transendothelial migration of colon
carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stressactivated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276 : 33762-33772
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Stress & Chaperones. Volume 8 (1), 37-52. (2003)
Laferrière, J, Houle, F, Huot, J. Adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to endothelial cells
requires sequential events involving E-selectin and integrin β4. Sera soumis en 2003.
194
B.2 Communications
On retrouve ici les congrès nationaux ou internationaux où mes travaux ont été présentés.
Laferrière, J, Morin, C, Houle, F, Huot, J. E-selectin and beta4 integrin-mediated adhesion of
HT-29 colon carcinoma cells to endothelial cells: Impact on transendothelial migration.
Signalisation du stress cellulaire et cancer, Québec, 07/2003. Affiche. Premier prix
Laferrière, J, Houle, F, Guay, S, Kieda, C, Huot, J. Specificity of the interaction of colon
carcinoma HT-29 cells with endothelial cells conferred by adhesion molecules. IXth
International Congress of the Metastasis Research Society, Chicago, Illinois, 09/2002.
Affiche
Laferrière, J, Houle, F, Huot, J. Regulation of transendothelial migration of colon carcinoma
HT-29 cells by E-selectin-mediated activation of SAPK2/p38. 3rd International Conference on
Signal Transduction, Dubrovnik, Croatie, 05/2002. Affiche
Laferrière, J, Houle, F, Huot, J. Regulation of adhesion and migration of HT-29 cancer cells
on and through endothelial cells. Cell signaling, transcription and translation as therapeutic
targets, Luxembourg, 01/2002. Affiche
Laferrière, J., Houle, F. Huot, J. E-selectin-mediated adhesion of tumor cells to endothelial
cells and activation of the SAPK2/p38 pathway in the tumor cell are both required for
transendothelial migration. 5th Conference on Signaling in Normal and Cancer Cells, Banff,
Canada, 03/2001. Affiche
195
Huot, J., Laferrière, J., Houle, F. Regulation of transendothelial migration of colon
carcinoma cells by E-selectin-mediated activation of stress-activated protein kinase-2
(SAPK2/p38) in the tumor cells. Keystone Symposia, Lake Tahoe, Californie, 03/2001.
Affiche
Laferrière, J., Houle, F., Taher, M.M., Valerie, K. et Huot, J. Role of E-selectin and p38
MAP kinase in transendothelial migration of cancer cells. 91st AACR meeting, San Francisco,
04/ 2000. Affiche
Laferrière, J., Houle, F. et Huot, J. Role of E-Selectin and p38 MAP kinase in
transendothelial migration of HT-29 cancer cells.
CFBS, Winnipeg, Canada, 06/1999.
Affiche
Laferrière, J., Houle, F. et Huot, J. Regulation of transendothelial migration of HT-29 cancer
cells by E-Selectin and p38 MAP kinase.
MRC National Student Research Poster
Competition, Winnipeg, Canada, 06/1999. Affiche. Mention Or / Prix d’excellence
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